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La implementación y realización de las técnicas moleculares debe llevarse a cabo por personal altamente capacitado en el área de biología molecular. Sin embargo, los resultados que se obtengan no sólo dependerán de la prueba molecular que se emplee, sino también de la toma y conservación de la muestra de manera apropiada. De este modo, la metodología utilizada, bien sea simple o sofisticada, económica o costosa, no será confiable si no se parte de una muestra manejada de forma adecuada. En general el personal encargado de la toma, el transporte y del procesamiento de la muestra no es el mismo, por lo que es importante que cada uno de los implicados en el proceso conozca los cuidados y las consideraciones necesarios para evitar resultados erróneos. El manejo de muestras implica tres pasos fundamentales: selección, toma y preservación de la muestra.
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Selección de la muestra: ¿qué muestra debo estudiar?
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Debe elegirse la muestra que contenga el ácido nucleico de interés. De aquí surgen dos alternativas: estudio de ácidos nucleicos del individuo o detección de ácidos nucleicos exógenos. En la figura 10-1 se señalan algunos casos en los que pueden aplicarse los análisis moleculares y el tipo de muestra adecuado para tal fin.
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Estudio de ácidos nucleicos de un individuo
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En un individuo se puede estudiar su estructura genómica (ADN) o la expresión de sus genes (ARN) en una situación u órgano específicos.
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ANÁLISIS DE LA ESTRUCTURA GENÓMICA DE UN INDIVIDUO
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Para este tipo de estudios la molécula de interés es el ADN genómico que se encuentra en el núcleo de las células. Todas las células de un individuo poseen el mismo genoma, que no se ve afectado por la edad ni por variables metabólicas. Por ello, la muestra para estudiar la estructura genómica de un individuo puede ser cualquier célula nucleada. Sin embargo, hay que elegir la muestra que involucre el procedimiento menos invasivo y la menor cantidad de riesgos e incomodidad para el paciente.
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La muestra de elección para el análisis de la estructura genómica de un individuo es sangre periférica con anticoagulante; ésta contiene glóbulos blancos, glóbulos rojos y plaquetas. Las únicas células de este tejido que poseen núcleo, y por ende ADN, son los leucocitos, a partir de los cuales es posible extraer ADN genómico.
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El análisis del ADN de una persona es importante, ya que permite identificar individuos, detectar polimorfismos génicos de predisposición o protección a ciertas enfermedades, analizar mutaciones y establecer el diagnóstico de enfermedades genéticas.
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ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN GÉNICA DE UN INDIVIDUO
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Para este análisis la molécula de interés es ARN mensajero (ARNm). El estudio de la expresión génica de un individuo revelará los cambios bioquímicos que experimenta el organismo en respuesta a una situación particular o momento metabólico. La expresión génica se regula de manera espacial y temporal, y la regulación espacial representa la base de la diferenciación celular. Esto significa que los genes no se expresan en todos los tejidos, sino que cada tejido u órgano expresa solamente los genes necesarios para llevar a cabo su función; por ejemplo, la insulina se expresa en las células beta del páncreas, la albúmina en los hepatocitos, la mielina en las células de Schwann del sistema nervioso central, etc. Por otro lado, la regulación temporal significa que la expresión génica depende del momento metabólico en el que se encuentre el individuo: en un individuo sano o enfermo, en estado de ayuno o posprandial, en un embrión o en un anciano, o en estado de euforia o tristeza. Por esto, el individuo, como tal, es el resultado de la expresión de sus genes en un momento determinado. Estudiar la expresión génica resulta elemental en investigación para evaluar la respuesta a una variable específica y contribuir al conocimiento de la fisiología y patología humanas. Sin embargo, en la práctica médica, el estudio de la expresión de genes es complejo, y aún no supone una herramienta de diagnóstico de uso común, al alcance de todos, que brinde resultados que dicten o modifiquen estrategias de tratamiento clínico de manera significativa.
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La muestra de elección dependerá del tejido donde se exprese el gen de interés: si se expresa en leucocitos, la muestra será sangre periférica con anticoagulante; si lo hace en el hígado, una biopsia de hígado, y si se expresa en tejido tumoral, una biopsia del tejido sospechoso; por ejemplo, si se desea conocer qué tanto se expresa el gen de la telomerasa en un tumor de cáncer de pulmón, la muestra indicada será la biopsia del tumor.
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Detección de ácidos nucleicos exógenos
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Las técnicas de biología molecular permiten la detección del ADN procedente de cualquier fuente ajena al paciente, como bacterias y virus de ADN, por lo que constituyen una herramienta útil para el diagnóstico molecular de enfermedades causadas por microorganismos. Mycobacterium tuberculosis es un buen ejemplo, ya que es una bacteria de crecimiento lento cuyo diagnóstico mediante cultivo microbiológico puede requerir hasta cinco semanas; mientras que las técnicas moleculares permiten su detección en 24 a 48 horas. Sin embargo, para la identificación de otros microorganismos, el cultivo microbiológico es una herramienta económica, sensible, rápida y específica. Por tal motivo, es recomendable que los estudios moleculares no se apliquen en forma indiscriminada.
