Capítulo 13: Enzimas de restricción

El descubrimiento, la caracterización y el aislamiento de los diferentes tipos de enzimas ha facilitado en la investigación las tareas del estudio de los genomas así como su expresión, su regulación y su posterior correlación con el desarrollo de diversas enfermedades. Hoy por hoy es común la aplicación de técnicas de biología molecular en diversas áreas, y en particular en las ciencias de la salud, ya que han revolucionado los métodos analíticos generando gran impacto en la investigación básica y la clínica, especialmente en el diagnóstico de enfermedades.

Las enzimas de restricción son una herramienta primordial para la ejecución de diversos ensayos útiles en investigación clínica, desde la determinación de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (restriction fragment length polymorphism, RFLP), así como en la construcción de vectores con ADN recombinante y clonación de secuencias de ADN provenientes de humano, virus, bacterias y demás microorganismos de interés para la generación de conocimiento o para su aplicación en el área de la medicina. Entre las enzimas que modifican los ácidos nucleicos se encuentran las nucleasas, es decir, aquellas capaces de cortar los enlaces fosfodiéster que unen los nucleótidos de una cadena de ácidos nucleicos. Las nucleasas se denominan endonucleasas si son capaces de cortar el enlace fosfodiéster en nucleótidos localizados dentro de la cadena del ácido nucleico, y reciben el nombre de exonucleasas si cortan los enlaces fosfodiéster de los nucleótidos en los extremos de las cadenas. Así, existen 3’exonucleasas las que escinden enlaces en el extremo 3’ de la cadena, y 5’exonucleasas que rompen enlaces fosfodiéster en el extremo 5’ de la cadena.

Las enzimas de restricción presentan actividad endonucleasa, son de origen bacteriano y cortan los enlaces fosfodiéster del ADN en una secuencia específica denominada secuencia diana. El uso de estas enzimas como herramienta biotecnológica surgió de la necesidad de cortar las largas cadenas de ADN genómico para manipularse y analizarse en fragmentos más pequeños. El empleo de las enzimas de restricción y otras enzimas que modifican ácidos nucleicos, como la ligasa, permitió desarrollar la metodología del ADN recombinante.

En 1960, Stewart Linny y Werner Arber aislaron, en E. coli, enzimas que metilaban moléculas de ADN y que ademas cortaban un enlace fosfodiéster del ADN no metilado. Más tarde, en 1970, se caracterizó la primera nucleasa de restricción por Daniel Nathans Hamilton Smith, aislada de Haemophilus influenzae, denominada Hind I. En la actualidad, se sabe que todas las especies de bacterias sintetizan uno o más tipos de endonucleasas capaces de hacer cortes en secuencias específicas de nucleótidos de una doble cadena de ADN exógeno; generalmente, este ADN “extraño” es el proveniente de los bacteriófagos, virus con capacidad de infectar a dichas bacterias.

Estas endonucleasas se denominan enzimas de restricción debido a que restringen la permanencia de un ADN exógeno en la célula bacteriana que produce dicha enzima. Las enzimas de restricción empleadas con más frecuencia en la metodología del ADN recombinante suelen reconocer una secuencia única de 4 a 8 nucleótidos, donde realizan el corte.

Las endonucleasas de restricción forman parte de la maquinaria con la que cuenta la bacteria para defenderse de infecciones virales. El ADN de la bacteria que produce la enzima de restricción no se ve afectado por su propia enzima, ya que las bacterias metilan determinadas secuencias a su propio ADN para diferenciarlo del ADN viral por medio de una enzima metiltransferasa en bases específicas, que generalmente son las reconocidas por sus propias enzimas de restricción.

Por acuerdo internacional, la nomenclatura de las enzimas de restricción se asigna según su origen bacteriano y se define basándose en las siguientes reglas:

1. Tres letras en cursiva que corresponden al nombre científico de la bacteria de donde fue atraída (p. ej., Escherichia coli (Eco); Haemophilus influenzae (Hin), etc.). La primera letra, en mayúscula, corresponde al género; las otras dos, a la especie.

2. La cepa o estirpe, si la hubiese (p. ej., EcoR, aislada de la cepa “RY13” de E. coli).

3. En números romanos, un número para distinguir si hay más de una endonucleasa aislada de esa misma especie (p. ej., EcoRI, EcoRV).

