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Estructura primaria del ADN
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Corresponde a la secuencia de nucleótidos del polinucleótido linearizado (figura 3-6). La información genética está contenida en el orden exacto de las bases nitrogenadas que componen los nucleótidos, y si se modifica alguna de estas bases o su orden se alterará la información.
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Estructura secundaria del ADN
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En células eucariotas el ADN se encuentra como una cadena doble de polidesoxirribonucleótidos (double strand DNA, dsADN). Las dos cadenas del ADN giran alrededor de un eje de simetría imaginario y forman una estructura helicoidal, de aquí su nombre de “doble hélice del ADN” descrita por Watson y Crick en 1953. En la hélice del ADN, la columna hidrofílica de desoxirribosa-fosfato de cada cadena está en el exterior de la molécula, mientras que las bases nitrogenadas hidrófobas se orientan hacia el interior. La relación espacial que se genera por el giro entre las dos cadenas de la hélice crea un surco mayor (ancho) y uno menor (estrecho) (figura 3-7). La doble cadena del ADN tiene tres características principales:
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La asociación entre las dos cadenas es antiparalela; es decir, el extremo 5´ de una se asocia con el extremo 3’ de la otra. Las dos cadenas son complementarias; esto es, las bases nitrogenadas de una de las cadenas del ADN se unen mediante puentes de hidrógeno a las bases nitrogenadas de la otra cadena, de manera que A siempre se une a T, y G a C. Por lo tanto, la secuencia de nucleótidos de una cadena define y complementa la secuencia de nucleótidos en la otra. Así, una cadena de la doble hélice del ADN siempre es el complemento de la otra. Los pares de bases se mantienen unidos mediante dos enlaces de hidrógeno entre A y T, y tres enlaces de hidrógeno entre G y C (figura 3-8). El apareamiento específico de bases entre las cadenas de ADN sustenta las llamadas reglas de Chargaff: en cualquier muestra de ADN de cadena doble, la cantidad de A es igual a la cantidad de T, la cantidad de G es igual a la de C, y la cantidad de purinas es igual a la de pirimidinas.
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Variantes de la doble cadena de ADN
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Se han descrito tres formas estructurales principales del ADN: la forma B, descrita por Watson y Crick, la forma A y la forma Z. La forma B es la que adopta el ADN en condiciones fisiológicas, por lo que es la estructura predominante en el ADN cromosómico. La forma A se produce in vitro con la deshidratación moderada de la forma B. Es probable que la conformación de los híbridos ADN-ARN y del ARN de doble cadena se asemeje a la forma A. La forma Z del ADN es característica de regiones donde se encuentra una secuencia de purinas y pirimidinas alternadas (por ejemplo, zonas de repetición de GC). La función biológica del ADN-Z es poco comprendida, pero puede estar relacionada con la regulación de la expresión génica. Las características detalladas de cada una de las variantes se describen en el cuadro 3-2.
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El ADN mitocondrial y el de células procariotas se encuentra en forma de molécula circular, sin extremos, donde no hay interrupción de los enlaces fosfodiéster. Es posible encontrar al ADN circular como una estructura relajada (figura 3-9A) o como una estructura superenrollada y más compacta, donde la hélice del ADN (ya enrollada) gira sobre sí misma (superenrollada) y genera una superhélice (figura 3-9B). El superenrollamiento se produce debido a la acción de las enzimas topoisomerasas, que mediante el corte transitorio de una o ambas hebras introducen un aumento o una disminución (superenrollamiento positivo o negativo, respectivamente) en el número de vueltas de hélice. El ADN circular superenrollado permite la compactación del ADN para que ocupe menor espacio en la células; también permite que posiciones lejanas en la secuencia se aproximen, y además regula la accesibilidad a la información genética y la expresión génica, al mantenerse inaccesible para los factores de transcripción.
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Niveles de empaquetamiento del ADN
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Debido a la longitud del ADN genómico en las células eucariotas (alrededor de 2 metros/célula) es necesaria su compactación, de manera que permita ocupar menos espacio y quepa dentro del núcleo de la célula. El ADN se asocia con nucleoproteínas (histonas y no-histonas) para formar la cromatina y dar origen a los cromosomas; por ello, en el empaquetamiento del ADN se distinguen diferentes niveles de organización, que se describen a continuación.
