Capítulo 16: Reacción en cadena de la polimerasa

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se considera una de las técnicas más sensibles y específicas de las pruebas moleculares. Fue desarrollada en 1986 por el Dr. Kary Mullis, en los laboratorios de CETUR Corporation, en Estados Unidos, lo que le hizo valedor del premio Nobel en 1993. La idea se fundamentó en la necesidad de obtener un gran número de copias de fragmentos específicos de ADN de manera rápida y económica, los cuales no podían obtenerse por otros métodos hasta ese momento. Esta técnica se basa en una replicación exponencial in vitro de una molécula de ADN genómico (ADNg) o ADN complementario (ADNc), mediante ciclos repetitivos, que constan de tres temperaturas. En cada uno de los ciclos las moléculas se duplican hasta que los reactivos se agotan.

La longitud del producto amplificado la delimitan los iniciadores, también llamados primers u oligonucleótidos, de cuyo diseño adecuado depende el éxito de la PCR. Los iniciadores deben ser específicos, no formar estructuras secundarias entre ellos ni hibridaciones inespecíficas entre ellos u otra parte de la cadena.

La amplificación in vitro de la PCR se apega a las mismas reglas de la replicación; esto es, se basa en una secuencia que le sirve de molde y, por complementariedad, sintetiza la cadena antiparalela. También, la síntesis de la cadena sigue la dirección 5’-3’, ya que requiere de un nucleótido con el extremo 3’ libre que proporcione el grupo OH para la adición del siguiente nucleótido, con lo que se forma el enlace fosfodiéster.

Para que se lleve a cabo la PCR se requiere una cadena de ADNg o ADNc que sirva de molde, una enzima ADN polimerasa, cofactores necesarios para la actividad correcta de la ADN polimerasa, desoxinucleótidos (dNTP) para la síntesis del producto de PCR y oligonucleótidos o primers. La función de cada uno de estos elementos en la reacción se describe a continuación y se enlistan en la figura 16-1.

ADN polimerasa

En la actualidad, la Taq ADN polimerasa es la enzima más empleada para la PCR; tiene como función polimerizar una nueva cadena de ADN tomando como molde otra ya existente. Debido a que en cada ciclo de la PCR se lleva la mezcla de reacción a temperaturas de 95°C, se requiere de una ADN polimerasa capaz de soportar dichas temperaturas. Anteriormente, esta necesidad se suplía con la adición de E. coli en cada ciclo de la ADN polimerasa, que se inactivaba con la temperatura de 95°C, por lo que debía suplementarse de nuevo después de cada paso de desnaturalización (95°C). Sin embargo, el descubrimiento de bacterias habitantes de los géiser, que viven a temperaturas alrededor del punto de ebullición del agua, permitió el aislamiento de la Taq polimerasa de la bacteria Thermophilus aquaticus. Con ello, la técnica pudo hacerse más eficiente, pues dicha enzima soporta los 95°C, y la cantidad inicial de enzima añadida a la reacción es suficiente como para suplementar los 25 a 40 ciclos de amplificación. La concentración de Taq polimerasa que se recomienda es de 1 a 2.5 U/reacción de PCR, y su tasa de error en la incorporación de bases es de 4 × 10^-4. Esta enzima es capaz de polimerizar un promedio de 1000 nt/minuto.

ADN molde

Para la PCR teóricamente se requiere de una sola molécula, cuya secuencia sirva de molde para la amplificación, ya sea de ADN o de ADNg. El ADN se puede obtener de cualquier muestra biológica, y la mayoría de las técnicas de extracción de ácidos nucleicos proveen de moléculas de calidad adecuada para realizar la PCR. Si se quiere amplificar ARN, antes de la PCR se requiere realizar una reacción previa: la retrotranscripción, que permite convertir el ARN en ADNc, menos lábil que una cadena de ARN (cabe recordar que la inestabilidad molecular del ARN es elevada por la presencia del grupo OH en el carbono 2’ de la ribosa). El ADNc puede manejarse, entonces, con mayor facilidad. Las técnicas actuales empleadas en la PCR permiten realizar la amplificación a partir de 300 ng de ADN genómico, o bien desde 25 a 100 ng en el caso de ADNc o ADN proveniente de genes clonados en vectores. Es importante aclarar que en el caso de la amplificación de ADNc obtenido por retrotranscripción a partir de ARN, durante los primeros ciclos de la PCR se realiza la síntesis de la cadena complementaria del ADNc, lo que permitirá la amplificación de la secuencia como ADN de doble cadena (ADNds) en los ciclos posteriores de la PCR.

