++
Después de la exposición al virus, en general desde la segunda a la tercera semanas, los eventos virológicos y serológicos muestran una viremia elevada, lo que provoca la distribución del virus a todo el organismo. El ARN del VIH está presente antes de que el paciente desarrolle anticuerpos detectables anti-VIH.
++
La proteína de la cápside central del virus, el antígeno p24 (Ag p24), usualmente puede detectarse a los pocos días de la aparición de la viremia. Cuando el sistema inmune del huésped inicia una respuesta para controlar la infección, los niveles tanto del virus como del Ag p24 disminuyen hasta ser indetectables. En general el Ag 24 permanecerá indetectable hasta que el sistema inmune se desgaste, y se asocia con la progresión de la enfermedad.
++
El conocimiento de estos acontecimientos virológicos y serológicos que ocurren después de la infección permite diagnosticar la infección por el VIH por cualesquiera de las técnicas.
+++
Diagnóstico de la enfermedad
++
El diagnóstico de la infección por el VIH se basa en pruebas de laboratorio. Los métodos de diagnóstico se pueden clasificar en dos grupos:
Indirectos: detectan la presencia de anticuerpos específicos que el organismo produce como respuesta. En este grupo se encuentran las pruebas de tamizaje, como el análisis de inmunoabsorción ligado a enzimas (enzymelinked immunosorbent assay, ELISA) y la prueba confirmatoria (Western blot).
Directos: detectan el virus o algunos de sus componentes (cultivo viral, reacción en cadena de la polimerasa, PCR).
++
La prueba más frecuente es el ELISA; sin embargo, para diagnosticar la infección por el VIH se requieren dos pruebas de ELISA positivas y una prueba confirmatoria también positiva.
++
Estas pruebas detectan mínimas cantidades de anticuerpos, por lo que pequeñas cantidades de sustancias similares podrían conducir a resultados falsos positivos (vacuna contra la influenza, hepatitis B y rabia); que también son causados por estimulación del sistema inmune (infecciones virales, embarazo, enfermedades autoinmunes, transfusión de sangre, etc.). Para confirmar un resultado positivo, en general se realiza una prueba de inmunoelectrotransferencia (Western blot). La reacción se lleva a cabo en una placa de plástico con pozos microtitulados. La superficie de cada cavidad está cubierta por los anticuerpos y antígenos del VIH. A continuación, al pozo se le agrega suero o plasma del paciente y si en el suero existen anticuerpos específicos, éstos se unen al complejo de antígeno de la placa. Después se añade un anticuerpo secundario marcado que se va unir al complejo que se formó entre los anticuerpos presentes en el suero y los antígenos localizados en la placa. Por último, se agrega un sustrato cromógeno, que reacciona con el anticuerpo marcado con la enzima. Esta unión resulta en un cambio de color que se mide en el espectrofotómetro. La densidad óptica se correlaciona con la concentración de anticuerpos del VIH presentes en el paciente: a mayor intensidad, más anticuerpos en el suero.
++
Las pruebas rápidas son métodos de detección de anticuerpos anti-VIH con resultados en menos de 30 minutos, con una sensibilidad y una especificidad con rangos desde 99.6 a 100%. Además de plasma y suero sanguíneo, en las pruebas rápidas se utiliza sangre total o capilar, que se toma del dedo o del lóbulo de la oreja; también, otros ensayos utilizan orina o trasudación oral (no saliva). Las pruebas rápidas se basan en métodos de inmunocromatográficos, aunque hay técnicas que utilizan aglutinación de partículas, inmunoDOT e inmunofiltración. Suelen emplear péptidos sintéticos o proteínas recombinantes del VIH como fuente de antígeno, y consisten en una fase sólida compuesta de macropartículas que contienen los anticuerpos y el antígeno del VIH. Metodológicamente son menos complejas que los ELISA, y combinadas con otras pruebas de detección de anticuerpos constituyen una estrategia que mejora la especificidad de los resultados de forma asequible. Los resultados positivos siempre deben confirmarse con ELISA y Western blot.
++
La técnica consiste en separar las proteínas virales (antígenos) por su peso molecular por medio de electroforesis, después son transferidas a una membrana de nitrocelulosa que se va utilizar como tira reactiva del ensayo. Esta tira se incuba con el suero o el plasma del paciente. Si en el suero existen anticuerpos anti-VIH, éstos se van a unir al antígeno que está presente en la tira reactiva. El complejo resultante (antígeno-anticuerpo) se hace visible utilizando un anticuerpo secundario y su sustrato correspondiente. Las bandas que se observan en la tira reactiva concuerdan con los anticuerpos presentes en la muestra.
