Capítulo 9: Mecanismos de reparación del ADN

El ADN está expuesto constantemente a agentes físicos, químicos o biológicos que pueden originar mutaciones y alterar la información genética del individuo. Las modificaciones en el ADN pueden surgir por moléculas o mecanismos endógenos del metabolismo celular, errores en el proceso de la replicación del ADN, ciertas infecciones virales e incluso por factores ambientales como la luz ultravioleta, agentes químicos o la radiación ionizante. Estos factores interfieren en procesos como la transcripción y la replicación, e inclusive pueden provocar un descontrol en la división celular. La variabilidad genética también es necesaria para proporcionar adaptabilidad a las especies al cambiante medio ambiente; no obstante, cierta información genética es crucial y su modificación sería incompatible con la supervivencia del organismo. Para preservar la información genética lo más fielmente posible el organismo dispone de mecanismos complejos de reparación del ADN. En la mayoría de las ocasiones los cambios en el ADN no se manifiestan con cambios fenotípicos y no presentan efectos adversos en el organismo; pero algunas mutaciones sí pueden llegar a ser fatídicas, por lo que su persistencia se trata de evitar mediante mecanismos de reparación que implican complejos sistemas enzimáticos que buscan corregir las mutaciones. Varias enfermedades humanas, conocidas como síndromes de inestabilidad cromosómica, y ciertos tipos de cánceres están relacionados con fallas en los sistemas de reparación del ADN.

Las lesiones en el ADN pueden ocurrir espontáneamente o pueden estar causadas por la exposición a agentes mutagénicos. La desaminación, la depurinización y el daño oxidativo de las bases nitrogenadas son algunos de los daños que se producen en el ADN de forma espontánea. La desaminación consiste en la pérdida de grupos amino. En condiciones normales la desaminación de la citosina produce uracilo, base nitrogenada que no forma parte del ADN; esta base se aparea preferentemente con la adenina en lugar de hacerlo con la guanina, produciendo así la conversión de un par de GC en un par de AT (figura 9-1A).

La depurinización consiste en la eliminación del enlace N-glucosídico entre la base nitrogenada y el azúcar, con la consiguiente pérdida de un residuo de adenina o guanina. Como consecuencia aparecen sitios apurínicos en el ADN que conducen a un daño genético importante, ya que durante la replicación estos sitios no pueden unir una base complementaria a la purina original perdiéndose un nucleótido en la cadena de ADN recién sintetizada.

En todos los seres vivos el metabolismo normal aerobio produce especies reactivas de oxígeno como los radicales superóxido (O₂), peróxido de hidrógeno (H₂O₂) y radicales hidroxilo, moléculas que causan daños oxidativos en el ADN. Las principales alteraciones que originan estos radicales libres son la formación de una 8-oxo guanosina y el glicol de timina que bloquean la replicación del ADN si no se reparan (figura 9-1B).

Agentes alquilantes. Añaden grupos alquilo (etilo o metilo) a las bases nitrogenadas y alteran su patrón de apareamiento bloqueando la replicación. Uno de los sitios más propensos a la alquilación es el oxígeno del carbono 6 de la guanina formándose O6-metilguanina, que se aparea de modo incorrecto con la timina, provocando transiciones de un par de bases GC por un par AT.

Agentes intercalantes. Son compuestos que se intercalan entre los nucleótidos del ADN y producen adiciones de un solo par de nucleótidos. Entre los componentes químicos intercalantes se encuentran la proflavina, la acridina y el etidio. Cuando estas adiciones se producen en un gen, puede producirse consecuencias importantes en la traducción de su ARNm, ya que altera la secuencia codificadora en su marco de lectura correcto.

Análogos de bases. Son compuestos químicos con estructura similar a la de las bases nitrogenadas normales y se pueden incorporar al ADN en lugar de éstas. Debido a que los análogos de bases presentan diferencias estructurales con las bases convencionales, se aparean de forma incorrecta, lo que provoca errores frecuentes en el proceso de replicación. El 5-bromouracilo (5BrU) es análogo de la timina que contiene un bromo en el carbono 5. En su forma cetónica, el 5BrU forma un par de base con la adenina, mientras que en su forma enólica lo hace con la guanina. Si se incorpora la forma cetónica del bromouracilo, se produce una transición AT-GC y si se incorpora la forma enólica se produce una transición GC-AT (figura 9-2).

