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Esta técnica ha evolucionado desde su invención. En la actualidad, gracias a los múltiples sistemas de detección, a variantes en los iniciadores y a la cantidad de pares de primers empleada se dispone de diversas variantes de la técnica, que se enlistan a continuación:
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Se basa en la detección del producto de amplificación mediante una electroforesis en gel de agarosa o acrilamida. El producto amplificado se visualiza mediante una banda (ver el capítulo 12 Electroforesis). La intensidad de la banda se considera proporcional a la cantidad de producto amplificado y su longitud se verifica interpolando contra un marcador de peso molecular comercial de longitudes conocidas como se aprecia en la figura 16-6. El análisis de imagen de la banda del producto de PCR permite medir su intensidad mediante software y realizar una medición semicuantitativa de las bandas de los productos de PCR obtenidos en diversas muestras. La semicuantificación puede ser respecto a cualquiera de las muestras contenidas en el gel, como se observa en la figura 16-7A, en la que el carril 3 muestra una banda tres veces más intensa que la banda del carril 1, pero la mitad de intensa que la banda de la muestra 2. O bien una semicuantificación de las muestras respecto a un gen constitutivo, como se observa en la figura 16-7B. Para este tipo de análisis se mide la intensidad relativa de la banda del producto de PCR del gen de interés y de un gen constitutivo. Se considera un gen constitutivo aquel que tiene una expresión constante, ya que es indispensable para la viabilidad de la célula y esta expresión no se altera por la presencia de alguna enfermedad o variaciones en la condición fisiológica, no varía entre los individuos ni durante el desarrollo (edad) y no se ve afectado por las condiciones del experimento. GAPDH (gliceraldehido 3 fosfato deshidrogenasa), HPRT (hipoxanthine guanine phosphoribosyltransferase), β-actina (beta-actina) y ARNr 18S (ARN ribosomal 18S) son los genes constitutivos más empleados para este tipo de análisis
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Con el valor de intensidad relativa de los genes, los datos se normalizan respecto al gen constituido y se calcula un índice:
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Ya que la expresión del gen constitutivo permanecerá relativamente constante, esta relación indica directamente la variación entre muestras del gen de interés. Esta forma de semicuantificación es también posible realizarla con la tecnología de detección en tiempo real empleando los métodos 2ΔΔCt, o el método 2ΔCt, que se describen más adelante.
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Esta modalidad de PCR permite detectar la presencia o ausencia de un fragmento de ADN determinado. Es decir, sólo reporta si una muestra es positiva o negativa ante la presencia de un determinado ADN. Se emplea para el diagnóstico de enfermedades infecciosas y sólo permite confirmar la presencia o ausencia de un determinado agente patógeno, esto es, si una persona está o no infectada.
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Permite conocer los niveles de expresión de un gen (ARNm) en particular, y normaliza los niveles encontrados de este gen con los encontrados en un gen de expresión constitutiva, que se expresa de manera constante en la célula. Al realizar una relación entre la expresión del gen de interés con la expresión del gen constitutivo el índice que se obtenga indicará la expresión real del gen de interés y se reporta como porcentaje de expresión. Esto permite su comparación con otras muestras analizadas de la misma manera.
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En esta modalidad de PCR, el producto de PCR es cuantificable, lo que permite reportar en números absolutos la cantidad de un microorganismo o del ARNm de un gen en una muestra. Para la cuantificación absoluta se amplifica al mismo tiempo una curva con muestras de concentración conocida del ADN que se quiere analizar. Los resultados de las muestras se traslapan a los valores de la curva y de esta manera se conoce la concentración de la muestra.
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PCR múltiple (varias regiones o varios genes)
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En este tipo de PCR se realiza la amplificación de más de un fragmento de ADN en una sola reacción de PCR con dos o más juegos de primers (cada juego para un gen en particular). Tiene la ventaja de que ahorra tiempo y reactivos, pero presenta el inconveniente de que el diseño de los primers debe ser adecuado para que no se complementen entre ellos (hibridaciones inespecíficas). La PCR múltiple o multiplex puede emplearse para la búsqueda de varias deleciones, mutaciones y polimorfismos en un solo gen o en múltiples. Esta técnica se utiliza para el análisis simultáneo de múltiples marcadores moleculares asociados a alguna enfermedad, para la detección simultánea de varios agentes patógenos, organismos genéticamente modificados, etcétera.
