Capítulo 14: Vectores de clonación y expresión

Hasta la década de 1970, el ADN era una molécula cuyo análisis era sumamente problemático, ya que era demasiado larga y estaba formada sólo por cuatro monómeros. En esa época la secuencia de nucleótidos del ADN sólo había podido estudiarse indirectamente a través de la secuencia de aminoácidos en las proteínas o por su expresión en el ARN. Por ello, el descubrimiento de las enzimas de restricción facilitó el estudio del ADN, ya que gracias a ellas fue posible seccionar moléculas grandes de ADN y separarlas en fragmentos. Cada uno de esos fragmentos se analizaba por separado y fue posible multiplicarlos a través de la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR; véase el capítulo de PCR), e incluso determinar la secuencia de sus nucleótidos por secuenciación. Los procesos técnicos que forman parte de la metodología del ADN recombinante son, en gran parte, adaptaciones de procesos naturales de la genética microbiana o eucariota, mezclados con técnicas novedosas e ingeniosas. Gracias a la especificidad del reconocimiento de las secuencias que pueden ser cortadas por las enzimas de restricción ha sido posible la identificación, el aislamiento y la clonación de fragmentos de ADN provenientes de diferentes organismos, para producir moléculas de ADN recombinante. El termino clonación, per se, indica el acto de producir muchas copias idénticas de una molécula de ADN, y antes del advenimiento de la técnica de PCR era la manera usual de multiplicar una secuencia específica. En la actualidad, la clonación se emplea para la producción de moléculas recombinantes y para determinar sus funciones en el organismo. La célula que capta el ácido nucleico se denomina célula transformada y esta variación en su genoma es hereditaria.

La clonación de ADN, o clonación molecular, es la introducción de un fragmento de ADN denominado inserto dentro de una molécula de ADN denominada vector, que puede replicarse de manera autónoma e independiente del genoma de la célula hospedera. El resultado es la obtención de millones de copias de una molécula recombinante o clona molecular compuesta por ADN proveniente del inserto y del vector.

El inserto puede ser ADN obtenido de cualquier organismo y puede permanecer como ADN genómico (ADNg), ADN complementario (ADNc), producto de la retrotranscipción del ARN, un producto de PCR o un ARN obtenido por transcripción in vitro.

Un vector se define como una molécula de ADN de doble cadena (DNAds), con capacidad de albergar un fragmento de ADN exógeno (de otro origen).

Clasificación de vectores

De acuerdo con su uso, los vectores se clasifican en vectores de clonación y vectores de expresión.

Vectores de clonación

Los vectores son de clonación si su finalidad es el almacenamiento de secuencias y la obtención de grandes cantidades del ADN insertado o de la molécula recombinante. Los vectores de clonación suelen ser plásmidos, fagos, fagémidos, cósmidos y cromosomas artificiales bacterianos o de levadura.

Vectores de expresión

Los vectores de expresión son aquellos cuyo objetivo es producir un tránscrito (ARN) o la proteína producto de ese tránscrito. Los vectores de expresión pueden ser plásmidos o fagos (figura 14-1).

Elementos que forman un vector de clonación

Todos los vectores de clonación poseen, como parte de su estructura, los siguientes elementos básicos comunes:

1. Origen de replicación: es una secuencia en el ADN del vector que provee un sitio único de reconocimiento a las proteínas que identifican el sitio de inicio de la replicación (ORI). Los plásmidos se caracterizan por tener un solo sitio ORI en su genoma y realizar una replicación unidireccional.

2. Marcador de selección: es un gen que generalmente confiere resistencia a un antibiótico o genera un fenotipo particular con el cual puede seleccionarse la célula que incorporó el vector. En general, los marcadores de selección son únicos en los vectores, aunque existen algunos plásmidos que contienen dos. Entre los genes de selección más comunes se encuentran los de resistencia a ampicilina y kanamicina. Algunos vectores plasmídicos poseen un segundo marcador de selección, el gen lacZ, que se encuentra en el operón Lac de E. coli y codifica la enzima β-galactosidasa. Así, cuando el vector se replica dentro de la célula hospedera, la β-galactosidasa puede expresarse y generar una enzima funcional. Si la célula que contiene el vector se pone en contacto con un sustrato de la enzima, como el compuesto denominado X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolyl-β-D-galactopiranósido), es degradada por la enzima, lo que produce un color azul que permite identificar a las células que introdujeron el vector. También existen marcadores, como el gen de la proteína verde fluorescente (green fluorescente protein, GFP) que permite que la célula transformada emitía fluorescencia cuando se expone a luz ultravioleta (figura 14-2).

