CAPÍTULO 9: Enzimas: regulación de actividades

Después de estudiar este capítulo, usted debe ser capaz de:

• Explicar el concepto de la homeostasis de todo el cuerpo, y su respuesta a fluctuaciones en el ambiente externo.

• Comentar por qué las concentraciones celulares de sustratos para casi todas las enzimas tienden a estar cerca de la K_m.

• Listar múltiples mecanismos mediante los cuales se logra el control activo del flujo de metabolitos.

• Describir las ventajas de que ciertas enzimas se elaboren como proenzimas.

• Ilustrar los eventos fisiológicos que desencadenan la conversión de una proenzima en la enzima activa correspondiente.

• Describir los cambios estructurales típicos que acompañan a la conversión de una proenzima en la enzima activa.

• Describir las características básicas de un sitio de unión típico para metabolitos y segundos mensajeros que regulan la actividad catalítica de ciertas enzimas.

• Indicar dos maneras generales en las cuales un efector alostérico puede modificar la actividad catalítica.

• Esbozar los papeles de las proteína cinasas, proteína fosfatasas, y de mensajeros reguladores y hormonales y segundos mensajeros en el inicio de un proceso metabólico.

El fisiólogo del siglo xix Claudio Bernard enunció la base conceptual para la regulación metabólica. Observó que los organismos vivos responden de modos apropiados desde los puntos de vista tanto cuantitativo como temporal para permitirles sobrevivir a los múltiples desafíos planteados por cambios de sus ambientes externo e interno. Después, Walter Cannon acuñó el término “homeostasis” para describir la capacidad de los animales para mantener un ambiente intracelular constante a pesar de los cambios en su ambiente externo. Ahora se sabe que los organismos responden a cambios en sus ambientes externo e interno por medio de ajustes equilibrados y coordinados de los índices de reacciones metabólicas específicas. Las perturbaciones de la maquinaria de respuesta a detector de la cual depende el mantenimiento del equilibrio homeostático, pueden ser nocivas para la salud de seres humanos. El cáncer, la diabetes, la fibrosis quística y la enfermedad de Alzheimer, por ejemplo, se caracterizan por disfunciones de la regulación desencadenadas por agentes patógenos o mutaciones genéticas. Muchos virus oncogénicos elaboran proteína-tirosina cinasas que modifican los eventos reguladores que controlan los modelos de expresión de gen, lo que contribuye al inicio de cáncer y la progresión del mismo. La toxina de Vibrio cholerae, el agente causal del cólera, inhabilita vías de respuesta a detector en las células del epitelio intestinal al producir ADP-ribosilación de las proteínas de unión a GTP (proteínas G) que enlazan receptores de superficie celular a la adenilil ciclasa. La activación consiguiente de la ciclasa conduce al flujo irrestricto de agua hacia los intestinos, lo que da por resultado diarrea masiva y deshidratación. Yersinia pestis, el agente causal de la peste, elabora una proteína-tirosina fosfatasa que hidroliza grupos fosforilo en proteínas clave del citoesqueleto. Se cree que las disfunciones en los sistemas proteolíticos de los cuales depende la degradación de proteínas defectuosas o anormales, participan en enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer y la de Parkinson. Además de su función inmediata como reguladores de la actividad enzimática, la degradación de proteína, etc., las modificaciones covalentes, como la fosforilación, acetilación y ubiquitinación, proporcionan un código basado en proteína para el almacenamiento de información y la transmisión hereditaria de la misma (cap. 35). Esos sistemas de información dependientes de DNA se denominan epigenéticos. De esta manera, el conocimiento de los factores que controlan los índices de reacciones catalizadas por enzima es esencial para un entendimiento de la base molecular de la enfermedad y su transmisión. Este capítulo esboza los modelos mediante los cuales se controlan los procesos metabólicos y proporciona ejemplos ilustrativos. Los capítulos subsiguientes ofrecen más ejemplos.

Las enzimas que operan a su índice máximo no pueden mostrar respuesta a un aumento de la concentración de sustrato, y sólo pueden hacerlo a una disminución precipitada de la misma. En consecuencia, los valores de K_m para casi todas las enzimas tienden a ser cercanos a la concentración intracelular promedio de sus sustratos, de modo que los cambios de la concentración de sustrato generan cambios correspondientes del flujo de metabolitos (figura 9-1). Las respuestas a cambios de la concentración de sustrato representan un medio importante pero pasivo para coordinar el flujo de metabolitos y mantener la homeostasis en células quiescentes. Sin embargo, ofrecen un alcance limitado para mostrar respuesta a cambios en variables ambientales. A continuación se comentan los mecanismos que regulan la eficiencia de las enzimas de una manera activa en respuesta a señales internas y externas.

