Capítulo 15: Técnicas de hibridación

Al revelar los numerosos métodos mediante los cuales las células procesan, añaden, eliminan y transfieren información genética, los biólogos moleculares abrieron el camino para el desarrollo de sus propias manipulaciones genéticas. En los últimos años, se han desarrollado técnicas que han permitido abordar el análisis y la manipulación del ADN de una forma antes inimaginada. La tecnología del ADN recombinante ha hecho posible investigar más a fondo la estructura y la función de los genes, en especial de los genes eucarióticos, inaccesibles por otros métodos. Cuando los investigadores se enfrentaron por primera vez con el gran tamaño y la complejidad del ADN, incluso el del virus más simple, la posibilidad de descifrar la información genética codificada parecía estar más allá de toda esperanza. Se hizo evidente que para estudiar un gen individual, se lo debía aislar del resto del genoma ya que, cada gen representa una pequeña sección dentro de un cromosoma y, en ese contexto, no puede individualizarse. Para el aislamiento de un gen o de fragmentos más pequeños, el ADN debe fragmentarse. Si bien la rotura del ADN puede realizarse mecánicamente, por este medio la fragmentación se produce al azar. La obtención de fragmentos específicos de ADN fue posible mediante un método desarrollado a partir de herramientas propias de ciertos organismos. Para avanzar hacia un estudio más detallado del ADN fue necesaria una metodología que permitiera obtener grandes cantidades de fragmentos específicos de ADN. Estos fragmentos podían ser ADN genómico, ADN complementario (ADNc) o ADN obtenidos a partir de oligonucleótidos sintéticos. A menudo, antes de que un determinado fragmento de ADN o de ARN mensajero (ARNm) pueda manipularse de cualquier modo, primero debe localizarse. Los cromosomas, incluso los de las células eucarióticas más simples, contienen una enorme cantidad de ADN, por lo que localizar un segmento específico es como tratar de encontrar la proverbial aguja en el pajar. Para localizar fragmentos específicos se utiliza la técnica de hibridación de ácidos nucleicos. Entre las técnicas de hibridación más comunes se encuentran Southern blot, Northern blot, Slot blot, Dot blot e hibridación in situ. Antes de abordar cada metodología es importante mencionar algunos aspectos básicos que facilitarán el entendimiento técnico de estas herramientas de la biología molecular, como son la electroforesis de ácidos nucleicos y la definición de sondas.

Electroforesis de ácidos nucleicos

La electroforesis es una técnica analítica de separación de macromoléculas. La separación tiene lugar debido a la diferente movilidad que presentan las macromoléculas cargadas cuando se someten a la influencia de un campo eléctrico como consecuencia de su relación carga/masa. Los ácidos nucleicos son moléculas cargadas negativamente, debido a la presencia de grupos fosfato en su estructura. La naturaleza del enlace fosfodiéster de las cadenas polinucleotídicas condiciona la carga de un ácido nucleico, que es aproximadamente igual al número de grupos fosfato. La electroforesis en geles de agarosa se lleva a cabo en aparatos apropiados, cámaras generalmente horizontales, y requiere de dos elementos indispensables: la fase móvil y la fase estacionaria. La fase móvil es el medio amortiguado que permite la movilidad de las moléculas cargadas hacia los electrodos correspondientes cuando se genera un campo eléctrico. La fase estacionaria, o soporte, es un polímero de naturaleza gelatinosa conocida como agarosa (originalmente obtenido de algas, como el agar-agar, pero de composición más homogénea). Dependiendo de su concentración genera poros de cierto tamaño a través de los cuales migran los fragmentos de ADN o ARN. Normalmente la concentración es de 0.5 a 2%. La agarosa posee la propiedad de permanecer líquida a más de 50 °C y de formar un gel al enfriarse. Los fragmentos de ácidos nucleicos separados por electroforesis se visualizan mediante su tinción con bromuro de etidio, un colorante que se intercala entre las bases del ADN y que emite fluorescencia cuando se irradia con luz ultravioleta.

Sondas

Las sondas son segmentos de ADN o ARN de cadena sencilla marcados con moléculas reporteras, como enzimas o radioisótopos, que permiten su fácil detección. El diseño de la sonda, es decir, su secuencia nucleotídica, es lo que le permitirá, entre miles de fragmentos que forman parte del genoma de un ser humano, identificar “un solo gen” o “el fragmento de un gen”. Gran parte del éxito de este tipo de estrategias moleculares depende de la especificidad de la sonda. La longitud de las sondas puede ir de 15 a 30 bases, conocidas también como oligonucleótidos, hasta miles de bases de nucleótidos. Pueden sintetizarse y purificarse con relativa facilidad por instrumentos comerciales disponibles en la actualidad. En términos generales las sondas se obtienen a partir de síntesis química o de plásmidos, que se clonan con la sonda de interés. La especificidad de la síntesis de la sonda dependerá del objetivo de estudio (por ejemplo, el diagnóstico de mutaciones en enfermedades genéticas o la identificación de un polimorfismo).

