Capítulo 11: Extracción de ácidos nucleicos

Los ácidos nucleicos, el ADN y ARN reciben su nombre del hecho de ser moléculas con características acídicas (como la carga negativa en soluciones acuosas) y haberse localizado inicialmente en el núcleo celular, aunque ahora se sabe que también se encuentran en la mitocondria. Para su estudio los ácidos nucleicos deben aislarse del resto de los componentes celulares, como lípidos y proteínas, más abundantes que los ácidos nucleicos. Asimismo, dependiendo del objeto de estudio debe aislarse de preferencia el ADN o ARN; así, para estudios de niveles de expresión génica se extraerá ARN, mientras que para la búsqueda de modificaciones o alteraciones génicas, ADN.

La molécula de ADN con independencia de la estabilidad química dada por su estructura helicoidal, es físicamente frágil, por ser larga, tortuosa y con un peso molecular alto, lo que provoca que se someta a fuerzas hidrodinámicas que la disgregan. En solución, el ADN de doble cadena (ADNds) se comporta como una estructura rígida enrollada de forma aleatoria, regida por las repulsiones electrostáticas de las pares de bases y el esqueleto de fosfatos cargados negativamente. Al pipetear, agitar o revolver el ADN se genera un flujo hidrodinámico que puede separar las dos cadenas de ADN; entre más larga la molécula, más débil la fuerza requerida para esta rotura. Por ello, obtener fragmentos de ADN genómico es fácil, pero conforme se requieran tamaños moleculares elevados (> 150 kb) la técnica se dificulta. Los fragmentos de ADN generalmente obtenidos por las técnicas de extracción de ADN oscilan entre 100 y 150 kb y son adecuados para Southern blot, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), electroforesis y construcción de bibliotecas genómicas.

Elección del método de extracción

La extracción de ácidos nucleicos es el primer paso para la mayoría de los estudios en biología molecular y para las técnicas del ADN recombinante. En la actualidad, se dispone de múltiples metodologías de extracción, lo que permite que los biólogos moleculares puedan seleccionar la técnica que más se ajuste a sus necesidades. La elección del método de extracción suele realizarse en función de los siguientes criterios:

• Tipo de ácido nucleico que se va a extraer: ADN de cadena sencilla (ADNss), DNAds, ARN total, ARN mensajero (ARNm) o ARN ribosomal (ARNr).

• Organismo origen del ácido nucleico: mamíferos, plantas, procariotes o virus.

• Fuente del ácido nucleico: cultivo celular, tejido (generalmente biopsia), sangre (leucocitos), expectoración, suero, orina, líquido cefalorraquídeo, etcétera.

• Técnica en que se utilizará el ácido nucleico extraído: según el uso que vaya a tener el ácido nucleico los requerimientos de rendimiento, pureza y tiempo de extracción variarán acorde a la metodología que se vaya a aplicar, como retrotranscripción, PCR, clonación, Northern blot, Southern blot, etcétera).

En el área médica, el ADN genómico suele extraerse para su uso en procesos como una PCR cualitativa o Southern blot, para diagnóstico, determinación de variantes alélicas o clonación en vectores. En cambio, el ARN se extrae para realizar una reacción de retrotranscripción y, posteriormente, una PCR que determine los niveles de expresión génica en condiciones y momentos determinados. El ADN mitocondrial, por su parte, se extrae para diagnóstico de enfermedades mitocondriales o bien análisis evolutivo; pero el aislamiento de este ADN conlleva un proceso específico.

Fuente del ácido nucleico

En teoría el ADN/ARN puede obtenerse de cualquier célula/virus que lo contenga; solamente los eritrocitos no se consideran una fuente de ADN/ARN, ya que son anucleados. Las fuentes posibles de material para la extracción de los ácidos nucleicos son: leucocitos (sangre), suero, plasma, biopsia, orina, heces, líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial, líquido anmiótico, esputo, semen, raspado bucal, folículo capilar, etc. Por acuerdos éticos, se prefieren las muestras no invasivas frente a cualquier tipo de biospia o toma invasiva de líquido. En el cuadro 11-1 se ejemplifica el ácido nucleico adecuado, así como la muestra de elección según el tipo de enfermedad que se desee diagnosticar.