Desoxinucleótidos

Para que la polimerasa lleve a cabo su función necesita que existan desoxinucleótidos (dNTP: dATP, dCTP, dGTP, dTTP) en la mezcla de reacción para poder sintetizar la nueva hebra del ADN. Los desoxinucleótidos libres, cuando no forman cadenas de ácidos nucleicos, se encuentran en su forma trifosfatada, estructura molecular necesaria para su estabilidad y para proporcionar el grupo fosfato con el que se formará el enlace fosfodiéster en la unión nucleótido-nucleótido. Los desoxinucleótidos trifosfatados deben adicionarse en una concentración óptima de entre 50 y 200 µM, cantidad suficiente para sintetizar de 6.5 a 25 µg de ADN. Cantidades mayores de 200 µM pueden producir incorporaciones erróneas, mientras que concentraciones menores de 50 µM se consideran insuficientes para una síntesis adecuada.

Amortiguador

La solución amortiguadora proporciona el pH y concentraciones de sales adecuadas para la correcta función de la ADN polimerasa. Este buffer maneja un pH de 8.4 y está compuesto por Tris-HCl y KCl.

Cloruro de magnesio

El magnesio actúa como cofactor de la ADN polimerasa y se suplementa a una concentración de entre 1.0 y 2.5 mM. Esta concentración debe optimizarse de manera experimental para cada PCR, ya que un exceso de magnesio produce una amplificación inespecífica de productos de PCR, mientras que una baja concentración disminuye la producción del amplificado.

Iniciadores

El diseño adecuado de los iniciadores es la clave del éxito de una PCR. Estos oligonucleótidos, con secuencia específica, se utilizan para reconocer por complementariedad secuencias blanco en el ADN molde. En la PCR convencional, se usa un par de iniciadores para delimitar los extremos del producto que se desea amplificar. Su función radica en proporcionar un extremo 3’ libre al que se han de añadir los nucleótidos consecutivos mediante enlace fosfodiéster, ya que la ADN polimerasa requiere iniciar la síntesis partiendo de un 3’OH preexistente. A partir de ellos, la ADN polimerasa inicia la polimerización en dirección 5’-3’. Los iniciadores reciben el nombre de sentido y antisentido, según la secuencia a la que dan origen. El iniciador sentido es complementario y antiparalelo a la cadena 3’-5’ del ADN molde, por lo que la polimerasa, al adicionar nucleótidos en él, origina una cadena sentido (5’-3’). En cambio, el PRIMER antisentido es complementario y antiparalelo a la cadena 5’-3’, por lo que su polimerización originará la cadena 3’-5’ (figura 16-2). En la PCR la concentración óptima de los iniciadores es de 0.3 a 1 µM/reacción, ya que un exceso favorecería la formación de dímeros entre dos primers parcialmente complementarios, o bien de estructuras secundarias por complementariedad parcial de un primer con el mismo, como se aprecia en la figura 16-3.

Diseño de iniciadores y su papel en la especificidad de la PCR

Los iniciadores definen el tamaño del fragmento que se ha de amplificar. El tamaño de los productos a amplificar se encuentra entre 100 y 1000 pb, aunque se recomienda que sea entre 200 y 500 pb. En caso de que se desee analizar la expresión de un ARN mensajero (ARNm) convertido a ADNc, los primers se diseñan de tal forma que uno de éstos hibride en una secuencia exónica y el otro oligonucleótido lo haga en otra secuencia exónica; de esta manera, la amplificación del producto del tamaño esperado asegura que sólo los ARNm se han amplificado. En caso deque se haya amplificado también una secuencia de ADNg, (proveniente de contaminación de la muestra de ARN con ADN durante el proceso de extracción), el producto será de un tamaño diferente, ya que tiene secuencias intrónicas de por medio, como se aprecia en la figura 16-4.

La secuencia de los iniciadores debe ser altamente específica para el gen de interés, y procurar un contenido de nucleótidos G-C de 40 a 60% y una longitud óptima entre los 18 y los 30 nt. También debe evitarse un diseño que permita la complementariedad o la formación de estructuras secundarias inter e intra-primers, sobre todo cuando estas estructuras secuestran el extremo 3’, indispensable para la adición de nucleótidos como se ejemplificó en la figura 16-3.

