Capítulo 26: Bases moleculares del virus de la inmunodeficiencia humana

Los virus se clasifican en más de 60 familias, según el tipo de ácido nucleico que contengan, en la información que albergue su genoma y en la cantidad y el tipo de genes que presenten. Entre estas familias, al menos 20 infectan a los humanos. El agente causal del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (sida) es un retrovirus que se conoce como virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), que pertenece a la familia Retroviridae y al género Lentivirus.

El VIH se identificó por primera vez en Francia en 1983 por Luc Montagnier, y es un virus con genoma ARN que induce infección celular crónica por la conversión de su ARN a ADN proviral, que se integra en el genoma de la célula infectada e induce daño progresivo al sistema inmune del huésped. La infección por este lentivirus se caracteriza por una progresión lenta, con largos periodos de latencia clínica, seguido por la aparición de signos y síntomas graduales, como fiebre, linfadenopatía, enfermedades oportunistas, síndrome de desgaste, y enfermedades oncológicas y crónicas degenerativas.

Una de las principales características del VIH es su variabilidad genética, que muestra durante su evolución la transmisión de fragmentos genómicos de virus de simio al humano y que han dado origen a varios tipos, subtipos, variantes y múltiples formas recombinantes.

Otro factor que participa en la variabilidad genética es la alta tasa de mutación del genoma del virus, dada por la enzima transcriptasa inversa. Esta enzima carece de actividad exonucleasa en el proceso de replicación y genera 3 × 10⁻⁵ mutaciones por nucleótido por ciclo y una producción de 10¹⁰ partículas virales por día. Considerando estas dos variables, se estima que en promedio pueden generarse 3 × 10⁹ mutaciones por día en la población viral de cada persona con VIH. La mayoría de las mutaciones que se generan en las variantes tienen poco o nulo efecto en la función viral o en la capacidad de replicación, e incluso otras pueden ser letales para el virus. Sin embargo, cuando estas mutaciones se ubican en sitios genómicos clave como por ejemplo en genes de las enzimas virales, afectan a la capacidad del virus o pueden conferir resistencia a uno o varios antirretrovirales.

Otro factor que contribuye a la diversidad genética es la recombinación de las dos cadenas de ARN, que constituye una parte intrínseca del ciclo normal de replicación viral y puede mediar la reparación de genomas virales defectuosos, incrementar la diversidad viral o acelerar la propagación de mutaciones benéficas entre las cuasiespecies virales.

La variabilidad genética impacta en la pandemia del VIH a través del diagnóstico, la patogenia, la progresión y la transmisión de la enfermedad, la cuantificación de la carga viral, el manejo clínico, la respuesta al tratamiento antirretroviral y el diseño de una vacuna.

Los diferentes estados clínicos de la infección por el VIH son producto de alteraciones en el balance entre el estado inmunológico y el virológico. El estado inmunológico se determina por el conteo de los linfocitos TCD4⁺ y se expresa como células/mm³. El estado virológico se determina por el número de copias de ARN del VIH (carga viral) y se expresa como copias/ml. Son características de la infección la destrucción gradual de la población de linfocitos T CD4⁺ y la producción constante de nuevas partículas virales, lo que genera una inmunodeficiencia gradual que lleva al paciente al último estadio de la infección por el VIH o sida.

Los pacientes infectados por el VIH atraviesan por tres estadios clínicos (figura 26-1):

1. Infección primaria o fase aguda: seroconversión.

2. Estado asintomático o latencia clínica.

3. Estado sintomático o sida.

Infección primaria

Este periodo inicia con la infección del paciente y puede no tener ninguna manifestación clínica, ya que sólo es sintomática en aproximadamente 40-80% de los pacientes después de dos a tres semanas de haberse infectado. Los síntomas pueden variar, y pueden incluir fiebre, mononucleosis, erupción maculopapular, dolor de garganta, malestar general y dolor de articulaciones. Los signos y síntomas desaparecen en dos o tres semanas; posteriormente, el paciente es asintomático entre seis y 10 años.

Los primeros episodios que ocurren después de que el VIH atraviese la barrera de la mucosa se conocen como periodo de ventana, durante el cual la producción de anticuerpos IgM e IgG no es suficiente para que las pruebas diagnósticas detecten la respuesta inmunológica en contra de la presencia del VIH. La duración es controversial, aunque históricamente se ha sugerido que tarda aproximadamente tres meses. Debido a la naturaleza inespecífica de los síntomas durante esta etapa, el diagnóstico de la enfermedad por el VH rara vez se reconoce en la práctica médica.

Entre dos y seis semanas después de la infección, la carga viral en el plasma llega a centenas de miles de copias/ml. Debido al aumento masivo de la replicación viral, el número de células T CD4⁺ disminuye. En consecuencia, la carga viral elevada también contribuye a la transmisión de la enfermedad. Se ha estimado que hasta 30% de los contagios por el VIH se transmiten durante la fase aguda.

Entre las cuatro y las 12 semanas a partir de la infección inicial aparecen los anticuerpos IgG específicos contra el VIH y se activa la respuesta inmune celular específica, causa principal del descenso de la carga viral y del correspondiente aumento en el recuento de linfocitos T CD4⁺ y la seroconversión del paciente (figura 26-1).