Energía ionizante. La exposición del ADN a la luz ultravioleta (UV) produce dímeros de pirimidinas, sobre todo de timinas, cuando hay dos timinas consecutivas en la misma cadena de ADN. La luz UV produce que se formen enlaces covalentes entre dos pirimidinas contiguas, lo que interfiere con la unión normal de las bases nitrogenadas con la cadena complementaria. La radiación UV induce también transiciones GC–AT, transversiones, mutaciones con cambio de marco de lectura, duplicaciones y deleciones (véase el capítulo 8). La radiación ionizante produce daño directo en las bases nitrogenadas del ADN e induce la gene-ración de especies reactivas de oxígeno. Además, produce roturas del enlace N-glucosídico que conducen a la formación de sitios apurínicos, así como rompimientos en la doble cadena del ADN, responsables de efectos letales en la célula. Estas lesiones ocasionan cambios permanentes en el ADN que pueden alterar la secuencia codificadora o reguladora de un gen e impedir el uso del ADN como plantilla para la replicación y transcripción.

Para minimizar el daño del material genético el organismo dispone de diversos sistemas de reparación que se activan dependiendo del tipo de daño provocado en el genoma. Estos mecanismos de reparación se pueden clasificar en cuatro categorías: reparación directa, reparación por escisión, reparación de emparejamientos erróneos (apareamientos incorrectos) y reparación de roturas de doble cadena.

Reparación directa

La reparación directa involucra sistemas que eliminan directamente el daño en el ADN inmediatamente después de producidos. Este tipo de reparación no es muy común, ya que hay algunos daños en el ADN irreversibles. La fotorreactivación es el mecanismo de organismos procariotes mediante la enzima fotoliasa para reconocer los dímeros de pirimidinas producidos por la luz UV. Esta enzima se une al dímero de timina y utiliza la energía de la luz para romper los enlaces covalentes entre las pirimidinas, con lo que logra que vuelvan a formar complementariedad con la cadena antiparalela (figura 9-3). Otro tipo de enzimas que participan en este sistema de reparación son las alquiltransferasas, enzimas que eliminan los grupos alquilos de la guanina y restauran la estructura original, sin la necesidad de alterar el esqueleto del ADN.

Sistemas de reparación por escisión: reparación por escisión de bases y reparación por escisión de nucleótidos

Reparación por escisión de bases

El sistema de reparación por escisión de bases (base excision repair, BER) elimina del genoma las bases dañadas que se producen por alquilación, radiación ionizante, oxidación y desaminación. En este sistema intervienen las enzimas denominadas ADN glucosilasas, de las cuales existen por lo menos ocho tipos distintos específicos para cada lesión. La reparación se realiza hidrolizando el enlace glucosídico entre la base nitrogenada y el azúcar, con lo que se elimina la base dañada. Esta rotura genera sitios apurínicos o apirimidínicos reconocidos por una AP endonucleasa 1 (APE-1) que rompe el enlace fosfodiéster adyacente. Posteriormente, la ADN polimerasa β adiciona los nucleótidos para rellenar el hueco generado empleando la cadena que no está dañada como molde. El fragmento recién sintetizado forma el enlace fosfodiéster faltante para su ligación gracias a la ligasa (figura 9-4).

Reparación por escisión de nucleótidos

El sistema de reparación por escisión de nucleótidos (nucleotide excision repair, NER) reconoce cualquier lesión que provoque una distorsión importante en la doble cadena del ADN. Implica en primer lugar el reconocimiento del daño en la secuencia del ADN; posteriormente, una endonucleasa hidroliza los enlaces fosfodiéster a cada lado y varios pares de bases de distancia de la lesión, y se elimina el fragmento de ADN de cadena sencilla que presenta la lesión. El hueco que se genera por la rotura se rellena con ayuda de la ADN polimerasa I y, por último, la ligasa sella la cadena que se sintetiza. Defectos en las proteínas de este sistema provocan el síndrome xeroderma pigmentosa (XP).