La secuencia y la longitud de los iniciadores es determinante para su temperatura de fusión (Tm), la cual se define como aquélla a la que el 50% de los iniciadores se encuentra en estructura de cadena lineal. Se procura un diseño tal que la Tm de ambos primers sea muy similar y no presente más de 5ºC de diferencia con la Tm del producto que se va a amplificar, lo cual garantiza temperaturas de alineamiento similares para ambos primers y una eficiencia de amplificación adecuada. La Tm aumenta según la longitud del iniciador, por lo que un iniciador por debajo de las 18 nt hibridaría de forma inespecífica en la cadena molde y originaría productos inespecíficos. Por otro lado, iniciadores muy largos requieren de Tm superiores a 65°C; por esto, la longitud óptima está entre los 20 y 30 nucleótidos para que se obtenga una Tm entre 55 y 65°C, compatible con la amplificación de la generalidad de los fragmentos. Existen muchos métodos para calcular la Tm de los iniciadores, pero todos toman en consideración el contenido de nucleótidos, sobre todo G y C, la longitud del primer y la concentración de Na⁺ en el tubo de la PCR. En la actualidad, muchos programas computacionales permiten el diseño semiautomatizado de los primers, tomando en cuenta los parámetros mencionados. Algunos de los programas utilizados son Oligo 6.0, Primer Express^®, Primer Desing^®, etc. Una vez diseñados, los oligonucleótidos deben verificarse contra alineaciones inespecíficas en la misma secuencia blanco o bien en otras secuencias, empleando el programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Este software coteja una posible hibridación, total o parcial, con alguna secuencia reportada en el Gene Bank que pudiera interferir con la especificidad de los primers y su empleo correcto. En caso de hibridación con otras secuencias (ARNm o génicas) reportadas en el banco de genes su diseño debe replantearse.

En la figura 16-2 se presenta el esquema convencional de una PCR, que incluye los siguientes pasos:

1. Inicio de la desnaturalización.

2. Ciclos de amplificación.

   • Temperatura de desnaturalización.

   • Temperatura de alineamiento.

   • Temperatura de extensión.

3. Amplificación final.

4. Almacenamiento temporal.

Estos pasos se llevan a cabo mediante el cambio automático de temperaturas en un equipo diseñado para este fin denominado termociclador.

Termociclador

Es el equipo en el cual se realiza la PCR. Es capaz de cambiar la temperatura de la muestra en cuestión de segundos, lo que por lo general se logra mediante calentamiento/enfriamiento por resistencia eléctrica de una placa metálica, que distribuye la temperatura de manera homogénea durante tiempos programados en el rango de segundos a minutos. Normalmente los rangos de temperatura que abarca el equipo van de 4 a 96°C. Dado que las PCR que se incuban son soluciones acuosas, los equipos cuentan con una placa metálica a manera de tapa, la cual se mantiene a 103°C para evitar la condensación del agua en las tapas de los tubos donde ocurre la reacción. De esta manera, se evita que la concentración de los solutos se modifique, lo que alteraría las condiciones óptimas para la ADN polimerasa y la termodinámica de hibridación de los primers. Para el enfriamiento se generan flujos de aire frío, lo que permite descensos de temperatura relativamente rápidos.

Inicio de la desnaturalización

Es necesaria una temperatura de 95°C para la desnaturalización de la doble cadena de ADN, en el caso del ADN genómico, o el rompimiento de estructuras secundarias, en el ADNc. Esta temperatura se mantiene por cinco minutos al inicio de la PCR.

Ciclos de amplificación

Un ciclo típico de PCR convencional consta de las tres temperaturas siguientes:

• 95°C: desnaturalización por unos 30 segundos.

• 55 a 60°C: alineación por 30 a 40 segundos.

• 72°C extensión, según la longitud del producto que se va a amplificar, considerando la adición de 1000 nucleótidos en 60 segundos.

Este ciclaje de temperatura se repite continuamente por 30 a 35 ocasiones. Cada temperatura cumple con una función específica.

Desnaturalización

Se realiza a 95°C y tiene como objetivo desnaturalizar la doble cadena de ADN y/o destruir las estructuras secundarias del ADN, lo que permite el acceso de los primers a la cadena molde en sus secuencias complementarias. Esta temperatura se mantiene por 30 segundos.

Alineación

En esta fase, la temperatura se encuentra en un rango entre 55 y 60°C, en el cual la mayoría de los iniciadores hibridan; esto es, se genera la energía cinética necesaria para que los iniciadores busquen en las cadenas de ADN su secuencia complementaria y formen los puentes de hidrógeno con la cadena molde, dejando el extremo 3’OH disponible y listo para la adición de los nucleótidos consecutivos por la ADN polimerasa.

