Capítulo 3: Ácidos nucleicos

Las células son las unidades funcionales de cualquier organismo vivo. Las instrucciones necesarias para dirigir sus actividades están contenidas en los cromosomas, que en el caso de las eucariotas se localizan en el núcleo celular y son conocidas en su conjunto como información genética.

Los ácidos nucleicos constituyen el material genético de los organismos y son necesarios para el almacenamiento y la expresión de la información genética. Existen dos tipos de ácidos nucleicos química y estructuralmente distintos: el ácido desoxirribonucleico (ADN) y el ácido ribonucleico (ARN); ambos se encuentran en todas las células procariotas, eucariotas y virus. El ADN funciona como el almacén de la información genética y se localiza en los cromosomas del núcleo, las mitocondrias y los cloroplastos de las células eucariotas. En las células procariotas el ADN se encuentra en su único cromosoma y, de manera extracromosómica, en forma de plásmidos. El ARN interviene en la transferencia de la información contenida en el ADN hacia los compartimientos celulares. Se encuentra en el núcleo, el citoplasma, la matriz mitocondrial y el estroma de cloroplastos de células eucariotas y en el citosol de células procariotas.

Composición de los ácidos nucleicos

La unidad básica de los ácidos nucleicos es el nucleótido, una molécula orgánica compuesta por tres componentes:

1. Base nitrogenada, una purina o pirimidina.

2. Pentosa, una ribosa o desoxirribosa según el ácido nucleico.

3. Grupo fosfato, causante de las cargas negativas de los ácidos nucleicos y que le brinda características ácidas (figura 3-1).

Las bases nitrogenadas son moléculas formadas de átomos de carbono y nitrógeno que crean anillos heterocíclicos. Se conocen dos tipos de bases nitrogenadas: las purinas y las pirimidinas. Las purinas se componen de dos anillos condensados, mientras que las pirimidinas están formadas por un solo anillo. Los átomos de carbono y nitrógeno de los anillos se identifican mediante números naturales: del 1 al 6 para las pirimidinas y del 1 al 9 para las purinas (figura 3-2). Las purinas se sintetizan de novo en el hígado como mononucleótidos unidos con una molécula de ribosa 5-fosfato; las pirimidinas lo hacen como bases libres y después se unen a la ribosa 5-fosfato. Es importante mencionar que el recambio de ácidos nucleicos da lugar a la liberación de bases libres, tanto de purinas como pirimidinas; estas bases se reciclan y se unen a una pentosa y un grupo fosfato para generar de nuevo el nucleótido.

Las purinas características de los ácidos nucleicos son adenina (A) y guanina (G), ambas presentes en los nucleótidos del ADN y del ARN. Las pirimidinas características de los ácidos nucleicos son la citosina (C), la timina (T) y el uracilo (U). La C está presente en los nucleótidos que componen tanto al ADN como al ARN, mientras que la T sólo forma los nucleótidos que componen al ADN y el U, únicamente los nucleótidos que componen al ARN.

La pentosa que compone el nucleótido es la D-ribosa para el ARN y la D-desoxirribosa en el caso del ADN. Los nucleótidos que contienen ribosa se denominan ribonucleótidos, mientras que los que contienen desoxirribosa, desoxirribonucleótidos. Los carbonos de la pentosa se identifican en los nucleótidos mediante números del 1 al 5, con una comilla, y se denominan primos. La diferencia entre la ribosa y la desoxirribosa es que la primera posee un grupo OH en el carbono dos, mientras que la segunda carece de dicho grupo funcional y sólo cuenta con un hidrógeno (figura 3-3).

Nucleósidos

La unión de una base nitrogenada y la pentosa produce un nucleósido, mediante un enlace covalente denominado N-glucosídico que se forma entre el C-1’ de la pentosa y el N-1 de las pirimidinas o bien el N-9 de las purinas (figura 3-4). Si la base nitrogenada se une a una ribosa da lugar a los ribonucleósidos, y si, por el contrario, lo hace a una desoxirribosa genera los desoxirribonucleósidos.