Alrededor de seis a 12 meses tras la infección se alcanza y se mantiene un equilibrio entre la cantidad de partículas virales producidas y eliminadas y el número de linfocitos T CD4⁺ destruidos y generados cada día.

Fase asintomática

La mayoría de los pacientes se diagnostican en esta fase, a pesar de la ausencia de síntomas tempranos. Durante esta etapa persiste una replicación viral alta y el número de partículas virales que se producen alcanzan más de 10¹⁰ partículas por día. Estas partículas se contrarrestan por la capacidad de regeneración de los linfocitos T CD4⁺; sin embargo, no son suficientes para detener, en definitiva, la progresión de la enfermedad. Con el uso adecuado del tratamiento antirretroviral, que inhibe la replicación del virus en distintas etapas del ciclo de replicación viral, es posible la reconstitución del sistema inmune, lo que prolonga la aparición de los síntomas de sida y aumenta la cantidad y la calidad de vida de las personas que viven con el VIH. La duración de esta fase asintomática, también llamada crónica, es variable y depende de muchos factores tanto del virus como del individuo infectado. En 80 y 90% de los pacientes esta etapa dura entre 8 y 10 años (figura 26-1).

Etapa sintomática o sida

El continuo desgaste del sistema inmune por la pérdida de los linfocitos T CD4⁺ incrementa la susceptibilidad de adquirir diversas infecciones. En esta etapa se produce un aumento de la actividad de replicación viral, y el sistema inmunológico ya no es capaz de frenarla. Clínicamente, cuando la cuenta de linfocitos CD4⁺ disminuye a < 200 células/mm³, los pacientes son más susceptibles de presentar infecciones oportunistas que le pueden conducir a la muerte. Neoplasias como el sarcoma de Kaposi, tuberculosis, neumonía, candidiasis y ciertos trastornos neurológicos son algunas infecciones características de la etapa de sida. La duración de esta fase es desfavorable, con una supervivencia inferior a 15 a 30% a los tres años. Ya en este estado de la enfermedad, el sistema inmune está muy comprometido y aunque el paciente reciba tratamiento antirretroviral, eventualmente morirá (figura 26-1).

La epidemiología molecular del VIH es un tema complejo que está en constante evolución, debido a la alta variabilidad genética inherente a este retrovirus. El VIH se originó en África occidental y central, por la transmisión de múltiples zoonosis de los virus de la inmunodeficiencia de los simios y de primates no humanos a los humanos.

Existen varias hipótesis que explican la transmisión entre los primates y los humanos; las más aceptadas son: a) el proceso de caza y matanza de los primates para consumo de la carne; b) la exposición directa de los humanos a la sangre o secreciones de las mucosas de los animales, y c) la contaminación en la preparación de la vacuna oral contra la poliomielitis.

La clasificación del VIH se elabora según los patrones de agrupamiento por similitud genética. Hasta la fecha se han identificado dos tipos de VIH: el VIH-1 y el VIH-2 (figura 26-2).

VIH-1

A través de numerosos análisis filogenéticos de las cepas del VIH, aisladas en diversas zonas geográficas del mundo, el virus se ha clasificado en cuatro categorías: grupos, subtipos, sub-subtipos y formas circulantes recombinantes.

Existen cuatro grupos del VIH-1, transmitidos de manera independiente del chimpancé y el gorila al humano, denominados M, N, O y P (figura 26-2). Los grupos M y N tienen relación filogenética con los virus encontrados en el chimpancé (Pan troglodytes troglodytes), mientras que los grupos O y P, con los hallados en los gorilas (Gorilla gorilla gorilla).

Los grupos se denominan “M” por main, o principal, “O” por outlier y “N” por non-M, non-O. La nomenclatura para clasificar las cepas del VIH se propuso en 1999, y desde entonces se acordó que a los nuevos grupos se les asignaría una letra por estricto orden alfabético, tal es el caso del recientemente descrito grupo P.

El grupo M incluye las cepas responsables de la pandemia alrededor del mundo, y se subdivide en nueve subtipos (A-D, F-H, J y K) (figura 26-2). Los subtipos A y F se subdividen sub-subtipos (A1, A2, F1 y F2). Conforme se encuentren nuevos subtipos, también se les denominará por orden alfabético.

Cuando, mediante el análisis filogenético, algunas cepas se agrupan con distintos subtipos en diferentes regiones de sus genomas, a estos genomas mosaicos se les denomina formas recombinantes circulantes (FRC), que se forman cuando en la misma región geográfica cocirculan varios subtipos que infectan a un individuo y generan virus recombinantes con información genética de dos subtipos diferentes (figura 26-3). En la actualidad se han descrito 52 FRC que se identifican con los números y con las letras de los subtipos que están involucrados. Cuando se recombinan más de tres subtipos, se denominan cpx (complex) y se clasifican en el orden en que se describieron.

En el mundo, el subtipo C representa 48% de las infecciones, seguido de los subtipos A, B, G y D, que suponen 12, 11, 5 y 2% de las infecciones, respectivamente. Las FRC representan, por lo menos, 20% de las infecciones por el VIH en el mundo. En México predomina el subtipo B y las formas recombinantes intersubtipo BF y BG.