Extensión

Se produce a la temperatura óptima para el funcionamiento de la ADN polimerasa empleada, por lo que dependerá ésta para la PCR. En el caso de la Taq polimerasa, la más utilizada es de 72°C.

Amplificación final

Una vez terminados los ciclos designados para la PCR, la temperatura de extensión (72°C) se mantiene por cinco minutos, lo que permite que la polimerasa termine la extensión de los productos a los cuales se encuentra unida.

Almacenamiento temporal

Durante la programación de los ciclos de la PCR se programa también un ciclo final de 4°C por varias horas, lo que permite conservar los productos de PCR hasta que se retiren los tubos de reacción del equipo.

Teóricamente, en cada uno de los ciclos de amplificación se duplica la cantidad de producto inicial. Así, el producto de PCR aumenta exponencialmente conforme al número de ciclos de PCR (n). Sin embargo, el producto de PCR depende del número inicial de copias del molde de ADN (T), por lo que se aplica la fórmula que indica que si se parte del doble de moléculas iniciales de ADN se obtendrá el doble de producto:

donde:

• P = número de moléculas producto de PCR;

• n = número de ciclos;

• T = número de copias inicial de la molécula molde.

Por ejemplo, una PCR de 25 ciclos, partiendo de 10 copias de ADN molde, producirá la cantidad de P = (2)^25×10;

o sea, 2²⁵⁰, o lo que es lo mismo, 1.8 × 10⁷⁵ moléculas.

En la figura 16-5 se presenta un esquema de esta amplificación exponencial.

La PCR es una técnica altamente sensible y específica, al alcance de la mayoría de los laboratorios de biología molecular. Bajo las condiciones y diseño de oligonucleótidos apropiados se puede obtener una sensibilidad y una especificidad de 100%. Sin embargo, en experimentación es difícil obtener estos resultados, ya que múltiples factores influyen de manera crucial en el desarrollo de una PCR, como la selección de un sistema adecuado de detección del producto amplificado, el diseño correcto de primers y sondas, la calidad de la muestra que se va a amplificar, el control de los inhibidores de la reacción, la contaminación ambiental, la contaminación con otros productos de PCR, la optimización de las condiciones de reacción, la concentración de reactivos, el termociclador empleado, etc. El control y el manejo correcto de cada uno de estos factores influirán en la calidad de la PCR. Esta sensibilidad es su principal característica y desventaja: una PCR puede proporcionar un diagnóstico temprano, pues tan sólo con pocas copias del genoma de un patógeno puede determinarse su presencia. Sin embargo, esta misma característica hace que la realización de una PCR sea una tarea para el especialista y que siempre deba tenerse cuidado de evitar un acarreamiento de material que pueda contaminar la reacción y producir falsos positivos.

Esta técnica ha evolucionado desde su invención. En la actualidad, gracias a los múltiples sistemas de detección, a variantes en los iniciadores y a la cantidad de pares de primers empleada se dispone de diversas variantes de la técnica, que se enlistan a continuación:

PCR convencional

Se basa en la detección del producto de amplificación mediante una electroforesis en gel de agarosa o acrilamida. El producto amplificado se visualiza mediante una banda (ver el capítulo 12 Electroforesis). La intensidad de la banda se considera proporcional a la cantidad de producto amplificado y su longitud se verifica interpolando contra un marcador de peso molecular comercial de longitudes conocidas como se aprecia en la figura 16-6. El análisis de imagen de la banda del producto de PCR permite medir su intensidad mediante software y realizar una medición semicuantitativa de las bandas de los productos de PCR obtenidos en diversas muestras. La semicuantificación puede ser respecto a cualquiera de las muestras contenidas en el gel, como se observa en la figura 16-7A, en la que el carril 3 muestra una banda tres veces más intensa que la banda del carril 1, pero la mitad de intensa que la banda de la muestra 2. O bien una semicuantificación de las muestras respecto a un gen constitutivo, como se observa en la figura 16-7B. Para este tipo de análisis se mide la intensidad relativa de la banda del producto de PCR del gen de interés y de un gen constitutivo. Se considera un gen constitutivo aquel que tiene una expresión constante, ya que es indispensable para la viabilidad de la célula y esta expresión no se altera por la presencia de alguna enfermedad o variaciones en la condición fisiológica, no varía entre los individuos ni durante el desarrollo (edad) y no se ve afectado por las condiciones del experimento. GAPDH (gliceraldehido 3 fosfato deshidrogenasa), HPRT (hipoxanthine guanine phosphoribosyltransferase), β-actina (beta-actina) y ARNr 18S (ARN ribosomal 18S) son los genes constitutivos más empleados para este tipo de análisis

