Capítulo 5: Transcripción

Una de las funciones de la doble cadena del ADN, representada en el dogma de la Biología Molecular, es expresar la información contenida en el material genético. El primer paso en la expresión génica es la transcripción, que consiste en la síntesis de una cadena de ARN complementaria y antiparalela, a la secuencia de nucleótidos de una de las cadenas de ADN denominada cadena molde, y por lo tanto, tiene la secuencia de nucleótidos idéntica a la cadena opuesta del ADN llamada cadena codificadora, con la premisa de que la timina se sustituye por uracilo en la molécula de ARN (figura 5-1).

La transcripción es el paso previo y necesario para la generación de proteínas funcionales que definen el metabolismo y la identidad de las células. Las secuencias de ADN que se copian en cada proceso de transcripción se denominan genes (figura 5-2). Desde el punto de vista molecular, el gen es una secuencia lineal de nucleótidos en la molécula de ADN, que contiene la información necesaria para la síntesis de un ARN funcional, que puede ser ARNm, ARNt o ARNr. Los genes se sitúan a lo largo de cada cromosoma en una posición determinada llamada locus. Se estima que el número de genes que se encuentra en la especie humana es de aproximadamente 23 000; sin embargo, todavía no se tiene certeza acerca del número exacto. La definición de gen propuesta por Gerstein y colaboradores lo describe como un conjunto de secuencias que codifican para potenciales productos funcionales que se sobreponen entre sí y que pueden estar localizadas en más de un locus en el ADN.

El mecanismo de transcripción en células eucariotas, aunque transcurre de manera similar que en procariotas, es un proceso mucho más complejo; tanto el número de proteínas y enzimas como la diversidad y la estructura de los genes son considerablemente mayores, por lo que se requiere de una regulación más precisa. La mayoría de los genes en procariotes están organizados en operones, esto es, un conjunto de genes situados en el mismo fragmento de ADN que se transcriben como una unidad y que generan varios productos funcionales que participan en una vía metabólica común; aunque también pueden existir unidades que codifiquen para un solo producto funcional. Por el contrario, en los eucariotes, se transcribe generalmente un solo producto génico (unidades transcripcionales monocistrónicas) con mayor complejidad en su regulación.

Los genes eucariotes están constituidos por secuencias regulatorias y codificantes. El inicio del sitio de transcripción se denomina +1, y la numeración aumenta conforme se dirige al extremo 3’. Esta dirección se conoce como corriente abajo, donde se encuentran las secuencias codificantes del gen. Hacia el extremo 5’, en la dirección opuesta, conocida como corriente arriba, la numeración se indica como —1, y es allí donde se encuentra la mayoría de regiones regulatorias del gen (figura 5-3).

La región codificadora del gen también contiene regiones que no serán traducidas, denominadas intrones, y que son retirados por medio del proceso corte y empalme del ARNm primario o heterogéneo nuclear (ARNhn). Las regiones que codifican para el producto génico se conocen como exones. Un solo gen puede sintetizar diferentes proteínas mediante el arreglo de los exones por el proceso de corte y empalme alternativo. El tránscrito primario o ARNhn es el producto inmediato de la transcripción y consiste en un ARN que contiene las secuencias intrónicas y exónicas, cuyos extremos 5’ y 3’ no han sufrido ninguna modificación. El producto final, ARN mensajero maduro, ARN ribosomal (ARNr) y ARN transferencia (ARNt), se produce cuando sucede una serie de modificaciones en el tránscrito primario: modificaciones postranscripcionales. En procariotes, el ARN recién sintetizado no sufre modificaciones postranscripcionales y se utiliza para la traducción de forma inmediata sin sufrir ningún proceso.

Un tipo de secuencias de ADN regulatorias que no codifican para el producto génico, pero regulan su expresión, son los promotores. El promotor mínimo es la región regulatoria indispensable para la transcripción del gen. Las secuencias adyacentes a este promotor mínimo forman parte de él, y pueden modificar la tasa de transcripción del gen, pero no son imprescindibles para la unión de la ARN polimerasa.

El promotor basal es la secuencia mínima requerida para la unión de la maquinaria basal de transcripción y para la ARN pol II (ARN polimerasa II) incluye el Inr y la caja TATA o el DPE.