El flujo de metabolitos tiende a ser unidireccional

Pese a la existencia de oscilaciones a corto plazo de las concentraciones de metabolitos y de enzimas, las células vivas existen en un estado estable dinámico en el cual las concentraciones medias de intermediarios metabólicos permanecen relativamente constantes con el tiempo. Aun cuando todas las reacciones químicas son hasta cierto grado reversibles, en las células vivas los productos de reacción sirven como sustratos para —y son eliminados por— otras reacciones catalizadas por enzima (figura 9-2). De este modo, muchas reacciones nominalmente reversibles ocurren de manera unidireccional. Tal sucesión de reacciones metabólicas acopladas se acompaña de un cambio general de la energía libre que favorece el flujo unidireccional de metabolitos (cap. 11). El flujo unidireccional de metabolitos a través de una vía con un cambio negativo general grande en energía libre es análogo al flujo de agua a través de una tubería en la cual un extremo está más bajo que el otro. Las flexiones o los acodamientos en la tubería simulan pasos individuales catalizados por enzima con un cambio negativo o positivo pequeño de la energía libre. Empero, el flujo de agua a través de la tubería permanece unidireccional debido al cambio general de altura, que corresponde al cambio general de la energía libre en una vía (figura 9-3).

En eucariotas, las vías anabólicas y catabólicas que interconvierten productos comunes pueden tener lugar en compartimientos subcelulares específicos. Por ejemplo, muchas de las enzimas que degradan proteínas y polisacáridos residen dentro de organelos denominados lisosomas. De modo similar, la biosíntesis de ácidos grasos ocurre en el citosol, mientras que la oxidación de ácidos grasos tiene lugar dentro de las mitocondrias (caps. 22 y 23). La segregación de ciertas vías metabólicas dentro de tipos de células especializados puede proporcionar compartimentalización física adicional.

Afortunadamente, muchas vías al parecer antagonistas pueden coexistir en ausencia de barreras físicas, siempre y cuando la termodinámica dicte que cada una procede con la formación de uno o más intermediarios únicos. Para cualquier reacción o serie de reacciones, el cambio de la energía libre que tiene lugar cuando el flujo de metabolitos procede en la dirección “anterógrada” es de igual magnitud pero de signo opuesto al que se requiere para proceder en la dirección inversa. Algunas enzimas dentro de estas vías catalizan reacciones, como isomerizaciones, que pueden actuar como catalíticos bidireccionales in vivo porque la diferencia de energía libre entre sustratos y productos es cercana a cero. Sin embargo, representan la excepción más que la regla. Casi todas las vías metabólicas proceden por medio de uno o más pasos para los cuales ΔG es importante. Por ejemplo, la glucólisis, la desintegración de glucosa para formar dos moléculas de piruvato, tiene un ΔG general favorable de –96 kJ/mol, un valor demasiado grande para simplemente operar en “reversa” cuando se desea convertir piruvato excesivo en glucosa. En consecuencia, la gluconeogénesis procede por medio de una vía en la cual los tres pasos más energéticamente desfavorecidos de la glucólisis son remplazados por reacciones nuevas catalizadas por enzimas separadas (cap. 20).

La capacidad de las enzimas para distinguir entre las coenzimas similares desde el punto de vista estructural NAD+ y NADP+ también da lugar a una forma de compartimentalización. Las formas reducidas de ambas coenzimas no son fácilmente distinguibles. Sin embargo, las reacciones que generan y más tarde consumen electrones que están destinados para la generación de ATP están segregadas en el NADH, lejos de las que se usan en los pasos reductivos de muchas vías biosintéticas, que son portadas por el NADPH.

El control de una enzima que cataliza una reacción limitante regula una vía metabólica completa

Si bien el flujo de metabolitos a través de vías metabólicas incluye catálisis por muchas enzimas, el control activo de la homeostasis se logra por medio de regulación de únicamente un subgrupo selecto de estas enzimas. La enzima ideal para intervención reguladora es aquella cuya cantidad o eficiencia catalítica dicta que la reacción que cataliza sea lenta en comparación con todas las otras en la vía. Por ende, el decremento de la eficiencia catalítica o de la cantidad del catalítico para la reacción limitante de la velocidad reduce de inmediato el flujo de metabolitos por toda la vía. A la inversa, un incremento de su cantidad o eficiencia catalítica aumenta el flujo a través de la vía en conjunto. Por ejemplo, la acetil-CoA carboxilasa cataliza la síntesis de malonil-CoA, la primera reacción comprometida de la biosíntesis de ácidos grasos (cap. 23). Cuando se inhibe la síntesis de malonil-CoA, las reacciones subsiguientes de la síntesis de ácidos grasos cesan por falta de sustratos. Como “rectoras” naturales del flujo metabólico, las enzimas que catalizan pasos limitantes constituyen blancos eficientes para intervención reguladora mediante fármacos. Así, por ejemplo, los fármacos “estatina” reducen la síntesis de colesterol al inhibir la HMG-CoA reductasa, que cataliza la reacción limitante de la colesterogénesis.