Con el valor de intensidad relativa de los genes, los datos se normalizan respecto al gen constituido y se calcula un índice:

Ya que la expresión del gen constitutivo permanecerá relativamente constante, esta relación indica directamente la variación entre muestras del gen de interés. Esta forma de semicuantificación es también posible realizarla con la tecnología de detección en tiempo real empleando los métodos 2ΔΔCt, o el método 2ΔCt, que se describen más adelante.

PCR cualitativa

Esta modalidad de PCR permite detectar la presencia o ausencia de un fragmento de ADN determinado. Es decir, sólo reporta si una muestra es positiva o negativa ante la presencia de un determinado ADN. Se emplea para el diagnóstico de enfermedades infecciosas y sólo permite confirmar la presencia o ausencia de un determinado agente patógeno, esto es, si una persona está o no infectada.

PCR semicuantitativa

Permite conocer los niveles de expresión de un gen (ARNm) en particular, y normaliza los niveles encontrados de este gen con los encontrados en un gen de expresión constitutiva, que se expresa de manera constante en la célula. Al realizar una relación entre la expresión del gen de interés con la expresión del gen constitutivo el índice que se obtenga indicará la expresión real del gen de interés y se reporta como porcentaje de expresión. Esto permite su comparación con otras muestras analizadas de la misma manera.

PCR cuantitativa

En esta modalidad de PCR, el producto de PCR es cuantificable, lo que permite reportar en números absolutos la cantidad de un microorganismo o del ARNm de un gen en una muestra. Para la cuantificación absoluta se amplifica al mismo tiempo una curva con muestras de concentración conocida del ADN que se quiere analizar. Los resultados de las muestras se traslapan a los valores de la curva y de esta manera se conoce la concentración de la muestra.

PCR múltiple (varias regiones o varios genes)

En este tipo de PCR se realiza la amplificación de más de un fragmento de ADN en una sola reacción de PCR con dos o más juegos de primers (cada juego para un gen en particular). Tiene la ventaja de que ahorra tiempo y reactivos, pero presenta el inconveniente de que el diseño de los primers debe ser adecuado para que no se complementen entre ellos (hibridaciones inespecíficas). La PCR múltiple o multiplex puede emplearse para la búsqueda de varias deleciones, mutaciones y polimorfismos en un solo gen o en múltiples. Esta técnica se utiliza para el análisis simultáneo de múltiples marcadores moleculares asociados a alguna enfermedad, para la detección simultánea de varios agentes patógenos, organismos genéticamente modificados, etcétera.

PCR selectiva (detecta genes silvestres o mutados)

Para la PCR selectiva se diseñan primers capaces de hibridar solamente en secuencias con presencia de una mutación, por lo que, en caso de estar ausente, no se produce un producto de PCR. Como control se produce una PCR con primers diseñados para la amplificación de la forma silvestre del gen, cuyos resultados deben coincidir con los obtenidos con los primers que amplifican la mutación. En caso de homocigatos sólo una de las dos reacciones debe resultar positiva, en el caso de heterocigenos ambas reacciones resultan positivas.

PCR in situ

Se realiza en una muestra de tejido embebida en parafina (laminilla) o congelada y cortada en criostato. No requiere extracción del ADN del tejido. En la laminilla se añaden los reactivos necesarios para la PCR y se colocan en un termociclador especial, ya que en lugar de tener orificios para colocar tubos contiene ranuras para colocar las laminillas. Esta modalidad de PCR permite saber qué tipo celular presente en un tejido expresa un determinado gen o cuál célula está infectada por un patógeno.

PCR anidada (nested-PCR)

Esta variante de la PCR convencional proporciona mayor sensibilidad a la técnica, al amplificar las secuencias de ADN en dos rondas de amplificación con distintos pares de iniciadores o primers en cada una. Esto es, primero se realiza una PCR con un par de iniciadores externos para amplificar una región de ADN extensa, que contiene el segmento diana que se desea amplificar. Después, este producto de amplificación sirve de molde para una segunda PCR con otro par de iniciadores internos (primers anidados) para amplificar una región más pequeña (interna). Por lo tanto, la longitud del producto de amplificación de la segunda PCR, o PCR anidada, será menor que la del primer producto de PCR (figura 16-8).

