++
El estímulo antigénico intermitente o permanente que proporciona el parásito al hospedero durante la infección y la respuesta efectora del mismo a base de anticuerpos permiten la búsqueda de estos últimos con fines diagnósticos, a fin de encontrar una correlación positiva entre el cuadro clínico y las pruebas serológicas. Las técnicas para demostrar la presencia de anticuerpos contra parásitos o sus componentes antigénicos han cambiado mucho en los últimos años; sin embargo, estas pruebas inmunológicas permanecen como procedimientos de laboratorio especializado que permiten el diagnóstico en circunstancias en que la identificación física del parásito no es posible. Como todas las pruebas inmunológicas de diagnóstico, se basan en la unión antígeno-anticuerpo y dependen de una alta sensibilidad analítica (capacidad de identificación de muy pequeñas cantidades de analitos). Al igual que cualquier prueba diagnóstica, se fundamentan en su valor predictivo, en donde los términos básicos son la sensibilidad diagnóstica y la especificidad. La sensibilidad diagnóstica es la capacidad de determinar que un individuo está enfermo al tener un resultado anormal de la prueba. La especificidad diagnóstica es la capacidad de la prueba de identificar a un individuo como “no enfermo” al tener un resultado normal. La cantidad de técnicas diferentes para mostrar anticuerpos contra parásitos crece día con día, lo cual indica que todas ellas tienen desventajas o problemas. A continuación se revisa en forma general en qué consisten estas técnicas.
++
En esta técnica se pone en contacto el suero del paciente con los parásitos muertos y preservados o sus antígenos, y luego de lavar se añade la fluoresceína conjugada o unida a un anticuerpo antiinmunoglobulina humana. Se observa bajo el microscopio de fluorescencia si la prueba resulta positiva. El resultado aquí obtenido es cualitativo, pero también se puede diluir el suero del paciente hasta determinar la dilución a la cual todavía hay resultados positivos. De esta manera se tiene una técnica semicuantitativa; sin embargo, esta prueba como tal no es de uso común en el laboratorio, porque se requiere tener un microscopio de fluorescencia y reactivos perecederos, además de que es difícil mantener la fuente de parásitos.
++
Los métodos inmunológicos evolucionaron para mejorar la especificidad y la sensibilidad, lo cual, aunado a las necesidades antes descritas, hizo menos común el uso de la inmunofluorescencia. Las dificultades para obtener parásitos intactos impulsaron el uso de extractos parasitarios, y con ello la aplicación de inmunodifusión simple y doble, precipitación, aglutinación, contrainmunoelectroforesis y, más recientemente, los estudios inmunoenzimáticos como el ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA, Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay), Inmuno dot y Western blot.
++
La inmunodifusión simple o doble se basa en la reacción de antígenos y anticuerpos en un medio sólido, como el gel de agar o de agarosa. La reacción antígeno-anticuerpo es visible, ya que ocurre una precipitación que se manifiesta como una o varias bandas, según se trate de una o varias especies de antígenos o de anticuerpos. Estas técnicas, aunque extraordinariamente simples y rápidas, cayeron en desuso porque se requieren concentraciones altas de reactantes, es decir, de antígenos parasitarios y de anticuerpos que tienen baja sensibilidad y, en consecuencia, poca utilidad clínica.
++
Esta técnica es más sensible que la difusión, y consiste en hacer reaccionar los antígenos parasitarios y los anticuerpos sobre partículas de látex o sobre eritrocitos. En este último caso se denomina hemaglutinación. Para este método se obtienen los extractos antigénicos de los parásitos, y luego, mediante una reacción química, esas moléculas se enlazan en forma covalente a los eritrocitos o a las partículas de látex. Puede realizarse en placas de microtitulación, lo cual permite efectuar de manera simultánea un número grande de muestras. Aunque estas técnicas tienen mayor sensibilidad que las de inmunodifusión, consumen más tiempo que otras técnicas que se describen más adelante.
+++
Contrainmunoelectroforesis
++
Consiste en poner la muestra de suero con los anticuerpos al lado de un gel y el antígeno o los antígenos parasitarios enfrente. Enseguida se aplica una corriente eléctrica; según la carga eléctrica, los reactantes migran al polo positivo o al negativo. Cuando se encuentran en su concentración óptima ocurre la reacción antígeno-anticuerpo, que se manifiesta como una banda de precipitación.
+++
Pruebas inmunoenzimáticas
++
A partir de la publicación de Engvall y Perlman en 1972, las pruebas inmunoenzimáticas han contribuido tanto a la investigación como al servicio médico diario, ya que se trata de técnicas más sensibles que todas las ya descritas en los párrafos anteriores. El amplio uso de estas técnicas confirma que se trata de pruebas sensibles, confiables, reproducibles y específicas. Todos los antígenos de naturaleza proteica o peptídica pueden ser fijados en el fondo de un pozo de una microplaca de poliestireno o de cloruro de polivinilo con ayuda de un amortiguador de pH alcalino; el suero de las personas o pacientes que se desea probar se agrega a la placa. Los anticuerpos circulantes específicos para el antígeno reaccionan en el fondo de la placa, y la reacción antígeno-anticuerpo se hace visible mediante la adición de un anticuerpo antiinmunoglobulina humana conjugado con una enzima. Después, mediante una mezcla del sustrato y un agente que genera color, aparece una reacción colorida cuya intensidad se determina en un espectrofotómetro. Este instrumento permite cuantificar con precisión la cantidad de anticuerpo o antígeno presente.