A los promotores se les unen proteínas reguladoras conocidas como factores transcripcionales (transcriptional factors, TF), cuya función es regular (aumentar o disminuir) la tasa de transcripción. Aunque existe mucha diversidad entre los promotores reconocidos por la ARN polimerasa II se pueden definir secuencias consensos comunes entre sí. Una secuencia consenso es la región conocida como iniciador (Inr) localizada entre las posiciones –3 y +5. La secuencia consenso denominada caja TATA, debido a su composición de ocho pb A-T, se encuentra en la mayoría de los promotores y se localiza a –31 a –25 bp hacia el extremo 5’ del punto de inicio. Éste es el único elemento que se localiza en una dirección relativamente fija con respecto al punto de inicio. Los promotores que carecen de caja TATA se denominan TATA menos. Cuando existe una mutación en la caja TATA, el sitio de inicio de la transcripción cambia, ya que la ARN pol II al ser activada se sitúa en otro sitio (figura 5-4). El DPR (downstream promoter element) es un elemento común en los promotores TATA menos, se localiza de +28 a +32.

Algunos promotores basales son fuertes, como la mayoría de los ubicados en los genes procariotes y virales; se les denomina así ya que la maquinaria de transcripción basal se une de forma eficaz y la tasa de transcripción es elevada. Otros son débiles, como la mayoría de los promotores de genes eucariotes, con un inicio de la transcripción menos frecuente, por lo que requieren secuencias accesorias contenidas en promotores proximales, localizadas generalmente a menos de 200 pb corriente arriba del sitio de inicio de la transcripción. Las cajas GC, CAAT y el octámero son ejemplos de estos promotores proximales, reconocidos por los factores transcripcionales específicos para favorecer la iniciación. El número y la posición de estos elementos varían entre los promotores de los diversos genes. La unidad de transcripción se refiere a la interacción de todas las secuencias funcionales o estructurales posibles, así como el complejo proteico formado de enzimas y TF que se requieran durante el proceso de la transcripción.

Otras regiones regulatorias que ayudan a los promotores débiles a iniciar la transcripción son los promotores distales, que generalmente se encuentran a más de 200 pb río arriba (región 5’) del sitio de inicio de la transcripción, aunque también se han localizado hacia el extremo 3’ (corriente abajo). Las regiones que controlan la transcripción de un gen no necesariamente tienen que estar cerca de la región codificadora. Estas regiones son mucho más complejas y pueden activar o desactivar genes.

Los potenciadores o secuencias amplificadoras (enhancers) son secuencias cortas que potencian o aumentan la transcripción del gen de manera cooperativa con otras secuencias reguladoras y alteran la estructura del ADN, ya que inducen el superenrollamiento en la zona del promotor basal y aumentan la unión de TF, lo que implica una aproximación física entre ambos y una flexibilidad en la molécula de ADN, y favorece el inicio de la transcripción.

Por otra parte, los silenciadores (silencers) son secuencias cortas de nucleótidos de dos tipos: los elementos silenciadores o los elementos de regulación negativa (negative regulation elements, NRE) y pueden actuar de varias maneras:

1. Modificando la estructura de la cromatina y evitando que los genes sean activados.

2. Reclutando factores transcripcionales represores y evitando que factores transcripcionales inductores se unan al ADN.

3. Alterando el proceso de corte y empalme del ARN heterogéneo nuclear y evitando su maduración.

4. Creando señales que bloquean la traducción, e inactivando así la expresión génica.

La acción de un potenciador o un silenciador puede inhibirse por la presencia de secuencias aisladoras, cuya función es bloquear la transmisión de la señal de un sitio a otro en el ADN e impedir el silenciamiento. La mayoría de los potenciadores o silenciadores actúan sobre el promotor que se encuentra vecino, sin ser específicos de un determinado gen.

La enzima protagonista en este proceso es la ARN pol, que sintetiza una cadena de ARN en dirección 5’ → 3’ al igual que la ADN pol. Esta enzima actúa de manera continua durante toda la unidad de transcripción: primero sobre el sitio de inicio indicado en el promotor basal, continúa en la secuencia codificadora y finaliza en una secuencia de terminación. En las células eucariotas los genes nucleares son transcritos por tres tipos de ARN pol: I, lI y III, que transcriben diferentes tipos de genes en lugares específicos del núcleo. Cada una reconoce promotores y TF con características específicas. Las ARN pol de mitocondrias se asemejan más a la ARN pol bacteriana, dada la menor complejidad de los genomas de estos organelos (figura 5-5).