Con independencia del tipo de muestra utilizada para la extracción, es una técnica minuciosa, que involucra lisis de la célula, separación, purificación, precipitación, lavado y disolución. Durante la extracción de ácidos nucleicos, y en particular en la extracción del ARN, que es una molécula más lábil ya que es de cadena sencilla, debe considerarse el uso de material nuevo, estéril, libre de ADNsas y ARNsas, y el uso de guantes para impedir la degradación de la muestra con nucleasas provenientes del ambiente (pelo, sudor, saliva, polvo), así como para impedir cualquier contaminación con ácidos nucleicos exógenos. Todo el proceso debe realizarse en frío; esto es, con los reactivos y las muestras a 4°C antes y durante el proceso, conservando la muestra congelada hasta justo antes de iniciar la extracción.

Las técnicas comunes de extracción de ácidos nucleicos son muy diversas e incluyen procesamientos químicos y físicos que las diferencian; cada una presenta ventajas y desventajas, que se agrupan en el cuadro 11-2.

Extracción de ADN por la técnica fenol-cloroformo

Esta técnica se fundamenta en la lisis total de las células y sus estructuras subcelulares mediante el empleo de detergentes con la posterior eliminación de las proteínas mediante su extracción y la de componentes lipídicos con solventes orgánicos. Esto deja al ADN puro listo para su separación por precipitación en soluciones alcohólicas. Es la técnica más empleada, por la cantidad y la calidad del ADN obtenido. A continuación se describen los pasos que implica esta metodología, esquematizados en la figura 11-1.

Lisis de las células y liberación del ADN

El primer paso en la extracción es la homogeneización del tejido y la lisis con detergentes (Triton o docedil sulfato sódico, SDS) capaces de romper las membranas celular y nuclear, y liberar el ácido nucleico de las células de donde se extraerá el ADN. El procedimiento de lisis celular es crítico y debe ser lo suficientemente agresivo como para lograr la fragmentación del tejido y la rotura de la membrana celular, sin dañar el ácido nucleico. La disgregación del tejido y su homogeneización se llevan a cabo en un buffer de lisis, que contiene sales, un detergente y proteinasa K, que libera el ADN de las histonas con las que se encuentra empaquetado y proteoliza proteínas celulares. La incubación con la enzima se realiza por 2 horas a 65°C. En el caso del ADN, la homogeneización se lleva a cabo con un homogeneizador manual para evitar la rotura mecánica de la molécula; para el ARN se emplea un homogeneizador eléctrico que gira a unas 200 a 1000 rpm. En el caso de células con pared celular, como las células vegetales, se prefiere el empleo de sonicadores, los cuales, mediante ondas de sonido, rompen la pared celular y la membrana celular y nuclear, para liberar el ADN. Cuando la extracción se lleva a cabo a partir de células de sangre periférica, se recomienda el empleo de tubos con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) como anticoagulante (EDTA 0.1 M al 0.02% V/V), ya que la heparina interfiere con enzimas como las polimerasas o las enzimas de restricción, que se emplearán en pasos subsiguientes. También es necesario retirar los eritrocitos, ya que por su alto contenido de hemoglobina y carencia de núcleo contaminan la muestra. La lisis de eritrocitos suele realizarse por adición de una solución hipotónica a base de cloruro de amonio. Los procedimientos comunes de lisis celular y su fundamento se incluyen en el cuadro 11-3.

La inactivación de nucleasas intracelulares previene la digestión enzimática de los ácidos nucleicos, lo que permite lograr la obtención de fragmentos relativamente largos de ADN y ARN. La lisis celular y la inactivación de las nucleasas intracelulares en general se llevan a cabo en el mismo paso, ya que la solución de lisis está compuesta por sales caotrópicas, como el EDTA, que secuestra cationes divalentes y, por lo tanto, inactiva las ADNasas.