No están muy claros todos los efectos que tienen los subtipos sobre la progresión de la enfermedad, pero se ha demostrado que el subtipo D progresa más rápido que el A.

El grupo N está formado por secuencias filogenéticas muy relacionadas, ya que sólo se ha descrito en muy pocos individuos de Camerún.

El grupo O se encontró originalmente en la región centrooccidental de África e, igual que el grupo M, la diversidad de sus secuencias es elevada. Se clasifica en las clases I-V, que son genéticamente distantes entre ellas como los subtipos del grupo M; sin embargo, no se han propagado en todo el mundo.

El grupo P se describió recientemente, y sólo se dispone de un par de secuencias en individuos originarios de Camerún.

VIH-2

El VIH-2 presenta una relación cercana con el virus de inmunodeficiencia en simios aislado de sooty mangabey (Cercocebus aty). Se divide en grupos de A a H.

Este virus es endémico de África occidental, y los estudios filogenéticos demuestran que los diversos grupos de este virus se originaron por transmisiones independientes entre el sooty mangabey y los humanos.

El genoma del VIH consta de aproximadamente 10 kb, y está compuesto por nueve genes: tres estructurales, que son característicos de los retrovirus; dos reguladores, y cuatro accesorios. Además, en los extremos cuenta con repeticiones terminales largas (long-terminal repeat, LTR), que funcionan como regiones promotoras para la transcripción del virus (figura 26-4).

Las proteínas estructurales son necesarias para la síntesis de nuevas partículas virales, y los genes que codifican para estas proteínas son gag, pol y env. El gen gag codifica para las proteínas de la cápside (p24, p17, p9 y p7). p24 forma la nucleocápside; p17 forma la matriz del virus y se encuentra entre le envoltura externa del virus y la nucleocápside, y p7 y p9 están estrechamente asociadas con el ARN viral. El gen pol codifica para las tres enzimas esenciales del ciclo de replicación viral: la enzima transcriptasa inversa (p66)/ARNasa H, la integrasa (p31) y la proteasa. El gen env codifica para la proteína precursora de la envoltura y se procesa por una proteasa celular en dos proteínas de envoltura: gp120, que se encuentra en la superficie del virus, y gp41, una proteína transmembranal. Este complejo de glucoproteínas es el que une al receptor celular (figura 26-4).

Los genes reguladores son tat y rev, cuyas proteínas no se ensamblan en el virus, pero son esenciales para la replicación viral dentro de la célula. La función de la proteína Tat es regular la transcripción del promotor viral, y la de la proteína Rev, ayudar al transporte eficiente del ARN viral del núcleo al citoplasma. En ausencia de Rev no se forman las proteínas estructurales (figura 26-4).

Los genes accesorios están involucrados en la regulación de la expresión de genes virales y en la latencia celular. Estos genes son: nef, vif, vpr, vpu y vpx. Los genes nef, vif y vpr se encuentran en todos los retrovirus a excepción del SIVagm, que no contiene vpr. El VIH-1 contiene vpu, mientras que el VIH-2, vpx (figura 26-4). El gen nef codifica para una proteína que se requiere para una replicación viral eficiente, interactúa con componentes de la célula huésped y se asocia con elevadas cargas virales. La proteína Nef tiene, al menos, dos funciones distintas: mejora la replicación viral y estimula una reducción en el número de receptores celulares CD4 en la superficie de la célula infectada, función que sirve para prevenir reinfecciones. Otra función biológica de Nef es la regulación de la molécula MHC-1 en las células infectadas, que enmascara al sistema inmune. La proteína Vif influye en las partículas virales que se encuentran libres y sean infecciosas. La proteína Vpr tiene múltiples funciones durante la replicación viral en células que no están en división: tiene efectos en el proceso de transcripción inversa, en la importación del complejo de preintegración del ADN viral y en la regulación de la apoptosis e interviene en los genes de la célula huésped. La proteína Vpu sólo se encuentra en el VIH-1, facilita la liberación de las partículas virales, interviene en el retículo endoplásmico en las señales para la expresión del receptor celular CD4, está involucrado en la maduración de las proteínas de la envoltura y no se encuentra en el virión; sin esta proteína las partículas virales permanecen unidas a la membrana celular. Por último, el gen vpx es exclusivo del VIH-2 y tiene funciones similares a la proteína Vpr del VIH-1, pero sin detener el ciclo celular. Esta proteína se asocia a la patogenia del virus porque en su ausencia se desarrolla sida.

El VIH pertenece a un grupo de virus isométricos y mide entre 90 y 140 nm de diámetro. Como otros retrovirus, la partícula viral del VIH está compuesta por la proteína de la cápside (p24), la de la nucleocápside (p7/p9), dos cadenas de ARN de cadena simple y tres enzimas: proteasa, transcriptasa inversa e integrasa (figura 26-5).