Nucleótidos

La unión de un grupo fosfato a un nucleósido da lugar a una molécula de nucleósido monofosfato o nucleótido, como por ejemplo la adenosina monofosfato (AMP). Si se agrega un segundo o un tercer fosfato al nucleósido monofosfato se obtiene un nucleósido difosfato (como el ADP) o bien trifosfato (como el ATP). Los nucleósidos, en su forma de monofosfato, son los componentes de los ácidos nucleicos; aunque cuando se encuentran libres lo están en su forma trifosfatada. El primer fosfato se une al nucleósido mediante un enlace éster con el OH del carbono 5’ de la pentosa. El segundo y el tercer fosfatos se conectan con el nucleótido mediante un enlace fosfoanhídrido que requiere un gasto de energía para su formación. Químicamente, los nucleótidos pueden definirse como ésteres monofosfato, difosfato o trifosfato de nucleósidos. Los nucleótidos son moléculas ácidas, ya que el grupo fosfato se ioniza en medio acuoso. (Para la nomenclatura completa de las moléculas nucleotídicas véase el cuadro 3-1.)

Cadenas de ácidos nucleicos o polinucleótidos

Los nucleótidos se unen mediante enlaces fosfodiéster para dar lugar a cadenas de ácidos nucleicos o polinucleótidos. El enlace fosfodiéster tiene lugar entre el C-5’-fosfato de un nucleótido y el C-3’-hidroxilo del siguiente nucleótido. La unión sucesiva de nucleótidos mediante enlace 3,5-fosfodiéster genera un polinucleótido polarizado; es decir, con extremos diferentes. Por un lado de la cadena se encuentra un extremo 5’-fosfato y, por el otro, un extremo 3’-hidroxilo (figura 3-5). Si la cadena es de ribonucleótidos, se genera un polirribonucleótido o cadena de ARN, mientras que si la cadena se forma con desoxirribonucleótidos se origina un polidesoxirribonucleótido o cadena de ADN.

Los nucleótidos que constituyen las cadenas de ADN contienen las bases A, G, T y C; mientras que los nucleótidos que forman las cadenas de ARN están constituidos por las bases nitrogenadas A, G, C y U. Por consenso universal, la secuencia de nucleótidos en una cadena de polinucleótidos se escribe en dirección 5’ → 3’, y el orden exacto de nucleótidos o secuencia de la cadena se considera la estructura primaria de los ácidos nucleicos. El enlace fosfodiéster entre nucleótidos puede escindirse por las nucleasas: DNasas para el ADN y RNasas para el ARN.

Estructura primaria del ADN

Corresponde a la secuencia de nucleótidos del polinucleótido linearizado (figura 3-6). La información genética está contenida en el orden exacto de las bases nitrogenadas que componen los nucleótidos, y si se modifica alguna de estas bases o su orden se alterará la información.

Estructura secundaria del ADN

En células eucariotas el ADN se encuentra como una cadena doble de polidesoxirribonucleótidos (double strand DNA, dsADN). Las dos cadenas del ADN giran alrededor de un eje de simetría imaginario y forman una estructura helicoidal, de aquí su nombre de “doble hélice del ADN” descrita por Watson y Crick en 1953. En la hélice del ADN, la columna hidrofílica de desoxirribosa-fosfato de cada cadena está en el exterior de la molécula, mientras que las bases nitrogenadas hidrófobas se orientan hacia el interior. La relación espacial que se genera por el giro entre las dos cadenas de la hélice crea un surco mayor (ancho) y uno menor (estrecho) (figura 3-7). La doble cadena del ADN tiene tres características principales:

• Es antiparalela.

• Es complementaria.

• Forma un giro helicoidal dextrógiro o levógiro.