La ARN pol I reside en una zona definida del núcleo, el nucleolo, donde transcribe los genes que codifican para los ARNr. Esta enzima sintetiza un único tránscrito, el ARNr 45S, precursor de los ARNr 18S, 28S y 5.8S. La ARN pol III se encuentra en el nucleoplasma y es la encargada de la síntesis de los ARNt, el ARNr 5S y otros pequeños ARN (small nuclear, ARNsn).

La ARN pol II también se encuentra en el nucleoplasma y sintetiza las moléculas de ARNhn, el precursor del ARNm y algunos ARNsn. Existen tres subunidades comunes para las tres ARN pol: en primer lugar, una subunidad grande, el dominio terminal carboxilo (carboxy terminal domain, CTD), que puede ser altamente fosforilada en los residuos de serina y treonina, y es muy importante en el inicio de la transcripción, en el corte y empalme, en la modificación de los extremos del ARN y en la terminación. Las otras dos subunidades son las de reconocimiento de la secuencia de ADN y la del sitio catalítico.

La producción de ARNhn por la ARN pol II requiere de una regulación mucho más compleja, donde el número y el tipo de factores de transcripción involucrados es mayor. Como se mencionó anteriormente, los TF son proteínas que se unen al ADN en el promotor, potenciador o silenciador para el control de la expresión de los genes. Éstos se unen al ADN reconociendo una secuencia específica, aunque una misma secuencia puede ser reconocida por más de un TF, que puede ser activador o represor. Los TF se han clasificado, de acuerdo con su función, en factores transcripcionales generales o basales y factores transcripcionales inducibles.

Factores transcripcionales (TF) generales o basales

Son los requeridos para el inicio de la transcripción en todos los promotores basales. Se unen a la ARN pol para formar un complejo que rodea el sitio de inicio, determinando la iniciación. Los TF toman el nombre de la ARN pol con la que actúan y, junto con ésta, forman el aparato básico de transcripción. Por lo tanto, los TF que actúan con la ARN pol I se denominan TF I; los que actúan con la ARN pol II, TF II, y los que actúan con la ARN pol III, TF III.

Factores transcripcionales inducibles

El conjunto de TF requerido para la expresión de un determinado gen es particular para cada promotor. Los TF inducibles, o TF de tejido específico, interactúan con el ADN de la misma manera que los TF generales, pero su función es más bien reguladora y se unen preferentemente a los promotores distales. Se sintetizan o activan bajo un estímulo y controlan la transcripción en tiempo y espacio. Un gen con un promotor que contenga secuencias reconocibles sólo por los TF generales puede transcribirse en cualquier tipo celular y éstos son los responsables de la expresión de genes que se expresan constitutivamente. En cambio, los genes controlados por TF inducibles requieren de la formación de un complejo mediador estimulado de forma aleatoria.

La transcripción tiene lugar en el núcleo. En el sitio de inicio de la transcripción, la molécula de ADN se separa de forma transitoria en dos cadenas sencillas y una se utiliza como molde para la síntesis de ARN, formando una burbuja (burbuja de transcripción). Conforme la ARN pol avanza y copia el ADN, el ADN ya copiado se vuelve a unir a su cadena complementaria y forma nuevamente la doble hélice, liberando el ARN como una cadena sencilla de nucleótidos (sólo los últimos 25 nucleótidos sintetizados forman complejo con el ADN). La reacción de transcripción se divide en tres etapas: iniciación, elongación y terminación.

El reconocimiento del promotor basal, o preiniciación, de la transcripción inicia con la unión de la primera proteína del complejo del TFIID a la caja TATA, conocida como proteína de unión específica de TATA (TATA binding protein, TBP). La TBP tiene la capacidad inusual de unirse al ADN por el surco menor donde lo dobla. Esta unión provoca una deformación en la estructura del ADN sin separar las dos cadenas. Es el componente clave en el posicionamiento de la ARN pol II y delimita la distancia desde el punto de inicio hasta la caja TATA. En los promotores que carecen de caja TATA, la TBP puede incorporarse por asociación a otras proteínas que reconocen el ADN. El TFIID está formado, además de por la TBP, por 11 TAF (TBP associated protein). Los TAF son subunidades diferentes y pueden reconocer una variedad de promotores tanto basales como distales. Estas proteínas desempeñan un papel fundamental en el nexo entre el aparato basal de transcripción y los otros factores 5’ y TF reguladores, para formar el complejo mediador de la unidad transcripcional (figura 5-6).