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PCR selectiva (detecta genes silvestres o mutados)
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Para la PCR selectiva se diseñan primers capaces de hibridar solamente en secuencias con presencia de una mutación, por lo que, en caso de estar ausente, no se produce un producto de PCR. Como control se produce una PCR con primers diseñados para la amplificación de la forma silvestre del gen, cuyos resultados deben coincidir con los obtenidos con los primers que amplifican la mutación. En caso de homocigatos sólo una de las dos reacciones debe resultar positiva, en el caso de heterocigenos ambas reacciones resultan positivas.
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Se realiza en una muestra de tejido embebida en parafina (laminilla) o congelada y cortada en criostato. No requiere extracción del ADN del tejido. En la laminilla se añaden los reactivos necesarios para la PCR y se colocan en un termociclador especial, ya que en lugar de tener orificios para colocar tubos contiene ranuras para colocar las laminillas. Esta modalidad de PCR permite saber qué tipo celular presente en un tejido expresa un determinado gen o cuál célula está infectada por un patógeno.
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PCR anidada (nested-PCR)
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Esta variante de la PCR convencional proporciona mayor sensibilidad a la técnica, al amplificar las secuencias de ADN en dos rondas de amplificación con distintos pares de iniciadores o primers en cada una. Esto es, primero se realiza una PCR con un par de iniciadores externos para amplificar una región de ADN extensa, que contiene el segmento diana que se desea amplificar. Después, este producto de amplificación sirve de molde para una segunda PCR con otro par de iniciadores internos (primers anidados) para amplificar una región más pequeña (interna). Por lo tanto, la longitud del producto de amplificación de la segunda PCR, o PCR anidada, será menor que la del primer producto de PCR (figura 16-8).
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Es aquella en la que el producto de PCR se analiza después de 25 a 35 ciclos en el punto previo a la saturación de la reacción, mediante un gel de electroforesis. Presenta el inconveniente de que diferente cantidad de material de inicio da lugar a una cantidad diferente de producto al final, además de que diferente cantidad de material de inicio da lugar a la misma cantidad de producto al final, de la reacción. La detección en punto final también presenta las desventajas de que depende de la resolución del gel de agarosa, que suele ser baja y no permite detectar pequeños cambios en la concentración; requiere un procesamiento posreacción, y la tinción de bromuro de etidio es semicuantitativa, pues más de una molécula de bromuro de etidio puede unirse a un solo producto de PCR y, por tanto, tiene una precisión pobre y presenta una sensibilidad menor que la PCR en tiempo real.
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Las desventajas que presenta la PCR en punto final llevaron a los investigadosres a diseñar una tecnología que solventara estos inconvenientes conocida como PCR en tiempo real. La reacción de amplificación es la misma, lo que cambia es el método de detección del producto amplificado y su temporalidad. La detección de las copias del producto de PCR se realiza al mismo tiempo que sucede la amplificación, mediante intercalados en el producto de PCR, un láser que detecta fluorocromos acoplados a los primers o a una sonda que hibrida en medio de los primers, que se degrada y libera su fluorocromo por la acción exonucleasa 3’-5’ de la polimerasa. Mediante la detección de la fluorescencia liberada durante la reacción de amplificación puede medirse la cantidad de ADN sintetizado en cada momento, ya que la emisión de fluorescencia producida en la reacción es proporcional a la cantidad de producto de PCR formado. Esto permite conocer y registrar en todo momento la cinética de la reacción de amplificación.
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Cabe mencionar que para la técnica de PCR en tiempo real la temperatura de alineación y extensión es la misma, por lo que ambos pasos se unifican. Esto se logra porque la temperatura óptima para la enzima AmpliTaq Gold® es de 60ºC, lo que aunado a un diseño de primers que permite su alineación óptima a la misma temperatura permite que este paso sea conjuntado y reduce el tiempo de reacción.