Extracción de proteínas y lípidos con solventes orgánicos

Al concluir la lisis celular y la inactivación de nucleasas, se retiran los restos celulares, proceso conocido como purificación. Los métodos de purificación de ácidos nucleicos combinan estrategias tan diversas como la extracción/precipitación, la cromatografía, la centrifugación, la electroforesis y la separación por afinidad. Para la extracción por la técnica del fenol-cloroformo, se utiliza una solución que tiene una relación 25:24:1 v/v para el fenol:cloroformo:alcohol isoamílico; generalmente se añade hidroxiquinolina al 0.1%, que funciona como antioxidante del fenol, un inhibidor parcial de ARNsas, quelante débil de iones metálicos, y que ayuda a identificar la fase orgánica por el color amarillo que le confiere. El alcohol isoamílico se emplea para reducir la espuma que puede generarse al agitar esta solución. Esta solución desnaturaliza las proteínas (entre ellas las nucleasas) y mantiene la separación de la fase orgánica y acuosa tras la centrifugación de la muestra. La eliminación de las proteínas y componentes no hidrosolubles del homogenado celular se efectúa con la formación de dos fases con propiedades de solubilidad particulares a) una fase orgánica (fenólica) en la parte inferior del tubo de precipitado que contiene lípidos, proteínas y debris celulares, y b) una fase acuosa en la parte superior (menos densa), que contiene los ácidos nucleicos y otras pequeñas moléculas hidrosolubles. En la interfase se ubican la mayor parte de las proteínas debido a su contenido en aminoácidos hidrofóbicos e hidrofílicos, como se aprecia en la figura 11-2.

El ADN es poco soluble en fenol, por lo que previamente suele estabilizarse con una solución amortiguadora de Tris que lo mantiene en un pH de 8.0 a 8.5, lo que hace que el ADN permanezca en la fase acuosa. La modificación del pH de 8.5 a 5.2 en esta solución puede favorecer la extracción de ARN frente a la de ADN.

Precipitación de ADN

El ADN disuelto en la solución acuosa se precipita añadiendo alcohol absoluto (isopropanol o etílico), ya que los ácidos nucleicos son insolubles en soluciones alcohólicas. Cuando se emplea etanol (EtOH), la cantidad que se requiere para la precipitación es dos veces el volumen de la fase acuosa, mientras que con isopropanol (IprOH) se demanda solamente 0.7 veces el volumen de fase acuosa. Por otro lado, al emplear IprOH puede acelerarse el proceso, con un tiempo de incubación menor, y la precipitación puede realizarse a temperatura ambiente. Sin embargo, se ha reportado una mayor dificultad para disolver ácidos nucleicos precipitados con IprOH que con EtOH.

Para facilitar la precipitación también suelen añadirse cationes monovalentes (K⁺, Na⁺, NH4⁺) a la solución de ácidos nucleicos cargados negativamente, con el fin de generar sales insolubles en alcohol de fácil precipitación. Si la cantidad del ácido nucleico en la muestra es baja, es posible incrementar sus agregados utilizando algún compuesto inerte que se asocie a los ácidos nucleicos y aumente su precipitación, sin interferir en futuras reacciones, como por ejemplo el glucógeno, que por su gran tamaño molecular forma una red que arrastra al ADN y facilita su precipitación. La precipitación se favorece incubando a bajas temperaturas (–20°C); una centrifugación posterior permite la obtención de una pastilla o botón del ácido nucleico en el fondo del tubo, al decantar el alcohol.

Lavado del ADN

El botón de ADN obtenido en la precipitación se lava con etanol al 70% por, al menos, dos ocasiones. El contenido de alcohol de esta solución (70%) mantiene al ADN precipitado, y el H₂O (30%) permite la disolución de las sales presentes. Después de los lavados, se seca el botón, lo que permite la evaporación del alcohol (espontánea o acelerada en un desecador).

Disolución del ADN y adición de ARNsa

Inmediatamente después de la evaporación del alcohol, el botón de ADN se disuelve en soluciones que aseguren su preservación, como agua estéril y libre de ADNsas, o bien soluciones amortiguadoras, como el buffer Tris EDTA (TE). La cantidad de solución para disolver el ADN debe ser mínima para mantener una concentración adecuada del ácido nucleico que permita su empleo en técnicas posteriores, pero suficiente para lograr una disolución total del ADN. El ADN se disuelve por pipeteo constante del botón hasta lograr una solución homogénea. Los estudios indican que la disolución del ADN en buffer TE preserva por mayor tiempo y en mejores condiciones que cuando se disuelve en agua estéril; sin embargo, se prefiere disolver el ARN en agua-dietil pirocarbonato (DEPC) al 0.1%, lo que evita cualquier interferencia de las sales de las soluciones amortiguadoras y lo preserva de las ARNsas. Para eliminar el ARN contaminante proveniente de la extracción, la solución de ADN se incuba por una hora a 37°C con ARNsas para, así, evitar que el ARN interfiera en la cuantificación y en posteriores técnicas.

