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A continuación, se exponen los pasos de los que consta una electroforesis típica.
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Preparar un gel de agarosa o acrilamida a la concentración requerida.
Mezclar las muestras a analizar con un buffer de carga adecuado.
Cargar las muestras en el gel.
Realizar la corrida electroforética al voltaje pertinente.
Visualizar los ácidos nucleicos
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Electroforesis de ácidos nucleicos
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El método más común para la electroforesis de ADN es elaborar un gel horizontal de agarosa, con una concentración de 0.5 a 2%. La carga eléctrica de la molécula de ADN la otorgan sus grupos fosfato, de carga negativa, y cuyo número es igual al doble del número de pares de bases. Dado que la forma de la molécula de ADN siempre es la misma, la movilidad de la electroforesis dependerá únicamente de la longitud del ADN (pb) y se representará en bandas (figura 12-10). El corrimiento se realiza a voltajes de entre 25 y 100 V; a mayor voltaje mayor velocidad de corrimiento. El avance electroforético se monitorea a través de la visualización de los colorantes (azul de bromofenol y azul de xileno) contenidos en el buffer de carga con el que se mezcló con la muestra previa a su colocación en el pocillo. Si los fragmentos de ADN son pequeños (menos de 50 pb) o bien se requiere discernir entre fragmentos de ácidos nucleicos con una diferencia de longitud de 1 a 20 pb, se recomienda utilizar un gel de poliacrilamida que permita esta resolución. Las agarosas con un punto de fusión bajo permiten la preparación de geles a elevadas concentraciones y se aconseja para obtener una buena separación de moléculas de ADN con < 1000 pb. Son ideales para preparar geles analíticos de productos procedentes de técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) u otras. Algunas son capaces de separar fragmentos que difieren entre 10 y 20 pb. Para la preparación del gel debe estandarizarse primero qué concentración de agarosa es la más adecuada, según la muestra que se desee separar.
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El volumen de agarosa depende del tamaño de la cámara de electroforesis; 20 a 25 ml son suficientes para las dimensiones más comunes del gel: 8 × 6 × 0.5 cm (L × A × A). Inmediatamente después de vaciar la agarosa a la cámara, debe insertarse el o los peines necesarios. La agarosa tarda en solidificar alrededor de 20 minutos, mientras que la poliacrilamida, unos 30 minutos. Una vez solidificado el gel, se añade el buffer de corrimiento (TAE o TBE) a concentración 1×, cubriendo perfectamente el gel (0.5 a 1 cm por encima del gel) y se retiran los peines. Las muestras se mezclan con el buffer de carga y se depositan cuidadosamente en los pocillos, evitando que se salgan y puedan entrar en otros pozos contaminando el pocillo contiguo. Debe considerarse el uso de un marcador de peso molecular en, por lo menos, uno de los carriles, para la determinación del peso molecular de la muestra. Este marcador también debe mezclarse con un buffer de carga, excepto cuando ya viene preparado para su uso de la casa comercial en que se obtuvo.
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Una vez depositadas las muestras en los pocillos se procede a la transmisión de la corriente eléctrica. Se conectan los cables de la fuente de energía de cada polo eléctrico a la cámara de electroforesis en el electrodo que le corresponda y se aplica un voltaje de acuerdo con el peso molecular de las moléculas de ADN que se va a separar. Para el caso de productos de PCR (entre 100 pb y 1.5 kb), se recomienda usar voltajes comprendidos entre 75 y 100 V. Para muestras de ADN genómico y plasmídico (> 2 kb) se recomienda aplicar valores de entre 25 y 75 V. En la figura 12-11 se aprecia una fuente de energía, con su pantalla, que indica el amperaje. Es importante que se estandarice el tiempo de electroforesis a fin de conseguir la mejor resolución posible.
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Durante el corrimiento se monitorea la migración de la muestra con colores que contiene el buffer de carga, donde se observa el color azul y el verde correspondientes a los colorantes azul de bromofenol y azul de xileno, respectivamente. En geles de agarosa, dentro del rango de 0.5 y 1.5%, el azul de xileno migra de manera similar a un fragmento de ADN de 4 kb, mientras que el azul de bromofenol se comporta como un fragmento de 300 pb. La electroforesis se detiene cuando se considera que la muestra se localiza en la posición deseada, o bien cuando la muestra ha corrido por lo menos tres cuartas partes del gel.