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Los sistemas de detección por fluorescencia empleados en la PCR en tiempo real pueden ser iniciadores marcados por fluoróforos (primers LUX —light uponextension fluorogenic—), sondas específicas marcadas con fluorócromos (sondas TaqMan) o bien agentes intercalantes fluorescentes, como SyberGreen o SyberSafe.
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PCR en tiempo real empleando SyberGreen
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Para la detección en tiempo real, puede emplearse un agente intercalante denominado SYBERreen. En este método, muy utilizado por su bajo costo, el fluoróforo se une al ADN de doble cadena de manera inespecífica y produce fluorescencia (figura 16-9). La desventaja estriba en que la unión, al ser inespecífica, será a lo largo de toda la molécula de ADN de doble cadena, incluyendo los dímeros de primer que pudieran formarse. El uso de SYBERGreen implica un diseño muy cuidadoso de los primers con el fin de evitar la formación de dímeros. La detección del producto amplificado corresponderá a la intensidad de la fluorescencia; sin embargo, ya que varias moléculas de SYBERGreen pueden unirse a una sola molécula de ADNds, se considera un método de cuantificación menos preciso que las tecnologías con primers LUX o sondas TaqMan.
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PCR en tiempo real con sondas TaqMan
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En esta tecnología (de Applied Biosystems), la reacción de amplificación se lleva a cabo en un termociclador que realiza, a la vez, la detección de fluorocromos mediante luz láser. En esta tecnología, además de un juego de primers se utiliza una sonda marcada con fluorescencia. La sonda TaqMan® empleada se diseña de manera que hibrida en algún punto intermedio de la secuencia franqueada por el primer sentido y el antisentido. Estos primers están diseñados para amplificar fragmentos de entre 60 y 150 pb. La sonda tiene acoplado un fluorocromo en su extremo 5’, silenciado por otro fluorocromo o quencher (referencia pasiva). La sonda hibrida en la cadena molde del ADN que va a ser amplificada y libera su fluorocromo sólo cuando la sonda se degrada por la acción de exonucleasa 5’-3’ de la ADN polimerasa. Las sondas TaqMan se basan en el método FRET. Este método consiste en la transferencia de energía fluorescente mediante resonancia entre dos moléculas. Estas moléculas son dos tipos de fluorocromos, un donador y un aceptor, y su principio se basa en que una molécula de alta energía cercana a otra de baja energía (quencher) promueve una transferencia energética sin emisión de fluorescencia. Una vez que se separan dichas moléculas se emite la fluorescencia, que capta el lector del equipo. Las sondas TaqMan son cortas y para separar las dos moléculas fluorescentes necesitan la rotura de su estructura por la ADN polimerasa con actividad endonucleasa y así liberar la fluorescencia. En esta tecnología se emplea la ADN polimerasa (AmpliTaq Gold®), que se mantiene inactiva por la unión de un anticuerpo y se libera cuando la reacción se incuba a los 95°C iniciales de desnaturalización. Los dNTP empleados contienen dUTP en lugar de dTTP, por lo que los productos de PCR contienen dUTP. La mezcla de reacción contiene uracil-N-glicosilasa (UNG) (AmpErase®). La enzima UNG degradados productos de PCR de reacciones previas, previniendo la contaminación de la reacción de PCR actual con ADN endógenos. Ya que durante los ciclos normales de PCR las altas temperaturas inactivan la UNG, sólo los ADN presentes en la muestra servirán de molde para ser amplificados. Asimismo, el fluorocromo ROX (conjugado de glicina de 5-carboxi-X-rodamina, succinimidiléster) se incluye como referencia pasiva a una concentración final de 500 nM para normalizar la fluorescencia entre reacciones por cualquier posible fluctuación asociada con variación en el volumen. El empleo de este tipo de sondas se esquematiza en la figura 16-10.