Existen diversos métodos de cuantificación de ácidos nucleicos; los más usados son la espectrofotometría y la fluorometría.

Espectrofotometría

El fundamento de la espectrofotometría es que cualquier solución que contenga moléculas suspendidas permite el paso de un haz de luz a través de ella en proporción inversa a la cantidad de moléculas que contiene. Los nucleótidos de ADN y ARN presentan la absorción máxima a una longitud de onda de 260 nm (luz ultravioleta, UV); por lo tanto, los espectrofotómetros son los aparatos más utilizados para determinar la concentración de ácidos nucleicos en solución. En la celda del espectrofotómetro un haz de luz atraviesa la solución de ácidos nucleicos y, cuando ha pasado por la muestra, un fotodetector mide la intensidad de luz absorbida. Mientras más luz absorba la muestra (absorbancia) mayor será la concentración de ácidos nucleicos. En la figura 11-4 se esquematiza el fundamento de la medición de concentración de moléculas en un espectrofotómetro.

La densidad óptica (OD) es la unidad de absorbancia y tiene valores particulares para cada molécula específica en una determinada longitud de onda por unidad de distancia. En el caso de los ácidos nucleicos, una OD de 1 a 260 nm equivale a 50 µg/ml de ADNds, 37 µg/ml de ADNss, 40 µg/ml de ARN o 33 µg/ml de oligonucleótidos. Según estos valores, se estableció la siguiente fórmula para el cálculo de la concentración de los ácidos nucleicos:

µg/µl de AN = OD a 260 nm × Dilución × constante / 1 000

En donde:

OD a 260 nm: absorbancia del ácido nucleico a 260 nm de longitud de onda.

Dilución: como se requieren volúmenes relativamente grandes de solución para cubrir la capacidad de las celdas de los espectrofotómetros, suelen manejarse diluciones 1:100 a 1:1000 del stock de ADN, en una solución en fosfato de sodio dibásico, 1.5 μM a pH 5.2 (Na₂HPO₄), que permite leer los nucleótidos sin interferencia. Algunos equipos permiten la lectura directa del ácido nucleico, como el espectrofotómetro NanoDrop™, usando volúmenes micrométricos (1 a 2 µM), donde la muestra no se diluye sino que se aplica directamente en el aparato.

Constante: proveniente del valor teórico de OD para cada ácido nucleico: a) 50 para el ADNds; b) 40 para ARN; c) 33 para oligonucleótidos, y d) 37 para ADNss.

Valoración de la pureza del ácido nucleico extraído

A pesar de que la técnica de extracción de ácidos nucleicos esté bien realizada, es prácticamente imposible eliminar la totalidad de las proteínas celulares que acompañan al ADN, así como solventes u otros componentes orgánicos empleados en la extracción, los cuales se presentan como contaminantes de la solución de ácido nucleico, lo que puede repercutir en las técnicas en que se pretenda emplear el ácido nucleico. Debido a que el espectro de absorción de luz de estas moléculas es característico, la absorción en otras longitudes de onda de la muestra de ácidos nucleicos se compara con la absorción a 260 nm, con el fin de valorar la pureza del ácido nucleico extraído. Así, para el cálculo de estos índices se procede a dividir la OD obtenida para la muestra de ácidos nucleicos a 260 nm entre la OD de interés.

Contaminación con proteínas: índice 260 ÷ 280

Dado que las proteínas (en particular los aminoácidos aromáticos) absorben luz a una longitud de onda de 280 nm, por lo común el índice de absorción 260÷280 nm se utiliza para valorar la pureza de los ácidos nucleicos con respecto a la contaminación con proteínas. Cuando éste se encuentra entre 1.8 y 2.0, se considera óptimo, ya que valores cercanos a 1.8 indican que la muestra contiene casi exclusivamente ADN; para el ARN el índice óptimo es de 2.0. La presencia de proteínas hará disminuir este cociente, por lo que si la relación 260÷280 es menor que 1.8 la cantidad de proteína en la muestra es alta y es conveniente realizar un nuevo proceso de extracción. Un índice mayor que valores de 2.0 indica una rotura de las cadenas de los ácidos nucleicos, y se considera que es un ácido nucleico de calidad insuficiente, por lo que en este caso también se recomienda una nueva extracción. Sin embargo, este índice no es infalible y puede modificarse si el pH del medio se modifica; la acidez puede hacer disminuir hasta 0.2 a 0.3 unidades el índice, mientras que la basicidad puede aumentarlo. Por otro lado, la composición de nucleótidos libres afecta también esta relación, ya que si se calculase el índice 260÷280 para cada nucleótido se obtendría: guanina: 1.15, adenina: 4.50, citosina: 1.51, uracilo: 4.00 y timina: 1.47; por ello, el ARN tendrá típicamente valores mayores que el índice 260÷280, por su contenido de uracilos, que difieren notablemente del índice que producen las timinas.

