Capítulo 4: Replicación

Una de las características más notables del ADN es su capacidad de replicarse; dicho de otra manera, tiene la capacidad de formar copias de sí mismo. La replicación se lleva a cabo en la fase de síntesis (S) del ciclo celular. Esta etapa es un paso obligado para realizar la división celular. Por ello, se determina que la información genética se transfiere de una célula a otra mediante el proceso de replicación del ADN.

El objetivo de la replicación es el de conservar la información genética. La representación estructural del ADN en doble hélice permite comprender cómo dicha molécula puede dar lugar a otras idénticas, sin perder su conformación. En principio, las dos hebras deberán separarse y, después, mediante la acción de una enzima, añadir desoxirribonucleótidos y, según la complementariedad de bases, construir ADN a partir de las dos hebras molde iniciales.

La síntesis de las cadenas de ADN durante la replicación se lleva a cabo en dirección 5’ → 3’ tanto en eucariotes como en procariotes. Solamente el carbono de la posición 3’ de la pentosa posee un radical hidroxilo (OH) libre, con el que puede formar un nuevo enlace fosfodiéster con otro desoxirribonucleótido y formar así la hebra creciente de ADN; por esta razón, la cadena de ADN sólo puede crecer en dirección 3’. A este proceso se le llama polimerización, que consiste en la unión de un dNTP (desoxirribonucleótido) complementario a la hebra molde según la Ley de Chargaff (véase el capítulo 1). La replicación del ADN cuenta con tres características que la definen y permiten entender el proceso: semiconservadora, bidireccional y antiparalela.

Semiconservadora

Se refiere a que en cada replicación una molécula de ADN recién sintetizada conserva una de las cadenas originales y la otra es sintetizada de novo.

Anteriormente existían tres teorías que trataban de explicar el proceso de la replicación; se decía que podía ser: semiconservadora, conservadora y dispersora o dispersante.

• Semiconservadora (modelo correcto). En cada una de las moléculas hijas se conserva una de las cadenas originales.

• Conservadora. Se sintetiza una molécula totalmente nueva, copia de la original, por lo que tras la duplicación quedan, por un lado, las dos hebras antiguas juntas y, por otro, las dos hebras nuevas.

• Dispersora o dispersante. Las cadenas hijas constan de fragmentos de la cadena antigua y fragmentos de la nueva.

El experimento definitivo para dilucidar cuál de estas tres hipótesis era la correcta lo realizaron Meselson y Stahl en 1957, y confirmó la hipótesis semiconservadora. Este experimento se basaba en dos premisas fundamentales: por una parte, el nitrógeno es uno de los principales elementos del ADN, ya que forma parte de las bases nitrogenadas, y por la otra, existen dos isótopos de este átomo, ¹⁴N y ¹⁵N, que pueden distinguirse mediante técnicas de laboratorio. Aunque el ¹⁴N es el isótopo más abundante en la naturaleza, el ¹⁵N también es viable y es más pesado, característica que permite diferenciarlos. Este experimento se realizó utilizando bacterias cuyo medio de cultivo contenía ¹⁵N, por lo que todo su ADN también lo contenía. Después se les cambió el medio de cultivo por uno que contenía ¹⁴N. Se permitió que las bacterias se replicaran sólo una vez y se extrajo el ADN que se analizó por centrifugación en gradiente de cloruro de cesio, que permite separar las moléculas por tamaño o peso. El resultado mostró una sola banda con un peso intermedio ¹⁴N y ¹⁵N, lo que sugirió que la molécula resultante estaba compuesta de ¹⁴N y ¹⁵N. En la segunda replicación en medio con ¹⁴N se observaron dos bandas, una correspondiente a ¹⁴N (del ADN replicado en esta segunda división celular) y otra intermedia entre ¹⁴N y ¹⁵N de la mezcla ADN parental: ADN recién sintetizado. De esta forma, Meselson y Stahl demostraron el mecanismo correcto de la replicación del ADN (figura 4-1 A y B).

Bidireccional

La replicación del ADN en eucariotes es bidireccional, ya que a partir del sitio de origen (ORI, también llamados ARS en eucariotes), se sintetizan las dos cadenas en ambos sentidos, con dos puntos de crecimiento que forman lo que se conoce como horquillas de replicación (figura 4-2).

En organismos eucariotes, debido al gran tamaño del ADN, existen múltiples orígenes de replicación (sitios ORI), por lo que a la replicación se la considera multifocal (figura 4-3). Los sitios ORI son secuencias específicas ricas A y T y controlan la replicación de una unidad de ADN llamada replicón. La presencia de bases A:T facilita la separación de las hebras y la formación de la burbuja de replicación. En los cromosomas de bacterias y virus existe un origen único de replicación por molécula de ADN; este sitio ORI permite la replicación de todo el ADN circular, por lo que se afirma que la replicación es monofocal (figura 4-4).