La asociación entre las dos cadenas es antiparalela; es decir, el extremo 5´ de una se asocia con el extremo 3’ de la otra. Las dos cadenas son complementarias; esto es, las bases nitrogenadas de una de las cadenas del ADN se unen mediante puentes de hidrógeno a las bases nitrogenadas de la otra cadena, de manera que A siempre se une a T, y G a C. Por lo tanto, la secuencia de nucleótidos de una cadena define y complementa la secuencia de nucleótidos en la otra. Así, una cadena de la doble hélice del ADN siempre es el complemento de la otra. Los pares de bases se mantienen unidos mediante dos enlaces de hidrógeno entre A y T, y tres enlaces de hidrógeno entre G y C (figura 3-8). El apareamiento específico de bases entre las cadenas de ADN sustenta las llamadas reglas de Chargaff: en cualquier muestra de ADN de cadena doble, la cantidad de A es igual a la cantidad de T, la cantidad de G es igual a la de C, y la cantidad de purinas es igual a la de pirimidinas.

Variantes de la doble cadena de ADN

Se han descrito tres formas estructurales principales del ADN: la forma B, descrita por Watson y Crick, la forma A y la forma Z. La forma B es la que adopta el ADN en condiciones fisiológicas, por lo que es la estructura predominante en el ADN cromosómico. La forma A se produce in vitro con la deshidratación moderada de la forma B. Es probable que la conformación de los híbridos ADN-ARN y del ARN de doble cadena se asemeje a la forma A. La forma Z del ADN es característica de regiones donde se encuentra una secuencia de purinas y pirimidinas alternadas (por ejemplo, zonas de repetición de GC). La función biológica del ADN-Z es poco comprendida, pero puede estar relacionada con la regulación de la expresión génica. Las características detalladas de cada una de las variantes se describen en el cuadro 3-2.

ADN circular

El ADN mitocondrial y el de células procariotas se encuentra en forma de molécula circular, sin extremos, donde no hay interrupción de los enlaces fosfodiéster. Es posible encontrar al ADN circular como una estructura relajada (figura 3-9A) o como una estructura superenrollada y más compacta, donde la hélice del ADN (ya enrollada) gira sobre sí misma (superenrollada) y genera una superhélice (figura 3-9B). El superenrollamiento se produce debido a la acción de las enzimas topoisomerasas, que mediante el corte transitorio de una o ambas hebras introducen un aumento o una disminución (superenrollamiento positivo o negativo, respectivamente) en el número de vueltas de hélice. El ADN circular superenrollado permite la compactación del ADN para que ocupe menor espacio en la células; también permite que posiciones lejanas en la secuencia se aproximen, y además regula la accesibilidad a la información genética y la expresión génica, al mantenerse inaccesible para los factores de transcripción.

Niveles de empaquetamiento del ADN

Debido a la longitud del ADN genómico en las células eucariotas (alrededor de 2 metros/célula) es necesaria su compactación, de manera que permita ocupar menos espacio y quepa dentro del núcleo de la célula. El ADN se asocia con nucleoproteínas (histonas y no-histonas) para formar la cromatina y dar origen a los cromosomas; por ello, en el empaquetamiento del ADN se distinguen diferentes niveles de organización, que se describen a continuación.

Nucleosoma

Las histonas son proteínas con carga positiva a pH fisiológico, debido a su alto contenido en aminoácidos básicos, como la lisina y la arginina. Esta propiedad les permite asociarse a la molécula de ADN de carga negativa (conferida por los grupos fosfato). Existen cinco tipos de histonas: H1, H2A, H2B, H3 y H4. Dos moléculas de histona H2A, H2B, H3 y H4 se asocian para formar un octámero de histonas. Un segmento de ADN de doble cadena de aproximadamente 146 pb se enrolla dando 1.6 vueltas al octámero para formar una estructura llamada nucleosoma. Los diferentes fragmentos de ADN presentes en el núcleo se asocian a diversos octámeros y forman una cadena de nucleosomas conocida como “cuentas de rosario” o “cuentas de collar” por su semejanza con estas estructuras al observarse en el microscopio electrónico. Entre cada nucleosoma queda un segmento de ADN de aproximadamente 55 pb denominado ADN enlace o linker (figura 3-10A). La función del nucleosoma es condensar el ADN en una fibra de 11 nm de ancho que se asemeja al mencionado collar de perlas, donde cada nucleosoma sería una perla y el ADN de enlace, el cordón con el cual están unidas estas perlas. El ADN linker se asocia, entonces, con otra histona denominada H1 y ayuda al empaquetamiento del ADN, lo que facilita la formación de otra estructura, llamada solenoide, que se describirá con detalle en la siguiente sección. El extremo aminoterminal de las histonas puede unirse de manera reversible a grupos acetilo, metilo o fosfato, lo que se conoce como modificaciones epigenéticas; la adición de estos grupos modifica la unión de las histonas al ADN y, por tanto, regula la disponibilidad de la información génica.