PCR en punto final

Es aquella en la que el producto de PCR se analiza después de 25 a 35 ciclos en el punto previo a la saturación de la reacción, mediante un gel de electroforesis. Presenta el inconveniente de que diferente cantidad de material de inicio da lugar a una cantidad diferente de producto al final, además de que diferente cantidad de material de inicio da lugar a la misma cantidad de producto al final, de la reacción. La detección en punto final también presenta las desventajas de que depende de la resolución del gel de agarosa, que suele ser baja y no permite detectar pequeños cambios en la concentración; requiere un procesamiento posreacción, y la tinción de bromuro de etidio es semicuantitativa, pues más de una molécula de bromuro de etidio puede unirse a un solo producto de PCR y, por tanto, tiene una precisión pobre y presenta una sensibilidad menor que la PCR en tiempo real.

PCR en tiempo real

Las desventajas que presenta la PCR en punto final llevaron a los investigadosres a diseñar una tecnología que solventara estos inconvenientes conocida como PCR en tiempo real. La reacción de amplificación es la misma, lo que cambia es el método de detección del producto amplificado y su temporalidad. La detección de las copias del producto de PCR se realiza al mismo tiempo que sucede la amplificación, mediante intercalados en el producto de PCR, un láser que detecta fluorocromos acoplados a los primers o a una sonda que hibrida en medio de los primers, que se degrada y libera su fluorocromo por la acción exonucleasa 3’-5’ de la polimerasa. Mediante la detección de la fluorescencia liberada durante la reacción de amplificación puede medirse la cantidad de ADN sintetizado en cada momento, ya que la emisión de fluorescencia producida en la reacción es proporcional a la cantidad de producto de PCR formado. Esto permite conocer y registrar en todo momento la cinética de la reacción de amplificación.

Cabe mencionar que para la técnica de PCR en tiempo real la temperatura de alineación y extensión es la misma, por lo que ambos pasos se unifican. Esto se logra porque la temperatura óptima para la enzima AmpliTaq Gold^® es de 60ºC, lo que aunado a un diseño de primers que permite su alineación óptima a la misma temperatura permite que este paso sea conjuntado y reduce el tiempo de reacción.

Los sistemas de detección por fluorescencia empleados en la PCR en tiempo real pueden ser iniciadores marcados por fluoróforos (primers LUX —light uponextension fluorogenic—), sondas específicas marcadas con fluorócromos (sondas TaqMan) o bien agentes intercalantes fluorescentes, como SyberGreen o SyberSafe.

PCR en tiempo real empleando SyberGreen

Para la detección en tiempo real, puede emplearse un agente intercalante denominado SYBERreen. En este método, muy utilizado por su bajo costo, el fluoróforo se une al ADN de doble cadena de manera inespecífica y produce fluorescencia (figura 16-9). La desventaja estriba en que la unión, al ser inespecífica, será a lo largo de toda la molécula de ADN de doble cadena, incluyendo los dímeros de primer que pudieran formarse. El uso de SYBERGreen implica un diseño muy cuidadoso de los primers con el fin de evitar la formación de dímeros. La detección del producto amplificado corresponderá a la intensidad de la fluorescencia; sin embargo, ya que varias moléculas de SYBERGreen pueden unirse a una sola molécula de ADNds, se considera un método de cuantificación menos preciso que las tecnologías con primers LUX o sondas TaqMan.