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Para la detección de genomas exógenos, la muestra dependerá de la historia natural del microorganismo infectante; por ejemplo, en la detección del virus de la hepatitis B (VHB), se sabe que éste es un virus hepatotrófico que al replicarse produce lisis celular y que los virus se diseminan por todo el organismo a través del torrente sanguíneo; por ello, la muestra de elección es sangre periférica sin anticoagulante para la obtención de suero mediante centrifugación.
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La detección de ARN exógeno a través de estudios moleculares es una práctica continua en investigación, y en algunos casos específicos de aplicación clínica. Por ejemplo, la detección y la cuantificación del ARN del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y del virus de la hepatitis C (VHC) mediante estudios moleculares suponen una herramienta elemental en el monitoreo de su tratamiento.
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La muestra de elección dependerá, al igual que en la determinación de ADN, de la historia natural de la partícula viral infectante. Tanto en el caso del VIH como en el del VHC, su historia natural permite establecer que el espécimen adecuado es suero procedente de una muestra de sangre periférica sin anticoagulante.
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Toma de la muestra: ¿cómo debe tomarse la muestra?
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En la toma de muestras para estudios moleculares deben considerarse algunos factores y recomendaciones que se mencionan a continuación. Si la muestra es sangre periférica, no es indispensable el estado de ayuno, ya que la ingesta de alimento no modifica la concentración ni la estructura de los ácidos nucleicos; sin embargo, es recomendable el ayuno para evitar que la alta concentración de lípidos de la muestra interfiera con la extracción de los ácidos nucleicos.
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Uso de material libre de nucleasas
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Las nucleasas (ADNsas y ARNsas) son enzimas altamente estables que degradan ARN, por lo que es necesario que se garantice la ausencia de estas enzimas en el material que se destine para análisis molecular, como lo son puntas y tubos de plástico, que deben ser nuevos, estériles y desechables. El material de vidrio y de metal puede someterse a temperatura de 230°C durante 8 horas para inactivar nucleasas.
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Uso de guantes y cubrebocas
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Las ADNsas y ARNsas se encuentran en la saliva y en el sudor, por lo que es obligatorio usar guantes y cubrebocas y su cambio frecuente cuando se trabaja con ácidos nucleicos.
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Las bacterias, los hongos y las células muertas de la piel son fuentes ricas en ARNsas, por lo que se recomienda tomar las muestras en un ambiente higiénico, limpiar las superficies de trabajo con agentes descontaminantes y utilizar inhibidores de ARNsas, como el fenol, el dietilpirocarbonato de sodio (DEPC) u otros agentes ofrecidos por diversas casas comerciales.
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Se dispone de diversas sustancias que inhiben la cascada de la coagulación y que se utilizan en la toma de muestras. El ácido etilendiaminotetracético (EDTA) es un quelante de calcio y es el anticoagulante empleado con más frecuencia. Otro anticoagulante muy común es el citrato de sodio. Ambos pueden utilizarse para toma de muestras de sangre que se someterán a estudios moleculares. No se recomienda el uso de heparina, ya que puede interferir en procedimientos posteriores, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
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ADN o ARN de glóbulos blancos
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Para aislar ADN o ARN a partir de glóbulos blancos, debe tomarse una muestra de sangre periférica en un tubo nuevo, estéril con anticoagulante, EDTA o citrato de sodio. La cantidad de sangre dependerá del método de extracción de ácidos nucleicos que vaya a emplearse y de la cantidad de éstos que se requiera. Para la obtención de ADN, las muestras pueden guardarse a 4ºC hasta por cinco días sin que afecte de manera significativa a la cantidad de ADN. Para la obtención de ARN el procesamiento debe ser, de preferencia, de inmediato, para evitar la degradación por ARNsas.
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Se toman 3 ml de sangre periférica en un tubo seco. Se deja a temperatura ambiente el tiempo mínimo necesario para permitir la formación del coágulo (máximo, 20 minutos). Enseguida, la muestra se centrifuga a 3 000 rpm durante 10 minutos; se separa el suero, y se transfiere a un tubo nuevo y estéril. El suero se somete al proceso de extracción de ácidos nucleicos adecuado, o bien se almacena a -20ºC hasta su procesamiento. El paquete globular se desecha de acuerdo con las normas sanitarias de seguridad para desechos de material biológico contaminante.