Contaminación con fenol: índice 260 ÷ 270

El fenol tiene un pico de absorbancia de 270 nm, por lo que a 260 nm todavía absorbe gran cantidad de luz. Debido a este efecto solapante, la contaminación con fenol (utilizado en la extracción) sobreestima de forma significativa la concentración de ácidos nucleicos. Las preparaciones de ácidos nucleicos sin contaminación fenólica presentan un índice 260÷270 de alrededor de 1.2.

Contaminación con fenol y sales: índice 260 ÷ 230

La absorción de luz UV a una longitud de onda de 230 nm significa que la muestra está contaminada con iones fenolatos o tiocianatos, péptidos, compuestos aromáticos u otras sustancias. Para muestras puras de ácidos nucleicos el índice 260÷230 se espera en el rango 2.0-2.2; muestras con un índice menor indican la presencia de contaminantes que absorben a 230 nm, como EDTA, carbohidratos y fenol. El TriZol™, empleado para la extracción de ARN, es una solución fenólica que absorbe luz UV tanto a 230 nm como a 270 nm.

Fluorometría

La cuantificación de ADN o ARN por fluorometría es 1000 veces más sensible que la espectrofotométrica, y menos susceptible a las interferencias por proteínas y contaminantes presentes en la solución. Esta metodología se basa en la unión específica de colorantes fluorescentes al ácido nucleico, que absorbe luz de una determinada longitud de onda y emite luz de una longitud de onda superior (de menor energía). La relación entre la concentración del ácido nucleico y la intensidad de emisión fluorescente es directamente proporcional. Esta técnica requiere de estándares de concentración conocida, contra el cual interpolar los valores de la muestra.

Los colorantes más empleados son el Hoechst 33258, una bis-benzimida que se intercala en la doble cadena de ADN en regiones ricas en AT, que se excita en el espectro UV (350 nm) y emite en el visible a 450 nm. Su sensibilidad es de aproximadamente 10 ng/ml. Para la cuantificación de ARN, se realiza un pretratamiento con ADNsas, y suele emplearse RiboGreen, un colorante que absorbe a ~500 nm y emite a ~525 nm. Su sensibilidad es de 1 pg/µl. La desventaja principal de esta técnica es que no proporciona información de la pureza (como el índice A260:A280), ni de la posible degradación del ARN o ADN, por lo que se requiere realizar una electroforesis para comprobar la integridad del ácido nucleico. En los fluorómetros, la señal electrónica para la misma concentración de una sustancia varía de un instrumento a otro, por lo que mediciones hechas en equipos diferentes no pueden compararse. Se recomienda medir la fluorescencia en soluciones diluidas, pues se corre riesgo de no iluminar por igual todas las partes de la solución y cuantificar de forma inadecuada las distintas capas de la solución.

Preservación del ADN

El ácido nucleico se mantiene en congelación (–80°C es la temperatura recomendada) hasta su empleo. Es bien sabido que a menor temperatura la preservación se prolonga, así como que múltiples descongelaciones ocasionan una degradación progresiva en los ácidos nucleicos, por lo que se recomienda hacer alícuotas. También se dispone de métodos comerciales para la preservación del ADN, como son los tubos GenTegra™ ADN, que contienen una matriz química inerte que permite el almacenamiento del ADN seco y a temperatura ambiente por días o meses sin hidrólisis u oxidación.