Fundamento

La técnica de Southern blot la desarrolló, en 1975, Edwin Southern y es una estrategia estándar para analizar ADN previamente digerido con enzimas de restricción.

Esta técnica se utiliza para determinar la presencia de un gen o fragmentos del ADN específicos en una mezcla de ácidos nucleicos previamente extraídos.

Se basa en la aplicación de dos procesos fundamentales: la desnaturalización o separación de las cadenas complementarias del ADN y la hibridación o unión de dos cadenas complementarias. Este fundamento es compartido por todas las técnicas de hibridación.

Procedimiento técnico

En este procedimiento, primero se aísla el ADN de cualquier célula del organismo excepto de glóbulos rojos, ya que carecen de núcleo. Para el análisis molecular de un paciente, el ADN puede obtenerse de linfocitos. Sin embargo, la extracción puede hacerse también de otras fuentes: cultivos celulares, células de líquido amniótico, vellosidades coriónicas o cualquier órgano biopsiado. Una vez extraído el ADN, se digiere con enzimas de restricción y los fragmentos se separan por electroforesis en geles de agarosa, de acuerdo con su carga/masa. En algunas ocasiones se utilizan geles de acrilamida cuando los fragmentos que se van a separar son muy pequeños. En este procedimiento electroforético, como ya se mencionó, las muestras se someten a un campo eléctrico; como los fragmentos de ADN tienen carga negativa (por sus grupos fosfato) todos se mueven en la misma dirección hacia el electrodo positivo, y los fragmentos más pequeños migran más rápidamente.

Las moléculas de ADN separadas pueden visualizarse mediante su tinción con bromuro de etidio. En este momento el procedimiento no es informativo, debido a que el fragmento de interés se encuentra inmerso en millones de fragmentos creados por las enzimas de restricción. Posteriormente, el ADN se desnaturaliza para obtener cadenas sencillas, mediante un proceso químico, generalmente por tratamiento con álcalis. A continuación, los fragmentos se transfieren del gel a un soporte sólido, como membranas de nitrocelulosa o de nailon. Existen diferentes métodos para la transferencia, como la capilaridad, el vacío o la electrotransferencia. Es importante señalar que la finalidad de la transferencia es crear una réplica de lo que se tenía en el gel, ahora en un soporte mucho más sólido, como es una membrana. Por último, para identificar uno o más fragmentos entre millones de fragmentos, se utiliza una sonda específica marcada con alguna molécula reportera (por ejemplo, “radiactividad”, ³²P-dCTP). La sonda se pone en contacto con la membrana de nitrocelulosa y en aquellos lugares en donde la sonda encuentre su secuencia complementaria se pegará, proceso conocido como hibridación. La sonda emitirá radiactividad, la cual se detectará mediante un proceso de revelado con placas de rayos X. La emisión de la sonda corresponderá únicamente al fragmento de interés. En la figura 15-1 se observa un esquema de cada uno de los pasos involucrados en la técnica de Southern blot.

Marcaje de las sondas

Las sondas pueden marcarse radiactivamente (en general con ³²P) o enzimáticamente (biotina, digoxigenina, etc.). Una ventaja de los sistemas enzimáticos es que, una vez marcada la sonda, su vida media es muy larga (meses), mientras que el marcaje radiactivo es más corto (para ³²P, de 15 días). Sin embargo, la sensibilidad varía: las radiactivas detectan hasta 0.1 pg de ácido nucleico y las enzimáticas, entre 1 y 10 pg. Las sondas pueden marcarse en un extremo o a lo largo de toda la cadena. Para marcar en un extremo puede utilizarse la enzima polinucleótido cinasa (que introduce un único nucleótido marcado en el extremo 5’ de la sonda) o la enzima transferasa terminal (que introduce varios nucleótidos marcados en el extremo 3’ de la sonda).

El marcaje en toda la sonda se realiza por el procedimiento de nick traslation (figura 15-2). En este método se combinan dos actividades enzimáticas:

1. Actividad ADNsa 1, que suprime un nucleótido al azar de una de las dos cadenas de la sonda.

2. Actividad de ADN polimerasa, que, a partir del hueco dejado en la cadena deADN por la ADNsa 1, va incorporando nuevos nucleótidos por complementariedad (entre los que están marcados), tomando como molde la otra cadena de ADN intacta.