4. Todas deberían indicar con una “R” por restricción o una “M” por metilasa, según la función de la enzima, pero generalmente se omite.

Por ejemplo:

• Hind III:

• H = genero Haemophilus.

• in = especie influenzae.

• d = cepa DSM 11121.

• III = tercera endonucleasa aislada en este organismo.

• Eco RI:

• E = género Escherichia.

• co = especie coli.

• R = cepa RV 13.

• I = primera endonucleasa aislada de esta cepa.

De acuerdo a su función las enzimas de restricción se han clasificado en tipo I, II, III.

Tipo I

Las enzimas que pertenecen a este grupo reconocen una secuencia específica de nucleótidos y hacen un corte aleatorio en la doble cadena en cualquier secuencia del ADN y a una distancia aproximada de 1000 pb del sitio de corte; además tienen la función de metilar su propio genoma. Estas enzimas necesitan adenosín trifosfato (ATP) para moverse a lo largo de la molécula de ADN desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio de corte.

Tipo II

Son enzimas que reconocen secuencias específicas y hacen el corte de la doble cadena de ADN en el mismo sitio de reconocimiento. Estas enzimas sólo tienen actividad de restricción no de metilación y son las utilizadas en ingeniería genética, ya que cortan el ADN en secuencias específicas reconocidas. Requieren Mg²⁺ como cofactor y no requieren de ADN. Las secuencias de reconocimiento de estas enzimas son palindrómicas, es decir, son secuencias que se leen igual en las dos cadenas de ADN. Por ejemplo: Por ejemplo:

Tipo III

Estas enzimas reconocen una secuencia específica y cortan el ADN de doble cadena fuera de la secuencia diana (aproximadamente de 25 a 27 pares de bases corriente abajo del sitio de reconocimiento). Tienen, al igual de las de tipo I, actividad de metilasa y requieren de ATP para desplazarse a lo largo de la molécula de ADN. Las características de los diferentes tipos de enzimas, de restriccioón se resumen en el cuadro 13-1.

Las enzimas de restricción son una herramienta básica en clonación e ingeniería genética; se utilizan, entre otros fines, para hacer mapas de restricción de plásmidos o genomas. Un mapa de restricción se define como la serie de fragmentos que se generan por el corte con determinada(s) enzima(s), específicos en tamaño (y secuencia) y que permiten emplearlos para la caracterización de dicho ADN. Esta herramienta es sumamente importante para la clonación con vectores. También, en estudios de determinación de polimorfismos, como la técnica de RFLP, según se presente o no el sitio de corte de una enzima de restricción, se puede establecer la variante alélica, ya que el peso molecular del fragmento o fragmentos de ADN generado(s) permitirá la caracterización de la secuencia. Asimismo, la construcción de moléculas de ADN recombinante implica el obvio empleo de las enzimas de restricción para definir y delimitar las secuencias que se insertarán en el constructo recombinante. De la misma manera, el corte de ADN genómico que suele ser, según el organismo, del orden de millones de pb, es más manipulable cuando es digerido por estas enzimas en fragmentos más pequeños. Esto permite un manejo adecuados sin el riesgo de degradacióny manipulación lación para la construcción de bibliotecas genómicas, que se discuten en el capítulo de vectores de clonación.

Los cortes que realizan las enzimas de restricción sobre la cadena de ADN pueden generar dos estructuras o formas: cohesivas o romas. Los cortes cohesivos, también llamados pegajosos, se generan porque la enzima corta en cada cadena de ADN entre nucleótidos localizados en posiciones diferentes respecto al eje de simetría de la secuencia de diana. Estos cortes generan extremos monocatenarios en un segmento de 3 a 5 bases de longitud, por lo que en esta fracción la falta de cadena complementaria facilita su interacción con otro fragmento en monocadena con secuencia complementaria, como se muestra en el cuadro 13-2. Los extremos así generados propician la unión específica entre segmentos diferentes de ADN, pero cortados por la misma enzima, lo que origina condiciones idóneas de unión específica para la producción de ADN recombinante. Los extremos romos se generan porque la enzima corta en ambas cadenas de ADN sobre un mismo eje, por lo que dichos extremos son de doble cadena, y la unión entre fragmentos de ADN con extremos romos es más inespecífica, ya que no depende de la complementariedad de regiones monocadena. En la figura 13-1 se muestran las enzimas que generan extremos cohesivos o pegajosos (EcoRI, BamHI, HindIII), y en la figura 13-2 las enzimas que generan extremos romos (SspI, SmaI).