++
A continuación se exponen las proteínas que pueden detectarse con esta prueba, que corresponden a los genes estructurales del VIH:
Proteínas de la envoltura: gp160, gp41, gp120.
Proteínas de la polimerasa: p31/p34, p39/p40, p51/p52, p66/p68.
Proteínas de la nucleocápside: p17/p18, p24/p25, p55.
++
La formación de anticuerpos después de la infección sigue una cinética específica; por ejemplo, la p24 y la gp120 se detectan en fases tempranas mientras que la p31 por lo común se observa en fases tardías de la infección. Una prueba de Western blot se considera positiva cuando al menos son visibles dos o tres bandas.
++
Los criterios internacionales para determinar un resultado positivo no están definidos de manera uniforme, y son los siguientes:
Organización Mundial de la Salud (OMS): dos glucoproteínas cualesquiera.
Cruz Roja Americana: una proteína de cada gen estructural.
Food and Drug Administration (FDA): p24+p32+(gp41 o gp120 o gp160).
Centers for Disease Control and Prevention (CDC): p24 + (gp41 o gp120 o gp160) o gp41 + (gp120 o gp160).
+++
Ensayos de detección de ARN del VIH
++
Aunque los ensayos con anticuerpos son el pilar en el diagnóstico de la infección por el VIH, los anticuerpos pueden permanecer indetectables durante las primeras tres a seis semanas después de la infección. La detección del ARN viral desempeña un papel importante en la infección temprana de la infección antes de que ocurra la seroconversión. En general, puede detectarse entre la primera y la segunda semanas después de la infección, cuando ni los anticuerpos ni el antígeno p24 son detectables. Esta clase de pruebas tiene la sensibilidad de detectar de 50 copias/ml en adelante. Estas pruebas no se han adaptado como herramientas de detección porque son costosas y técnicamente complejas para llevarlas a cabo.
++
El único ensayo aprobado por la FDA como ayuda al diagnóstico de la infección es el ensayo cualitativo de ARN (aptimade gen-probe). En resumen, se captura el ARN en una micropartícula magnética y, posteriormente, se amplifica para detectar por medio de una sonda quimioluminiscente.
++
Se recomienda en los bebés nacidos de madres positivas para el VIH, pacientes con un riesgo elevado de adquirir la infección y que presenten síntomas que sugiera la infección, así como en pacientes con infección aguda. La infección aguda por el VIH se define como niveles detectables de ARN viral en plasma con resultados de anticuerpos negativos o indeterminados.
++
El desarrollo de los ensayos para cuantificar los niveles de ARN del VIH (carga viral) en plasma ha revolucionado el manejo clínico de la infección por el VIH. Aunque estas pruebas cuantitativas desde hace varios años existen, no están aprobadas para el diagnóstico de la infección, ya que en pacientes positivos para el VIH, pero con niveles bajos de ARN, pueden dar un resultado falso negativo.
++
Los pacientes con infección por el VIH diagnosticados con ensayos de detección de ARN viral deben practicarse un examen serológico para confirmar la seroconversión.
+++
Ensayos de seguimiento
++
Durante el periodo de latencia clínica asociada a la infección por el VIH el virus continúa replicándose. Este periodo termina con el desarrollo de síntomas de la enfermedad. El conocimiento de los factores que afectan la progresión de la enfermedad ayuda al manejo integral de la infección por el VIH. Se ha demostrado la relación entre alta cantidad de ARN del VIH y la disminución de la cantidad de linfocitos T CD4+ con la rápida progresión de la enfermedad.
++
La cuantificación de la carga viral y el recuento de los linfocitos T CD4+ proporcionan información pronóstica esencial para el médico. Las pruebas para medir la carga viral en los pacientes se utilizan para monitorear la eficacia del tratamiento antirretroviral, con la finalidad de mantener la carga viral por debajo de los niveles detectables, y en pacientes sin tratamiento antirretroviral, para evaluar si se requiere iniciarlo. Un aumento significativo y progresivo de la carga viral en el paciente indica el fracaso del tratamiento, pero no si es por falta de adherencia al tratamiento o por resistencia a los antirretrovirales. Para corroborar si el fracaso terapéutico es por resistencia a los antirretrovirales se realiza la prueba de genotipificación.