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PCR en tiempo real con primers LUX
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La PCR con primers LUX se fundamenta en que uno de los iniciadores se encuentra marcado con un fluoróforo; cuando el iniciador hibrida con la cadena blanco, el fluoróforo es excitado, lo que da como resultado un incremento significativo de la señal de fluorescencia que el láser detecta. Para la amplificación con primers LUX se emplea una enzima TaqPlatinum® ADN polimerasa que se activa sólo después del hot-start inicial de la PCR (5 minutos a 95°C). De la misma manera que con la tecnología TaqMan, la mezcla de reacción contiene una UNG para prevención de contaminación por acarreamiento. Además, el mix contiene Tris-HCl, KCl, 6 mM de MgCl2, 400 µM de desoxiguanina trifosfato (dGTP), 400 µM de desoxiadenosina trifosfato (dATP), 400 µM de desoxicitidina trifosfato (dCTP), 800 µM de desoxiuridina trifosfato (dUTP), UNG, 1 µM de fluorocromo ROX y estabilizadores. Su empleo se esquematiza en la figura 16-11.
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Semicuantificación en tiempo real con el método 2DDCt
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En la PCR en tiempo real la concentración relativa se obtiene interpolando todas las muestras en un punto umbral, ciclo de corte o cyclethreshold (CT). El CT es el ciclo elegido por el usuario de la fase exponencial en donde la cantidad inicial de moléculas del gen de interés presentes en una muestra es inversamente proporcional a la intensidad de fluorescencia. El CT permite discriminar el comportamiento de las muestras, ya que a un menor valor de CT existe mayor cantidad inicial de moléculas del gen de interés en una muestra. El CT lo determina un software a un umbral de fluorescencia fijo (threshold) seleccionado por el analista, como se expone en la figura 16-12. Estos valores pueden relacionarse con una curva estándar para determinar la cantidad de moléculas de ADN existentes (cuantificación absoluta) o con un grupo de referencia (cuantificación relativa). La cuantificación relativa puede utilizarse para determinar la expresión de los niveles de ARNm de un grupo de células o tejidos respecto a una referencia (control o condición experimental). Para la cuantificación relativa debe tenerse en cuenta que todas las muestras provienen de individuos diferentes; por tanto, debe realizarse un procedimiento conocido como normalización, con un gen control endógeno (constitutivo), para eliminar la variabilidad entre muestra y muestra. El cálculo se realiza mediante la fórmula 2ΔΔCt relativo a un grupo que se considera calibrador. Donde:
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ΔCT = CT promedio del grupo de muestras para el gen de interés – CT promedio del grupo de muestras para el gen constitutivo;
ΔΔCT = ΔCT grupo calibrador – ΔCT grupo de interés.
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Por tanto, después de la normalización de los datos respecto al gen constitutivo (ΔCT) se selecciona un grupo que funciona como calibrador del experimento y los datos del resto de los grupos se comparan con el grupo calibrador tendrá el valor de 1 y el resto de los grupos, un valor menor o mayor lo que proporciona un valor semicuantitativo.
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Semicuantificación en tiempo real con el método 2ΔCt
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Este método de semicuantificación para muestras procesadas en tiempo real se realiza cuando no se desea tomar un grupo de muestras como referencia, como cuando la muestra se desea comparar frente a ella misma en diferentes condiciones. La fórmula se aplica:
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ΔCT = CT promedio de la muestra para el gen constitutivo – CT promedio de la muestra para el gen de interés.
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PCR cuantitativa mediante la tecnología en tiempo real
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Para una PCR cuantitativa se emplea la metodología en tiempo real y una curva con estándares de concentración conocida. Esta curva debe tener en cuenta que el ADN o ARN que se emplee debe estar diluido de manera precisa, y en el caso particular de ARN se asume que la eficiencia de retrotranscripción ha sido la misma para todas las muestras. La curva estándar se construye a partir de concentraciones conocidas de un plásmido que contiene clonado el cADN de la muestra a analizar. Debe asegurarse que la eficiencia de la PCR sea la misma para la muestra y para el estándar. Las diferentes diluciones de la curva presentarán CT proporcionales a la cantidad de muestra, y mediante la fórmula de regresión lineal (y = mx + b), interpolando los valores de las muestras en el gráfico obtenido se puede conocer la concentración absoluta de las muestras.