++
La Inmuno dot también es una prueba inmunoenzimática, pero la reacción antígeno-anticuerpo ocurre en un papel de nitrocelulosa y no en una placa. Esta técnica es más simple y no requiere instrumentos para su lectura; se ha adaptado para obtener resultados en sólo ocho minutos. Una versión de esta técnica recibe el nombre de prueba rápida, ya que se utiliza un conjugado de proteína A con oro coloidal para hacer visible la reacción antígeno-anticuerpo. Estas pruebas son de uso generalizado en las zonas geográficas donde no existe infraestructura médica que permita el uso de técnicas más complejas.
+++
Prueba Western blot o de inmunoelectrotransferencia
++
En esta técnica se hace reaccionar el suero o plasma de un paciente con una tira de nitrocelulosa que contiene uno o más antígenos parasitarios. La reacción antígeno-anticuerpo es evidente cuando se agrega una mezcla de sustrato cromógeno; los resultados se notan a simple vista. Esta técnica es en realidad muy sencilla si se compran las tiras reactivas, de lo contrario se requiere un equipo de electroforesis para preparar geles de poliacrilamida y también un equipo para transferir las proteínas del gel al papel de nitrocelulosa.
+++
Problemas y limitaciones de las técnicas para estudiar antígenos parasitarios
++
En los últimos 20 años se establecieron varias casas comerciales extranjeras que venden en México estuches completos para efectuar la titulación de anticuerpos contra antígenos parasitarios mediante las técnicas descritas en este capítulo. En la mayoría de los casos, dichas casas cambiaron también las técnicas y la fuente de antígenos. Todo esto, aunado al inconveniente del costo y los problemas de especificidad y sensibilidad, representan hoy en día un problema para diseñar y mejorar las pruebas existentes. En esta sección se tratan los dos principales problemas compartidos, en cierta forma, por todas las técnicas descritas: falta de especificidad y de sensibilidad.
+++
Falta de especificidad
++
Este problema se debe en buena medida al uso de extractos antigénicos crudos, es decir, no purificados y, por tanto, no definidos en términos químicos. La presencia de antígenos o proteínas contaminantes del huésped de donde se obtuvieron los parásitos también contribuye a la falta de especificidad. Incluso el cultivo de los parásitos se puede contaminar en el laboratorio con proteínas o componentes del medio de cultivo. Debido a que no existen patrones de referencia de antígenos específicos de los parásitos que sirvan como estándar, se vivió una época de variación entre los resultados publicados por diferentes autores. Este problema se resolverá por completo cuando se disponga de la información completa acerca de los antígenos parasitarios inmunodominantes, que además sean específicos de especie, es decir, que no los compartan diferentes organismos. Una vez identificados, aislados y purificados dichos antígenos, es preciso definir el epítopo o los epítopos contra los cuales están dirigidos los anticuerpos. Esos epítopos o determinantes antigénicos son en general una pequeña porción de una proteína que puede ser sintetizada químicamente para tener siempre una fuente homogénea del mismo material.
++
En algunas parasitosis los investigadores han logrado definir, aislar y purificar determinados antígenos específicos de especie. Algunos de esos antígenos son de naturaleza proteica, por lo cual se pudo obtener la secuencia de aminoácidos de los epítopos pertinentes; con esa información se sintetizaron los péptidos y se resolvieron los problemas de abastecimiento y variación en la composición antigénica. En algunas parasitosis ya se dispone de productos obtenidos de esta forma, pero no existen preparaciones semejantes para todas las parasitosis de interés médico.
+++
Falta de sensibilidad
++
Algunas pruebas, como la aglutinación de partículas de látex o la f loculación de bentonita, ya casi no se utilizan porque es inaceptable la cantidad tan elevada de resultados falsos positivos y negativos que se generan. Algunas compañías comerciales de Estados Unidos, Inglaterra y Alemania vendieron a los países en desarrollo varias pruebas de inmunof luorescencia para el diagnóstico de infecciones, como la enfermedad de Chagas, leishmaniosis y esquistosomosis, que cada vez se utilizan menos debido a su baja sensibilidad. Las pruebas de aglutinación de látex y eritrocitos, aunque permiten conocer el título de anticuerpos contra algunos antígenos parasitarios y fueron de cierta utilidad en el pasado, no reúnen las características de especificidad, sensibilidad, reproducibilidad y estabilidad que se requieren en el laboratorio clínico moderno, por lo cual han caído en desuso.
++
Las pruebas para cuantificar anticuerpos y antígenos parasitarios mejoraron en forma sustancial cuando se emplearon las técnicas inmunoenzimáticas, o ELISA, que se iniciaron en 1972. Esta técnica mejoró en forma notable la sensibilidad de las técnicas previas, ya que se logró combinar la lectura de los resultados con la detección instrumental mediante un espectrofotómetro. Además, el uso de algunos anticuerpos monoclonales contra antígenos parasitarios proporcionó la especificidad necesaria. Esta técnica y algunas de sus variantes lograron aceptación por la versatilidad para adaptarse en la identificación de antígenos y anticuerpos.