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El Clostridium difficile produce diarrea infecciosa, habitualmente asociada al uso de antimicrobianos. La enfermedad asociada a C. difficile (CDAD, del inglés C. difficile–associated disease) es responsable de una mayor morbilidad y mortalidad debido a la creciente virulencia de las cepas infectantes. Se desconoce el papel de los principales factores de virulencia del microorganismo —toxina A y toxina B— en el contexto de la infección clínica. Estudios previos han sugerido que la toxina A es el factor de virulencia más importante y que la toxina B debe actuar en asociación con la toxina A. Sin embargo, esos estudios habían usado sólo toxinas purificadas, en vez de la infección natural, para evaluar el papel de cada uno de los factores en la patogenia de la CDAD.

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Ha sido difícil caracterizar genéticamente C. difficile y sólo recientemente se ha dispuesto de métodos para construir mutantes cromosómicos. Lyras et al. (2009) desarrollaron un método que usa un plásmido inestable, el vector recombinante, para introducir ADN en el genoma del C. difficile y alterar así genes específicos. Estos autores estudiaron la trascendencia de la toxina A (codificada por tcdA) y la toxina B (codificada por tcdB) en la CDAD. Se clonó un producto de reacción en cadena de la polimerasa específica de tcdA o tcdB de 566 pares de bases en el vector de recombinación y se insertó en la región cromosómica correspondiente al gen por recombinación homóloga, lo que producía la disrupción del gen de la toxina A o el gen de la toxina B. Se aislaron mutantes derivados independientemente de toxina A y de toxina B de una cepa de C. difficile. Se confirmaron los genotipos de los mutantes mediante análisis con PCR y Southern blot; los western blots demostraron que los mutantes de toxina A no producían toxina A y que los mutantes de toxina B no producían toxina B. Se usaron análisis de citotoxicidad para confirmar que los mutantes de toxina A producían poco efecto de toxina A pero tenían efectos de toxina B al natural, mientras que los mutantes de toxina B producían poco efecto de toxina B pero tenían efectos de toxina A también natural.

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En un modelo de enfermedad de hámster análogo a la CDAD de los seres humanos, la exposición a C. difficile natural produjo la colonización de los 10 hámster en 2 días; 9 de los 10 murieron en los 5 días posteriores a la colonización. Con los mutantes de toxina A que produjeron niveles naturales de toxina B, las tasas de colonización y muerte fueron similares a las registradas con bacterias naturales. Se usaron muestras fecales en los estudios de citotoxicidad que confirmaron la presencia de toxina B pero no de toxina A. Cuando se estudiaron mutantes de toxina B, las tasas de colonización y los tiempos hasta la colonización fueron similares, pero la mortalidad fue significativamente menor que la posterior a la infección con cepas naturales; esto es, sólo murieron 4 de 19 animales (p = ...

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