3. Sitio de clonación múltiple: es un fragmento de ADN que contiene una serie de sitios únicos de reconocimiento para enzimas de restricción, muy cercanos entre sí, con una amplia gama de posibilidades de insertar cualquier fragmento de ADN. Los sitios de restricción más comunes presentes en el sitio de clonación múltiple de la mayoría de los vectores son para las enzimas EcoR I, Hind III, BamH I, Xho I y Kpn I (ver la figura 14-1).

A continuación se detallan los vectores de clonación más utilizados, esquematizados en la figura 14-3; sus características se resumen en el cuadro 14-1.

Plásmidos

Los plásmidos son pequeñas moléculas circulares de ADN que se replican y se transmiten con independencia del cromosoma bacteriano. De manera natural constituyen el material genético móvil de las bacterias, donde funcionan como medio de transporte de genes a otras bacterias, como la resistencia a antibióticos. Los plásmidos permanecen de manera episomal en la bacteria, esto es, sin incorporarse en su genoma, y en ella puede haber múltiples copias del mismo plásmido. Cuando una bacteria se reproduce, estos plásmidos se transmiten a las células descendientes por distribución equitativa del citoplasma bacteriano durante la división celular. Sin embargo, también pueden transmitirse a través de los pili entre las bacterias. La replicación y transcripción plasmídica depende de la maquinaria enzimática de la célula huésped.

Los plásmidos han sido manipulados genéticamente en el laboratorio con la finalidad de preservar sólo las características deseables, eliminar el ADN innecesario y añadirle otras que no poseen de forma natural. Los plásmidos usados como vector en general están formados por de 2 a 5 kb de ADN, lo que facilita el análisis de los insertos incorporados a él. Existen cientos de plásmidos disponibles comercialmente que ofrecen una amplia variedad de posibilidades en cuanto a las enzimas de restricción que se van a emplear para la clonación, la longitud del producto que se va a insertar y los marcadores de selección de las clonas transformadas. Entre los plásmidos más utilizados se encuentran pBlueescript, pUC19, pBR322 y pGLO.

Bacteriófagos

Los bacteriófagos son virus que infectan naturalmente bacterias y se comportan como parásitos intracelulares obligados que se multiplican haciendo uso de la maquinaria biosintética de las bacterias. Al igual que los plásmidos, los bacteriófagos se replican de forma autónoma, portan información genética y pueden conferirle a la bacteria nuevas propiedades o desarrollarle procesos patológicos.

Para convertirlo en un vector, el bacteriófago silvestre (virus natural) es modificado genéticamente. Dichas modificaciones consisten en la adición de sitios de restricción específicos y la eliminación de aquellos genes que no se requieren para la replicación, lo que permite la incorporación de fragmentos de ADN de mayor longitud que los plásmidos (de hasta 23 kb).

El bacteriófago lambda es el fago más utilizado como vector de clonación, y su genoma consiste de una molécula lineal de aproximadamente 45000 pb, cuyos extremos son 12 nucleótidos, que contienen secuencias complementarias entre sí, denominados sitios cos, que utiliza para “circularizar” su genoma a través de la acción de una ligasa de la célula huésped (ver la figura 14-3).

Cósmidos

Algunos estudios de análisis de ADN genómico requieren de la clonación de fragmentos de ADN grandes. En estos casos, es recomendable utilizar los cósmidos ya que pueden aceptar insertos de hasta 45 kb.

Los cósmidos son vectores híbridos del ADN de un plásmido (proporciona la resistencia a los antibióticos) y los sitios cos del bacteriófago (le permiten empaquetar el ADN). Los cósmidos derivados del fago P1 pueden admitir 85 kb de ADN exógeno. Además, contienen los genes de selección y un sitio ORI del plásmido, por lo que se replican de manera independiente del genoma bacteriano, como lo hacen los plásmidos.