La capacidad catalítica de la reacción limitante en una vía metabólica es el producto de la concentración de moléculas de enzima y su eficiencia catalítica intrínseca. Por ende, resulta que la capacidad catalítica puede influir tanto al cambiar la cantidad de enzima presente como al alterar su eficiencia catalítica intrínseca.

Las proteínas se sintetizan y degradan de manera continua

Al medir los índices de incorporación de los aminoácidos ¹⁵N marcados hacia proteínas, y los índices de pérdida de ¹⁵N desde proteína, Schoenheimer dedujo que las proteínas del cuerpo se encuentran en un estado de “equilibrio dinámico” en el cual se están sintetizando y degradando de manera continua, proceso llamado recambio de proteína. Esto sigue siendo válido incluso para las proteínas que están presentes a una concentración de estado estable en esencia constante, o constitutiva. Por otro lado, las concentraciones de muchas enzimas están influidas por una amplia gama de factores fisiológicos, hormonales o de la dieta.

La cantidad absoluta de una enzima refleja el balance neto entre sus índices de síntesis y de degradación. En seres humanos, las alteraciones de las cifras de enzimas específicas pueden estar afectadas por un cambio de la constante de índice para los procesos generales de síntesis (k_s), degradación (k_deg), o ambos.

Control de la síntesis de enzima

La síntesis de ciertas enzimas depende de la presencia de inductores, típicamente sustratos o compuestos relacionados desde el punto de vista estructural que estimulan la transcripción del gen que las codifica (caps. 36 y 37). Por ejemplo, Escherichia coli cultivada en glucosa sólo cataboliza lactosa luego de adición de un β-galactósido, un inductor que inicia la síntesis de una beta-galactosidasa y una galactósido permeasa (figura 38-3). Las enzimas inducibles de seres humanos comprenden la triptófano pirrolasa, treonina deshidratasa, tirosina-α-cetoglutarato aminotransferasa, enzimas del ciclo de la urea, HMG-CoA reductasa y citocromo P450. A la inversa, un exceso de un metabolito puede restringir la síntesis de su enzima cognada por medio de represión. Tanto la inducción como la represión implican elementos cis, secuencias de DNA específicas localizadas torrente arriba de genes regulados, y proteínas reguladoras que transactúan. Los mecanismos moleculares de la inducción y represión se comentan en el capítulo 38. La síntesis de otras enzimas puede estimularse mediante la interacción de hormonas y otras señales extracelulares con receptores de superficie específicos de célula. En el capítulo 42 se presenta información detallada sobre el control de la síntesis de proteína en respuesta a estímulos hormonales.

Control de la degradación de enzima

En animales, muchas proteínas se degradan por medio de la vía de la ubiquitina-proteasoma, cuyo descubrimiento les valió un Premio Nobel a Aaron Ciechanover, Avram Hershko e Irwin Rose. La degradación ocurre en el proteasoma 26S, un complejo macromolecular grande constituido por más de 30 subunidades polipeptídicas dispuestas en forma de cilindro hueco. Los sitios activos de sus subunidades proteolíticas miran hacia el interior del cilindro, lo que impide degradación indiscriminada de proteínas celulares. Las proteínas se dirigen hacia el interior del proteasoma mediante “ubiquitinación”, la fijación covalente de una o más moléculas de ubiquitina; esta última es una proteína pequeña, de alrededor de 75 residuos, que está muy conservada entre eucariotas. La ubiquitinación es catalizada por una familia grande de enzimas denominadas ligasas E3, que fijan ubiquitina al grupo amino de cadena lateral de residuos lisilo.

La vía de la ubiquitina-proteasoma se encarga tanto de la degradación regulada de proteínas celulares seleccionadas (p. ej., ciclinas, cap. 35), como de la eliminación de especies proteínicas defectuosas o aberrantes. La clave para la versatilidad y selectividad del sistema de ubiquitina-proteasoma reside tanto en la variedad de las ligasas E3 intracelulares, como en su capacidad para distinguir entre diferentes estados físicos o conformacionales de una proteína blanco. De este modo, la vía de la ubiquitina-proteasoma puede degradar de manera selectiva proteínas cuya integridad física y competencia funcional han quedado comprometidas por la pérdida de un grupo prostético o por daño del mismo, oxidación de residuos cisteína o histidina, o desaminación de residuos asparagina o glutamina. El reconocimiento por enzimas proteolíticas también puede ser regulado por modificaciones covalentes, como fosforilación; unión de sustratos o de efectores alostéricos, o asociación con membranas, oligonucleótidos u otras proteínas. Cada vez más pruebas sugieren que las disfunciones de la vía de ubiquitina-proteasoma contribuyen a la acumulación de especies proteínicas plegadas de modo aberrante, características de varias enfermedades neurodegenerativas.

