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Introducción

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A pesar del papel tan importante que desempeña la secuencia de ADN en la materia viva, el desarrollo de los métodos para su determinación es relativamente reciente, debido sobre todo al tamaño tan grande de las moléculas de ADN en las células.

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En los decenios de 1960 y 1970, dos grupos de investigación independientes, liderados por los británicos Frederick Sanger y Alan Coulson y los estadounidenses Alan Maxam y Walter Gilbert, idearon de manera prácticamente simultánea dos procedimientos diferentes para determinar de modo directo la secuencia del ADN. Estos métodos sólo requieren de pequeñas cantidades de ADN, son altamente confiables y han revolucionado la biología molecular. En la actualidad, el equipo automatizado hace que la secuenciación sea un procedimiento rápido y de rutina en los laboratorios (figura 17-1).

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Figura 17-1.

Estrategia general de secuenciación de ADN. Los métodos de secuenciación se basan en la síntesis de ADN, en cuatro reacciones en paralelo, una para cada nucleótido, a fin de producir el paro de la reacción cuando un ddNTP se añada a la reacción. Los ddNTP pueden marcarse diferencialmente con fluorocromos de diferente color. Se obtendrá la secuencia de la cadena complementaria a la cadena molde por autorradiografía o fluorescencia, leyendo de abajo hacia arriba (5’ → 3’).

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Secuenciación

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Método químico o de degradación de Maxam y Gilbert

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Es un método de secuenciación que depende de la degradación química específica del ADN que describieron Maxam y Gilbert, en 1977. Este método tiene la ventaja de que puede emplear ADN de doble hebra, pero requiere una separación de hebras o fraccionamiento equivalente por cada fragmento de restricción estudiado, lo cual lo hace laborioso.

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La fragmentación específica del ADN es la base de este método, desarrollado en cinco pasos, que a grandes rasgos implican el marcaje radiactivo del extremo 5’ con 32P, la modificación de una base, la eliminación de la base modificada, rotura de la cadena de ADN en la desoxirribosa modificada y el análisis de la secuencia fragmentada por electroforesis en gel de poliacrilamida. El método está limitado por el poder de resolución del gel de poliacrilamida que, en el contexto histórico de la época, permitía secuenciar aproximadamente 100 bases a partir del punto de marcaje.

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La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas según su movilidad en un campo eléctrico a través de una matriz porosa, la cual finalmente las separa por tamaños moleculares y carga eléctrica, según la técnica que se use. La electroforesis en gel en general se utiliza con propósitos analíticos, pero puede ser una técnica preparativa para purificar parcialmente moléculas antes de aplicar espectrometría de masas, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), clonación o secuenciación de ADN (para mayores detalles, consultar el capítulo relacionado).

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