Cromosomas artificiales

Fragmentos de ADN de mayor tamaño (cientos de kilobases) pueden clonarse en cromosomas artificiales de bacterias (BAC) o levadura (YAC), que se replican como un cromosoma independiente dentro de bacterias o levaduras, respectivamente. Este tipo de vectores son particularmente útiles para estudios de mapeo de cromosomas, por su capacidad para almacenar fragmentos de gran tamaño. Un BAC es un constructo derivado del plásmido F (functional fertility plasmid) capaz de regular la distribución equitativa de plásmidos después de la división bacteriana. Usualmente, acepta insertos de 150 a 350 Kb, pero se han clonado segmentos de hasta 700 kb. Un sistema similar denominado PAC, derivado del plásmido bacterial P1, tiene capacidad de insertar hasta 300 kb.

Los YAC son cromosomas artificiales que contienen telómeros, origen de replicación, un centrómero de levadura y un marcador de selección para su identificación en las células que los contengan. Su capacidad de clonación es de 100 a 1000 kb.

Los vectores de expresión se emplean con dos finalidades: generar el ARN producto de la transcripción o bien producir la proteína codificada en la secuencia génica que portan (proteína recombinante). Los vectores de expresión son plásmidos o bien bacteriófagos.

Componentes de los vectores de expresión

En su estructura los vectores de expresión poseen los elementos básicos presentes en los vectores de clonación (origen de replicación, marcador de selección y sitio de clonación múltiple), además de contar en su secuencia con por lo menos un promotor fuerte. Se caracterizan por constituir un sistema de inducción simple y efectivo, tener una baja expresión basal y ser fácilmente transferible a otras cepas. También debe incluir secuencias de terminación de la transcripción y de adición de cola de poliadelinación, pues con ello el tránscrito estará protegido de la degradación de nucleasas, con lo que su vida media se extenderá. Otro factor importante presente en un vector de expresión es el sitio de unión al ribosoma (internal robosome entry site, IRES), que es la secuencia Shine-Dalgarno que precede el codón de inicio AUG de la traducción en los ARNm procariotes. Dicha secuencia es complementaria con el extremo 3’ del ARNr 16S, cuya hibridación permite el ensamblaje de la maquinaria de inicio de la traducción. Además, debe considerarse la expresión basal del plásmido, lo que se conoce como número de copias del plásmido, característica determinada por la fuerza del sitio de origen de replicación, que origina plásmidos con un elevado número de copias per se. También debe considerarse que la presencia de promotores fuertes en plásmidos con un alto número de copias origina interferencias en la viabilidad celular. Algunos ejemplos de vectores de expresión son los de la serie pcADN3.1, pET161 y pDEST10, entre otros.

Usualmente, la célula hospedera del vector es una bacteria (E. coli), pero también puede ser una célula eucariota. A la introducción de un vector a una célula eucariota se le denomina transfección y si el vector es un virus, transducción.

La introducción del ADN recombinante tiene como propósito la transformación celular, es decir, que el material genético se incorpore de manera extracromosómica y se replique, transcriba y traduzca empleando la maquinaria enzimática de la célula huésped.

La clonación de cualquier fragmento de ADN involucra los siguientes pasos, los cuales se esquematizan en la figura 14-4.

1. Preparación del inserto de ADN que se va a clonar.

2. Preparación del vector para la clonación.

3. Ligación del inserto y el vector.

4. Preparación de células competentes.

5. Transformación celular.

6. Identificación de las colonias celulares que contienen el vector recombinante.

1. Preparación del inserto de ADN que se va a clonar. Involucra la digestión con enzimas de restricción para liberar el fragmento de interés de la molécula de ADN completa. La selección de la(s) enzima(s) que corten el ADN es un punto crítico que determina la facilidad y la eficiencia de la metodología. Para facilitar la clonación se prefiere el uso de enzimas de restricción cuyos sitios de corte estén presentes en el sitio de clonación múltiple del vector, con lo que se evita la necesidad de una posible modificación posrestricción del inserto. Asimismo, el inserto deberá cortarse con la(s) misma(s) enzima(s) o con unas que dejen los mismos extremos, de manera tal que la complementariedad de los extremos generados en el inserto coincida con los extremos del vector (figura 14-5). Debe tomarse en cuenta que la incorporación de un inserto con extremos romos (véase capítulo de enzimas de restricción) implica una eficiencia de 50% en la clonación, ya que en la mitad de las ocasiones el inserto va en el sentido apropiado (5’-3’), pero en el otro 50% de las ocasiones la inserción será en el sentido opuesto (3’-5’). El inserto, producto de la digestión enzimática, se purifica y separa de la molécula de ADN de donde proviene, mediante una electroforesis en gel de agarosa (véase capítulo de electroforesis). La banda correspondiente al inserto (que se verifica por el tamaño que presenta) se escinde del gel y se extrae y purifica mediante técnicas convencionales (figura 14-6).

