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Los vehículos utilizados para la transferencia de genes a células somáticas pueden dividirse en dos categorías: vectores no virales y vectores virales.
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La transferencia de genes por un vector viral se denomina transducción y la que se realiza por un sistema no viral se denomina transfección. Los métodos de envío de genes se resumen en el cuadro 27-1.
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Transferencia de genes por un vector no viral
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Los métodos no virales de envío de genes basan su acción en la entrega directa de la información genética dentro de la célula blanco, y si bien estos sistemas muestran una baja toxicidad y, en general, su costo es bajo, la transferencia de genes es generalmente ineficiente y transitoria. Estos procedimientos se dividen, a su vez, en físicos y químicos.
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Electroporación: se utiliza para cultivos celulares y consiste en el uso de una celda donde se colocan las células, que se adapta a un electroportador que genera una corriente eléctrica del orden de milivoltios, con una duración de milisegundos, para generar orificios en la membrana celular. A través de estos orificios se introduce el material genético, generalmente por precipitación de complejos ADN-sales.
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Bombardeo de partículas: es el método de elección para la transfección de células vegetales, ya que la pared celular es un obstáculo físico que bloquea de manera natural la transducción. También se le conoce como pistola de genes y consiste en el uso de un aparato de balística que dispara micropartículas de oro, rodeadas de ADN plasmídico. La fuerza aplicada permite que estas partículas atraviesen la pared celular y depositen el material genético en el citoplasma de la célula.
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Microinyección: la microinyección consiste en la inyección directa de ADN en el núcleo celular mediante una microjeringa y un microscopio óptico, llamado micromanipulador, para poder introducir el material genético a una célula blanco. Se utiliza principalmente para la producción de animales transgénicos. Tiene el inconveniente de que sólo transduce una célula al mismo tiempo y requiere material y personal especializado, pero su eficiencia es alta.
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Precipitación con fosfato de calcio: los coprecipitados de fosfato de calcio (CaPO-4) y de ADN se utilizan para la transferencia de información genética en células tanto bacterianas como eucariotas. Éstos consisten en formar un precipitado insoluble entre el cloruro de calcio y el ADN en una solución salina de fosfatos. Estos precipitados forman microagregados que se depositan sobre la membrana celular y, posteriormente, son endocitados. Es la técnica más difundida para la producción de líneas celulares transfectadas de forma estable. y la de elección para experimentos in vitro por su bajo costo. Además, es un método rápido, simple y puede utilizarse en diversas líneas celulares.
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DEAE-Dextran: esta técnica difiere de la del fosfato de calcio en que se emplea sólo para la transfección transitoria de células y se utiliza de manera eficiente sólo en algunas líneas celulares eucariotas; debido a su toxicidad en otras no resulta adecuada. Se desconoce el mecanismo por el cual el DEAE-Dextran permite la entrada de ADN a las células y su transporte hasta el núcleo, pero se asume que los complejos formados por el DEAE-Dextran y el ADN se adhieren a la superficie celular y entran por endocitosis.
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Liposomas: esta técnica se basa en el uso de moléculas lipídicas de carga neta altamente positiva (catiónicas) que interactúan con el esqueleto fosfatado de la molécula de ADN. Estos polímeros de poliamidoaminas y lipopoliaminas con cargas positivas se unen electrostáticamente a las negativas del ADN y forman vesículas multilaminales que interactúan con los lípidos de la membrana celular, lo que facilita la transferencia de los ácidos nucleicos al interior de las células. También se conoce que a pH fisiológico estas moléculas contienen residuos protonables, lo que permite el control del pH del endosoma y, por tanto, la protección al ADN de la degradación por el sistema lisosomal.