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Hay múltiples factores que pueden afectar la migración del ADN, como la concentración del gel utilizado, el tamaño de la molécula de ADN muestra, el empaquetamiento del ADN, el voltaje, la temperatura del buffer de corrimiento (que puede aumentar demasiado si el voltaje es muy alto), la contaminación con agentes intercalantes en la muestra, la composición del buffer de corrimiento, etcétera.
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Visualización de las muestras
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Para la visualización de los ácidos nucleicos se utiliza un colorante fluorescente, el bromuro de etidio, que tiene la propiedad de intercalarse entre las bases nitrogenadas del ADN y el ARN. Debido a esta propiedad es un agente mutagénico y debe manipularse con cuidado. El bromuro de etidio, por lo general, se incorpora a la agarosa (0.5 mg/ml) antes de permitir la solidificación, o puede incorporarse luego del corrimiento, incubando el gel en una solución que lo contenga a 0.5 mg/ml. El bromuro de etidio fluorece de color naranja cuando se expone a la luz ultravioleta (longitud de absorción de 254 nm, con longitud de emisión de 366 nm). La señal fluorescente es proporcional a la cantidad de producto, como puede observarse en la figura 12-10. Su sensibilidad permite detectar aproximadamente 30 pg de ácido nucleico por banda (según el grosor del gel). El bromuro de etidio es teratogénico, mutagénico y cancerígeno, por lo que para este procedimiento se recomienda el uso de guantes. En la actualidad, el bromuro de etidio se ha sustituido por un compuesto comercial, SYBR® Safe, que se une de manera no covalente a los ácidos nucleicos. Este colorante tiene una fluorescencia a 280, una excitación máxima a 502 nm y una emisión máxima a 530 nm. Con este colorante, el ADN puede visualizarse con una luz ultravioleta en el rango de 470 a 530 nm. Por otro lado, el SYBR®-Green es un fluoróforo que se une con gran afinidad al surco menor del ADN bicatenario, y es unas 25 veces más fluorescente que el bromuro de etidio. SYBR®-Green con epiiluminación de 254 nm puede detectar 60 pg de dsADN/banda; 1–2 ng de oligonucleótidos, y 100 a 300 pg de ARN o ssADN/banda. Para los geles de acrilamida una alternativa al bromuro de etidio es el nitrato de plata; sin embargo, éste utiliza reactivos peligrosos, como el formaldehído. Por otro lado, la tinción con plata es más sensible que el bromuro de etidio, más barata a largo plazo y menos tóxica. En la figura 12-12 se aprecia una muestra visualizada por bromuro de etidio y otra por SYBR® Safe.
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Electroforesis de proteínas
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El método más empleado para electroforesis de proteínas se lleva a cabo en un sistema discontinuo; es decir, un gel conformado por dos geles de poliacrilamida (uno de resolución y otro de compactamiento), que difieren en su concentración, composición y pH. Los geles están unidos pero limitados por una fase de separación visible a contra luz; para lograrlo deben prepararse por separado esperando la polimerización total del primero, para continuar con la del segundo; de lo contrario, en estado líquido, se mezclarían.
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Cabe recordar que en el caso de los geles de acrilamida para ácidos nucleicos sólo se tiene una fase, conformada por el gel de resolución, donde las moléculas de ADN migrarán, generando un patrón electroforético, según su tamaño.
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Para electroforesis de proteínas, la acrilamida se prepara a partir de una solución al 30% de acrilamida-bisacrilamida 19:1. Ésta se mezcla con el buffer correspondiente y una solución de SDS; además, se añade persulfato de amonio (APS) y N,N,N’,N’-tetrametiletilenodiamina (TEMED) como polimerizadores en concentraciones del orden de 1 a 10 mM. El APS genera radicales libres, por lo que es un iniciador de la reacción de polimerización que finalmente forma el gel. El TEMED funciona como otro iniciador de polimerización. Las propiedades del gel resultante dependen de la concentración de APS y TEMED, ya que un aumento en su concentración disminuye la longitud media de la cadena de polímero y, por lo tanto, disminuye su elasticidad y le resta transparencia al gel. Por ello, debe utilizarse la menor concentración posible de catalizadores que permita la polimerización en un tiempo óptimo.