2. Preparación del vector para clonación. Consiste en:

   1. Corte con la(s) misma(s) enzima(s) de restricción con que se digirió el inserto y obtener un ADN lineal. La estrategia de clonación debe diseñarse para que el corte genere extremos con secuencias complementarias a los extremos del inserto a clonar.

   2. Desfosforilación del vector con la finalidad de impedir la autoligación del vector. Se realiza usando la fosfatasa alcalina bovina de origen intestinal (CIP) o la fosfatasa bacteriana (BAP) que elimina los grupos fosfato 5’ de una cadena de ADN.

   3. Purificación del vector. Consiste en eliminar las partículas de agarosa, los restos de enzimas inactivadas y las sales provenientes de la reacción de digestión. En general, se realiza empleando columnas de resinas con alta afinidad al ADN en presencia de altas concentraciones de sales caotrópicas. Esto permite una elución de la muestra en volúmenes pequeños de agua o buffer con baja concentración de sales. También existe la posibilidad de purificar por la técnica fenol:cloroformo modificada, para obtener ADN plasmídico (evitando la extracción del ADN genómico); sin embargo, presenta el inconveniente de que para su realización consume mucho tiempo y que en general se obtiene un ADN plasmídico de menor calidad (véase el capítulo de métodos de extracción de ácidos nucleicos).

      Otra estrategia de ligación consiste en el uso del fragmento largo de la polimerasa (fragmento Klenow), que “rellena” los extremos cohesivos generados por cualquier enzima y los convierte en romos. Sin embargo, los extremos romos en el vector no dirigen la inserción, por lo que la eficiencia de clonación disminuye, como se mencionó previamente (ver la figura 14-5).

3. Ligación del inserto con el vector. La ligación de un segmento de ADN exógeno a un vector involucra la formación de enlaces fosfodiéster entre los residuos fosfato que se localizan en los extremos 5’ de la cadena de ADN y los residuos hidroxilo 3’. Esta unión la cataliza in vitro una enzima denominada ligasa. Las más utilizadas son la ligasa de E. coli y la T4 ligasa de bacteriófagos. Para la reacción de ligación existen diferentes protocolos, que dependen del tipo de extremos generados por las enzimas de restricción. Los requerimientos generales que deben considerarse para las ligaciones se describen en el cuadro 14-2.

4. Preparación de células competentes. Para su replicación, los vectores requieren encontrarse dentro de una célula, que debe prepararse para hacerla permeable a la entrada del vector recombinante, proceso denominado generación de células competentes. Las células competentes generalmente son células procariotas. La bacteria más utilizada para este procedimiento es E. coli, que carece de un mecanismo natural para la incorporación de ADN exógeno. El estado de competencia puede inducirse por diferentes métodos de laboratorio, y la elección del método dependerá del procedimiento de transformación seleccionado.

   Uno de los métodos de competencia más utilizados consiste en tratar las bacterias con una solución de CaCl₂. Se desconoce el mecanismo exacto por el cual este compuesto induce la competencia. Sin embargo, una explicación sostiene que la membrana bacteriana es permeable a los iones cloro, mas no a los iones calcio, de manera que los iones Ca⁺⁺ se rodean de moléculas de agua para entrar a la célula, lo que provoca que la célula se abulte, lo que facilita la formación de poros y la entrada del ADN. Este procedimiento se prefiere para células que se van a transformar usando precipitados de ClCa₂. Para lograr el estado de competencia por cualquiera de las técnicas se requiere que las células se encuentren en la fase logarítmica de crecimiento (OD entre 0.5 y 0.7), que corresponde a una densidad celular de 5 × 10⁷ cel/ml). Otro método para conferir competencia a las bacterias es someterlas a lavados consecutivos por 4-5 veces con una solución de glicerol a 10%, para obtener células libres de iones y proteger a la membrana celular del daño que ocasionará la electroporación por la cual se transformarán.