La envoltura del virus está compuesta de lípidos, que son derivados de la célula huésped, y espículas virales, codificadas por el virus. Posee cerca de 70 espículas sobre la envoltura lipídica, que consisten de una molécula transmembranal, la glucoproteína 41 que actúa no covalentemente con la gp120 (glucoproteína exterior). Debajo de la envoltura del virión se encuentra la proteína de la matriz (p17), que delimita la membrana externa de la cápside interna (figura 26-5).

La partícula madura del VIH contiene una cápside interna ribonucleoproteica formada por las proteínas p24 y p7/p6. Dentro de la cápside se encuentran las enzimas transcriptasa inversa/ARNsa H, integrasa y proteasa; además, contiene dos copias de ARN de cadena simple unidas mediante enlaces no covalentes (figura 26-5).

Como otros retrovirus, el VIH necesita replicarse dentro de una célula blanco, utilizando su maquinaria celular. El virus inicia el ciclo de infección con la unión de la partícula viral a células con receptor CD4⁺, y las células susceptibles de infectarse son los linfocitos T cooperadores, macrófagos, células de Langerhans, células dendríticas, de la microglia y megacariocitos.

La partícula viral se adhiere a la célula con la interacción de la glucoproteína gp120 de la envoltura del virus con el receptor de superficie celular CD4⁺. Esta unión produce cambios conformacionales en ambos receptores, lo que permite un acercamiento más estrecho entre ellos y lleva al virus a una segunda unión con el correceptor celular (CCR5 o CXCR4). Esta segunda interacción genera un nuevo cambio conformacional en la gp41, lo que provoca que se forme un poro de fusión, unión que ocasiona cambios en la membrana celular y la envoltura del virus, lo que permite su fusión (figura 26-6). Como consecuencia, al degradarse parcialmente la cápside, se libera el contenido de la partícula viral (entre otros componentes las dos hebras de ARN y la enzima transcriptasa inversa) en el citoplasma de la célula.

El siguiente paso en la replicación involucra la transcripción inversa, donde el ARN viral se transcribe en ADN proviral. La enzima transcriptasa inversa es la responsable de la síntesis de la primera cadena de ADN (ADNss[-]) y es complementaria a la cadena de ARN. Durante la síntesis de esta cadena, con frecuencia la transcriptasa inversa cambia de una cadena de ARN a la otra y genera una sola cadena de ADN con recombinación de las dos cadenas originales de ARN viral. La actividad ARNsa H de la enzima degrada el ARN cuando éste ya se ha sido copiado.

Subsecuentemente, el ADNss(-) sirve como templado para sintetizar la segunda hebra deADN y forma el complejo de preintegración que se transporta vía retículo endoplásmico, y con ayuda de la proteína viral Vpr, al núcleo celular, donde será integrado al genoma de la célula huésped. Con la participación de la enzima integrasa, el complejo de preintegración atraviesa la membrana nuclear y, junto con enzimas reparadoras del huésped, integra el genoma viral en el cromosoma de la célula huésped, generando el genoma proviral (figura 26-6).

La transcripción del genoma proviral se regula por los genes tat y rev. La proteína Tat ayuda a la elongación de ARN y Rev regula la transportación del ARN del núcleo citoplasmático. El ARN se une a los ribosomas e inicia la síntesis de proteínas virales y estas proteínas se transportan para ensamblarse cerca de la membrana de la célula. Las proteínas estructurales de los genes gag, pol y env se expresan como poliproteínas, que son cortadas por la proteasa del virus hasta convertirlas en unidades funcionales más pequeñas. Los productos del gen env son transportados a la membrana celular y el empaquetamiento del ARN requiere de las señales del gen gag. Las proteínas de envoltura viral se unen dentro de la membrana de la célula huésped, junto con las proteínas que forman el core del virus, las dos hebras ARN y las enzimas. Finalmente, la liberación de las nuevas partículas virales interviene el gen vpu. El virus pincha la célula y libera nuevos virus fuera de la célula, donde, gracias a la proteasa, el virus sigue madurando (figura 26-6). La capacidad de infección del virus depende de la maduración de éste y del gen vif. Una sola célula puede producir miles de partículas infecciosas del VIH durante semanas o en una sola explosión tras la muerte de la célula infectada.

Después de la exposición al virus, en general desde la segunda a la tercera semanas, los eventos virológicos y serológicos muestran una viremia elevada, lo que provoca la distribución del virus a todo el organismo. El ARN del VIH está presente antes de que el paciente desarrolle anticuerpos detectables anti-VIH.

La proteína de la cápside central del virus, el antígeno p24 (Ag p24), usualmente puede detectarse a los pocos días de la aparición de la viremia. Cuando el sistema inmune del huésped inicia una respuesta para controlar la infección, los niveles tanto del virus como del Ag p24 disminuyen hasta ser indetectables. En general el Ag 24 permanecerá indetectable hasta que el sistema inmune se desgaste, y se asocia con la progresión de la enfermedad.

El conocimiento de estos acontecimientos virológicos y serológicos que ocurren después de la infección permite diagnosticar la infección por el VIH por cualesquiera de las técnicas.