PCR en tiempo real con sondas TaqMan

En esta tecnología (de Applied Biosystems), la reacción de amplificación se lleva a cabo en un termociclador que realiza, a la vez, la detección de fluorocromos mediante luz láser. En esta tecnología, además de un juego de primers se utiliza una sonda marcada con fluorescencia. La sonda TaqMan^® empleada se diseña de manera que hibrida en algún punto intermedio de la secuencia franqueada por el primer sentido y el antisentido. Estos primers están diseñados para amplificar fragmentos de entre 60 y 150 pb. La sonda tiene acoplado un fluorocromo en su extremo 5’, silenciado por otro fluorocromo o quencher (referencia pasiva). La sonda hibrida en la cadena molde del ADN que va a ser amplificada y libera su fluorocromo sólo cuando la sonda se degrada por la acción de exonucleasa 5’-3’ de la ADN polimerasa. Las sondas TaqMan se basan en el método FRET. Este método consiste en la transferencia de energía fluorescente mediante resonancia entre dos moléculas. Estas moléculas son dos tipos de fluorocromos, un donador y un aceptor, y su principio se basa en que una molécula de alta energía cercana a otra de baja energía (quencher) promueve una transferencia energética sin emisión de fluorescencia. Una vez que se separan dichas moléculas se emite la fluorescencia, que capta el lector del equipo. Las sondas TaqMan son cortas y para separar las dos moléculas fluorescentes necesitan la rotura de su estructura por la ADN polimerasa con actividad endonucleasa y así liberar la fluorescencia. En esta tecnología se emplea la ADN polimerasa (AmpliTaq Gold®), que se mantiene inactiva por la unión de un anticuerpo y se libera cuando la reacción se incuba a los 95°C iniciales de desnaturalización. Los dNTP empleados contienen dUTP en lugar de dTTP, por lo que los productos de PCR contienen dUTP. La mezcla de reacción contiene uracil-N-glicosilasa (UNG) (AmpErase^®). La enzima UNG degradados productos de PCR de reacciones previas, previniendo la contaminación de la reacción de PCR actual con ADN endógenos. Ya que durante los ciclos normales de PCR las altas temperaturas inactivan la UNG, sólo los ADN presentes en la muestra servirán de molde para ser amplificados. Asimismo, el fluorocromo ROX (conjugado de glicina de 5-carboxi-X-rodamina, succinimidiléster) se incluye como referencia pasiva a una concentración final de 500 nM para normalizar la fluorescencia entre reacciones por cualquier posible fluctuación asociada con variación en el volumen. El empleo de este tipo de sondas se esquematiza en la figura 16-10.

PCR en tiempo real con primers LUX

La PCR con primers LUX se fundamenta en que uno de los iniciadores se encuentra marcado con un fluoróforo; cuando el iniciador hibrida con la cadena blanco, el fluoróforo es excitado, lo que da como resultado un incremento significativo de la señal de fluorescencia que el láser detecta. Para la amplificación con primers LUX se emplea una enzima TaqPlatinum^® ADN polimerasa que se activa sólo después del hot-start inicial de la PCR (5 minutos a 95°C). De la misma manera que con la tecnología TaqMan, la mezcla de reacción contiene una UNG para prevención de contaminación por acarreamiento. Además, el mix contiene Tris-HCl, KCl, 6 mM de MgCl2, 400 µM de desoxiguanina trifosfato (dGTP), 400 µM de desoxiadenosina trifosfato (dATP), 400 µM de desoxicitidina trifosfato (dCTP), 800 µM de desoxiuridina trifosfato (dUTP), UNG, 1 µM de fluorocromo ROX y estabilizadores. Su empleo se esquematiza en la figura 16-11.

Semicuantificación en tiempo real con el método 2DDCt

En la PCR en tiempo real la concentración relativa se obtiene interpolando todas las muestras en un punto umbral, ciclo de corte o cyclethreshold (CT). El CT es el ciclo elegido por el usuario de la fase exponencial en donde la cantidad inicial de moléculas del gen de interés presentes en una muestra es inversamente proporcional a la intensidad de fluorescencia. El CT permite discriminar el comportamiento de las muestras, ya que a un menor valor de CT existe mayor cantidad inicial de moléculas del gen de interés en una muestra. El CT lo determina un software a un umbral de fluorescencia fijo (threshold) seleccionado por el analista, como se expone en la figura 16-12. Estos valores pueden relacionarse con una curva estándar para determinar la cantidad de moléculas de ADN existentes (cuantificación absoluta) o con un grupo de referencia (cuantificación relativa). La cuantificación relativa puede utilizarse para determinar la expresión de los niveles de ARNm de un grupo de células o tejidos respecto a una referencia (control o condición experimental). Para la cuantificación relativa debe tenerse en cuenta que todas las muestras provienen de individuos diferentes; por tanto, debe realizarse un procedimiento conocido como normalización, con un gen control endógeno (constitutivo), para eliminar la variabilidad entre muestra y muestra. El cálculo se realiza mediante la fórmula 2ΔΔCt relativo a un grupo que se considera calibrador. Donde:

Por tanto, después de la normalización de los datos respecto al gen constitutivo (ΔCT) se selecciona un grupo que funciona como calibrador del experimento y los datos del resto de los grupos se comparan con el grupo calibrador tendrá el valor de 1 y el resto de los grupos, un valor menor o mayor lo que proporciona un valor semicuantitativo.

