Skip to Main Content

++

Introducción

++

A pesar de la función tan importante que desempeña la secuencia de ácido desoxirribonucleico (DNA, deoxyribonucleic acid) en la materia viva, el desarrollo de los métodos para su determinación es de inicio reciente, debido sobre todo al tamaño tan grande de las moléculas de DNA en las células.

En los decenios de 1960 y 1970, dos grupos de investigación independientes, liderados por los británicos Frederick Sanger y Alan Coulson y los estadounidenses Alan Maxam y Walter Gilbert, idearon de manera prácticamente simultánea dos procedimientos diferentes para determinar de modo directo la secuencia del DNA, el método enzimático y el químico de manera respectiva. Estos métodos sólo requieren de pequeñas cantidades de DNA, son altamente confiables y revolucionaron a la biología molecular. En la actualidad, el equipo automatizado para secuenciación hace que este método sea un procedimiento rápido y habitual en los laboratorios (figura 18-1).

++
Figura 18-1

Estrategia general de secuenciación de DNA. Los métodos de secuenciación se basan en la síntesis de DNA, en cuatro reacciones en paralelo, una para cada nucleótido, a fin de producir el paro de la reacción cuando un ddNTP se añada a la reacción. Los ddNTP pueden marcarse diferencialmente con fluorocromos de diferente color. Se obtendrá la secuencia de la cadena complementaria a la cadena molde por autorradiografía o fluorescencia, leyendo de abajo hacia arriba (5′ → 3′).

Graphic Jump Location
++

Secuenciación

++

Método químico o de degradación de Maxam y Gilbert

++

Este es un método de secuenciación que depende de la degradación química específica del DNA descrita por Maxam y Gilbert en 1977. La ventaja de este método consiste en el empleo de DNA de doble hebra; requiere una separación de hebras o fraccionamiento equivalente por cada fragmento de restricción estudiado, por lo cual es laborioso.

++

La fragmentación específica del DNA es la base de este método, desarrollado en cinco pasos, que a grandes rasgos implican el marcaje radiactivo del extremo 5′ con 32P, la modificación de una base, la eliminación de la base modificada, rotura de la cadena de DNA en la desoxirribosa modificada y el análisis de la secuencia fragmentada por electroforesis en gel de poliacrilamida. El método está limitado por el poder de resolución del gel de poliacrilamida que, en el contexto histórico de la época, permitía secuenciar cerca de 100 bases a partir del punto de marcaje.

++

La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas según su movilidad en un campo eléctrico a través de una matriz porosa, la cual finalmente las separa por tamaños moleculares y carga eléctrica, según la técnica utilizada. La electroforesis en gel por lo general se utiliza con propósitos analíticos, pero puede ser una técnica preparativa para purificar de manera parcial moléculas antes de aplicar espectrometría de masas, reacción en cadena de ...

Pop-up div Successfully Displayed

This div only appears when the trigger link is hovered over. Otherwise it is hidden from view.