En seres humanos, la inducción de síntesis de proteína es un proceso complejo, de múltiples pasos, que típicamente requiere horas para producir cambios importantes de la concentración de enzima general. En contraste, los cambios de la eficiencia catalítica intrínseca por unión de ligandos disociables (regulación alostérica) o por modificación covalente logran regulación de la actividad enzimática en segundos. En consecuencia, los cambios en la concentración de proteína suelen dominar cuando se encuentran requerimientos adaptativos a largo plazo, mientras que los cambios de la eficiencia catalítica son más idóneos para alteraciones rápidas y transitorias del flujo de metabolitos.

Inhibición por retroacción se refiere al proceso mediante el cual el producto terminal de una vía biosintética de múltiples pasos se une a, e inhibe, una enzima que cataliza uno de los primeros pasos de esa vía. En el ejemplo que sigue, para la biosíntesis de D a partir de A, catalizada por las enzimas Enz₁ a Enz₃:

la concentración alta de D inhibe la conversión de A en B. En este ejemplo, el inhibidor por retroacción D actúa como un efector alostérico negativo de Enz₁. Sobreviene inhibición, no por el “respaldo” de intermediarios, sino por la capacidad de D para unirse a Enz₁ e inhibirla. Por lo general D se une en un sitio alostérico, distinto desde el punto de vista espacial del sitio catalítico de la enzima blanco. Así, los inhibidores por retroacción típicamente tienen poca o ninguna similitud estructural con los sustratos de las enzimas que inhiben, por ejemplo, el NAD⁺ y 3-fosfoglicerato, los sustratos para la 3-fosfoglicerato deshidrogenasa, que cataliza el primer paso comprometido de la biosíntesis de serina, no se parecen al inhibidor por retroacción serina. En vías biosintéticas ramificadas, como las que se encargan de la biosíntesis de nucleótidos (cap. 33), las reacciones iniciales proporcionan intermediarios requeridos para la síntesis de múltiples productos terminales. En la figura 9-4 se muestra una vía biosintética ramificada hipotética en la cual las flechas curvas van desde los inhibidores por retroacción hacia las enzimas cuya actividad inhiben. Las secuencias S₃ → A, S₄ → B, S₄ → C y S₃ → → D, representan, cada una, secuencias de reacción lineal que son inhibidas por retroacción por sus productos finales. Así, las enzimas de punto de ramificación pueden direccionarse para dirigir el flujo de metabolitos.

Los inhibidores por retroacción típicamente inhiben el primer paso comprometido en una secuencia biosintética particular. La cinética de inhibición por retroacción puede ser competitiva, no competitiva, parcialmente competitiva, o mixta. La actividad escalonada de múltiples asas de retroacción puede proporcionar control fino adicional. Por ejemplo, la presencia de producto B excesivo disminuye el requerimiento del sustrato S₂ (figura 9-5). Sin embargo, S₂ también se requiere para la síntesis de A, C y D. De este modo, para esta vía, el exceso de B restringe la síntesis de los cuatro productos terminales, al margen de la necesidad de los otros tres. Para sortear esta dificultad potencial, cada producto terminal sólo puede inhibir de manera parcial la actividad catalítica. El efecto de un exceso de dos o más productos terminales puede ser estrictamente aditivo o, de modo alternativo, mayor que su efecto individual (inhibición por retroacción cooperativa).

La aspartato transcarbamoilasa (ATCasa) es una enzima alostérica modelo

La ATCasa, el catalítico para la primera reacción singular para la biosíntesis de pirimidina (figura 33-9), es un blanco de regulación por retroacción por dos nucleótidos trifosfato de citidina (CTP) y trifosfato de adenosina (ATP). El CTP, un producto terminal de la vía biosintética de pirimidina, inhibe la ATCasa, mientras que el nucleótido de purina ATP la activa. Además, las concentraciones altas de ATP pueden superar la inhibición por CTP, lo que permite que la síntesis de nucleótidos pirimidina proceda cuando las concentraciones de nucleótido purina están altas.

Los sitios alostérico y catalítico están separados espacialmente

Jacques Monod propuso la existencia de sitios alostéricos que son físicamente distintos del sitio catalítico. Razonó que la falta de similitud estructural entre un inhibidor por retroacción y el o los sustratos para la enzima cuya actividad regula indicó que estos efectores no son isostéricos con un sustrato, sino alostéricos (“ocupan otro espacio”). Así, las enzimas alostéricas son aquellas para las cuales la catálisis en el sitio activo puede modularse mediante la presencia de efectores en un sitio alostérico. Desde entonces, la existencia de sitios activo y alostérico separados espacialmente se ha verificado en varias enzimas usando muchas líneas de evidencia. Por ejemplo, la cristalografía con rayos X reveló que la ATCasa de E. coli consta de seis subunidades catalíticas y seis subunidades reguladoras, de las cuales estas últimas se unen a los nucleótido trifosfatos que modulan la actividad. En general, la unión de un regulador alostérico induce un cambio conformacional en la enzima que abarca el sitio activo.