Solenoide

Los nucleosomas se compactan para formar un polinucleosoma de seis unidades mediante interacciones entre las H1 de cada nucleosoma, lo que genera una estructura más compacta. Esta estructura recibe el nombre de solenoide y forma una hebra de 30 nm, conocida como cromatina, en este nivel el ADN está compactado unas 100 veces. La cromatina puede encontrarse activa de forma transcripcional, por lo que se descompacta y entonces recibe el nombre de eucromatina. La cromatina inactiva se encuentra en su forma compacta y se la conoce como heterocromatina.

Asas cromatínicas

La fibra de 30 nm se pliega y condensa aún más, formando estructuras de asas amplias superenrolladas, las cuales se anclan sobre proteínas de andamiaje y dan lugar una hebra de 300 nm de grosor.

Cromosoma condensado

Las asas cromatínicas se compactan y forman un cromosoma condensado de 700 nm de espesor visible durante la interfase.

Cromosomas mitóticos

Las cromátides hermanas visibles en la mitosis representan la última etapa de la organización del ADN y llegan a medir 1 400 nm de grosor.

Los niveles de empaquetamiento del ADN se presentan esquematizados en la figura 3-10B.

Desnaturalización y renaturalización del ADN

La desnaturalización es la pérdida de la estructura helicoidal (estructura secundaria) característica de la molécula de ADN. El proceso de desnaturalización ocurre por la rotura de los puentes de hidrógeno entre las bases nitrogenadas, lo que ocasiona la separación de las dos cadenas antiparalelas sin que se altere la estructura primaria, ya que los enlaces fosfodiéster no resultan afectados.

La desnaturalización puede ocurrir por exposición de los ácidos nucleicos a agentes químicos o físicos, cambios de pH y enzimas.

Los agentes desnaturalizantes, como la urea, la formamida y el formaldehído, son altamente polares, con grupos amino y carbonilo que compiten con los grupos amino y carbonilo de las bases nitrogenadas en la formación de puentes de hidrógeno y dan lugar a la separación de las hebras. También un pH extremadamente alcalino o ácido puede desnaturalizar el ADN; sin embargo, este tratamiento puede dar lugar a la rotura de enlaces fosfodiéster, y por lo tanto, a la pérdida de la estructura primaria. La temperatura es el agente desnaturalizante más representativo: el calentamiento gradual del ADN hasta llegar a 100°C debilita las fuerzas estabilizadoras de la doble hélice, de forma que las dos hebras se desenrollan hasta su separación total. La temperatura de fusión (T_m) se define como la temperatura a la que se ha desnaturalizado el 50% de las moléculas de ADN de la muestra que se está calentando. La T_m representa el punto en que la energía aplicada es suficiente para romper la mitad de los puentes de hidrógeno que mantienen unidas las dos cadenas de la molécula de ADN. Una muestra de ADN con alto contenido de G y C tiene una mayor T_m en comparación con una con alto contenido de A y T. Esto se debe a que G y C están unidas con tres puentes de hidrógeno, a diferencia de A y T, que lo están por dos puentes de hidrógeno, por lo que para disociarlas se requiere una temperatura mayor. La pérdida de la estructura helicoidal del ADN puede vigilarse con la medición de su absorbancia a 260 nm, ya que el ADN de cadena sencilla tiene una absorbancia relativa mayor que el ADN de cadena doble en la misma longitud de onda.