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Transferencia de genes por un vector viral
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Los vectores virales son virus manipulados genéticamente para eliminar su capacidad autorreplicativa y en su genoma puedan incorporar genes terapéuticos. Una vez dentro de la célula pueden quedarse de manera episomal o integrarse al genoma de la célula, para posteriormente emplear la maquinaria enzimática celular y producir la proteína transgénica deseada. Los vectores virales emplean los mecanismos naturales de infección viral para introducirse en la célula —generalmente a través de receptores celulares— e introducir el gen terapéutico que contienen. Los vectores virales ofrecen grandes ventajas respecto a los no virales, y en general presentan una habilidad elevada para transducir células, por lo que son los modelos de elección para protocolos clínicos de terapia génica in vivo.
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Los virus que se utilizan como vectores virales son retrovirus, adenovirus, adenoasociados, herpesvirus y baculovirus. Para su uso como vectores, los virus se modifican genéticamente para que sean deficientes en replicación, y en algunas ocasiones se les modifica la cápside, con la finalidad de dirigir o redirigir su célula blanco. Cada uno de estos vectores posee ventajas y limitaciones respecto a los otros, según el gen terapéutico que transporten, el tipo celular y la vía de administración. En general, un vector ideal para utilizarse en terapia génica debe cumplir las siguientes condiciones:
Su producción debe ser fácil y eficiente.
No debe ser tóxico o inducir reacciones inmunológicas en el paciente.
Debe ser capaz de infectar a células tanto en reposo como en replicación.
Debe transducir tipos celulares de manera específica.
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De acuerdo con su capacidad de integrarse en el genoma de la célula huésped, los vectores pueden clasificarse como vectores integrativos o no integrativos. Los primeros se basan en retrovirus, mientras que los segundos incluyen virus del herpes simple tipo 1 (HSV-1), adenovirus y virus adenoasociados.
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Constituyen el grupo viral más desarrollado como vectores para protocolos clínicos. Los retrovirus recombinantes más usados son Lentivirus, derivados del virus de la leucemia murina. Éstos pertenecen a la familia Retroviridae y al género Lentivirus, y son virus dotados de envoltura con un diámetro de 80 a 130 nm. Su genoma es una cadena sencilla de ARN de aproximadamente 10 kb, lo que los obliga a realizar el proceso de retrotranscripción para su replicación. Además, tienen capacidad para incorporar transgenes de hasta 8 kb, un envío eficiente de genes a células en proliferación, y se integran en el ADN de la célula huésped, por lo que su expresión es estable. La integración se realiza de manera aleatoria en el genoma de la célula huésped, con lo que ofrecen una expresión persistente del gen terapéutico, lo que los hace útiles para su uso en enfermedades monogénicas hereditarias o crónicas. Sin embargo, presentan el riesgo, aunque extremadamente bajo, de mutagénesis insercional, debido a la posibilidad de integrarse y alterar un gen vital, modificar un gen supresor de tumores, interrumpiendo su expresión, o bien insertarse en un protooncogén induciendo su activación a oncogén. Su principal ventaja es que no contienen las proteínas virales en el vector, con lo que la respuesta inmune del huésped es nula; además, tampoco existe interferencia de una respuesta inmune previa.
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Son virus de doble cadena de ADN, de la familia Herpersviridae; el género más usado como vector es Simplexvirus. Su genoma mide de 120 a 240 kb, lo que le permite aceptar transgenes de gran tamaño o, inclusive, varios genes. El herpes virus puede ser una herramienta muy valiosa en células del sistema nervioso central, ya que sus células diana son las neuronas y se trata de un virus integrativo, con una capacidad de expresión persistente. Su complejidad, así como el hecho de que aún se duda de la existencia de un herpes virus no replicativo o sin capacidad de producir las proteínas líticas, ponen en entredicho la seguridad de su utilización.
