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Introducción

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La reacción en cadena de la polimerasa (PCR, polimerase chain reaction) se considera una de las técnicas más sensibles y específicas de las pruebas moleculares. En 1986, el doctor Kary Mullis desarrolló esta técnica en los laboratorios de CETUR Corporation, en Estados Unidos, lo que le hizo valedor del premio Nobel en 1993. La idea se fundamentó en la necesidad de obtener un gran número de copias de fragmentos específicos de ácido desoxirribonucleico (DNA, deoxyribonucleic acid) de manera rápida y económica, los cuales no podían obtenerse por otros métodos hasta ese momento. Esta técnica se basa en una replicación exponencial in vitro de una molécula de DNA genómico (gDNA) o DNA complementario (cDNA), mediante ciclos repetidos, que constan de tres temperaturas. En cada uno de los ciclos las moléculas se duplican hasta que los reactivos se agotan.

La longitud del producto amplificado la delimitan los iniciadores, también llamados primers u oligonucleótidos, de cuyo diseño adecuado depende el éxito de la PCR. Los iniciadores deben ser específicos, no formar estructuras secundarias ni hibridaciones inespecíficas entre ellos u otra parte de la cadena.

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Características de la amplificación in vitro y requerimientos necesarios para la PCR

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La amplificación in vitro de la PCR se apega a las mismas reglas de la replicación realizada en la célula; esta técnica se basa en una secuencia que le sirve de molde y, por complementariedad, sintetiza la cadena antiparalela. También, la síntesis de la cadena sigue la dirección 5′-3′, ya que requiere de un nucleótido con el extremo 3′ libre que proporcione el grupo OH para la adición del siguiente nucleótido, con lo que se forma el enlace fosfodiéster.

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Para que se lleve a cabo la PCR se requiere una cadena de gDNA o cDNA que sirva de molde, una enzima DNA polimerasa, cofactores necesarios para la actividad correcta de la DNA polimerasa, desoxinucleótidos (dNTP) para la síntesis del producto de PCR y oligonucleótidos o primers. Estos componentes se colocan en un tubo de ensayo en un equipo llamado termociclador. El orden de adición suele iniciar con el DNA molde, los otros reactivos y terminar con la DNA polimerasa (sobre todo si se emplea una DNA polimerasa termolábil).

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La función de cada uno de estos elementos en la reacción se describe a continuación y se enlistan en la figura 17-1.

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Figura 17-1

Componentes de la reacción de PCR. Para que se lleve a cabo la reacción en cadena de la polimerasa se requiere una cadena de gDNA o cDNA que sirva de molde, una enzima DNA polimerasa, Mn+2 o Mg+2 necesarios como cofactores para la enzima, dNTP o desoxinucleótidos y oligonucleótidos para el inicio de la síntesis. Estos reactivos se mezclan y se someten en el termociclador a los ciclos de amplificación.

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