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La técnica de Southern blot la desarrolló, en 1975, Edwin Southern y es una estrategia estándar para analizar ADN previamente digerido con enzimas de restricción.
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Esta técnica se utiliza para determinar la presencia de un gen o fragmentos del ADN específicos en una mezcla de ácidos nucleicos previamente extraídos.
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Se basa en la aplicación de dos procesos fundamentales: la desnaturalización o separación de las cadenas complementarias del ADN y la hibridación o unión de dos cadenas complementarias. Este fundamento es compartido por todas las técnicas de hibridación.
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Procedimiento técnico
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En este procedimiento, primero se aísla el ADN de cualquier célula del organismo excepto de glóbulos rojos, ya que carecen de núcleo. Para el análisis molecular de un paciente, el ADN puede obtenerse de linfocitos. Sin embargo, la extracción puede hacerse también de otras fuentes: cultivos celulares, células de líquido amniótico, vellosidades coriónicas o cualquier órgano biopsiado. Una vez extraído el ADN, se digiere con enzimas de restricción y los fragmentos se separan por electroforesis en geles de agarosa, de acuerdo con su carga/masa. En algunas ocasiones se utilizan geles de acrilamida cuando los fragmentos que se van a separar son muy pequeños. En este procedimiento electroforético, como ya se mencionó, las muestras se someten a un campo eléctrico; como los fragmentos de ADN tienen carga negativa (por sus grupos fosfato) todos se mueven en la misma dirección hacia el electrodo positivo, y los fragmentos más pequeños migran más rápidamente.
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Las moléculas de ADN separadas pueden visualizarse mediante su tinción con bromuro de etidio. En este momento el procedimiento no es informativo, debido a que el fragmento de interés se encuentra inmerso en millones de fragmentos creados por las enzimas de restricción. Posteriormente, el ADN se desnaturaliza para obtener cadenas sencillas, mediante un proceso químico, generalmente por tratamiento con álcalis. A continuación, los fragmentos se transfieren del gel a un soporte sólido, como membranas de nitrocelulosa o de nailon. Existen diferentes métodos para la transferencia, como la capilaridad, el vacío o la electrotransferencia. Es importante señalar que la finalidad de la transferencia es crear una réplica de lo que se tenía en el gel, ahora en un soporte mucho más sólido, como es una membrana. Por último, para identificar uno o más fragmentos entre millones de fragmentos, se utiliza una sonda específica marcada con alguna molécula reportera (por ejemplo, “radiactividad”, 32P-dCTP). La sonda se pone en contacto con la membrana de nitrocelulosa y en aquellos lugares en donde la sonda encuentre su secuencia complementaria se pegará, proceso conocido como hibridación. La sonda emitirá radiactividad, la cual se detectará mediante un proceso de revelado con placas de rayos X. La emisión de la sonda corresponderá únicamente al fragmento de interés. En la figura 15-1 se observa un esquema de cada uno de los pasos involucrados en la técnica de Southern blot.
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Marcaje de las sondas
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Las sondas pueden marcarse radiactivamente (en general con 32P) o enzimáticamente (biotina, digoxigenina, etc.). Una ventaja de los sistemas enzimáticos es que, una vez marcada la sonda, su vida media es muy larga (meses), mientras que el marcaje radiactivo es más corto (para 32P, de 15 días). Sin embargo, la sensibilidad varía: las radiactivas detectan hasta 0.1 pg de ácido nucleico y las enzimáticas, entre 1 y 10 pg. Las sondas pueden marcarse en un extremo o a lo largo de toda la cadena. Para marcar en un extremo puede utilizarse la enzima polinucleótido cinasa (que introduce un único nucleótido marcado en el extremo 5’ de la sonda) o la enzima transferasa terminal (que introduce varios nucleótidos marcados en el extremo 3’ de la sonda).
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El marcaje en toda la sonda se realiza por el procedimiento de nick traslation (figura 15-2). En este método se combinan dos actividades enzimáticas:
Actividad ADNsa 1, que suprime un nucleótido al azar de una de las dos cadenas de la sonda.
Actividad de ADN polimerasa, que, a partir del hueco dejado en la cadena deADN por la ADNsa 1, va incorporando nuevos nucleótidos por complementariedad (entre los que están marcados), tomando como molde la otra cadena de ADN intacta.
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Otro método para marcar sondas es el de random primers (secuencias cortas de oligonucleótidos, normalmente hexámeros, que por su pequeño tamaño hibridan al azar a lo largo de toda la cadena). Al añadir la enzima ADN polimerasa 1 desde el lugar donde se unen los primers, van incorporándose nucleótidos en donde algunos van marcados radiactivamente hasta que finalmente se completa la cadena.
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La técnica de Southern blot ha sido de gran utilidad para identificar genes asociados con enfermedades de transmisión genética, e identificar mutaciones, como rearreglos, deleciones y dosis génica en caso de portadores (figura 15-3).
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También se utiliza para detectar polimorfismos en los fragmentos de restricción de diversos genes.