+++
Cuantificación de los linfocitos T CD4+
++
Los linfocitos T CD4+ son fundamentales para desarrollar la respuesta inmune específica a las infecciones, en particular a los patógenos intracelulares. Puesto que estas células son el blanco del VIH, su disminución limita gravemente la capacidad de respuesta inmune del hospedero. La capacidad del sistema inmune de tener una respuesta específica contra el VIH es un factor clave en el curso de la enfermedad, y la cuantificación de las células CD4+ es el predictor más significativo de la progresión de la enfermedad. Recuentos bajos de linfocitos T CD4+ se asocian con mayor riesgo de progresión de la enfermedad, y la recomendación para iniciar tratamiento se basa en la cuenta de los linfocitos T CD4+ antes que en cualquier otro marcador.
++
El riesgo de progresión a sida aumenta sustancialmente cuando el recuento de los linfocitos T CD4+ es < 350 células/mm3. El riesgo es mayor cuando los recuentos caen por debajo de 200 células/mm3. Con este conteo se recomienda comenzar el tratamiento antirretroviral (200 a 350 células/mm3).
++
El recuento de los linfocitos CD4+ se lleva a cabo por citometría de flujo, mediante anticuerpos fluoresceinados y cuenta el porcentaje de células CD4+.
++
La cuantificación de la carga viral del VIH se utiliza como marcador pronóstico para medir tanto para progresión de la enfermedad como la eficacia del tratamiento antirretroviral. Como se mencionó anteriormente, niveles elevados de carga viral se asocian a una disminución de los linfocitos T CD4+, lo que lleva a la progresión a sida y la muerte.
++
La guía define fracaso virológico como la situación en que no se logra una carga viral con niveles indetectables después de seis meses de tratamiento (< 50 copias/ml) o cuando se tiene una carga viral constante de > 50 copias/ml o > 400 copias/ml después de la supresión por debajo de este nivel.
++
En la actualidad están aprobados por la FDA cinco ensayos para cuantificar las copias de ARN del VIH/ml de plasma; dos son pruebas de RT-PCR, que son más sensibles y menos susceptibles a la contaminación. Una utiliza PCR estándar, otra con ADN ramificado, y por último, la otra utiliza amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA). Estas pruebas tienen sensibilidad mayor al 98%, detectan al grupo M del VIH-1, con excepción del RT-PCR tiempo real, que detecta los grupos M, N y O del VIH-1.
+++
Pruebas de resistencia a los antirretrovirales
++
La resistencia se define como la disminución de la sensibilidad del fármaco antirretroviral. Es la principal causa de la falla al tratamiento y se genera por una serie de sustituciones en los genes que codifica para el receptor y las enzimas virales, blanco en los que actúan los antirretrovirales.
++
Las pruebas de resistencia determinan la secuencia de nucleótidos del genoma viral y sus resultados son una lista de cambios de aminoácidos o mutaciones que son diferentes a la cepa de referencia de tipo silvestre. Esas mutaciones se expresan por la posición que tienen en el genoma (codón), precedido por la letra que corresponde al aminoácido de tipo silvestre y seguido por el aminoácido que muestra la mutación, como por ejemplo la L90M, leucina del codón 90 que cambia a metionina.
++
En la actualidad existen más de 100 mutaciones involucradas en el desarrollo de resistencia a los antirretrovirales. Existen varios algoritmos tanto públicos (cinco) como privados (seis), que facilitan la interpretación del genotipo para determinar el nivel de resistencia a los antirretrovirales. Se dispone de cinco ensayos comerciales para determinar la resistencia, todos basados en obtener la secuencia de ARN viral para analizar las mutaciones en los genes en donde actúan los antirretrovirales que están disponibles a la fecha. La Asociación Internacional de SIDA y la guía para la atención médica de la Secretaría de Salud recomiendan el uso de estas pruebas bajo las siguientes circunstancias: a) infección aguda por el VIH en el momento del diagnóstico; b) fracaso del tratamiento antirretroviral, si la carga viral es > 1 000 copias/ml; c) en mujeres embarazadas, como profilaxis en la transmisión vertical, si en la madre se detecta ARN viral; d) respuesta subóptima a la terapia, cuando no se logra disminuir la carga viral en un periodo de ocho a 12 semanas, lo que sugiere la preexistencia de resistencia, y e) antes de iniciar tratamiento antirretroviral. En México, entre pacientes naïve a tratamiento ARV se encontró que 16% al menos presentaba resistencia a un antirretroviral; además, 7.3% mostró niveles de resistencia altos.