Los efectos alostéricos pueden ocurrir sobre K_m o sobre V_máx

Hacer referencia a la cinética de la inhibición alostérica como “competitiva” o “no competitiva” con sustrato conlleva implicaciones mecanicistas desorientadoras. En lugar de eso se hace referencia a dos clases de enzimas reguladas alostéricamente: de la serie K y de la serie V. Para las enzimas alostéricas de la serie K, la cinética de saturación de sustrato es competitiva en el sentido de que K_m está incrementada sin un efecto sobre V_máx. Para enzimas alostéricas de la serie V, el inhibidor alostérico disminuye V_máx sin afectar la K_m. Las alteraciones de K_m o V_máx a menudo se producen por cambios conformacionales en el sitio catalítico inducidos por unión del efector alostérico en su sitio. Para una enzima alostérica de la serie K, este cambio conformacional puede debilitar los enlaces entre sustrato y residuos de unión a sustrato. Para una enzima alostérica de la serie V, el efecto primario puede ser alterar la orientación o la carga de residuos catalíticos, lo que genera un decremento de la V_máx. Aun así, como consecuencia de estos cambios conformacionales, pueden observarse efectos intermedios sobre K_m y V_máx.

En células tanto de mamífero como de bacterias, algunos productos terminales producen “retroacción” de su propia síntesis, y la controlan, en muchos casos por medio de inhibición por retroacción de una enzima biosintética temprana. Comoquiera que sea, es necesario distinguir entre regulación por retroacción, término fenomenológico desprovisto de inferencias mecanicistas, e inhibición por retroacción, mecanismo para la regulación de la actividad enzimática. Por ejemplo, si bien el colesterol de la dieta aminora la síntesis hepática de colesterol, esta regulación por retroacción no incluye inhibición por retroacción. La HMG-CoA reductasa, la enzima limitante de la colesterogénesis, queda afectada, pero el colesterol no inhibe por retroacción su actividad. De hecho, la regulación en respuesta al colesterol de la dieta comprende restricción por el colesterol o por un metabolito del colesterol, de la expresión del gen que codifica para HMG-CoA reductasa (represión de enzima) (cap. 26).

Los impulsos nerviosos —y la unión de muchas hormonas a receptores de superficie celular— desencadenan cambios del índice de reacciones catalizadas por enzima dentro de células blanco, al inducir liberación o síntesis de efectores alostéricos especializados llamados segundos mensajeros. El mensajero primario, o “primer mensajero”, es la molécula de hormona o el impulso nervioso. Los segundos mensajeros incluyen 3ʹ,5ʹ-cAMP, sintetizado a partir de ATP por la enzima adenilil ciclasa en respuesta a la hormona adrenalina, y Ca²⁺, que se almacena dentro del retículo endoplásmico de casi todas las células. La despolarización de membrana originada por un impulso nervioso abre un canal de membrana que libera ion calcio hacia el citoplasma, donde se unen a enzimas comprendidas en la regulación de la contracción muscular y la movilización de glucosa almacenada desde glucógeno, y las activan. La glucosa después satisface las demandas de energía aumentadas de la contracción muscular. Otros segundos mensajeros incluyen el 3ʹ,5ʹ-cGMP, óxido nítrico y los polifosfoinositoles, producidos por la hidrólisis de inositol fosfolípidos por fosfolipasas reguladas por hormona. En los capítulos 19, 42 y 48 hay ejemplos específicos de la participación de segundos mensajeros en la regulación de procesos celulares.

En células de mamífero, ocurre un amplio rango de modificaciones covalentes reguladoras. La proteólisis parcial y la fosforilación, por ejemplo, se emplean a menudo para regular la actividad catalítica de enzimas. Por otro lado, las histonas y otras proteínas de unión a DNA en la cromatina están sujetas a modificación extensa mediante acetilación, metilación, ribosilación de ADP, así como fosforilación. Estas últimas modificaciones, que modulan la manera en la cual las proteínas dentro de la cromatina interactúan entre sí, así como el DNA mismo, constituyen la base para el “código de histona”. Los cambios resultantes de la estructura de la cromatina dentro de la región afectada pueden hacer a los genes más accesibles a la proteína que se encarga de su transcripción, lo que aumenta la expresión de gen o, a mayor escala, facilita la replicación de todo el genoma (cap. 38). Por otro lado, se dice que los cambios de la estructura de la cromatina que restringen la accesibilidad de genes a factores de transcripción, RNA polimerasas dependientes de DNA, etc., lo que inhibe la transcripción, silencian la expresión de gen.

El código de histona representa un ejemplo clásico de epigenética, la transmisión hereditaria de información por un medio que no es la secuencia de nucleótidos que forman el genoma. En este caso, el patrón de expresión de gen dentro de una célula “hija” recién formada estará determinado, en parte, por el grupo particular de modificaciones covalentes de histona comprendidas en las proteínas de cromatina heredadas desde la célula “progenitora”.