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El gel de acrilamida se forma entre dos vidrios, y el sistema completo se sumerge en el buffer de corrimiento dentro de la cámara vertical de electroforesis. En el momento de sumergir los geles en el tanque, se debe de asegurar que los pocillos del gel estén totalmente cubiertos por el buffer. Es común en los geles de acrilamida realizar un precorrimiento de unos 10 a 30 minutos a voltajes bajos, con el cual se asegura que los pocillos se limpien antes de cargar las muestras.
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Para la preparación de la muestra de proteína, se realiza una reacción fisicoquímica, en la que se rompen enlaces peptídicos y puentes disulfuro por acción de detergentes iónicos (SDS), reactivos reductores (beta-mercaptoetanol) y temperaturas elevadas (95°C), que al final consigue desnaturalizar la proteína hasta su estructura primaria. La muestra mezclada con el buffer de carga se deposita con cuidado en los pocillos, evitando la contaminación del pocillo contiguo. Hay que considerar el uso de un marcador estándar de proteínas para la medición del peso molecular de la muestra, que debe someterse a los mismos tratamientos que la proteína, excepto cuando se trate de un marcador previamente teñido, en que el que se obviará el uso del buffer de carga.
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Una vez colocadas las muestras de proteínas en cada pocillo del gel, se conectan los cables correspondientes de los electrodos a la fuente de energía, con la selección de voltaje o amperaje adecuados. Para el cálculo del voltaje es importante conocer la distancia en centímetros del gel desde la parte superior hasta la parte inferior. La distancia multiplicada por 8-15 V permitirá determinar el voltaje del corrimiento. El voltaje óptimo dependerá de la molécula que se piensa separar; en consecuencia, se recomienda estandarizar este procedimiento. El valor del amperaje o corriente eléctrica (medida en amperios o miliamperios) dependerá de la fuerza iónica del buffer. En el caso de trabajar con buffer Tris-SDS-glicina, el valor recomendado es de 25 a 30 mA. La electroforesis se realiza hasta que el colorante, visualizado como una línea azul, haya llegado a los límites de la parte inferior del gel.
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Visualización de las muestras
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Si se requiere, el gel se sumerge en un recipiente conteniendo el colorante azul brillante de Coomasie y se incuba por unos minutos, lo que permitirá la visualización de las bandas de proteínas. El proceso de coloración se basa en la atracción electrostática del enlace peptídico de las proteínas sobre grupos de ácido sulfónico, que tiñen la proteína de color azul. Asimismo, las fuerzas de Van der Waals y las interacciones hidrofóbicas participan en este proceso de unión mecánica. La tinción de Coomassie Blue clásica, normalmente puede detectar bandas de proteína de 50 ng, mientras que la tinción con plata incrementa este límite de sensibilidad unas 50 veces. La tinción con plata consiste en desarrollar el color en el gel por incubación en soluciones de metano al l40%: ácido acético al 10%, luego metanolal 40%, seguido de agua y posteriormente tiosulfato de sodio al 0.01%. Después de este proceso se lava y se procede a la incubación en frío (4°C) en cloruro de plata al 0.1%; posteriormente, se lava e incuba con carbonato de sodio al 2% en formalina al 0.04% (llamada también formol al 35%), que actúa como revelador. Por último, se incuba con soluciones de ácido acético antes de fotografiar o escanear.
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Muchas variables pueden influir en la intensidad del color y todas las proteínas tienen características distintas de tinción.
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Algunas veces, el gel se seca para conservarlo. Para ello, primero se deshidrata en glicerol-metanol y, posteriormente, se coloca en una lámina de celofán hidrofílico y no plastificado que cubra totalmente el gel. Se cubre el gel con un segundo celofán previamente remojado en agua y se sella con calor. Aquí se deja secar en condiciones ambientales por aproximadamente dos días o se acelera el proceso con el uso de desecadores de geles.
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Algunas proteínas pueden migrar anómalamente y aparecer con un peso molecular mayor que el esperado; esto puede deberse a que presentan modificaciones postraduccionales en su estructura, como residuos de glicosilación, fosforilación y acetilación, que podrían retardar la migración de las muestras. Asimismo, si existe desnaturalización de las proteínas, se considera que la proteína está degradada y suelen aparecer manchas difusas en todo el carril.