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Un vector se define como una molécula de ADN de doble cadena (DNAds), con capacidad de albergar un fragmento de ADN exógeno (de otro origen).
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Clasificación de vectores
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De acuerdo con su uso, los vectores se clasifican en vectores de clonación y vectores de expresión.
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Vectores de clonación
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Los vectores son de clonación si su finalidad es el almacenamiento de secuencias y la obtención de grandes cantidades del ADN insertado o de la molécula recombinante. Los vectores de clonación suelen ser plásmidos, fagos, fagémidos, cósmidos y cromosomas artificiales bacterianos o de levadura.
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Vectores de expresión
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Los vectores de expresión son aquellos cuyo objetivo es producir un tránscrito (ARN) o la proteína producto de ese tránscrito. Los vectores de expresión pueden ser plásmidos o fagos (figura 14-1).
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Elementos que forman un vector de clonación
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Todos los vectores de clonación poseen, como parte de su estructura, los siguientes elementos básicos comunes:
Origen de replicación: es una secuencia en el ADN del vector que provee un sitio único de reconocimiento a las proteínas que identifican el sitio de inicio de la replicación (ORI). Los plásmidos se caracterizan por tener un solo sitio ORI en su genoma y realizar una replicación unidireccional.
Marcador de selección: es un gen que generalmente confiere resistencia a un antibiótico o genera un fenotipo particular con el cual puede seleccionarse la célula que incorporó el vector. En general, los marcadores de selección son únicos en los vectores, aunque existen algunos plásmidos que contienen dos. Entre los genes de selección más comunes se encuentran los de resistencia a ampicilina y kanamicina. Algunos vectores plasmídicos poseen un segundo marcador de selección, el gen lacZ, que se encuentra en el operón Lac de E. coli y codifica la enzima β-galactosidasa. Así, cuando el vector se replica dentro de la célula hospedera, la β-galactosidasa puede expresarse y generar una enzima funcional. Si la célula que contiene el vector se pone en contacto con un sustrato de la enzima, como el compuesto denominado X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolyl-β-D-galactopiranósido), es degradada por la enzima, lo que produce un color azul que permite identificar a las células que introdujeron el vector. También existen marcadores, como el gen de la proteína verde fluorescente (green fluorescente protein, GFP) que permite que la célula transformada emitía fluorescencia cuando se expone a luz ultravioleta (figura 14-2).
Sitio de clonación múltiple: es un fragmento de ADN que contiene una serie de sitios únicos de reconocimiento para enzimas de restricción, muy cercanos entre sí, con una amplia gama de posibilidades de insertar cualquier fragmento de ADN. Los sitios de restricción más comunes presentes en el sitio de clonación múltiple de la mayoría de los vectores son para las enzimas EcoR I, Hind III, BamH I, Xho I y Kpn I (ver la figura 14-1).
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A continuación se detallan los vectores de clonación más utilizados, esquematizados en la figura 14-3; sus características se resumen en el cuadro 14-1.
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Los plásmidos son pequeñas moléculas circulares de ADN que se replican y se transmiten con independencia del cromosoma bacteriano. De manera natural constituyen el material genético móvil de las bacterias, donde funcionan como medio de transporte de genes a otras bacterias, como la resistencia a antibióticos. Los plásmidos permanecen de manera episomal en la bacteria, esto es, sin incorporarse en su genoma, y en ella puede haber múltiples copias del mismo plásmido. Cuando una bacteria se reproduce, estos plásmidos se transmiten a las células descendientes por distribución equitativa del citoplasma bacteriano durante la división celular. Sin embargo, también pueden transmitirse a través de los pili entre las bacterias. La replicación y transcripción plasmídica depende de la maquinaria enzimática de la célula huésped.
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Los plásmidos han sido manipulados genéticamente en el laboratorio con la finalidad de preservar sólo las características deseables, eliminar el ADN innecesario y añadirle otras que no poseen de forma natural. Los plásmidos usados como vector en general están formados por de 2 a 5 kb de ADN, lo que facilita el análisis de los insertos incorporados a él. Existen cientos de plásmidos disponibles comercialmente que ofrecen una amplia variedad de posibilidades en cuanto a las enzimas de restricción que se van a emplear para la clonación, la longitud del producto que se va a insertar y los marcadores de selección de las clonas transformadas. Entre los plásmidos más utilizados se encuentran pBlueescript, pUC19, pBR322 y pGLO.
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Los bacteriófagos son virus que infectan naturalmente bacterias y se comportan como parásitos intracelulares obligados que se multiplican haciendo uso de la maquinaria biosintética de las bacterias. Al igual que los plásmidos, los bacteriófagos se replican de forma autónoma, portan información genética y pueden conferirle a la bacteria nuevas propiedades o desarrollarle procesos patológicos.
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Para convertirlo en un vector, el bacteriófago silvestre (virus natural) es modificado genéticamente. Dichas modificaciones consisten en la adición de sitios de restricción específicos y la eliminación de aquellos genes que no se requieren para la replicación, lo que permite la incorporación de fragmentos de ADN de mayor longitud que los plásmidos (de hasta 23 kb).
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El bacteriófago lambda es el fago más utilizado como vector de clonación, y su genoma consiste de una molécula lineal de aproximadamente 45000 pb, cuyos extremos son 12 nucleótidos, que contienen secuencias complementarias entre sí, denominados sitios cos, que utiliza para “circularizar” su genoma a través de la acción de una ligasa de la célula huésped (ver la figura 14-3).
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Algunos estudios de análisis de ADN genómico requieren de la clonación de fragmentos de ADN grandes. En estos casos, es recomendable utilizar los cósmidos ya que pueden aceptar insertos de hasta 45 kb.
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Los cósmidos son vectores híbridos del ADN de un plásmido (proporciona la resistencia a los antibióticos) y los sitios cos del bacteriófago (le permiten empaquetar el ADN). Los cósmidos derivados del fago P1 pueden admitir 85 kb de ADN exógeno. Además, contienen los genes de selección y un sitio ORI del plásmido, por lo que se replican de manera independiente del genoma bacteriano, como lo hacen los plásmidos.
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Cromosomas artificiales
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Fragmentos de ADN de mayor tamaño (cientos de kilobases) pueden clonarse en cromosomas artificiales de bacterias (BAC) o levadura (YAC), que se replican como un cromosoma independiente dentro de bacterias o levaduras, respectivamente. Este tipo de vectores son particularmente útiles para estudios de mapeo de cromosomas, por su capacidad para almacenar fragmentos de gran tamaño. Un BAC es un constructo derivado del plásmido F (functional fertility plasmid) capaz de regular la distribución equitativa de plásmidos después de la división bacteriana. Usualmente, acepta insertos de 150 a 350 Kb, pero se han clonado segmentos de hasta 700 kb. Un sistema similar denominado PAC, derivado del plásmido bacterial P1, tiene capacidad de insertar hasta 300 kb.
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Los YAC son cromosomas artificiales que contienen telómeros, origen de replicación, un centrómero de levadura y un marcador de selección para su identificación en las células que los contengan. Su capacidad de clonación es de 100 a 1000 kb.