En Escherichia coli esta reparación la llevan a cabo cuatro proteínas: UvrA, UvrB, UvrC y UvrD (UV resistant). UvrA y UvrB se unen para formar un complejo que se encarga de reconocer las distorsiones en la cadena de ADN. Una vez que localizan el daño, UvrA se disocia del complejo; UvrB separa la doble cadena de ADN; a continuación, UvrC se une a UvrB, y el complejo corta a siete nucleótidos de distancia en dirección 5´ y cuatro en dirección 3’ del sitio de la lesión. Posteriormente, UvrD, una helicasa, ayuda a liberar el fragmento y, por acción de la ADN polimerasa I y la ligasa, se rellena el hueco generado con el corte (figura 9-5).

Sistema 8-oxo guanina

La radiación UV, la radiación ionizante y algunos agentes químicos pueden provocar que las bases del ADN se oxiden. Una base muy susceptible de oxidación por especies reactivas de oxígeno (ROS) es la guanina, que como consecuencia se transforma en 8-oxo guanina (GO) u 8-hidroxiguanina, que en lugar de unirse a la citosina se unirá a una adenina y producirá un par erróneo G-A. Este error ocasionará, después de la replicación, una sustitución de C por A en el genoma, error que si no se repara se transmitirá a la siguiente generación como un cambio permanente.

En humanos, una enzima llamada ADN OGG1 reconoce a la adenina unida con la GO, elimina la base incorrecta (adenina) y la sustituye por la citosina correcta (figura 9-6). Las enzimas participantes en este sistema en procariotes son mutM y mutY (metil-directed mismatch repair).

Sistema de reparación de los apareamientos erróneos

Este sistema se basa en la reparación de las bases mal apareadas y la corrección de los bucles que se producen en la cadena de ADN como consecuencia del deslizamiento de la polimerasa durante la replicación. El ejemplo más clásico de este sistema de reparación es el que utiliza E. coli, en el que participan tres proteínas: MutS, MutL y MutH. La proteína MutS reconoce las bases mal apareadas y se une a ellas; MutL permitirá que se forme el complejo de reparación y, a su vez, activará MutH, con actividad de endonucleasa; además producirá la rotura de la cadena donde se localiza la base mal apareada, y MutH tiene la capacidad de discriminar la cadena que se tiene que reparar por el fenómeno de hemimetilación. La enzima Dam metilasa (ADN adenine methylation) se encarga de la metilación de la secuencia 5´-GATC-3´ en las dos cadenas, por lo que después de que ocurra la replicación del ADN, la única cadena metilada será la parental, mientras que la cadena de nueva síntesis no estará metilada y se reconocerá como la cadena que se ha de reparar. Una vez que se elimina el segmento con la base mal apareada, la polimerasa III añade la base correcta (figura 9-7). Este sistema de reparación también puede encontrarse en células eucariotas, donde participan dos proteínas: la MSH y MLH, análogos de MutS y MutL, respectivamente. Un defecto en este sistema provoca inestabilidad cromosómica asociada a enfermedades como el cáncer de colon.

Sistema SOS

Este sistema responde a la acumulación de ADN de cadena sencilla cuando el proceso de replicación se bloquea. Está integrado por más de 40 genes, que son activados por la proteína RecA (recombination protein A) en procariotes. En ausencia de daño, los genes SOS (save our soul) se encuentran unidos a su represor LexA. El ADN de cadena sencilla es una señal de activación para la proteína RecA que se une al ADN de cadena sencilla (ADNss) e interactúa con el represor LexA, lo que facilita su autoproteólisis; esto induce la transcripción de los genes que contienen la caja SOS (figura 9-8). Con ello, aumentan los niveles de las proteínas lexA, recA, UvrA, UvrB y UvrD. Por tanto, el primer mecanismo de reparación que se activa en respuesta a SOS es la reparación por escisión de nucleótidos (NER), que tratará de corregir el daño sin un encendido total de la vía SOS. Si el sistema NER no es suficiente para la reparación del ADN, las concentraciones de LexA disminuyen y se expresan genes como sulA, umuD y umuC (UV-induced mutagenesis). La proteína SulA se une a FtsZ (molécula indispensable para el inicio del ciclo celular) y detiene la división celular. Con ello, se induce al sistema de reparación Umu-DC dependiente de mutagénicos.