Semicuantificación en tiempo real con el método 2ΔCt

Este método de semicuantificación para muestras procesadas en tiempo real se realiza cuando no se desea tomar un grupo de muestras como referencia, como cuando la muestra se desea comparar frente a ella misma en diferentes condiciones. La fórmula se aplica:

PCR cuantitativa mediante la tecnología en tiempo real

Para una PCR cuantitativa se emplea la metodología en tiempo real y una curva con estándares de concentración conocida. Esta curva debe tener en cuenta que el ADN o ARN que se emplee debe estar diluido de manera precisa, y en el caso particular de ARN se asume que la eficiencia de retrotranscripción ha sido la misma para todas las muestras. La curva estándar se construye a partir de concentraciones conocidas de un plásmido que contiene clonado el cADN de la muestra a analizar. Debe asegurarse que la eficiencia de la PCR sea la misma para la muestra y para el estándar. Las diferentes diluciones de la curva presentarán CT proporcionales a la cantidad de muestra, y mediante la fórmula de regresión lineal (y = mx + b), interpolando los valores de las muestras en el gráfico obtenido se puede conocer la concentración absoluta de las muestras.

La retrotranscripción es una reacción para la conversión del ARN en ADNc y en general se lleva a cabo antes de una PCR, cuando se pretende analizar secuencias de ARN. La realización consecutiva de una retrotranscripción y una PCR se conoce como RT-PCR. Esta técnica es una variante de la técnica convencional de PCR, con el objetivo de amplificar un ARN específico para evaluar su expresión o presencia. Esta técnica es más sensible y rápida que otras técnicas de análisis de la expresión de genes (Northen blot, Dot blot, Slot blot, ensayos de la nucleasa) y se basa en el uso de transcriptasa inversa de los retrovirus cuya función es sintetizar ADN a partir de ARN (figura 16-13).

En la reacción de retrotranscripción una cadena de ARN se transcribe a ADN de secuencia complementaria al ARN, por lo que se le denomina ADNc. La transcriptasa inversa más empleada es la del M-MLV (Murine-Moloney leukemia virus). Además del ARN molde, que se convertirá en ADNc, se requieren primers, generalmente hexámeros formados de secuencias aleatorias de 6 nt. Estos hexámeros hibridarán con las secuencias complementarias a ellos, que se localizan por azar en todos los ARN presentes en la muestra. Para la reacción se requiere también un inhibidor de ARNsas (RNAsin^®, RNAseout^®), un componente enzimático que impide la acción de estas enzimas que puedan estar presentes en la muestra. Los dNTP (A, G, C, T) se emplearán en la síntesis de las cadenas de ADNc, mientras que una solución amortiguadora proporcionará las condiciones de pH y cofactores necesarios para un funcionamiento óptimo de la retrotranscriptasa. A diferencia de lo que sucede en la PCR, en esta reacción no se requieren ciclos, y basta con una hora a la temperatura óptima de la enzima para realizar la conversión del ARN a ADNc (para la M-MLV son 37°C). Los pasos de que consta esta reacción son desnaturalización del ARN a 70°C por 10 minutos para eliminar estructuras secundarias, alineación de los hexámeros por 10 min a 25°C y polimerización por la retrotranscriptasa a 37°C por una hora. Una vez obtenida la cadena de ADNc, ésta se emplea como molde para la técnica de PCR. Este método se utiliza principalmente para detectar genomas virales compuestos por ARN (como la influenza A, el VIH y la hepatitis C), así como para cuantificar ARNm de cualquier proteína expresada en un tejido.

Los productos de PCR pueden utilizarse para la secuenciación, detección de patógenos infecciosos (virus bacterias, hongos), amplificación de segmentos para su análisis mediante ADN finger-printing, o huella deADN, en medicina forense, detección de mutaciones, análisis de la expresión génica o determinación de carga viral, entre otras muchas aplicaciones.

La PCR se encuentra al alcance económico de la mayoría de los laboratorios y en los últimos 20 años se ha convertido en una técnica indispensable para el diagnóstico médico. Con ella se pueden amplificar segmentos que contienen una mutación conocida (diagnóstico) o bien mutaciones desconocidas que se secuenciarán y determinarán después de una PCR. Esto ha sido de gran ayuda para el diagnóstico y la correlación de variaciones génicas con enfermedades. En cuanto a las enfermedades adquiridas, la detección de genomas de patógenos es la aplicación diagnóstica más empleada de la PCR. Debido a su alta sensibilidad, permite la detección aun de pocas copias del genoma, lo que suele suceder en los periodos iniciales de la infección; por lo tanto, la PCR permite un diagnóstico temprano.