Diagnóstico de la enfermedad

El diagnóstico de la infección por el VIH se basa en pruebas de laboratorio. Los métodos de diagnóstico se pueden clasificar en dos grupos:

1. Indirectos: detectan la presencia de anticuerpos específicos que el organismo produce como respuesta. En este grupo se encuentran las pruebas de tamizaje, como el análisis de inmunoabsorción ligado a enzimas (enzymelinked immunosorbent assay, ELISA) y la prueba confirmatoria (Western blot).

2. Directos: detectan el virus o algunos de sus componentes (cultivo viral, reacción en cadena de la polimerasa, PCR).

La prueba más frecuente es el ELISA; sin embargo, para diagnosticar la infección por el VIH se requieren dos pruebas de ELISA positivas y una prueba confirmatoria también positiva.

ELISA

Estas pruebas detectan mínimas cantidades de anticuerpos, por lo que pequeñas cantidades de sustancias similares podrían conducir a resultados falsos positivos (vacuna contra la influenza, hepatitis B y rabia); que también son causados por estimulación del sistema inmune (infecciones virales, embarazo, enfermedades autoinmunes, transfusión de sangre, etc.). Para confirmar un resultado positivo, en general se realiza una prueba de inmunoelectrotransferencia (Western blot). La reacción se lleva a cabo en una placa de plástico con pozos microtitulados. La superficie de cada cavidad está cubierta por los anticuerpos y antígenos del VIH. A continuación, al pozo se le agrega suero o plasma del paciente y si en el suero existen anticuerpos específicos, éstos se unen al complejo de antígeno de la placa. Después se añade un anticuerpo secundario marcado que se va unir al complejo que se formó entre los anticuerpos presentes en el suero y los antígenos localizados en la placa. Por último, se agrega un sustrato cromógeno, que reacciona con el anticuerpo marcado con la enzima. Esta unión resulta en un cambio de color que se mide en el espectrofotómetro. La densidad óptica se correlaciona con la concentración de anticuerpos del VIH presentes en el paciente: a mayor intensidad, más anticuerpos en el suero.

PRUEBAS RÁPIDAS

Las pruebas rápidas son métodos de detección de anticuerpos anti-VIH con resultados en menos de 30 minutos, con una sensibilidad y una especificidad con rangos desde 99.6 a 100%. Además de plasma y suero sanguíneo, en las pruebas rápidas se utiliza sangre total o capilar, que se toma del dedo o del lóbulo de la oreja; también, otros ensayos utilizan orina o trasudación oral (no saliva). Las pruebas rápidas se basan en métodos de inmunocromatográficos, aunque hay técnicas que utilizan aglutinación de partículas, inmunoDOT e inmunofiltración. Suelen emplear péptidos sintéticos o proteínas recombinantes del VIH como fuente de antígeno, y consisten en una fase sólida compuesta de macropartículas que contienen los anticuerpos y el antígeno del VIH. Metodológicamente son menos complejas que los ELISA, y combinadas con otras pruebas de detección de anticuerpos constituyen una estrategia que mejora la especificidad de los resultados de forma asequible. Los resultados positivos siempre deben confirmarse con ELISA y Western blot.

Western blot

La técnica consiste en separar las proteínas virales (antígenos) por su peso molecular por medio de electroforesis, después son transferidas a una membrana de nitrocelulosa que se va utilizar como tira reactiva del ensayo. Esta tira se incuba con el suero o el plasma del paciente. Si en el suero existen anticuerpos anti-VIH, éstos se van a unir al antígeno que está presente en la tira reactiva. El complejo resultante (antígeno-anticuerpo) se hace visible utilizando un anticuerpo secundario y su sustrato correspondiente. Las bandas que se observan en la tira reactiva concuerdan con los anticuerpos presentes en la muestra.

A continuación se exponen las proteínas que pueden detectarse con esta prueba, que corresponden a los genes estructurales del VIH:

• Proteínas de la envoltura: gp160, gp41, gp120.

• Proteínas de la polimerasa: p31/p34, p39/p40, p51/p52, p66/p68.

• Proteínas de la nucleocápside: p17/p18, p24/p25, p55.

La formación de anticuerpos después de la infección sigue una cinética específica; por ejemplo, la p24 y la gp120 se detectan en fases tempranas mientras que la p31 por lo común se observa en fases tardías de la infección. Una prueba de Western blot se considera positiva cuando al menos son visibles dos o tres bandas.

Los criterios internacionales para determinar un resultado positivo no están definidos de manera uniforme, y son los siguientes:

• Organización Mundial de la Salud (OMS): dos glucoproteínas cualesquiera.

• Cruz Roja Americana: una proteína de cada gen estructural.

• Food and Drug Administration (FDA): p24+p32+(gp41 o gp120 o gp160).

• Centers for Disease Control and Prevention (CDC): p24 + (gp41 o gp120 o gp160) o gp41 + (gp120 o gp160).

Ensayos de detección de ARN del VIH

Aunque los ensayos con anticuerpos son el pilar en el diagnóstico de la infección por el VIH, los anticuerpos pueden permanecer indetectables durante las primeras tres a seis semanas después de la infección. La detección del ARN viral desempeña un papel importante en la infección temprana de la infección antes de que ocurra la seroconversión. En general, puede detectarse entre la primera y la segunda semanas después de la infección, cuando ni los anticuerpos ni el antígeno p24 son detectables. Esta clase de pruebas tiene la sensibilidad de detectar de 50 copias/ml en adelante. Estas pruebas no se han adaptado como herramientas de detección porque son costosas y técnicamente complejas para llevarlas a cabo.