El TFIIA controla la capacidad de unión de TBP al ADN y permite al TFIID reconocer la región que se extiende hacia el extremo 5’. El TFIIB es otro factor que se une de forma adyacente a TBP, específicamente en la secuencia del promotor basal BRE y proporciona mayor superficie de reconocimiento para el anclaje de la ARN pol II. El TFIIF es el medio de unión de la ARN pol II al complejo de transcripción.

La proteína TFIIH tiene actividad helicasa y contacta con la ARN pol II, lo que le permite su anclaje a ésta. La burbuja de transcripción se origina mediante un desenrollamiento local, que se inicia en el sitio de unión de la ARN pol II. En el caso de promotores débiles, en este paso tiene lugar el ensamblaje de todas las proteínas necesarias para iniciar la síntesis.

1. Inicio. El inicio se refiere a la síntesis de los primeros enlaces nucleotídicos de ARN. La ARN pol II permanece en el promotor mientras sintetiza los primeros nueve enlaces. La fase de inicio puede retrasarse por la ocurrencia de intentos abortivos, en los que la enzima sintetiza pequeños fragmentos (menos de nueve bases) y los libera, y vuelve a iniciar nuevamente. El inicio termina cuando la enzima comienza a alargar la cadena y abandona el promotor con el complejo de iniciación (figura 5-6).

2. Elongación. La fase de elongación requiere de las proteínas TFIIE y TFIIH, que se unen corriente arriba de la ARN pol II; ambas se requieren para iniciar su movimiento a lo largo del ADN y el abandono del promotor basal. Una vez unida TFIIE, se pueden unir TFIIH, que excepcionalmente continúa unido a la ARN pol II y tiene varias actividades: ATPasa, helicasa y cinasa, que puede fosforilar el dominio CTD de la ARN pol II. La fosforilación del dominio carboxiterminal (CTD) está implicado en el abandono del promotor basal y el inicio de la fase de elongación. En la elongación, la enzima ARN pol II se mueve a lo largo del ADN y sintetiza la cadena naciente de ARN. A medida que la enzima avanza sobre el ADN, lo desenrolla para exponer un nuevo segmento de cadena sencilla de ADN, que fungirá como molde. Los nucleótidos se añaden de forma covalente al extremo 3’OH y en la región desenrollada se forma un híbrido ADN-ARN (figura 5-7)

3. Terminación. La terminación de la transcripción implica el reconocimiento de una secuencia que contiene una región rica en GC, en una serie de seis o más adeninas contenidas en el tránscrito de ARN. En la transcripción del ARN se leería como la señal de poliadenilación que determina el final de la adición de nucleótidos a la cadena y la desintegración del complejo de transcripción. Se presume que este proceso puede ser mucho más complejo. Cuando se añade el último nucleótido a la burbuja de transcripción se colapsa al desaparecer el híbrido ADN-ARN, y se libera la ARN pol II. Es importante mencionar que existe una superposición de eventos, de tal manera que los procesos de elongación, terminación y maduración del ARNhn son simultáneos, por lo que cuando termina la transcripción ya existe un ARNm maduro y listo para transportarse al citoplasma (figura 5-7).

El tránscrito primario, o ARNhn, tiene que procesarse de diversas formas para su maduración antes de exportarse del núcleo y participar en el proceso de traducción. El proceso de maduración incluye la adición de un capuchón de guanina modificada en el extremo 5’, la poliadenilación del extremo 3’, el corte y empalme, además del proceso de edición que sucede sólo en algunos genes (figuras 5-7 y 5-8).

El extremo 5’ se modifica cuando el ARN es apenas un polímero de 20 a 40 ribonucleótidos, por la adición de una 7-metil-guanosina, en tres pasos enzimáticos: la eliminación de un grupo fosfato (enzima ARN trifosfatasa); la adición del nucleótido guanina (enzima guanilil transferasa), y por último, su metilación (enzima metil transferasa). Las tres enzimas son reclutadas por el factor de elongamiento hSPT5 unido al CTD de la ARN pol II. La 7-metil guanosina queda unida a través de un enlace entre carbono 5’-5’ de las ribosas (figura 5-8A).

La etapa de la terminación de la transcripción y la adición de la cola de poliadenilación (poli-A) en el extremo 3’ están íntimamente ligadas. El CTD de la ARN pol II, de igual manera, participa en el reclutamiento de las enzimas para la poliadenilación que sucede al encontrar secuencias de reconocimiento en el ARN tránscrito primario en tres procesos:

1. Los complejos proteicos, el factor estimulante de la escisión (cleavage stimulation factor, CstF) y el factor específico de poliadenilación y escisión (cleavage and polyadenylation specificity factor, CPSF), transferidos desde CTD al ARNhn, lo escinden.