Las topoisomerasas, las girasas y las helicasas son enzimas que pueden desenrollar (desnaturalizar) el ADN. Las topoisomerasas cortan una o ambas hebras del ADN, lo que provoca la relajación del superenrollamiento. Las girasas actúan desenrollando el ADN circular presente en las bacterias, y las helicasas se unen al ADN cerca de la horquilla de replicación, rompen los puentes de hidrógeno y catalizan la separación de las hebras mediante la energía liberada por hidrólisis de ATP.

El ADN desnaturalizado puede renaturalizarse si se retira gradualmente el agente desnaturalizante. Por ejemplo, si una solución de ADN desnaturalizada por calentamiento se enfría lentamente, las dos cadenas se vuelven a asociar por complementariedad de sus bases.

Es el ácido nucleico más abundante en la célula eucariota, donde suele ser 10 veces más abundante que el ADN.

En cuanto a su estructura tres características diferencian al ARN del ADN:

1. El ARN suele ser monocatenario (una sola cadena).

2. Contiene uracilo en lugar de timina.

3. La pentosa que constituye a sus nucleótidos es la ribosa, en lugar de la 2-desoxirribosa del ADN (la presencia del grupo hidroxilo en el C2´ de la ribosa provoca que el ARN sea una molécula químicamente inestable).

Estructura primaria del ARN

Al igual que en el ADN la estructura primaria del ARN está determinada por secuencia lineal de sus ribonucleótidos, que se escriben siempre en dirección 5’-3’ (figura 3-11A).

Estructura secundaria del ARN

La estructura secundaria está dada por el apareamiento de secuencias complementarias en la misma cadena de ARN (asociación intracatenaria parcial) o por asociaciones intercatenarias, en el caso de los ARN de doble cadena de ciertos virus. La complementariedad ocasional de bases en el ARN da origen a las estructuras de pasador (hairpin), formaciones típicas, en las cuales parte de la cadena de ARN es complementaria y origina puentes de hidrógeno entre ésta y la parte no complementaria da origen a un loop o asa de bases que no se unen como se aprecia en la figura 3-11B.

Estructura terciaria del ARN

La estructura terciaria del ARN no siempre se forma, sólo surge cuando las condiciones celulares propician la interacción entre bases nitrogenadas de diferentes regiones de una misma molécula de ARN. Los ARN de transferencia (ARNt) forman una estructura terciaria característica: en disolución están plegados en forma de “L” compacta estabilizada por apareamientos de bases convencionales y por interacciones entre las bases de más de dos nucleótidos, como los tripletes de bases (véase el capítulo 6). Las bases nitrogenadas pueden interactuar a través de los átomos de hidrógeno para unirse al esqueleto fosfodiéster de la cadena de ARN, o bien a través del OH del carbono 2’ de la ribosa, que actúa como un importante dador y aceptor de hidrógenos.

Tipos de ARN

Aunque químicamente son iguales, los ARN según la función que desempeñen en la célula se agrupan en:

ARN heterogéneo nuclear

Es un ARN también conocido como tránscrito primario, de alto peso molecular. Es el producto inicial de la síntesis de la ARN polimerasa en el proceso de transcripción. En el núcleo de las células eucariotas actúa como precursor de los demás tipos de ARN que se encuentran en el citoplasma. La fragmentación del ARNhn para formar otros tipos de ARN supone la maduración o el procesamiento del ARN (véase el capítulo 5). En las células procariotas, el tránscrito primario actúa directamente como molde para la síntesis de proteínas, sin necesidad de maduración o modificaciones postranscripcionales.