La acetilación, la ADP-ribosilación, la metilación y la fosforilación son ejemplos de modificaciones covalentes “reversibles”. En este caso, reversible se refiere al hecho de que la proteína modificada puede restituirse a su estado original, libre de modificación. Sin embargo, no se refiere a los mecanismos mediante los cuales tiene lugar esa restitución. La termodinámica dicta que la reacción catalizada por enzimas mediante la cual se introdujo la modificación es termodinámicamente favorable, el cambio de energía libre involucrado en simplemente tratar de correr la reacción en reversa será desfavorable. La fosforilación de proteínas en residuos serilo, treonilo o tirosilo, catalizada por proteína cinasas, es favorecida termodinámicamente como consecuencia de utilizar el grupo fosforilo gamma de alta energía del ATP. Los grupos fosfato son eliminados, no al combinar el fosfato con ADP para formar ATP, sino por medio de una reacción hidrolítica catalizada por enzimas llamadas proteína fosfatasas. De modo similar, en las acetiltransferasas se emplea un sustrato donador de alta energía, el NAD⁺, mientras que las desacetilasas catalizan una hidrólisis directa que genera acetato libre.

Dado que la barrera entrópica alta evita la reunificación de las dos porciones de una proteína producida por hidrólisis de un enlace peptídico, la proteólisis constituye una modificación fisiológicamente irreversible. Una vez que una proteína es activada, seguirá llevando a cabo sus funciones catalíticas o de otros tipos en tanto no sea eliminada por degradación o algún otro medio. Así, la activación de zimógeno representa un mecanismo sencillo y económico, aunque unidireccional, para restringir la actividad latente de una proteína en tanto se encuentran las circunstancias apropiadas. Por ende, no sorprende que se emplee con frecuencia proteólisis parcial para regular proteínas que funcionan en el tubo digestivo o en el torrente sanguíneo más que en el interior de células.

Ciertas proteínas son sintetizadas y secretadas como proteínas precursoras inactivas conocidas como proproteínas. La proteólisis selectiva o parcial convierte una proproteína por medio de uno o más “cortes” proteolíticos sucesivos en una forma que muestra la actividad característica de la proteína madura, por ejemplo, su actividad catalítica. Las formas proproteínas de enzimas son llamadas proenzimas o zimógenos. Las proteínas sintetizadas como proproteínas son la hormona insulina (proproteína = proinsulina), las enzimas digestivas pepsina, tripsina y quimotripsina (proproteínas = pepsinógeno, tripsinógeno y quimotripsinógeno, respectivamente), varios factores de las cascadas de coagulación de la sangre y de disolución de coágulo de sangre (cap. 51), y la proteína del tejido conjuntivo colágeno (proproteína = procolágeno).

Las proenzimas facilitan la movilización rápida de una actividad en respuesta a demanda fisiológica

La síntesis y secreción de proteasas como proenzimas inactivas en el aspecto catalítico, protege al tejido de origen (p. ej., el páncreas) contra autodigestión, como puede ocurrir en la pancreatitis. Ciertos procesos fisiológicos como la digestión son intermitentes, pero bastante regulares y predecibles en cuanto a frecuencia. Otros, como la formación de coágulo de sangre, la disolución de coágulo y la reparación de tejido, sólo se ponen en marcha en respuesta a necesidad fisiológica o fisiopatológica apremiante. Está claro que los procesos de formación de coágulo de sangre y de disolución del mismo deben estar coordinados de modo temporal para lograr la homeostasis. Las enzimas necesarias de manera intermitente pero con rapidez a menudo se secretan en una forma inicialmente inactiva puesto que el proceso de secreción o la síntesis nueva de las proteínas requeridas podría ser insuficientemente rápido para responder a una demanda fisiopatológica apremiante, como la pérdida de sangre (cap. 51).

La activación de la proquimotripsina requiere proteólisis selectiva

La proteólisis selectiva comprende uno o más cortes proteolíticos muy específicos que pueden o no acompañarse de separación de los péptidos resultantes. Lo que es más importante, la proteólisis selectiva suele originar cambios conformacionales que “crean” el sitio catalítico de una enzima. Note que aun cuando los residuos His 57 y Asp 102 catalíticamente esenciales residen en el péptido B de la α-quimotripsina, Ser 195 reside en el péptido C (figura 9-6). Los cambios conformacionales que acompañan a la proteólisis selectiva de la proquimotripsina (quimotripsinógeno) alinean los tres residuos de la red de transmisión de carga (figura 7-7), lo que forma el sitio catalítico. Note también que los residuos de contacto y catalítico pueden estar ubicados en diferentes cadenas peptídicas, pero aún estar dentro de la distancia formadora de enlace de sustrato unido.