El único ensayo aprobado por la FDA como ayuda al diagnóstico de la infección es el ensayo cualitativo de ARN (aptimade gen-probe). En resumen, se captura el ARN en una micropartícula magnética y, posteriormente, se amplifica para detectar por medio de una sonda quimioluminiscente.

Se recomienda en los bebés nacidos de madres positivas para el VIH, pacientes con un riesgo elevado de adquirir la infección y que presenten síntomas que sugiera la infección, así como en pacientes con infección aguda. La infección aguda por el VIH se define como niveles detectables de ARN viral en plasma con resultados de anticuerpos negativos o indeterminados.

El desarrollo de los ensayos para cuantificar los niveles de ARN del VIH (carga viral) en plasma ha revolucionado el manejo clínico de la infección por el VIH. Aunque estas pruebas cuantitativas desde hace varios años existen, no están aprobadas para el diagnóstico de la infección, ya que en pacientes positivos para el VIH, pero con niveles bajos de ARN, pueden dar un resultado falso negativo.

Los pacientes con infección por el VIH diagnosticados con ensayos de detección de ARN viral deben practicarse un examen serológico para confirmar la seroconversión.

Ensayos de seguimiento

Durante el periodo de latencia clínica asociada a la infección por el VIH el virus continúa replicándose. Este periodo termina con el desarrollo de síntomas de la enfermedad. El conocimiento de los factores que afectan la progresión de la enfermedad ayuda al manejo integral de la infección por el VIH. Se ha demostrado la relación entre alta cantidad de ARN del VIH y la disminución de la cantidad de linfocitos T CD4⁺ con la rápida progresión de la enfermedad.

La cuantificación de la carga viral y el recuento de los linfocitos T CD4⁺ proporcionan información pronóstica esencial para el médico. Las pruebas para medir la carga viral en los pacientes se utilizan para monitorear la eficacia del tratamiento antirretroviral, con la finalidad de mantener la carga viral por debajo de los niveles detectables, y en pacientes sin tratamiento antirretroviral, para evaluar si se requiere iniciarlo. Un aumento significativo y progresivo de la carga viral en el paciente indica el fracaso del tratamiento, pero no si es por falta de adherencia al tratamiento o por resistencia a los antirretrovirales. Para corroborar si el fracaso terapéutico es por resistencia a los antirretrovirales se realiza la prueba de genotipificación.

Cuantificación de los linfocitos T CD4⁺

Los linfocitos T CD4⁺ son fundamentales para desarrollar la respuesta inmune específica a las infecciones, en particular a los patógenos intracelulares. Puesto que estas células son el blanco del VIH, su disminución limita gravemente la capacidad de respuesta inmune del hospedero. La capacidad del sistema inmune de tener una respuesta específica contra el VIH es un factor clave en el curso de la enfermedad, y la cuantificación de las células CD4⁺ es el predictor más significativo de la progresión de la enfermedad. Recuentos bajos de linfocitos T CD4⁺ se asocian con mayor riesgo de progresión de la enfermedad, y la recomendación para iniciar tratamiento se basa en la cuenta de los linfocitos T CD4⁺ antes que en cualquier otro marcador.

El riesgo de progresión a sida aumenta sustancialmente cuando el recuento de los linfocitos T CD4⁺ es < 350 células/mm³. El riesgo es mayor cuando los recuentos caen por debajo de 200 células/mm³. Con este conteo se recomienda comenzar el tratamiento antirretroviral (200 a 350 células/mm³).

El recuento de los linfocitos CD4⁺ se lleva a cabo por citometría de flujo, mediante anticuerpos fluoresceinados y cuenta el porcentaje de células CD4⁺.

ARN del VIH

La cuantificación de la carga viral del VIH se utiliza como marcador pronóstico para medir tanto para progresión de la enfermedad como la eficacia del tratamiento antirretroviral. Como se mencionó anteriormente, niveles elevados de carga viral se asocian a una disminución de los linfocitos T CD4⁺, lo que lleva a la progresión a sida y la muerte.

La guía define fracaso virológico como la situación en que no se logra una carga viral con niveles indetectables después de seis meses de tratamiento (< 50 copias/ml) o cuando se tiene una carga viral constante de > 50 copias/ml o > 400 copias/ml después de la supresión por debajo de este nivel.

En la actualidad están aprobados por la FDA cinco ensayos para cuantificar las copias de ARN del VIH/ml de plasma; dos son pruebas de RT-PCR, que son más sensibles y menos susceptibles a la contaminación. Una utiliza PCR estándar, otra con ADN ramificado, y por último, la otra utiliza amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA). Estas pruebas tienen sensibilidad mayor al 98%, detectan al grupo M del VIH-1, con excepción del RT-PCR tiempo real, que detecta los grupos M, N y O del VIH-1.

Pruebas de resistencia a los antirretrovirales

La resistencia se define como la disminución de la sensibilidad del fármaco antirretroviral. Es la principal causa de la falla al tratamiento y se genera por una serie de sustituciones en los genes que codifica para el receptor y las enzimas virales, blanco en los que actúan los antirretrovirales.