ARN mensajero (ARNm)

El ARNm sirve de molde para la síntesis de proteínas en el proceso de traducción, ya que contiene la información génica para la formación de uno o varios polipéptidos (véase el capítulo 6). El ARNm se localiza en el citoplasma, su longitud es variable según la proteína para la que codifique y contiene, además, las señales necesarias para el inicio y la terminación de la traducción. En eucariotes el ARNm presenta características especiales: en su extremo 5’ muestra una capucha (cap) y en su extremo 3’, una cadena de poliadeninas (cola poliA) de longitud variable (figura 3-12). Estas modificaciones tienen por objeto aumentar la vida media de esta molécula en el citoplasma y permitir su disponibilidad en el proceso de traducción proteica. La presencia de la cola de poliA en el extremo 3´ facilita su purificación cuando se emplea cromatografía en columna de afinidad, ya que forma híbridos con residuos de poliuridinas (poli U) unidos a una resina empaquetada en el interior de la columna.

ARN ribosomal (ARNr)

El ARNr forma parte de los ribosomas, estructuras intracelulares en que se realiza la síntesis de proteínas (figura 3-13). Sus estructuras secundaria y terciaria presentan un plegamiento complejo que le permite asociarse tanto a las proteínas de los ribosomas como a otros ARNr y participar en el proceso de síntesis proteica.

ARN de transferencia (ARNt)

Las moléculas de ARNt tienen entre 75 y 90 nucleótidos, y su peso molecular es de unos 2.5 kDa. Se conocen unos 32 ARNt distintos y se encuentran en todas las células. Éstos intervienen en la síntesis de proteínas, ya que van unidos a un aminoácido que liberarán en el ribosoma durante el proceso de traducción. Suelen presentar bases nitrogenadas inusuales, como la inosina, la dihidrouridina, etc., e incluso la timina. Su estructura secundaria presenta un plegamiento complejo donde se encuentran zonas con apareamiento de secuencias complementarias y otras sin apareamiento de secuencias complementarias, y en donde se pueden distinguir regiones críticas, como la de unión al aminoácido y el brazo donde se ubica la secuencia del anticodón que reconoce los codones del ARNm (figura 3-14).

ARN pequeño nuclear (ARNsn)

Es el ARN presente en el núcleo eucariote y está implicado en los procesos de maduración del ARNhn. En este proceso, el ARNsn se asocia a proteínas, formando las ribonucleoproteínas pequeñas nucleares (RNPsn) que se encargan de eliminar intrones (fragmentos de ARNhn que no aparecen en el ARNm) (véase el capítulo 5). Cuando las RNPsn se unen al precursor del ARNm para eliminar los intrones se forma un complejo ARN-proteína de gran tamaño, visible en el microscopio electrónico, y que recibe el nombre de espliciosoma (spliceosome).

Enzimas de ARN (ribozimas)

Estos ácidos ribonucleicos funcionan como catalizadores biológicos. Poseen, al igual que las enzimas, un sitio activo, uno de unión para el sustrato y uno de unión para un cofactor que puede ser un ion metálico. Los ARNsn involucrados en maduración del ARNhn son un ejemplo clásico de ribozimas.

siARN

Moléculas de ARN de doble cadena de 20 a 25 nucleótidos que a través de la vía de interferencia de ARN de células suprimen la expresión de un gen específico. El siARN se une a una secuencia complementaria del ARNm, la unión del siARN con el ARNm produce la degradación enzimática del ARNm en células eucariotas de mamíferos y plantas. Las descubrió el grupo de David Baulcombe en Inglaterra, en 1999, y originalmente los describieron como parte del mecanismo de regulación génica postranscripcional en plantas.

miARN

Se trata de moléculas de ARN de cadena sencilla de 21-23 nucleótidos en longitud encargadas de regular la expresión génica. Los miARN se unen a una secuencia complementaria del ARNm y bloquean la traducción. El miARN no es totalmente complementario a la secuencia del ARNm; en este caso, el ARNm no se degrada pero tampoco puede utilizarse para la síntesis de proteínas. Originalmente los describió el grupo de Victor Ambros en 1993 como small ARNs. El término micro-ARN fue introducido en 2001 por Ruvkun por la capacidad de los siARNs y miARNs para silenciar genes.