   Con independencia del procedimiento empleado para inducir el estado de competencia, las células pueden almacenarse de forma indefinida sin perder su competencia en una solución acuosa con glicerol a 10%, para impedir que al descongelarse se lisen.

5. Transformación en bacterias. La transformación bacteriana consiste en la adquisición de ADN exógeno, que le confiere un nuevo fenotipo a la célula huésped. Entre los métodos más comunes se encuentran la transformación química y la transformación por electroporación.

   Cabe resaltar que el termino transformación se refiere a la introducción de material genético a través de vectores a las bacterias; el término transducción describe la introducción del ácido nucleico exógeno en una célula por medio de un vector viral, y el término transfección implica la introducción del material genético en las células empleando agentes químicos o físicos.

   1. Transformación química: esta técnica está basada en estudios realizados por Mandel e Higa en 1970, en los que observaron que la incorporación de ADN del fago λ por células bacterianas se incrementaba sustancialmente en presencia de cloruro de calcio. Posteriormente, este método se aplicó para la introducción de ADN plasmídico a células bacterianas. En este procedimiento las células y el ADN plasmídico se incuban en una solución hipotónica de CaCl₂, que forma un complejo con el ADN que facilita su entrada por endocitosis a una célula competente; además, se aplica un breve choque térmico a 42ºC por 90 segundos que incrementa la permeabilidad de la membrana celular. La eficiencia de este método es de 1 × 10⁴ a 1 × 10⁶ células transformadas/µg de plásmido, misma que varía dependiendo de la longitud del plásmido y la cepa de bacterias utilizadas. Es un método sencillo y proporciona una buena eficiencia de transformación para muchos de los procedimientos de rutina, aunque puede incrementarse utilizando otros cationes divalentes, como el rubidio y el manganeso.

   2. Transformación por electroporación: consiste en la aplicación de breves pulsos eléctricos de alto voltaje (> 1500 V/5 ms) a las células receptoras, para formar poros en la membrana plasmática en células eucariotas y/o la pared celular en bacterias. Los componentes de la membrana se desestabilizan, lo que permite la entrada del vector al citoplasma de la célula. Esta es la técnica de transformación bacteriana más eficiente, ya que se obtienen alrededor de 1 × 10⁸ células transformadas/µg de plásmido. Por otro lado, este método es la mejor opción para plásmidos grandes de hasta 50 kb. La electroporación no es exclusiva de las bacterias, ya que puede utilizarse en células eucariotas. Además, es el método de elección cuando las células son resistentes a los métodos tradicionales de transfección y transformación. Ambos procesos se esquematizan en la figura 14-7.

      Debe considerarse que factores como la longitud del vector influyen de forma significativa en la eficiencia de transformación, con independencia del método empleado para la misma.

6. Identificación de las colonias que contienen el vector recombinante. Para identificar las bacterias transformadas se utilizan marcadores de selección proporcionados por los vectores. Los más utilizados son los genes de resistencia a antibióticos, como la ampicilina, la tetraciclina, el cloramfenicol y la kanamicina. Después de la transformación, las bacterias se siembran en cajas petri con agar suplementado con el antibiótico, para el cual el plásmido es resistente. Si la transformación ha sido exitosa las bacterias serán capaces de metabolizar el antibiótico y vivirán, lo que indicará que incorporaron el vector (ver la figura 14-2); cada colonia representa un solo evento de transformación. Otros marcadores de selección se basan en la producción de moléculas fluorescentes o bien en la producción de enzimas que, al reaccionar con un sustrato, producen coloración en la colonia de células transformadas.

La clonación génica tiene múltiples aplicaciones y ha sido el principal impulsor de la biotecnología y la metodología del ADN recombinante. Este proceso puede emplearse para la producción de proteínas eucariotas en bacterias (proteínas recombinantes), como hormonas, antibióticos, vacunas, generación de cultivos transgénicos resistentes a plagas o sequías, producción de animales transgénicos capaces de producir en su leche proteínas recombinantes (véase capítulo de organismos transgénicos), así como para el establecimiento de librerías genómicas o genotecas, que han permitido secuenciar por completo el genoma humano y el de otros organismos.