Reparación de roturas de doble cadena

Reparación por recombinación homóloga

Es un sistema de reparación preciso que actúa durante la fase S del ciclo celular. Durante el proceso de replicación, este sistema se induce por la necesidad de tener una copia de ADN correcta que sirva como molde para restaurar la información perdida en la cadena dañada. En este sistema de reparación están involucrados los genes que pertenecen al grupo de epistasia de RAD52 (radiation sensitive mutant 52), como RAD50, RAD51, RAD52, RAD55, RAD57, RAD59 y el complejo MRN formado por MRE11 (meitoic recombination 11), RAD50 y NBS1 (Nijmegen breakage syndrome 1). Además, intervienen otros genes, como BRCA1 y BRCA2 (cáncer de mama 1 y 2). En humanos, RAD51 desempeña un papel primordial en los mecanismos de recombinación homóloga para la reparación de roturas en la doble cadena del ADN. La recombinación homóloga implica gasto e hidrolisis de adenosín trifosfato (ATP) para el intercambio de la cadena de ADN, por secuencias homólogas. El primer paso para la reparación por recombinación homóloga involucra la activación del gen de la ataxia-telangiectasia mutado (ataxia telangiectasia mutated, ATM) que recluta el complejo MRN para que se una al ADN y, por su actividad de exonucleasa 5’-3’, procesa los extremos donde ocurrió el daño dejando expuestos los extremos 3´ en forma de cadena sencilla. A continuación, la proteína de replicación A (RPA) se une al ADN de cadena sencilla e interactúa con RAD52; éste es desplazado por BRCA2, que atrae a RAD51. Por último, RAD51 se une a la cadena sencilla y forma una nucleoproteína filamentosa con el ADN. Con ayuda de RAD54 invade la hélice homóloga que sirve como molde para restaurar el fragmento dañado (figura 9-9). Alteraciones en las proteínas que participan en este sistema provocan el síndrome de Bloom, la ataxia-telangiectasia y la anemia de Fanconi, que se describirán más adelante.

Unión de extremos no homólogos

Este sistema es uno de los que pueden participar cuando se producen roturas en la doble cadena de ADN. El componente principal de este sistema es la proteína de cinasa dependiente de ADN (ADN-PKcs), que consta de tres subunidades: KU70, KU80 y la subunidad catalítica ADN-PKcs. Estas subunidades reconocen los cortes en el ADN y mantienen los extremos en proximidad para su procesamiento y reunión. Para que se lleve a cabo el alineamiento de los extremos es necesario el complejo ARTEMIS/ADN-PKcs, con actividad de nucleasa y el complejo XRCC4/ligasaIV, que se encarga del paso final de la ligación (figura 9-10). Este proceso puede tener varios errores, ya que únicamente une los extremos rotos, lo que conlleva la pérdida de nucleótidos en el punto de unión. Este proceso se lleva a cabo principalmente en mamíferos; sin embargo, también se ha encontrado en algunas procariotas, lo que sugiere que está muy conservado evolutivamente.

Muchas de las anomalías cromosómicas que generan enfermedades en la especie humana aumentan con la edad, pues los mecanismos de reparación tienden a fallar con más frecuencia. Sin embargo, también existen síndromes de inestabilidad cromosómica cuyo patrón de herencia es autosómico recesivo, caracterizados por una alta frecuencia de alteraciones cromosómicas en edades tempranas. Estas enfermedades implican defectos en los mecanismos de reparación del ADN. Los síndromes clásicos de inestabilidad cromosómica son: síndrome de Bloom, anemia de Fanconi, ataxiatelangiectasia, xeroderma pigmentoso, los cuales presentan anormalidades estructurales de los cromosomas, como roturas, puentes intercromosómicos, tétradas, entre otras. La expresión clínica de cada una de estas entidades es variable y se observa un incremento en la frecuencia de neoplasias.