Discontinua

La replicación siempre se produce en sentido 5’ → 3’, y el extremo 3’-OH libre es el punto a partir del cual se produce la elongación del ADN. Esto plantea un problema: las cadenas tienen que crecer de forma simultánea a pesar de que son antiparalelas, es decir, cada cadena tiene el extremo 5’ enfrentado con el extremo 3’ de la otra cadena. Por ello, una de las cadenas debería sintetizarse en dirección 3’ → 5’. Esta incógnita la resolvieron los científicos japoneses Reiji Okazaki y Tsuneko Okazaki en la década de 1960, al descubrir que una de las nuevas cadenas del ADN se sintetizaba en forma de fragmentos cortos que, en su honor, se denominan fragmentos de Okazaki. Su longitud suele variar entre 1000 y 2000 nucleótidos en las bacterias y entre 100 y 400 nucleótidos en eucariotes. La cadena que se sintetiza en el sentido que avanza la horquilla de replicación se denomina hebra adelantada, líder o conductora (leading strand), y se sintetiza de forma continua por la ADN polimerasa, mientras que la que se sintetiza en sentido contrario al avance de la horquilla se denomina hebra rezagada o retrasada (lagging strand), cuya síntesis se realiza de forma discontinua o en fragmentos, y para disponer de una cierta longitud de ADN molde para continuar hay que esperar a que la horquilla de replicación avance (cuadro 4-1).

La maquinaria encargada de la replicación del ADN es muy compleja y está formada por un grupo de proteínas que actúan en conjunto con una secuencia de ADN específica ya establecida. A continuación se describen las enzimas que intervienen en el proceso de replicación y enseguida se desarrollará el proceso mencionando las enzimas involucradas.

Helicasa: enzima encargada de separar las dos hebras del ADN mediante la rotura de los puentes de hidrógeno que se establecen entre las bases nitrogenadas de las dos cadenas del ADN. Ocasiona superenrollamientos positivos a los lados de la burbuja de replicación.

Proteínas de unión a cadena sencilla (SSB, singlestrand ADN binding proteins en procariotes y RPA en eucariotes): evitan la formación de los puentes de hidrógeno entre las dos cadenas separadas por la helicasa y permiten que se copien.

Topoisomerasas: son enzimas isomerasas que actúan sobre la topología del ADN, pueden cortar o formar enlaces fosfodiéster ya sea una de las hebras (topoisomerasa I) o en las dos (topoisomerasa II) que forman el ADN. Esta escisión selectiva permite al ADN liberar la tensión contorsional, con lo que se deshace el superenrollamiento, el cual en caso de persistir detendría la replicación. De esta manera se permite el acceso a la cadena de ADN a todas las enzimas involucradas en la replicación.

Primasa: es una enzima que sintetiza pequeños fragmentos de ARN de entre 8 y 10 nucleótidos de longitud, conocidos como cebadores o primers, complementarios a un fragmento del ADN. La unión de los cebadores al ADN proporciona un extremo 3´ necesario para que la ADN polimerasa (enzima que sintetiza ADN y que no puede añadir nucleótidos si no existe un extremo 3´libre) lleve a cabo su acción. Los cebadores, al ser ARN, luego son degradados por las nucleasas Rnasa H1 y sustituidos por ADN por acción de otra ADN polimerasa.

Rnasa H1: enzima encargada de retirar los cebadores de ARN durante la síntesis de los fragmentos de Okazaki y en los procesos de reparación del ADN.

FEN1/RTH1: también llamada endonucleasa flap 1 (flap endonuclease 1), se encarga de remover el ribonucleotido 5’ del fragmento de Okazaki. El Nick (falta de enlace fosfodiéster entre dos nucleótidos adyacentes) resultante es sellado por la ADN ligasa.

Ligasa: enzima que cataliza la formación del enlace fosfodiéster entre nucleótidos contiguos.

Telomerasa: es una ribonucleoproteína con actividad de ADN polimerasa dirigida por ARN (transcriptasa inversa) capaz de sintetizar una secuencia determinada de ADN que permite el alargamiento de los telómeros (extremos de los cromosomas eucariotes).

Antígeno nuclear de células en proliferación (PCNA): es un homotrímero que forma una estructura de toroide, la cual es abierta transitoriamente por acción del factor de replicación C (RFC, replication factor C), lo que permite su recircularización alrededor de la doble hélice del ADN a la altura del extremo del primer en la cadena líder. La estructura toroide del PCNA alrededor de la cadena de ADN permite su libre desplazamiento por la misma. PCNA interactúa con la ADN polimerasa, sirviendo como una pinza que sostiene a la polimerasa en el extremo del primer y le permite sintetizar la cadena de ADN.