Genotecas

Una biblioteca genómica o genoteca es una colección de fragmentos de ADN, provenientes del genoma de un organismo, clonados en vectores para facilitar su estudio. Se pueden construir genotecas de ADN o de ADN.

Genotecas de ADNc

Los bancos de ADNc se construyen a partir de secuencias de ARNm mediante una reacción in vitro que sintetiza una primera cadena de ADNc utilizando una ADN polimerasa con actividad de transcriptasa inversa. El ARNm que no se copia a ADNc se elimina con la adición de la enzima ARNasa H. La segunda cadena de ADNc, complementaria a la obtenida de la retrotranscripción, se sintetiza en una reacción de PCR (véase capítulo de reacción en cadena de la polimerasa) o empleando una DNAc polimerasa que utilice la cadena sencilla del ADNc como templado. Posteriormente, este ADNc de doble cadena se clona en un vector. La producción de una biblioteca de ADNc se esquematiza en la figura 14-8.

Genotecas de ADNg

Para construir bancos de ADN es necesario aislar el ADNg del organismo de interés. Este ADNg se corta con enzimas de restricción para generar fragmentos con extremos complementarios a los del vector de clonación. Una vez que se ha construido la genoteca, se rastrea el clon o clones que portan el ADN con el gen de interés. Los métodos más frecuentes de identificación de clones recombinantes en una genoteca son la hibridación usando alguna sonda marcada (véase capítulo de técnicas de hibridación), el uso de anticuerpos frente a la proteína de interés o la selección de clonas por la actividad biológica de la proteína. En la actualidad, gracias a los adelantos de la metodología del ADN recombinante, es posible separar regiones determinadas de ADN, secuenciarlas, alterar la secuencia e introducir ese ADN exógeno a las células de un organismo, y aun a células germinales, para la producción de organismos transgénicos (véanse detalles en el capítulo de organismos transgénicos).

Producción de proteínas recombinantes

La clonación molecular ha permitido determinar la función de múltiples proteínas y generar proteínas recombinantes, que han reducido los costos de producción de hormonas o proteínas requeridas en la terapéutica, de las cuales previamente sólo se disponía de pequeñas cantidades por la escasez de fuentes, y la dificultad en su aislamiento o purificación. La facilidad en la producción de las proteínas recombinantes ha revolucionado el área biotecnológica, que ahora es un mercado dominante en el mundo de la biología molecular y cubre más de 10% de toda la industria farmacéutica. Las proteínas recombinantes se producen en bacterias (E. coli, B. subtilis), levaduras (Saccharomyces cereviceae, Pichia pastoris), células de insecto (Spodoptera frugiperda-9) y células de mamífero (células de ovario de hámster chino –CHO–, línea celular de riñon de hámster bebé –BHK– y HEK293 de riñón de embrión humano). Para maximizar la expresión de las proteínas se emplean promotores fuertes que aseguren la expresión por arriba de 10% del total de las proteínas celulares, aunque esto impone una carga metabólica a las células bajando la velocidad de su crecimiento, por lo que ciertas proteínas recombinantes pueden resultar tóxicas para las células que las producen. También puede alterarse la secuencia del gen de interés sustituyendo codones para los que hay ARNt poco frecuentes y reemplazarlos por aquellos que codifican para el mismo aminoácido, pero que se usan más en el organismo huésped. Asimismo, la producción de proteínas recombinantes en plantas presenta la ventaja de que su disponibilidad es prácticamente ilimitada de biomasa, y los costos de producción son bajos, pues una vez establecido el cultivo no se requiere personal especializado, no presenta riesgos de contaminación con patógenos animales, endotoxinas bacterianas o secuencias de ADN oncogénicas. Una ventaja adicional es que las plantas permiten el almacenamiento estable de la proteína recombinante en semillas y tubérculos, lo que facilita su conservación, transporte y distribución. Esto permite el abaratamiento de costos respecto a otros sistemas de producción. Así, existen ya biorreactores vegetales que producen vacunas comestibles, en tubérculos u hojas de lechuga, como por ejemplo para el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B humana.

La clonación molecular ha incrementado las perspectivas iniciales de la metodología del ADN recombinante y, de cierta manera, sentó las bases para la clonación de organismos e impulsó el desarrollo de la biotecnología, que ha tomado un papel protagónico en las ciencias de la salud.