Las proteínas de mamífero son los blancos de una amplia gama de procesos de modificación covalente. Las modificaciones como prenilación, glucosilación, hidroxilación y acilación de ácido graso introducen características estructurales singulares en proteínas recién sintetizadas, que tienden a persistir durante toda la vida de la proteína. Entre las modificaciones covalentes que regulan la función de proteína (p. ej., metilación, acetilación), la más frecuente con mucho es la fosforilación-desfosforilación. Las proteína cinasas fosforilan proteínas al catalizar la transferencia del grupo fosforilo terminal de ATP hacia los grupos hidroxilo de residuos serilo, treonilo o tirosilo, lo que forma residuos O-fosfoserilo, O-fosfotreonilo, u O-fosfotirosilo, respectivamente (figura 9-7). Algunas proteína cinasas se dirigen hacia las cadenas laterales de residuos histidilo, lisilo, arginilo y aspartilo. La forma no modificada de la proteína puede regenerarse mediante eliminación hidrolítica de grupos fosforilo, catalizada por proteína fosfatasas.

Una célula de mamífero característica posee miles de proteínas fosforiladas y varios cientos de proteína cinasas y proteína fosfatasas que catalizan su interconversión. La facilidad de interconversión de enzimas entre sus formas fosfo- y desfosfo- explica, en parte, la frecuencia con la cual la fosforilación-desfosforilación se utiliza como un mecanismo para el control regulatorio. La fosforilación-desfosforilación permite alterar las propiedades funcionales de la enzima afectada sólo durante el tiempo que satisfaga una necesidad específica. Una vez que la necesidad ha desaparecido, la enzima puede convertirse de regreso a su forma original, preparada para responder al siguiente evento estimulador. Un segundo factor que fundamenta el uso difundido de fosforilación-desfosforilación de proteínas yace en las propiedades químicas del grupo fosforilo mismo. Para alterar las propiedades funcionales de una enzima, resulta necesario que cualquier modificación de su estructura química influya sobre la configuración tridimensional de la proteína. La densidad de carga alta de grupos fosforilo unidos a proteína, en general –2 a pH fisiológico, y su propensión a formar fuertes puentes salinos con residuos arginilo y lisilo, hacen de ellos potentes agentes para modificar la estructura y función de proteínas. La fosforilación regularmente influye sobre la eficiencia catalítica intrínseca de una enzima o sobre otras propiedades al inducir cambios conformacionales. Por tanto, los aminoácidos hacia los cuales se dirige la fosforilación pueden estar, y por lo general lo están, relativamente distantes del sitio catalítico en sí.

La modificación covalente regula el flujo de metabolitos

En muchos aspectos, los sitios de fosforilación de proteína y otras modificaciones covalentes pueden considerarse otra forma de sitio alostérico. De cualquier modo, en este caso, el “ligando alostérico” se une de modo covalente a la proteína. Tanto la fosforilación-desfosforilación como la inhibición por retroacción proporcionan regulación a corto plazo, fácilmente reversible, del flujo de metabolitos en respuesta a señales fisiológicas específicas. Ambas actúan sin alterar la expresión de gen. Las dos actúan sobre las primeras enzimas de una secuencia metabólica prolongada y a menudo biosintética, y ambas actúan en sitios alostéricos más que catalíticos. No obstante, la inhibición por retroacción involucra una sola proteína, y carece de características hormonales y neurales. En contraste, la regulación de enzimas de mamífero por fosforilación-desfosforilación comprende varias proteínas y ATP, y está bajo el control neural y hormonal directo.

La fosforilación-desfosforilación de proteína es un proceso muy versátil y selectivo. No todas las proteínas están sujetas a fosforilación; esta última sólo se dirige a uno, o un pequeño subgrupo, de los muchos grupos hidroxilo sobre la superficie de una proteína. Si bien la función enzimática afectada más a menudo es la eficiencia catalítica de la proteína, la fosforilación también puede alterar su ubicación dentro de la célula, la susceptibilidad a la degradación proteolítica, o la capacidad de respuesta a regulación por ligandos alostéricos. La fosforilación puede incrementar la eficiencia catalítica de una enzima, y convertirla en su forma activa en una proteína, mientras que la fosforilación de otra proteína la convierte en una forma intrínsecamente ineficiente, o inactiva (cuadro 9-1).

Muchas proteínas pueden fosforilarse en múltiples sitios. Otras están sujetas a regulación tanto por fosforilación-desfosforilación, como por la unión de ligandos alostéricos, o por fosforilación-desfosforilación y otra modificación covalente. La fosforilación-desfosforilación en cualquier sitio puede catalizarse por múltiples proteína cinasas o proteína fosfatasas. Muchas proteína cinasas y casi todas las proteína fosfatasas actúan sobre más de una proteína y se interconvierten entre formas activa e inactiva por la unión de segundos mensajeros o por modificación covalente por fosforilación-desfosforilación.