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ADN o ARN de biopsias
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La expresión génica constituye el fundamento de la diferenciación celular, por lo que el estudio de la expresión génica de un individuo involucra la toma de una biopsia del tejido de interés. También puede realizarse la búsqueda de ácidos nucleicos exógenos en un tejido específico. La toma de biopsia no es un procedimiento simple sistemático, sino que debe realizarlo personal médico experto. Es un método invasivo que representa un riesgo para el paciente y requiere del uso de equipos costosos; por ejemplo, en el caso de infección por el VHB en estadio no replicativo, una biopsia hepática podría servir tanto para evaluar el grado del daño hepático mediante el estudio de la expresión de colágena (ARN del huésped), como para llevar a cabo la búsqueda del virus (ADN viral). La toma de la biopsia hepática debe dirigirse con un equipo de ultrasonido, y el paciente debe permanecer en reposo total después del procedimiento, oprimiendo el sitio de la punción durante por lo menos 12 horas para evitar hemorragias y complicaciones.
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Otros fluidos biológicos
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En el caso de orina, líquido cefalorraquídeo o líquidos de punción, es necesario tomar la muestra en recipientes nuevos, estériles, con las precauciones de limpieza y esterilidad indicadas en este capítulo.
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Preservación. ¿Qué variables afectan la estabilidad de los ácidos nucleicos?
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Los ácidos nucleicos son susceptibles de degradarse por las nucleasas existentes en todas las células. La preservación de los ácidos nucleicos está dirigida a la inactivación de nucleasas, por lo que las principales variables que afectan la integridad del ADN y el ARN aislados o dentro de las muestras son la temperatura y el tiempo. Debido a las características fisicoquímicas y estructurales de los ácidos nucleicos, el ARN es una molécula mucho más sensible a la acción de nucleasas que el ADN, por lo que los cuidados para su preservación suelen ser más estrictos. El ADN aislado puede mantenerse viable a 4ºC durante varias semanas, a -20ºC durante varios meses y a -70ºC durante años. Pueden utilizarse inhibidores de ADNsas, cuando el ADN sea la molécula en estudio, o bien inhibidores de ARNsas, cuando se tenga interés en estudiar ARN. Una recomendación valiosa es colocar la muestra desde el momento de la toma en varias alícuotas para evitar congelamientos y descongelamientos repetidos que favorezcan la degradación de los ácidos nucleicos.
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Como ya se explicó, las biopsias se emplean generalmente para estudiar la expresión génica, es decir, ARN; aunque también puede extraerse ADN exógeno o del paciente. Sin embargo, los cuidados en el manejo de las biopsias están dirigidos principalmente a la preservación de ARN por ser una molécula fácilmente degradable. Los tejidos contienen ARNsas endógenas que pueden inactivarse a baja temperatura. Se recomienda el uso de nitrógeno líquido para congelar el tejido inmediatamente después de su recolección, ya que su temperatura se encuentra por debajo de los -196ºC, y transportarlo en él hasta el sitio donde se almacenará o procesará para la extracción de ácidos nucleicos. Sin embargo, la congelación con nitrógeno líquido no siempre es una opción viable, y existen algunas soluciones en el mercado para preservar la integridad del ARN en tejidos, almacenando la muestra a 4ºC hasta por un mes antes de aislar el ARN. Finalmente, las biopsias pueden mantenerse dentro de un ultracongelador a -70ºC, o bien en nitrógeno líquido por tiempo indefinido antes de la extracción de ácidos nucleicos.
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Siempre que la molécula de interés sea ARN, las muestras deben mantenerse a -70ºC o en nitrógeno líquido, hasta que se lleve a cabo la extracción de ARN.
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Las muestras de sangre para obtención de leucocitos y la posterior extracción de ADN pueden mantenerse a temperatura ambiente entre 15ºC y 25ºC, hasta por 48 horas; a 4ºC por varios días, o indefinidamente a -70ºC. Sin embargo, para garantizar la obtención de ADN en buena cantidad y de buena calidad utilizando métodos económicos de extracción, debe llevarse a cabo la extracción lo más pronto posible.
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El suero debe mantenerse a -70ºC o en nitrógeno líquido.
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Uso de métodos comerciales
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En la actualidad, el desarrollo de la biología molecular y la ingeniería genética han permitido el diseño de moléculas o sustancias que preservan la integridad de los ácidos nucleicos manteniendo las muestras a -20ºC, 4ºC y aun a temperatura ambiente. Asimismo, se dispone de métodos comerciales para la extracción de ácidos nucleicos de muestras no frescas, que ofrecen un rendimiento aceptable a partir de muestras no almacenadas de manera adecuada. Obviamente esta diferencia en el rendimiento se refleja también en el costo, ya que un método casero de extracción de ácidos nucleicos podrá tener un costo 100 veces menor que uno comercial. La cuidadosa preservación de las muestras garantizará resultados fidedignos y la disponibilidad de ADN o ARN para llevar a cabo ensayos por triplicado y asegurar resultados libres de errores, al ofrecer una cantidad y una calidad de ácidos nucleicos buenas en la muestra, aun utilizando métodos económicos y sencillos de extracción.