Las pruebas de resistencia determinan la secuencia de nucleótidos del genoma viral y sus resultados son una lista de cambios de aminoácidos o mutaciones que son diferentes a la cepa de referencia de tipo silvestre. Esas mutaciones se expresan por la posición que tienen en el genoma (codón), precedido por la letra que corresponde al aminoácido de tipo silvestre y seguido por el aminoácido que muestra la mutación, como por ejemplo la L90M, leucina del codón 90 que cambia a metionina.

En la actualidad existen más de 100 mutaciones involucradas en el desarrollo de resistencia a los antirretrovirales. Existen varios algoritmos tanto públicos (cinco) como privados (seis), que facilitan la interpretación del genotipo para determinar el nivel de resistencia a los antirretrovirales. Se dispone de cinco ensayos comerciales para determinar la resistencia, todos basados en obtener la secuencia de ARN viral para analizar las mutaciones en los genes en donde actúan los antirretrovirales que están disponibles a la fecha. La Asociación Internacional de SIDA y la guía para la atención médica de la Secretaría de Salud recomiendan el uso de estas pruebas bajo las siguientes circunstancias: a) infección aguda por el VIH en el momento del diagnóstico; b) fracaso del tratamiento antirretroviral, si la carga viral es > 1 000 copias/ml; c) en mujeres embarazadas, como profilaxis en la transmisión vertical, si en la madre se detecta ARN viral; d) respuesta subóptima a la terapia, cuando no se logra disminuir la carga viral en un periodo de ocho a 12 semanas, lo que sugiere la preexistencia de resistencia, y e) antes de iniciar tratamiento antirretroviral. En México, entre pacientes naïve a tratamiento ARV se encontró que 16% al menos presentaba resistencia a un antirretroviral; además, 7.3% mostró niveles de resistencia altos.

Desde el descubrimiento del VIH, se han tratado de comprender los mecanismos fisiopatológicos involucrados en el ciclo biológico del VIH, desde la interacción del virus con la célula hasta la liberación de las partículas virales. Con este conocimiento se han identificado los pasos críticos, que hoy son blancos terapéuticos y bloquean el ciclo de replicación viral. El tratamiento antirretroviral es la mejor opción para lograr la supresión viral por periodos prolongados, ya que la mantiene en niveles indetectables, y así aumentar los linfocitos CD4⁺ por el mayor tiempo posible, y en consecuencia reducir la mortalidad y la morbilidad; sin embargo, los tratamientos actuales no erradican la infección por el VIH. Inicialmente, la inhibición de la replicación del VIH se dirigió a las enzimas virales, que no están presentes en las células humanas y son exclusivas del virus. Los tratamientos actuales que inhiben la replicación del VIH abarcan la entrada del virus a la célula y bloquean la función de las tres enzimas virales. El uso del tratamiento antirretroviral altamente activo, y ha demostrado ser eficaz para retrasar la progresión a sida, al controlar la replicación viral por periodos prolongados. En México se han aprobado 28 productos que contienen antirretrovirales con seis mecanismos de acción diferentes para el tratamiento en diferentes etapas del ciclo de infección por el VIH (cuadro 26-1).

• Inhibidores de entrada: hay dos clases de inhibidores:

  • Antagonistas del CCR5.

  • Inhibidores de fusión.

• Inhibidores de la transcriptasa inversa.

  • Análogos de los nucleósidos/nucleótidos de la transcriptasa inversa (ITIAN).

  • No análogos de los nucleósidos de la transcriptasa inversa (ITINN).

• Inhibidores de la integrasa.

• Inhibidores de la proteasa (IP).

Inhibidores de entrada

La entrada del VIH tiene una gran relevancia como blanco farmacológico. La entrada del virus se puede dividir en cuatro etapas: 1) el virus se fija a la superficie de la célula; 2) el virus se une a receptor CD4⁺; 3) el complejo CD4-gp120 interactúa con los correceptores celulares, y 4) el virus se fusiona con la célula. Dentro de este grupo de antirretrovirales se incluyen los antagonistas del CCR5 y los inhibidores de fusión.

Antagonistas del CCR5

Después de la interacción de la gp120 con el linfocito CD4, ocurre un cambio conformacional que permite una interacción más cercana con alguno de los correceptores celulares CCR5 o CXCR4, para impulsar la fusión entre el virus y la célula. Los antirretrovirales de esta clase inhiben la unión del complejo gp120-CD4 con el correceptor CCR5 e interrumpen el ciclo de replicación del VIH. Los antagonistas del correceptor CCR5 se unen a su dominio transmembranal, lo que produce un cambio en el dominio extracelular del CCR5 que hace que la gp120 del VIH no lo reconozca. El antirretroviral aprobado de esta familia es el maraviroc.