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Los adenovirus son miembros de la familia Adenoviridae. Se trata de virus de ADN de doble cadena, con una longitud de 30 a 35 kb, y pueden aceptar hasta 8 kb de material genético exógeno. El virión es de 80 a 100 nm de diámetro, sin envoltura. Se han identificado más de 50 serotipos adenovirales (Ad1-Ad50), pero sólo Ad2 y Ad5 se utilizan como adenovirus recombinantes, debido a que están perfectamente caracterizados. Pueden infectar a una gran variedad de células, tanto en división como en reposo. Dentro de la célula persisten como ADN no integrado, y su expresión es transitoria; tienen una duración media de entre 12 y 25 días, aunque algunos investigadores han reportado hasta seis meses de expresión. Los adenovirus gutless tienen la capacidad de acomodar material genético de hasta 20 kb, ya que carecen de prácticamente todo su genoma, con excepción de las secuencias empaquetadoras. Los adenovectores deben su éxito en terapia génica a que son biológicamente muy seguros, se producen fácilmente en el laboratorio y de manera silvestre sólo se les relaciona con infecciones respiratorias y gastrointestinales leves. Alrededor de 90% de la población humana se encuentra sensibilizada a los adenovirus, por haber estado en contacto con éstos, y por tanto, presentan anticuerpos circulantes contra ellos, lo que limita su aplicación en protocolos clínicos. Por ello, su principal desventaja estriba en la fuerte respuesta inmune que despiertan en el huésped, lo cual puede llegar a limitar la eficiencia en su uso como vehículo génico, debido a que pueden eliminarse por el sistema inmune. Por esta razón, es necesario utilizar dosis altas para lograr un porcentaje adecuado de transducción, lo que podría desencadenar una respuesta inflamatoria inespecífica grave que puede provocar daños al paciente que lo pueden conducir a la muerte.
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Los AAV son virus relativamente pequeños, de 45 a 60 nm de diámetro, cuyo ADN es de cadena sencilla, con una longitud de 4.7 kb. Tienen una capacidad limitada para la inserción de genes, de sólo 1 kb, y son capaces de infectar tanto células en reposo como en replicación. Los AAV silvestres se integran de forma selectiva en el cromosoma 19, sitio q13.3-4; sin embargo, el virus adenoasociado recombinante pierde esta capacidad de integración y su expresión es episomal, pero estable, ya que forma estructuras de concatámeros cabeza-cola que persisten, en promedio, desde seis meses hasta más de un año. Su uso es muy prometedor, debido a que no generan respuesta inmune humoral en el huésped y se ha reportado la expresión del gen terapéutico por más de un año; sin embargo, tienen el inconveniente de que son difíciles de producir y los títulos que se obtienen son bajos.
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En el cuadro 27-2 se resumen las ventajas y desventajas de los diferentes virus usados como vectores en terapia génica. Como conclusión, el vector idóneo será el que sea capaz de entregar el gen a la célula blanco y logre expresarlo de manera eficiente.
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Características deseables de un vector
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Con independencia del tipo de vector que se utilice en la terapia génica, el vector ideal es aquel que presente las siguientes características:
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Facilidad para producirse a títulos elevados
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El empleo de vectores, en protocolos ya sea experimentales o clínicos, requiere cantidades elevadas de éstos, especialmente si la administración es sistémica, por lo que aquellos vectores que pueden producirse con facilidad en títulos elevados, mayores de 108 partículas/ml, son los ideales.
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Metodología de producción rápida y reproducible
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La metodología para la generación y producción de los vectores debe ser reproducible en cualquier laboratorio y no involucrar métodos complicados que puedan entorpecer el proceso.
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Introducción del transgén precisa y estable
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Una transferencia eficaz en las células blanco y una alta especificidad son las características ideales con las que debe contar el vector, sobre todo cuando la administración es sistémica y va dirigida a que se exprese en un tipo particular de tejido o célula.
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Respuesta inmune nula o mínima en el huésped
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El vector debe ser lo menos inmunológico posible para el huésped, lo que permitirá que la expresión del transgén sea más prolongada, además de evitar reacciones inmunológicas adversas.
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Transgén más elementos regulatorios
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Secuencias de genes estables con secuencias regulatorias, que permitan una expresión estable y de la información genética introducida.