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Proteínas recombinantes
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Las técnicas actuales de clonación, expresión y purificación de proteínas in vitro permiten utilizar antígenos específicos para diagnosticar numerosas enfermedades.
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Las proteínas específicas de los parásitos de interés se clonan en vectores de DNA que permiten su expresión y posterior purificación en cantidades adecuadas para ser utilizadas en pruebas de diagnóstico. Reciben el nombre de proteínas recombinantes porque el vector contiene la secuencia de una proteína de fusión, parte de la cual se “recombina” con la proteína clonada durante su transcripción y expresión. Este fragmento permite identificar la proteína blanco y en muchas ocasiones también facilita la purificación (figura 42-6).
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Los antígenos específicos obtenidos por este método se usan en pruebas de diagnóstico específicas para las enfermedades parasitarias. Los métodos más comunes para este fin son la inmunodetección en soportes sólidos (Western blot) y el ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA, Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay).
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En la inmunodetección se transfieren los antígenos específicos a soportes sólidos (papel de nitrocelulosa) y se evalúan (challenge) con el suero de los pacientes sospechosos. Luego se añaden anticuerpos (anticuerpos secundarios) que contienen alguna enzima (por lo regular, peroxidasa o fosfatasa alcalina) y se guían contra las IgG que pudieran haber estado presentes en los sueros de los pacientes que se encuentren unidas a las proteínas específicas. La reacción se revela al añadir el sustrato de la enzima utilizada, lo cual genera una reacción colorimétrica visible en el papel de nitrocelulosa. La aparición de la señal indica las muestras positivas.
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Esta técnica es menos sensible que la de hibridación, pero tiene la ventaja de ser menos costosa, más sencilla y puede aplicarse a varias muestras a la vez porque el papel de nitrocelulosa puede ser cortado en tiras de 0.5 a 1 cm de ancho y servir cada una de ellas para el diagnóstico de un paciente (figura 42-7). También es importante el hecho de que una vez transferida la proteína al papel de nitrocelulosa, es posible almacenar este último a −20 °C o −70 °C por largo tiempo.
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La prueba ELISA se optimizó con el uso de antígenos específicos para el diagnóstico. La prueba se basa en el reconocimiento de los antígenos parasitarios por parte de los anticuerpos presentes en los sueros de los pacientes. El reconocimiento se logra mediante un anticuerpo secundario utilizando el mismo principio del Western blot. Con esta prueba se puede determinar cuantitativamente la reacción antígeno-anticuerpo (figura 42-8). La sensibilidad es similar a la de Western blot, pero la sencillez de la técnica y la facilidad de aplicarla a grandes cantidades de muestras la convierten en la prueba de elección para muchas enfermedades, sobre todo cuando se utiliza en estudios epidemiológicos extensos.
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El punto débil de esta prueba serían las reacciones cruzadas que producen falsos positivos o los falsos negativos obtenidos por no existir una respuesta inmunitaria apropiada en el huésped. Es muy importante contar con controles positivos y negativos que se apliquen en cada prueba practicada. La prueba es muy valiosa si se cuenta con una proteína específica para el parásito que se desee diagnosticar, pero sobre todo que sea una proteína inmunógena que genere una adecuada respuesta inmunitaria en el huésped.
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Las proteínas recombinantes se utilizan para generar anticuerpos específicos que las reconozcan en animales de experimentación. Los anticuerpos específicos generados contra las proteínas de diagnóstico se usan para analizar muestras de tejidos en busca de parásitos intracelulares y de otros microorganismos patógenos. La técnica se basa en la permeabilización de las células del tejido por analizar con objeto de que los anticuerpos entren al espacio intracelular y se unan a las proteínas del parásito que se encuentran en la membrana externa de éste. Después se utilizan anticuerpos secundarios marcados con enzimas colorimétricas, oro coloidal o radiactividad, los cuales sirven para la identificación.
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Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
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A principios de la década de 1970-1979 fue descubierta una polimerasa de DNA que trabaja a elevadas temperaturas, lo que permitió elaborar una de las técnicas más difundidas y utilizadas para diagnosticar numerosas enfermedades de los últimos tiempos. Esta técnica se llama reacción en cadena de la polimerasa (PCR, del inglés polimerase chain reaction). La polimerasa de Thermus aquaticus (polimerasa de Taq) tiene su punto óptimo de actividad a 72 °C y resiste temperaturas de más de 94 °C, lo que permite obtener temperaturas adecuadas para la desnaturalización del DNA y proporciona la oportunidad de alcanzar temperaturas de alineamiento elevadas, lo cual ofrece la facultad de diseñar iniciadores específicos para detectar secuencias de DNAA de los parásitos sujetos a diagnóstico.
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La amplificación exponencial de las secuencias blanco aumenta la sensibilidad del método de manera importante, ya que permite detectar hasta más de 1/20 000 de parásito por muestra que habrá de ser analizada, que puede ser sangre, tejido, orina, líquido cefalorraquídeo, etcétera.