Inhibidores de fusión

El único antirretroviral aprobado de esta clase de inhibidores es el enfurvitide. Cuando el complejo CD4-gp120-correceptor celular se une para el ingreso de la partícula viral a la célula huésped, induce cambios conformacionales en gp41. Estos cambios provocan que la región hidrofóbica de la parte central de la gp41 quede expuesta. En esta región se encuentra el heapted repeat (HR) 1 y el HR2, que están compuestas de seis hélices que forman una estructura de “horquilla” que crea el poro de fusión por donde la cápside viral pasa a la célula. El mecanismo de acción de esta clase de antirretroviral consiste en la unión competitiva a HR1 para impedir los cambios conformacionales del complejo gp41-gp120, y evitar el acercamiento y la fusión entre el virus y la célula.

Inhibidores de la transcriptasa inversa

La enzima transcriptasa inversa se encarga de convertir el ARN viral en ADN de doble cadena, para formar el complejo de preintegración que después se llevará al núcleo de la célula. El sitio activo de esta enzima está altamente conservado y la sustitución de cualquier aminoácido disminuye su actividad enzimática asociada con la unión de los desoxinucleótidos (dNTP) y la elongación del templado. Existen dos clases de inhibidores de esta enzima: los análogos de los nucleósido/nucleótidos y los no análogos de los nucleósidos.

Inhibidores de la transcriptasa inversa análogos de los nucleósido/nucleótidos

Los ITIAN son antirretrovirales que requieren ser trifosfatados por las cinasas celulares para ser activos. Una vez fosforilados compiten por los dNTP naturales, al incorporarse en la cadena de ADN en formación, bloquean la elongación y finalizan su síntesis. Los ITIAN no tienen el grupo 3’ OH hidroxilo, y por tanto, previenen la formación del enlace fofodiéster de la cadena en crecimiento. En la actualidad, existen siete antirretrovirales de esta clase (cuadro 26-1).

Inhibidores de la transcriptasa inversa no-análogos de los nucleósidos

Los ITINN no requieren de activación celular y actúan directamente en el bloque de la actividad enzimática. Estos inhibidores se unen en el hueco hidrofóbico localizado cerca del sitio activo de la enzima, lo que causa un cambio debido al desplazamiento de la posición de los aminoácidos y la imposibilidad de la unión de la polimerasa. Los antirretrovirales de primera generación pertenecientes a este grupo (delavirdina, nevirapina y efavirenz) presentaban resistencia cruzada y una barrera genética baja, ya que con una mutación se generaba un grado elevado de resistencia. La segunda generación de los ITINN, como la etravirina y rilpivirina, muestran una barrera genética mayor y menores probabilidades de resistencia cruzada.

Inhibidores de la integrasa

La inserción del genoma viral en el ADN de la célula huésped se lleva a cabo mediante la enzima viral integrasa. La integrasa tiene dos funciones catalíticas: 1) forma el complejo de preintegración viral, ya que elimina un dinucleótido de cada extremo del ADN viral y luego se transporta a través del poro nuclear al núcleo; 2) dentro del núcleo, corta ambas cadenas de ADN de la célula e integra el ADN viral. A este proceso se le conoce como transferencia de cadenas. Las enzimas reparadoras de la célula huésped sellarán los espacios entre el ADN viral y el celular.

Los inhibidores de la integrasa, como el ealtegravir, buscan bloquear a esta enzima mediante la unión a su sitio catalítico, para evitar que se lleve a cabo el proceso de integración. En la formación del complejo de preintegración, la integrasa se adhiere a los extremos del ADN viral, y los inhibidores de esta enzima se adhieren a la integrasa. Este complejo se transporta al núcleo; sin embargo, con la presencia de los inhibidores, la integrasa ya no puede unir los extremos del ADN viral al ADN celular, lo que impide que se establezca la infección.

Inhibidores de la proteasa

La proteasa del virus tiene como función la de cortar la poliproteína que se forma como producto de la traducción del ARNm de los genes gag, pol y env, y transformarlas en proteínas funcionales o activas de la cápside interna, las enzimas esenciales y las glucoproteínas de la envoltura que se requieren para la producción de virus maduros. Los IP tienen una barrera genética muy alta y se unen al sitio activo de la enzima, lo que impide el ensamblaje de los viriones inmaduros y, por tanto, pierden su infectividad. En la actualidad existen nueve IP aprobados para su uso clínico (cuadro 26-1).

El desarrollo de resistencia a los antirretrovirales es la principal causa de la falla del tratamiento y se genera por una serie de sustituciones de nucleótidos en los genes que codifican para el receptor y enzimas virales, blanco en los que actúan los antirretrovirales.

La diferencia en el surgimiento de la resistencia a los antirretrovirales se explica por las barreras genéticas de los propios fármacos. Para los ITINN y la lamivudina (3TC), una sola mutación puede conferir resistencia y, en algunos casos, generar resistencia para todos los fármacos de esta misma clase. Para el resto de los ITIAN y los inhibidores de proteasa, el desarrollo de niveles altos de resistencia requiere de varias mutaciones (cuadro 26-2)

La continua replicación en presencia de antirretrovirales lleva a la acumulación de varias mutaciones y permite, con el tiempo, el desarrollo de resistencia cruzada dentro de una misma clase de antirretrovirales (cuadro 26-2). Cuando se requiere de múltiples mutaciones para conferir resistencia se dice que existe una barrera genética alta.