Si bien muchos pasos y soluciones son comunes al método de extracción por fenol-cloroformo, la principal diferencia en esta metodología radica en el empleo de una solución concentrada de sales en lugar de solventes orgánicos para la lisis celular y la extracción de proteínas. La adición de una solución saturada de sales provoca la agregación de proteínas y debris celular, lo que permite su separación de los ácidos nucleicos. Generalmente, estas soluciones se preparan a saturación con NaCl. Una centrifugación posterior a la adición de la solución concentrada de sales precipita el debris y las proteínas, y deja libre el ADN en el líquido del sobrenadante, que se traspasa a un nuevo tubo para su lavado y precipitado.

La extracción de ARN de células eucariotas se lleva a cabo para desarrollar estudios de expresión génica (análisis de los niveles de ARNm), para el diagnóstico de enfermedades ocasionadas por virus de ARN o, en el caso de bacterias, para análisis de expresión de genes o validar la clonación del ADN complementario (ADNc) en un vector. Al realizar la extracción de ARN de células eucariotas existen dos posibilidades: extracción de ARN total (ARNm, ARNr y ARN de transferencia, ARNt) y extracción oclusiva de ARNm. Es menos complejo y generalmente más barato la extracción de ARN total, y a menos que el ARNm sea sumamente escaso se opta por esta opción. También se dispone de kits comerciales basados en cromatografía de intercambio aniónico en fase sólida, que permiten purificar ARN total. Las células o tejidos se disgregan en una solución de tiocianato de guanidina para lisar las células e inactivar las ribonucleasas endógenas. El lisado celular se diluye con una solución alcohólica y se coloca en una columna de resinas de intercambio aniónico. La resina consiste en cuentas de sílica con superficie hidrofílica con tamaño de partícula reducido, hechas con cantidades elevadas de grupos dietil-amino-etil (DEAE). La purificación se basa en la interacción de estos grupos DEAE cargados positivamente con los grupos fosfatos (cargados negativamente) del ARN. Las proteínas y otros contaminantes son retirados con lavados. El pH y la concentración de sales de las soluciones amortiguadoras usadas en cada paso controlan la unión del ARN a la columna, la astringencia del lavado y la elución del ácido nucleico. El ARN unido a la columna se eluye con soluciones iónicas acuosas. El proceso es rápido, aunque la cantidad de ARN suele ser limitada; sin embargo, la calidad del ARN obtenido −de la cual se dice es la equivalente a dos rondas de purificación con gradientes de CsCl− es mayor, ya que no hay arrastre de fenol. Esto hace que la purificación por columna sea ideal para el ARN empleado en aplicaciones como la transfección, la microinyección, la clonación y la secuenciación.

Consideraciones especiales al trabajar con ARN

La molécula de ARN es sumamente lábil, por lo que la clave en la extracción es evitar su degradación por acción de ribonucleasas propias de la célula. Los protocolos existentes se basan en una rápida inactivación de ARNsas endógenas, muy estables y que no requieren de cofactores para funcionar. Es muy importante tomar precauciones para evitar la contaminación con ARNsas exógenas, por ejemplo, tratar el agua y soluciones salinas con inhibidores de ARNsas −como el DEPC al 0.1%−, que inactiva las ribonucleasas por modificaciones covalentes. Si es posible, se recomienda el empleo de pipetas, puntillas y soluciones exclusivas para trabajar con ARN. El material de vidrio debe esterilizarse por calor seco por 4 horas a 150°C, mientras que el material plástico debe ser nuevo y estéril, o bien debe enjuagarse con cloroformo, ya que la esterilización por autoclave no inactiva por completo las ARNsas.

Para la lisis celular suele optarse por la lisis mecánica o enzimática. La disrupción mecánica se emplea con más frecuencia para tejidos frescos o células, usando un homogeneizador mecánico. La disrupción de tejido congelado es más laboriosa y se recomienda el uso de un homogeneizador eléctrico. La homogeneización del tejido se realiza habitualmente en una solución comercial fenólica con tiocionato de guanidina, llamada Trizol.^®

En el mercado se encuentran disponibles soluciones comerciales estabilizadoras para el ARN (RNAlater^®, Ambion), que permiten preservar la muestra sin congelarla. Estas soluciones mantienen el ARN estable en el tejido a 37°C por un día, a 25°C por una semana, a 4°C por un mes y a temperaturas bajo cero por tiempo indefinido.