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La técnica se basa en la identificación de una secuencia específica en el genoma del microorganismo de interés y que de preferencia se repita muchas veces en su DNA para que la técnica sea más sensible. Una vez identificada la secuencia, se diseñan iniciadores que la flanqueen, pero que estén dirigidos en sentido contrario entre sí. Se recomienda que éstos contengan cantidades similares de G y C, de modo que la temperatura de alineamiento con la secuencia blanco sea similar, ya que a mayor contenido de G y C, mayor sería la temperatura de alineamiento permitida (figura 42-9). Las muestras de DNA obtenidas del paciente (DNA del paciente y DNA del parásito) se someten a varios ciclos de reacción en presencia de la polimerasa de Taq, cada uno de los cuales consiste en un tiempo de desnaturalización delDNA, que puede ser de 15 segundos a 1 minuto, tiempo de alineamiento cuya temperatura depende del contenido de G y C de los iniciadores (a mayor temperatura, mayor especificidad), y un tiempo de elongación durante el cual se sintetizan las cadenas del DNA blanco. La reacción puede ser de 25 a 40 ciclos, según la abundancia de la secuencia por diagnosticar.
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Otra ventaja que ofrece este método de diagnóstico es la pequeña cantidad de DNA necesario para realizarlo, ya que la reacción exponencial permite utilizar hasta un mínimo de 10 ng de DNA en la reacción. Las desventajas son la necesidad de un equipo especializado y contar con áreas absolutamente especiales para el aislamiento y preparación de las muestras, puesto que un área o un manejo inadecuado puede favorecer con mucha facilidad la contaminación de las muestras, lo que originaría diagnósticos positivos falsos.
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Los productos de la amplificación se observan en geles de agarosa o poliacrilamida, y la presencia de una banda del tamaño esperado se interpreta como una reacción positiva (figura 42-10).
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Una aplicación de la técnica de PCR es su uso en tejidos, lo que recibe el nombre de PCRin situ; esta técnica es muy útil para detectar hasta 10 copias de DNA del parásito por célula en cortes de tejidos frescos o en parafina. Para la técnica se requiere fijar o preparar los tejidos, permeabilizar las membranas celulares y la detección. Los tejidos que están embebidos en parafina primero deben ser tratados para retirar la parafina y los tejidos frescos se fijan con formalina al 10%. La permeabilización de las membranas se realiza de manera enzimática y la reacción de amplificación se lleva a cabo según la técnica normal de PCR. Aunque la metodología puede llegar a detectar hasta una copia de un gen en 1 µg de DNA celular, es necesario contar con un equipo especializado para efectuar la reacción (figura 42-11).
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La PCRin situ es una herramienta invaluable para el diagnóstico de parásitos intracelulares en situaciones donde la infección es tan baja que no puede ser detectada por otros medios, sobre todo cuando los parásitos ya no se encuentran circulando en sangre periférica, como ocurre en el caso de la enfermedad de Chagas. Sin embargo, el costo del equipo para realizarla es un impedimento para utilizar esta técnica en países no desarrollados y laboratorios de investigación.
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Con el avance de las técnicas se han creado paquetes comerciales aplicables en casi cualquier laboratorio de diagnóstico e investigación, por lo que es fácil comprender que cada vez están más al alcance los métodos de vanguardia de diagnóstico molecular, que permitirán establecer diagnósticos certeros y oportunos de las enfermedades parasitarias que aquejan a América Latina. Junto con los programas de salud adecuados, estas herramientas serán útiles para tener una panorámica epidemiológica real de los padecimientos ocasionados por parásitos que sufren los habitantes de estos países, e impulsarán los programas adecuados de control y erradicación de estas enfermedades.
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En 1992, Russell Higuchi y colaboradores describieron una modificación de la técnica de PCR, permitiendo la detección simultánea de más de una secuencia específica de DNA y dando paso al desarrollo de la técnica de PCR en tiempo real.
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La reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (o PCR cuantitativa) permite amplificar y cuantificar en forma absoluta varias secuencias específicas al mismo tiempo. El principio de la técnica se basa en la reacción de PCR, utilizando DNA como molde, deoxinucleótidos, enzima Taq polimerasa (o transcriptasa reversa) y cebadores específicos; sin embargo, la diferencia con la PCR convencional es que la PCR en tiempo real utiliza fluorocromos, que son detectados en diferentes longitudes de onda por los sensores habilitados en un termociclador de tiempo real.
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Cada señal es medida en cada ciclo de amplificación, lo que le da la característica de ser una medición “en tiempo real”, y cada fluorómetro utilizado representa la amplificación de una secuencia específica.
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Entre las ventajas que presenta el PCR en tiempo real comparado con el PCR convencional pueden mencionarse la capacidad de análisis simultáneo de más de una secuencia específica, su mayor sensibilidad (que reduce el riesgo de falsos negativos), menor tiempo requerido para el resultado y menor probabilidad de contaminación, con lo que disminuye los falsos positivos.
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Las aplicaciones del PCR en tiempo real incluyen la determinación de la carga viral (bacteriana o parasitológica) en una unidad biológica (sangre, líquido cefalorraquídeo, etc.), diagnóstico rápido y certero de varias patologías en una sola reacción, determinación de la expresión génica, detección de polimorfismos genéticos, medicina forense, identificación de organismos genéticamente modificados, entre otras muchas nuevas aplicaciones que cada día se describen en la literatura.