ADN polimerasa: son las principales enzimas en este proceso. Son capaces de sintetizar nuevas cadenas de ADN a partir de una hebra patrón o molde y las unidades estructurales correspondientes (desoxirribonucleótidos). Una característica importante de esta enzima es que añade los nucleótidos en la dirección 5’ → 3’ siempre y cuando haya un extremo 3’ disponible. Como consecuencia de esto, la dirección en la cual leerá la cadena molde de ADN será de 3’ → 5’.

En eucariotes se han descrito por lo menos cinco ADN polimerasas involucradas en la replicación del ADN, cada una con una actividad específica: α, β, γ, δ y ε. La polimerasa α (ADNpol α), también llamada primasa, inicia la síntesis del ADN mediante la formación de un cebador ARN. Las polimerasas δ y ε (ADNpol δ y ADNpol ε) son responsables de la mayor parte de la elongación de ambas hebras del ADN. La polimerasa β (ADNpol β) no interviene en la replicación y está involucrada en la reparación de errores o daños en el ADN. Es importante mencionar que las polimerasas α, β, δ y ε están involucradas en la replicación del ADN nuclear. La polimerasa γ (ADN pol γ) lleva a cabo la replicación del ADN mitocondrial. Existen otras polimerasas, como las polimerasas ζ (theta), η (eta) y ι (iota), cuya función no es muy conocida, pero se cree que están involucradas sobre todo en mecanismos de reparación y recombinación.

De las 5 polimerasas, sólo tres tienen la actividad de exonucleasa-3’ (pol δ, γ y ε), esto es, son capaces de corregir los errores cometidos al incorporar los nucleótidos a la hebra que se está sintetizando, eliminan el nucleótido equivocado y añaden el correcto. Ninguna ADN polimerasa en eucariotes presenta actividad de exonucleasa-5’. En procariotes la ADN pol I presenta este tipo de actividad.

A diferencia de lo observado en eucariotes, en la maquinaria para la replicación de los procariotes, sólo tres enzimas participan en la síntesis del ADN. La polimerasa I es la única que tiene actividad de exonucleasa de 5’ a 3’.

En el cuadro 4-2 se resumen las propiedades de la ADN polimerasa en eucariotes y en el 4-3, las de procariotes.

Para su estudio y mejor comprensión, como la mayoría de los procesos celulares la replicación se ha dividido en tres fases: inicio, elongación y terminación.

Inicio

Las zonas en el ADN donde se producen las burbujas de replicación no son aleatorias, se sabe que existen secuencias de aproximadamente 300 pb que indican los lugares precisos donde ha de comenzar la replicación. Estos sitios son ricos en A y T y son reconocidos por una serie de proteínas llamadas, en conjunto, proteínas de reconocimiento del sitio de origen. En eucariotes, los orígenes de replicación se llaman secuencias de replicación autónoma (SRA).

Cada burbuja de replicación posee dos horquillas de replicación, una de las cuales se desplaza hacia la derecha y otra hacia la izquierda. El proceso de replicación necesita, en primera instancia, que las dos cadenas del ADN se separen. Para esto, la helicasa se unirá a la cadena de ADN e hidrolizará los puentes de hidrógeno. La apertura de la doble hélice hace que las cadenas simples adquieran inestabilidad, que se compensa por la unión de proteínas estabilizadoras RPA. La ADN polimerasa no puede iniciar la síntesis a partir de los desoxirribonucleótidos libres; por lo tanto, necesita que la primasa sintetice un cebador, a partir del cual la ADN polimerasa incorporará los nucleótidos en forma complementaria a las bases de la cadena patrón (figura 4-5).

Elongación

Es el proceso por el cual la ADN polimerasa añade nucleótidos uno por uno complementarios a la cadena molde, a medida que avanza la horquilla, ayudada por PCNA. La función del PCNA es mantener la ADN polimerasa en contacto con la cadena molde, con la finalidad de que la lea y sintetice la cadena complementaria.

Una vez presente la maquinaria de inicio de la replicación, la horquilla avanza, aumentando la tensión por delante de la cadena. Para evitar que esta tensión impida el avance de la horquilla, las topoisomerasas (I y II) cortarán los enlaces fosfodiéster de la doble hélice y volverán a unirla, lo que permitirá que se desenrolle una vuelta si actúa la topoisomerasa I y dos si lo hace la topoisomerasa II.

Como ya se ha mencionado, la síntesis es diferente en cada una de las hebras de la horquilla de replicación; en la cadena líder, la síntesis se realizará en forma continua, y por el contrario, en la cadena retrasada, la síntesis se realizará en forma discontinua. Una de las consecuencias de la síntesis discontinua es que para la síntesis de cada fragmento de Okazaki se requiere de un cebador intercalado entre estos fragmentos, mientras que en el caso de la cadena continua es necesaria la presencia de un solo cebador. El proceso de elongación es similar en eucariotes que en procariotes (figura 4-6).