Isoesquizómeros

Se denomina isoesquizómeros a las enzimas de restricción obtenidas de diferente especie bacteriana pero que reconocen la misma secuencia diana de ADN y cortan entre diferentes nucleótidos de dicha secuencia (por ejemplo, Asp718 y KpnI). Ambas reconocen la secuencia 5´GGTAC3´ pero ASp718 corta el enlace entre GG mientras KpnI corta entre los nucleótidos AC, como se describe en la figura 13-3.

Una familia de enzimas de restricción está formada por aquellas que no necesariamente reconocen la misma secuencia diana, pero producen extremos cohesivos similares. Un ejemplo de familia es: BamHI y BclII, que reconocen las secuencias diana 5’GGATCC3’ y 5’AGATCT3’, respectivamente, pero que generan extremos cohesivos idénticos: 5’GATC3’.

Esta característica favorece que dos fragmentos cortados con estas enzimas puedan recombinarse de manera específica gracias a la complementariedad de sus bases en los extremos cohesivos generados, como se muestra en la figura 13-4.

Entre los factores que más afectan la actividad de las enzimas de restricción se encuentran:

• La pureza biológica del ADN. Contaminación de la muestra con otros ADN impide el buen funcionamiento de las enzimas.

• Los contaminantes como detergentes y estabilizadores (docedil sulfato de sodio –SDS–, ácido etilendiaminotetraacético –EDTA–), ya que concentraciones elevadas de sales y detergentes inhiben la actividad enzimática.

• Modificaciones en el pH y temperatura de incubación. Variaciones leves en estos parámetros inhiben enormemente la actividad de las enzimas.

• El grado de metilación del ADN, ya que algunas enzimas son inhibidas por metilación en ciertas secuencias.

Las enzimas de restricción, al igual que muchas otras proteínas, pueden disminuir su vida media y en consecuencia su actividad, al ser conservadas y manejadas de forma inadecuada fuera de su rango ideal de temperatura; deben conservarse a -20ºC, así que para evitar su congelamiento y su consecuente pérdida de actividad son diluidas en un volumen determinado de glicerol. Para usarlas se requiere un contenedor que asegure la menor variación de temperatura posible.

Todos los organismos cuentan con un mapa de restricción que indica la posición donde se encuentran los sitios de corte para muchas de las enzimas conocidas. Cuando se pretende realizar el corte en un plásmido conocido o comercial, por ejemplo, se revisa el mapa de restricción, el cual ofrece un listado en orden alfabético de las enzimas que son capaces de cortar dicho ADN, el sitio de corte, el tipo de corte, así como el número y tamaño de cada fragmento generado. En el caso del ADN genómico es necesario conocer la secuencia completa con la que se va a trabajar para conocer los sitios de corte y predecir el número y tamaño de los fragmentos. Se realiza ingresando dicha secuencia a una base de datos especializada para estudios de restricción y, de esta manera, se obtiene un listado de las posibles enzimas que reconocen la secuencia diana. Se elige la enzima tomando en cuenta las características experimentales ajustándose al objetivo perseguido.

Las hojas de instrucciones o insertos que facilita el proveedor incluyen las características y descripción de las condiciones óptimas de actividad de las enzimas de restricción disponibles comercialmente. Dichas condiciones están ajustadas para el volumen de reacción requerido, de acuerdo a la tecnología que se requiere aplicar. Se debe tener en cuenta la temperatura óptima de acción, presentación comercial de la enzima (unidades de enzima por microlitro), tiempo de incubación, así como los posibles requerimientos de aditivos, como albúmina, ATP, etcétera.

La cantidad de enzima utilizada en una reacción dependerá de la concentración de ADN en la muestra a digerir. La concentración de la enzima está descrita en la hoja de instrucciones del proveedor, como unidades por microlitro (u/μl). Una unidad de enzima se define como la cantidad de enzima requerida para producir la digestión completa de un microgramo de ADN sustrato en 60 minutos a la temperatura óptima de acción de la enzima. El tiempo de incubación de la reacción puede ser incrementado si la enzima utilizada está cerca de su fecha de caducidad y su actividad está mermando. Sin embargo, el tiempo no debe incrementarse demasiado, pues aunque el ADN es una molécula resistente, se corre el riesgo de su degradación.