Por otro lado, la disrupción enzimática se utiliza con más frecuencia para lisar células que contienen envoltura o cápsula, como bacterias y levaduras. La digestión con lisozima, zimoliasa o lisostafina suele seguirse de una sonicación, homogeneización o vórtex vigoroso en un buffer de lisis que contiene hidrocloruro de guanidina. Los métodos enzimáticos también pueden emplearse para tejidos eucariotes ricos en colágena, con la finalidad de digerirla antes de la lisis celular.

Las principales diferencias entre la extracción de ADN y de ARN se resumen en el cuadro 11-4.

El isotiocianato de guanidina y el fenol se utilizan como componentes de la solución de lisis. El isotiocianato de guanidina es un potente desnaturalizante de proteínas con capacidad de inhibir ARNsas, por lo que es ampliamente utilizado en la extracción de ARN. El fenol y el cloroformo se utilizan en la extracción del ARN con los mismos fines que en la extracción del ADN (formar las fases orgánica y acuosa, desnaturalizar proteínas e inactivar nucleasas). La solución fenólica empleada en la extracción del ARN es ácida (pH 5 a 6), para favorecer la extracción del ARN sobre la del ADN, ya que a pH ácido, el ADN es retenido en la fase orgánica y en la interfase, dejando el ARN en la fase acuosa. Posteriormente, el ARN es purificado a partir de la fase acuosa mediante precipitación a baja temperatura con isopropanol y con ayuda de una centrifugación de manera similar a como se hace con ADN. Este proceso se esquematiza en la figura 11-3.

Los métodos comerciales para la extracción de ácidos nucleicos suelen basarse en cromatografía de intercambio aniónico, y emplean algún tipo de columna. Los kits son rápidos y proporcionan una buena calidad del ácido nucleico; sin embargo, son costosos respecto a los métodos convencionales de extracción. En esta sección se describen los fundamentos de algunos métodos alternativos de extracción empleados, entre los que se encuentran los métodos comerciales.

Gradiente con cloruro de cesio

La centrifugación en gradientes de CsCl sirve para la purificación de ambos ácidos nucleicos, aunque su uso principal es el aislamiento del ADN genómico y plasmídico. Es una técnica laboriosa, prolongada y que requiere de un equipo especializado, como una ultracentrífuga. Este método es el preferido para la elaboración de genotecas de ADNc, en las que se requiere ARN alta pureza e integridad o para aislar ARN de tejidos con altos niveles de ARNsa endógena, como el páncreas.

Cromatografía por exclusión de tamaño

Esta técnica se fundamenta en la separación de ácidos nucleicos de acuerdo con su peso molecular, empleando una columna empaquetada con una matriz de gel conformada por partículas poliméricas orgánicas o de sílice; ambos materiales, mecánica y químicamente estables y con un contenido bajo en grupos iónicos, originan una red de poros hidrofílicos uniformes. Las moléculas de gran tamaño no penetrarán en los poros del polímero, por lo que migran más rápidamente que las de menor tamaño, que sí son capaces de penetrar por los poros de la matriz. Esta técnica es el fundamento de la purificación en gel de agarosa de un ácido nucleico de determinado tamaño, usado sobre todo en la clonación de vectores. Es una metodología rápida y reproducible.

Cromatografía de intercambio iónico

Empleada por lo común para separar proteínas, se ha convertido en un método alternativo que permite la concentración y la purificación de ADN de calidad, de manera rápida y con la misma eficacia que la extracción por gradientes de CsCl. Los ácidos nucleicos interactúan con la resinas de carga positiva de las columnas de intercambio iónico, por lo que el ácido nucleico cargado negativamente se retiene y permite que otras moléculas, como proteínas o lípidos, se eluyan primero, dejando los ácidos nucleicos retenidos en la columna, los cuales se eluirán empleando condiciones que rompan su enlace con los compuestos iónicos de la resina purificados.

Cromatografía de absorción

Los ácidos nucleicos en solución se fijan de forma selectiva en sílice o vidrio, en presencia de sales caotrópicas, mientras que proteínas, metabolitos y otros contaminantes se eliminan mediante lavados. Posteriormente, los ácidos nucleicos se recuperan con una solución hiposalina.

La importancia de la calidad del ácido nucleico extraído es crucial para su uso posterior en técnicas moleculares, por lo que el personal que realice estos procedimientos debe estar capacitado para observar las buenas prácticas de laboratorio, condición indispensable para obtener una cantidad y una calidad adecuadas de ARN o ADN