Síndrome de Bloom

Presenta características clínicas, como eritema telangiectásico en la cara, antebrazos y el dorso de las manos, fotosensibilidad, enanismo, manchas café con leche, alteraciones esqueléticas y neoplasias. A nivel celular se presentan intercambios entre cromátidas hermanas, roturas cromosómicas y reordenamientos. Las células son hipersensibles a la luz UV, la hidroxiurea (HU) y agentes alquilantes. El síndrome de Bloom lo causan mutaciones en el gen BLM, que codifica una proteína de la subfamilia RecQ de las ADN helicasas dependientes de ATP. Estas proteínas participan en la reparación, replicación y reparación por recombinación homóloga. BLM es un miembro del complejo BASC y contiene otros miembros que participan en los procesos de reparación, replicación y recombinación, como PCNA, RAD51, BRCA1, ATM y el complejo MRN. También actúa en la respuesta temprana al daño celular y promueve el posterior reclutamiento de proteínas de reparación en las horquillas de replicación.

Anemia de Fanconi

Es una enfermedad genética autosómica recesiva ligada al sexo, caracterizada por un conjunto de malformaciones congénitas, aplasia medular progresiva, con una prevalencia de 80%, y predisposición tumoral –más de 60% de los cánceres son hematológicos. Entre las alteraciones más frecuentes destacan la baja estatura, anomalías esqueléticas en antebrazos, dedos, cadera y rodillas, malformaciones renales y cardiacas, manchas café con leche, microcefalia, retraso mental leve e hipogonadismo en varones. La prevalencia de la anemia de Fanconi es de 1 a 5 nacimientos por cada millón de habitantes y se encuentra con una frecuencia de 0.3 a 1%, aunque estas cifras dependen del grupo étnico de que se trate así como del grado de consanguinidad.

La anemia de Fanconi es una enfermedad con heterogeneidad no sólo clínica sino también genética. Existen al menos 11 genes diferentes involucrados en la FA (FANCA, FANCB, FANCC, FANCD o BRCA2, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, FANCI, FANCJ, FANCL). Los defectos en cualquiera de los genes de anemia de Fanconi conllevan inestabilidad genómica y un riesgo elevado de presentar leucemias y carcinomas. El descubrimiento de BRCA2 como uno de los genes de la anemia de Fanconi fortalece el papel de esta enfermedad en el procesamiento de roturas de doble cadena mediante recombinación homóloga.

Ataxia-telangiectasia

Es un síndrome genético con un complejo fenotipo clínico. Las principales características clínicas son degeneración neuronal progresiva, telangiectasia ocular, inmunodeficiencia, hipogonadismo, envejecimiento prematuro, inestabilidad genómica y predisposición al cáncer. A nivel celular, se presenta inestabilidad cromosómica, hipersensibilidad a las radiaciones, defectos en los puntos de control del ciclo celular, acortamiento telomérico y alto nivel de especies reactivas de oxígeno.

La ataxia-telangiectasia es causada por defectos en el gen supresor de tumor ATM. En respuesta a las roturas de doble cadena, ATM fosforila rápidamente una serie de proteínas involucradas en vías de señalización, como p53 o Mdm2, así como otras proteínas de reparación, como RAD50-MRE11-NBS1 y BRCA1, relacionadas con síndromes de inestabilidad cromosómica.

Xeroderma pigmentoso

Es una enfermedad cutánea multigénica caracterizada por una elevada sensibilidad a todas las fuentes de radiación UV. Las personas afectadas presentan envejecimiento prematuro, lesiones oculares, trastornos neurológicos y una elevada predisposición a desarrollar cáncer de piel. El xeroderma pigmentoso es causado por defectos en uno o varios de los ocho genes XPA-XPG, más una variante, XPV; por lo tanto, existen nueve subtipos clínicos de la enfermedad, que incluyen varias manifestaciones cutáneas y neurológicas. Estos genes codifican para las proteínas que participan en los mecanismos de reparación NER, por lo que las mutaciones en los genes XPA-XPG son las responsables de la inestabilidad genómica presente en los pacientes con xeroderma pigmentoso.