La interrelación entre proteína cinasas y proteína fosfatasas, entre las consecuencias funcionales de la fosforilación en diferentes sitios, entre sitios de fosforilación y sitios alostéricos, o entre sitios de fosforilación y otros sitios de modificación covalente, proporciona la base para redes reguladoras que integran múltiples informes de entrada ambientales para desencadenar una respuesta celular coordinada apropiada. En estas redes reguladoras complejas, enzimas individuales muestran respuesta a diferentes señales ambientales. Por ejemplo, si una enzima puede ser fosforilada en un sitio único por más de una proteína cinasa, puede ser convertida desde una forma catalíticamente eficiente hacia una ineficiente (inactiva), o viceversa, en respuesta a cualquiera de varias señales. Si la proteína cinasa es activada en respuesta a una señal diferente de la señal que activa la proteína fosfatasa, la fosfoproteína se convierte en un nodo de decisión. La salida funcional, generalmente actividad catalítica, refleja el estado de fosforilación. Dicho estado o grado de fosforilación está determinado por las actividades relativas de la proteína cinasa y la proteína fosfatasa, un reflejo de la presencia y de la fuerza relativa de las señales ambientales que actúan a través de cada una.

La capacidad de muchas proteína cinasas y proteína fosfatasas para dirigirse a más de una proteína proporciona un medio para una señal ambiental para regular de manera coordinada múltiples procesos metabólicos. Por ejemplo, las enzimas 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa y acetil-CoA carboxilasa —las enzimas controladoras para la biosíntesis de colesterol y ácido graso, respectivamente— son fosforiladas y desactivadas por la proteína cinasa activada por monofosfato de adenosina (AMP). Cuando esta proteína cinasa se activa sea mediante fosforilación por aun otra proteína cinasa o en respuesta a la unión de su activador alostérico 5ʹ-AMP, las dos vías principales de las cuales depende la síntesis de lípidos a partir de acetil-CoA quedan inhibidas.

Las células llevan a cabo una compleja gama de procesos metabólicos que deben regularse en respuesta a una amplia gama de factores ambientales. En consecuencia, las enzimas interconvertibles, y las enzimas de las cuales depende su interconversión no actúan como conmutadores de “encendido” y “apagado” aislados. Para satisfacer las demandas de mantener la homeostasis, estos bloques de construcción están enlazados para formar redes reguladoras integradas.

Un ejemplo bien estudiado de ese tipo de red es el ciclo de células eucarióticas que controla la división celular. Cuando emerge del estado quiescente, o G₀, el proceso en extremo complejo de división celular procede a través de una serie de fases específicas designadas G₁, S, G₂ y M (figura 9-8). Complejos sistemas de vigilancia, llamados puntos de control, evalúan indicadores clave de progreso para asegurar que ninguna fase del ciclo se inicie sino hasta que la fase previa esté completa. En la figura 9-8 se desglosa de modo simplificado parte del punto de control que regula el inicio de replicación de DNA, denominado la fase S. Una proteína cinasa llamada ATM se asocia con el genoma. Si el DNA contiene una rotura de doble cadena, el cambio resultante en la conformación de la cromatina activa a la ATM. En el momento de la activación, una subunidad del dímero de ATM activada se disocia e inicia una serie, o cascada, de eventos de fosforilación-desfosforilación de proteína mediados por las proteínas cinasas CHK1 y CHK2, proteína fosfatasa Cdc25 y, por último, un complejo entre una ciclina y una proteína cinasa dependiente de ciclina, o Cdk. La activación del complejo de Cdk/ciclina bloquea la transición de G₁ a S, lo que evita la replicación de DNA dañado. La falla en este punto de control puede llevar a mutaciones en el DNA que pueden conducir a cáncer u otras enfermedades. Cada paso en la cascada proporciona un conducto para vigilar indicadores adicionales del estado de la célula antes de entrar en la fase S.

• La homeostasis incluye mantener un ambiente intracelular y dentro de órganos relativamente constante pese a amplias fluctuaciones en el ambiente externo. Esto se logra por medio de cambios apropiados en los índices de reacciones bioquímicas en respuesta a necesidad fisiológica.

• Los sustratos para casi todas las enzimas por lo general están presentes a una concentración cercana a su K_m. Esto facilita el control pasivo de los índices de formación de producto en respuesta a cambios de las concentraciones de intermediarios metabólicos.

• El control activo del flujo de metabolitos comprende cambios de la concentración, la actividad catalítica, o ambos, de una enzima que cataliza una reacción limitante comprometida.

• La proteólisis selectiva de proenzimas inactivas desde el punto de vista catalítico, inicia cambios conformacionales que forman el sitio activo. La secreción como una proenzima inactiva facilita la movilización rápida de actividad en respuesta a lesión o necesidad fisiológica, y puede proteger al tejido de origen (p. ej., autodigestión por proteasas).

• La unión de metabolitos y segundos mensajeros a sitios distintos del sitio catalítico de enzimas desencadena cambios conformacionales que alteran la V_máx o la K_m.

• La fosforilación por proteína cinasas de residuos serilo, treonilo o tirosilo específicos —y la desfosforilación subsiguiente por proteína fosfatasas— regula la actividad de muchas enzimas de seres humanos. Las proteína cinasas y fosfatasas que participan en cascadas de regulación que responden a informes hormonales o de segundo mensajero, constituyen redes reguladoras que pueden procesar e integrar información ambiental compleja para producir una respuesta celular apropiada e integral.