Terminación

El final de la replicación se produce cuando la ADN polimerasa δ llega al extremo del fragmento de ADN. Se produce entonces el desacoplamiento de todo el replisoma y la finalización de la replicación. Uno de los pasos cruciales en el proceso de terminación es completar la síntesis de la cadena retardada y unir los fragmentos de Okazaki. A este proceso se lo denomina maduración, y requiere la eliminación de los cebadores, la elongación del fragmento de ADN adyacente para rellenar el espacio que quedó por la eliminación del cebador y la unión de los extremos resultantes para formar una cadena continua. Para que esta maduración suceda, existe un sistema de nucleasas (FEN1/RTH1 + RNasa H1) encargado de eliminar el cebador de ARN. En consecuencia la ADNpol δ, o ADNpol ε, elonga el extremo 3’ del fragmento adyacente y rellena el lugar que antes ocupaba el cebador hasta alcanzar el extremo 5’ del fragmento contiguo. Por último, la ADN ligasa I sella la mella resultante uniendo el 3’-P del primer fragmento con el 5’-P del segundo.

Replicación de los telómeros. La fase final de la terminación de la replicación del ADN consiste en la replicación de los telómeros de las cadenas de ADN. Los telómeros son secuencias repetidas de 1-5 unidades T y G en una de las cadenas, y por lo tanto, C y A en la complementaria situadas en los extremos de los cromosomas eucariotes (los procariotes no poseen telómeros porque su ADN es circular). La dinámica de replicación que requiere de un primer para polimerizar no permite completar la copia de los extremos de la hebra de síntesis retrasada de ADN, al no poderse situar un cebador más allá del final de la secuencia. De esta manera, al retirar todos los cebadores de las cadenas de ADN de síntesis retrasada recién sintetizadas; en cada una de las dos moléculas de ADN uno de los extremos queda más corto. La telomerasa es una transcriptasa inversa formada por ARN (9 a 28 nucleótidos) y proteína que contiene un fragmento de la secuencia de su ARN complementario a la secuencia de los telómeros. Por lo tanto, en la replicación de los telómeros actúan las telomerasas, que se unen por complementariedad de bases a los telómeros y sintetizan los extremos de los cromosomas más allá de su tamaño, tomando como molde el ARN de la transcriptasa inversa.

La telomerasa sólo está presente en células somáticas, tejidos fetales y en ciertas células madre. En eucariotes la presencia de la telomerasa en las células germinales garantiza la preservación de las largas secuencias teloméricas. La desaparición de la enzima en las células somáticas condiciona la longitud de estas secuencias y puede alterar la división celular correcta, el tiempo de vida de una célula y, por extensión, del organismo. El acortamiento de los telómeros se ha vinculado con el envejecimiento (figura 4-7).

El mecanismo de acción de la telomerasa se detalla a continuación (figura 4-7):

1. La telomerasa se une a su respectiva secuencia complementaria y alarga el extremo saliente 3’, una vez que éste se encuentra alargado. Se produce un apareamiento de bases entre el ADN telomérico y el ARN de la telomerasa.

2. Con este apareamiento empieza la primera elongación. La telomerasa cataliza la elongación del extremo 3’ alargado, añadiendo dNTPs y empleando como molde la hebra de ARN de la propia telomerasa.

3. Una vez que se están añadiendo los dNTPs, la telomerasa se desliza sobre el extremo 3’ previamente elongado, conservando la complementariedad gracias a la repetición de secuencias, lo que se conoce como translocación.

4. La telomerasa elonga nuevamente el extremo 3’ saliente.

5. Se vuelven a repetir los pasos de translocación y elongación.

6. En la segunda fase la ADN polimerasa α rellena la otra hebra, y la ligasa sella la mella que queda en la elongación.

La replicación del ADN mitocondrial en mamíferos se ajusta al modelo del lazo de desplazamiento o lazo D. Las dos hebras del ADN mitocondrial se pueden diferenciar según su densidad, y existe una hebra ligera (L) y otra pesada (H). En primer lugar, se inicia la replicación o síntesis de la nueva hebra L, sin que se comience la replicación de la nueva hebra H. El origen de replicación de la hebra L es diferente al de la hebra H, de forma que existen dos orígenes de replicación diferentes, uno para cada una. Además, una vez iniciada la replicación de la nueva hebra L, la síntesis es unidireccional y avanza desplazando a la otra hebra. Cuando se han sintetizado aproximadamente dos tercios de la nueva hebra L, comienza la síntesis de la nueva hebra H, en una sola dirección, opuesta a la de síntesis de la hebra ligera L. Por consiguiente, la síntesis de la nueva hebra L termina antes que la de la nueva hebra H (figura 4-8).