Otro método para marcar sondas es el de random primers (secuencias cortas de oligonucleótidos, normalmente hexámeros, que por su pequeño tamaño hibridan al azar a lo largo de toda la cadena). Al añadir la enzima ADN polimerasa 1 desde el lugar donde se unen los primers, van incorporándose nucleótidos en donde algunos van marcados radiactivamente hasta que finalmente se completa la cadena.

Aplicaciones

La técnica de Southern blot ha sido de gran utilidad para identificar genes asociados con enfermedades de transmisión genética, e identificar mutaciones, como rearreglos, deleciones y dosis génica en caso de portadores (figura 15-3).

También se utiliza para detectar polimorfismos en los fragmentos de restricción de diversos genes.

Diferencias con Southern blot

Es la contraparte del Southern blot y como ácido nucleico se utiliza ARN en lugar de ADN. A diferencia del Southern blot, con esta técnica no se utilizan enzimas de restricción, ya que las moléculas de ARN son más pequeñas y para su análisis no requieren su fraccionamiento. Sin embargo, prácticamente comparten todos los demás pasos, como son la electroforesis, la desnaturalización (aunque el ARN es de cadena sencilla, puede formar estructuras secundarias), la transferencia y la hibridación con una sonda.

Aplicaciones

Es una herramienta muy útil para el estudio de los productos de la transcripción génica (ARNm) y de su regulación, ya que se pueden estudiar las potenciales variaciones en la abundancia de especies del ARN en diferentes condiciones experimentales o comparar condiciones clínicas normales o patológicas.

Tras el aislamiento y separación de los ácidos nucleicos, éstos se aplican directamente a la membrana sin separarlos, según su peso molecular; es decir, no se realiza electroforesis. La fijación se hace generalmente con vacío y en un molde cuyo pocillo puede tener forma de punto (dot blot) o ser lineal (slot blot) (figura 15-4). Es posible realizar detecciones no sólo cualitativas (positivo o negativo) sino también cuantitativas, utilizando como patrón diluciones seriadas de concentraciones conocidas del genoma que se está determinando.

Es un método histoquímico que emplea a la biología molecular de la misma manera que la inmunohistoquímica utiliza los métodos de la inmunología. Los principios de ambos métodos son semejantes y el resultado final es el mismo: la identificación de componentes tisulares que pueden observarse al microscopio. La especificidad de la inmunohistoquímica se basa en la unión antígeno/anticuerpo, mientras que la especificidad de la hibridación in situ se basa en la unión de una sonda con una secuencia complementaria de ADN o ARN dentro de un tejido. A diferencia de Southern blot y Northern blot, la hibridación in situ no requiere de la extracción de ácidos nucleicos, sino que en el mismo tejido se lleva a cabo el procedimiento de detección e hibridación; de ahí el nombre de in situ (en el mismo lugar). Las sondas que se utilizan para la hibridación in situ pueden ser radiactivas y no radiactivas. En la actualidad, las más relevantes son las marcadas con fluorescencia, modalidad conocida como hibridación in situ acoplada a un sistema de fluorocromos (FISH) (figura 15-5), o con biotina, ya que el detalle morfológico no se pierde, a diferencia de lo que ocurre con las modalidades radiactivas.

Aspectos técnicos

El primer paso para la hibridación es la preparación y fijación del tejido, en el cual deben conservarse los ácidos nucleicos lo más íntegramente posibles, mantener la morfología del tejido y permitir una accesibilidad suficiente para que la sonda penetre. La fijación con formalina, seguida de una inclusión con parafina es el procedimiento más usado. Después de la fijación las secciones de tejido deben adherirse al portaobjetos y no deben desprenderse durante el procedimiento de hibridación. Normalmente se utiliza gelatina crómica, polilisina o Vectabond^® (producto comercial). Antes de la hibridación, los tejidos se pretratan con HCl (que extrae proteínas e hidroliza parcialmente las secuencias diana) y proteinasa K (que incrementa la penetración y la accesibilidad de la sonda) y se someten a una posfijación con paraformaldehído (incrementa la especificidad de la señal). El procedimiento es muy complejo, por lo que únicamente se han mencionado algunos de los aspectos más relevantes.

Aplicaciones

La hibridación in situ tiene un alto grado de resolución, que permite la localización de secuencias génicas a nivel cromosómico, con lo que se pueden detectar translocaciones y otras alteraciones cromosómicas, así como el estudio de expresión de genes (ARNm) a nivel celular y subcelular. Las principales aplicaciones son la identificación de infecciones virales en tejidos, así como el mapeo cromosómico.