2. Adición de alrededor de 200 residuos de adenina en el extremo 3’ por la enzima poli-A polimerasa. Es importante mencionar que la cola de poli-A sólo se añade a los ARN generados por la ARN pol II; es decir, los que presentan la señal de poliadenilación AAUAAA.

3. La ARN pol II continúa añadiendo nucleótidos antes de colapsar la burbuja de transcripción, por lo que la señal de poliadenilación es clave para el proceso de terminación (figura 5-8B).

El proceso de corte y empalme (splicing) consiste en la remoción de los intrones (las secuencias intragénicas no codificadoras de la región codificadora) y el empalme de los exones (bloques de secuencias codificadoras para formar el ARNm maduro). Los exones y los intrones pueden empalmarse en más de una forma y generar variantes del ARNm por corte y empalme alternativo. Las regiones en el ARNhn reconocidas por la maquinaria de corte y empalme son secuencias conservadas de nucleótidos específicas que limitan los exones y los intrones, e indican dónde se realizará el corte y el empalme, sitio de empalme 5’ y 3’ (donante y receptor, respectivamente); una tercera secuencia, conocida como sitio de ramificación, se encuentra en la secuencia del intrón. Las enzimas del proceso también conocido como ayustosoma median dos reacciones de transesterificación sucesivas donde se rompen y se forman dos enlaces fosfodiéster nuevos. El ayustosoma está formado por 150 proteínas y 5 ARN nucleares pequeños (ARNsn), conocidos como U1, U2, U4, U5 y U6; por lo tanto, es una riboproteína. Las reacciones se pueden dividir en tres etapas:

1. Identificación de las secuencias donantes 5’ y sitio de ramificación por U1 y U2, respectivamente, ayudado por proteínas accesorias.

2. Formación de un plegamiento del ARN para acercar los tres sitios de corte y empalme, ayudado por U4, U5 y U6; en este momento, se produce el ataque nucleofílico de la adenina conservada en el sitio de ramificación en el enlace fosfodiéster de una guanina conservada del sitio donante 5’, formando un nuevo enlace fosfodiéster y una estructura llamada lazo intrónico.

3. Liberación de U1. Es remplazado por U6. En la segunda reacción de transesterificación el sitio donante 5’ libre se convierte en un nucleófilo que ataca el sitio receptor 3’. Los exones se empalman y liberan el lazo intrónico. En este momento se libera U4 y entran en contacto U6 y U2, y la unión de los exones es mediada por U5. El ayustosoma es constantemente reciclado y reclutado por el CTD de la ARN pol II a través del TAT-SF1 (figura 5-8C).

La edición es una forma de modificación postranscripcional del ARNm. En algunos casos genera el cambio de un aminoácido importante por otro o codones de paro de la traducción y la generación de una proteína truncada. El proceso de edición sólo se presenta en ciertos genes, en algunos tejidos o en algunos tipos celulares. Existen dos mecanismos que median la edición: la desaminación oxidativa de una citosina metilada, que se convierte en uridina del codón CAA (enzima citidina desaminasa) y genera el codón de paro UAA, o el cambio de aminoácido adenina por inosina, que prefiere aparearse con citosina (enzima adenosina desaminasa de acción sobre ARN, ADAR), mecanismo propio de los mamíferos, incluido el ser humano. La inserción o deleción de una uridina dirigida por un ARN guía se ha observado en procariotes, y ha cambiado los marcos de lectura para la traducción. El ejemplo más representativo del proceso de edición es en el ARNm de la apoliproteína B (ApoB). El ARNm sintetizado en el hígado produce una cadena polipeptídica de 100 aminoácidos, por lo que se lo conoce como ApoB-100. Este mismo gen en el intestino, al ser tránscrito, sufre un proceso de edición, en el que una citosina en la posición 2152 es desaminada y se convierte en U, cambiando el codón CAA por UAA, un codón de terminación que provoca la formación de una proteína truncada de tan sólo 48 aminoácidos denominada ApoB-48.

Las diferencias fenotípicas que caracterizan a las diferentes células presentes en organismos multicelulares, a pesar de tener el mismo genotipo, se deben a la expresión diferencial de sus genes. El desarrollo y el fenotipo de un organismo pueden regularse por el producto génico que interactúa con otros genes o con el ambiente en tiempo y espacio. Existen diversos mecanismos por los cuales se puede controlar la expresión de los genes (véase el capítulo 7).