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Las histonas son proteínas con carga positiva a pH fisiológico, debido a su alto contenido en aminoácidos básicos, como la lisina y la arginina. Esta propiedad les permite asociarse a la molécula de ADN de carga negativa (conferida por los grupos fosfato). Existen cinco tipos de histonas: H1, H2A, H2B, H3 y H4. Dos moléculas de histona H2A, H2B, H3 y H4 se asocian para formar un octámero de histonas. Un segmento de ADN de doble cadena de aproximadamente 146 pb se enrolla dando 1.6 vueltas al octámero para formar una estructura llamada nucleosoma. Los diferentes fragmentos de ADN presentes en el núcleo se asocian a diversos octámeros y forman una cadena de nucleosomas conocida como “cuentas de rosario” o “cuentas de collar” por su semejanza con estas estructuras al observarse en el microscopio electrónico. Entre cada nucleosoma queda un segmento de ADN de aproximadamente 55 pb denominado ADN enlace o linker (figura 3-10A). La función del nucleosoma es condensar el ADN en una fibra de 11 nm de ancho que se asemeja al mencionado collar de perlas, donde cada nucleosoma sería una perla y el ADN de enlace, el cordón con el cual están unidas estas perlas. El ADN linker se asocia, entonces, con otra histona denominada H1 y ayuda al empaquetamiento del ADN, lo que facilita la formación de otra estructura, llamada solenoide, que se describirá con detalle en la siguiente sección. El extremo aminoterminal de las histonas puede unirse de manera reversible a grupos acetilo, metilo o fosfato, lo que se conoce como modificaciones epigenéticas; la adición de estos grupos modifica la unión de las histonas al ADN y, por tanto, regula la disponibilidad de la información génica.
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Los nucleosomas se compactan para formar un polinucleosoma de seis unidades mediante interacciones entre las H1 de cada nucleosoma, lo que genera una estructura más compacta. Esta estructura recibe el nombre de solenoide y forma una hebra de 30 nm, conocida como cromatina, en este nivel el ADN está compactado unas 100 veces. La cromatina puede encontrarse activa de forma transcripcional, por lo que se descompacta y entonces recibe el nombre de eucromatina. La cromatina inactiva se encuentra en su forma compacta y se la conoce como heterocromatina.
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La fibra de 30 nm se pliega y condensa aún más, formando estructuras de asas amplias superenrolladas, las cuales se anclan sobre proteínas de andamiaje y dan lugar una hebra de 300 nm de grosor.
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Las asas cromatínicas se compactan y forman un cromosoma condensado de 700 nm de espesor visible durante la interfase.
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Las cromátides hermanas visibles en la mitosis representan la última etapa de la organización del ADN y llegan a medir 1 400 nm de grosor.
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Los niveles de empaquetamiento del ADN se presentan esquematizados en la figura 3-10B.
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Desnaturalización y renaturalización del ADN
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La desnaturalización es la pérdida de la estructura helicoidal (estructura secundaria) característica de la molécula de ADN. El proceso de desnaturalización ocurre por la rotura de los puentes de hidrógeno entre las bases nitrogenadas, lo que ocasiona la separación de las dos cadenas antiparalelas sin que se altere la estructura primaria, ya que los enlaces fosfodiéster no resultan afectados.
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La desnaturalización puede ocurrir por exposición de los ácidos nucleicos a agentes químicos o físicos, cambios de pH y enzimas.
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Los agentes desnaturalizantes, como la urea, la formamida y el formaldehído, son altamente polares, con grupos amino y carbonilo que compiten con los grupos amino y carbonilo de las bases nitrogenadas en la formación de puentes de hidrógeno y dan lugar a la separación de las hebras. También un pH extremadamente alcalino o ácido puede desnaturalizar el ADN; sin embargo, este tratamiento puede dar lugar a la rotura de enlaces fosfodiéster, y por lo tanto, a la pérdida de la estructura primaria. La temperatura es el agente desnaturalizante más representativo: el calentamiento gradual del ADN hasta llegar a 100°C debilita las fuerzas estabilizadoras de la doble hélice, de forma que las dos hebras se desenrollan hasta su separación total. La temperatura de fusión (Tm) se define como la temperatura a la que se ha desnaturalizado el 50% de las moléculas de ADN de la muestra que se está calentando. La Tm representa el punto en que la energía aplicada es suficiente para romper la mitad de los puentes de hidrógeno que mantienen unidas las dos cadenas de la molécula de ADN. Una muestra de ADN con alto contenido de G y C tiene una mayor Tm en comparación con una con alto contenido de A y T. Esto se debe a que G y C están unidas con tres puentes de hidrógeno, a diferencia de A y T, que lo están por dos puentes de hidrógeno, por lo que para disociarlas se requiere una temperatura mayor. La pérdida de la estructura helicoidal del ADN puede vigilarse con la medición de su absorbancia a 260 nm, ya que el ADN de cadena sencilla tiene una absorbancia relativa mayor que el ADN de cadena doble en la misma longitud de onda.
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Las topoisomerasas, las girasas y las helicasas son enzimas que pueden desenrollar (desnaturalizar) el ADN. Las topoisomerasas cortan una o ambas hebras del ADN, lo que provoca la relajación del superenrollamiento. Las girasas actúan desenrollando el ADN circular presente en las bacterias, y las helicasas se unen al ADN cerca de la horquilla de replicación, rompen los puentes de hidrógeno y catalizan la separación de las hebras mediante la energía liberada por hidrólisis de ATP.
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El ADN desnaturalizado puede renaturalizarse si se retira gradualmente el agente desnaturalizante. Por ejemplo, si una solución de ADN desnaturalizada por calentamiento se enfría lentamente, las dos cadenas se vuelven a asociar por complementariedad de sus bases.