Capítulo 42: Técnicas moleculares para el estudio de parásitos

El avance en el conocimiento de los procesos moleculares que ocurren en los organismos eucariotas y procariotas tuvo gran impulso en los últimos años debido al perfeccionamiento de innumerables técnicas moleculares. En el campo de la parasitología por fin se pudieron estudiar los procesos básicos que ocurren en los parásitos con objeto de desarrollar estrategias más eficaces de control, prevención y erradicación de enfermedades que afectan a las diferentes poblaciones del mundo.

Una de las principales aportaciones de la tecnología molecular es la generación de métodos de diagnóstico más sensibles y específicos para identificar a los patógenos que afectan a las diferentes especies de animales y plantas de interés económico, pero sobre todo al ser humano.

Con el fin de controlar los brotes de enfermedades entre la población humana y en mamíferos de importancia económica, se pusieron en marcha sistemas de vigilancia epidemiológica a nivel estatal y nacional en México, los cuales se beneficiaron con el perfeccionamiento de las técnicas de biología molecular para establecer diagnósticos apropiados y tempranos. Antes de esta etapa, que se podría llamar “era molecular”, los métodos de diagnóstico existentes se basaban en la observación directa de los microorganismos y en la utilización de las reacciones inmunológicas que generaban en el huésped, como las intradermorreacciones, y el desarrollo de métodos de detección de anticuerpos (p. ej., prueba ELISA), hemaglutinación directa e indirecta (HA) e inmunofluorescencia (IF).

Aunque estos métodos son confiables y ofrecen valores adecuados de especificidad y sensibilidad, las reacciones cruzadas producían errores en los diagnósticos y originaban la necesidad de recurrir a varias pruebas para establecer la causa exacta de la enfermedad en cuestión. Con el surgimiento de las técnicas moleculares se alcanzaron nuevas fronteras de especificidad y se aumentó la sensibilidad de las pruebas hasta poder detectar 1/12 000 de parásito, es decir, hasta 0.025 fentogramos de DNA en muestra de sangre (2.5 × 10⁻⁸ g).

En este capítulo se tratan primero las técnicas moleculares más comunes que se utilizan en la actualidad para las pruebas de diagnóstico. Debido a su sensibilidad, especificidad o facilidad de administración, estas técnicas demostraron ser muy útiles en la lucha contra diversas enfermedades parasitarias y se aplican de manera rutinaria en varios laboratorios a lo largo del territorio mexicano. Por último, se describen brevemente algunas técnicas para estudiar los parásitos, que conducen al entendimiento de los procesos básicos que regulan el desarrollo, el ciclo de vida, los mecanismos de invasión y la relación que establecen con sus huéspedes.

Hibridación

En muchas ocasiones es posible encontrar fragmentos de ácido desoxirribonucleico (DNA) en el genoma de los microorganismos, los cuales pueden servir de sondas para identificar específicamente la presencia del DNA del parásito en las muestras de los pacientes. La detección se logra por hibridación en soportes sólidos utilizando papel de nitrocelulosa o de nailon (Southern blot), en condiciones de temperatura y salinidad que permitan sólo el emparejamiento de la sonda con la secuencia complementaria específica.

En este método se requiere identificar la secuencia específica en el genoma del parásito, y conservarla y propagarla para obtener suficientes copias utilizando una molécula de DNA llamada plásmido. El plásmido es una molécula de DNA circular de doble cadena que se encuentra en forma natural en varias especies de bacterias. Son elementos génicos extracromosómicos que poseen la información necesaria para replicarse dentro de las bacterias, y que codifican para enzimas que confieren alguna ventaja a los microorganismos que los poseen. Entre esas enzimas se pueden encontrar genes con resistencia a algún antibiótico, lo cual permite seleccionar a las bacterias que los presentan (figura 42-1).

Una vez amplificada la secuencia se retira el plásmido por medio de enzimas de restricción, las cuales reconocen secuencias específicas que flanquean a la sonda y la liberan. Cuando la sonda es liberada, se separa y purifica eliminando el resto del plásmido mediante electroforesis en geles de agarosa; por último, se “marca” por diversos métodos (figura 42-2). La “marca” de la sonda se efectúa utilizando nucleótidos que contienen una molécula, la cual sirve para identificarla más tarde; dicha molécula puede ser un isótopo radiactivo, una enzima para una reacción colorimétrica o una para luminiscencia química. Por otra parte, el DNA extraído de la muestra es digerido con las enzimas de restricción y se transfiere a un soporte sólido (que por lo regular es un papel de nitrocelulosa o nailon), para que esté inmovilizado y expuesto a la sonda de diagnóstico. La presencia de una señal que produce la sonda indica que la reacción es positiva (figuras 42-3 y 42-4).

La técnica permite analizar varias muestras a la vez, lo que agiliza el proceso y reduce el costo. Cuando la efectividad de la sonda es indiscutible se puede utilizar una variante de esta técnica, consistente en usar gotas de los DNA que serán analizados; las gotas se colocan en los soportes sólidos y se someten a evaluación (challenge) con la sonda previamente marcada (figura 42-5).

Hibridación in situ

La hibridación in situ es una herramienta utilizada para detectar y localizar secuencias de ácido nucleico en preparaciones de tejido. Se puede utilizar para detectar DNA y ácido ribonucleico (RNA); además, proporciona información acerca del sitio de la expresión de genes, del análisis de la distribución y localización de microorganismos intracelulares, así como del mapeo de cromosomas, entre otros. Es posible aplicar métodos radiactivos, fluorescentes, directos con oro coloidal o colorimétricos, y ya se perfeccionaron métodos para diagnóstico en tejidos con parafina y sin ella.

Al igual que en la hibridación en soportes sólidos, es necesario contar con una sonda específica para la hibridación in situ, la cual se marca mediante el mismo método con nucleótidos que contienen los isótopos radiactivos, las enzimas o el oro coloidal para poder detectarla después.

Proteínas recombinantes

Las técnicas actuales de clonación, expresión y purificación de proteínas in vitro permiten utilizar antígenos específicos para diagnosticar numerosas enfermedades.

Las proteínas específicas de los parásitos de interés se clonan en vectores de DNA que permiten su expresión y posterior purificación en cantidades adecuadas para ser utilizadas en pruebas de diagnóstico. Reciben el nombre de proteínas recombinantes porque el vector contiene la secuencia de una proteína de fusión, parte de la cual se “recombina” con la proteína clonada durante su transcripción y expresión. Este fragmento permite identificar la proteína blanco y en muchas ocasiones también facilita la purificación (figura 42-6).

Los antígenos específicos obtenidos por este método se usan en pruebas de diagnóstico específicas para las enfermedades parasitarias. Los métodos más comunes para este fin son la inmunodetección en soportes sólidos (Western blot) y el ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA, Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay).

Inmunodetección

En la inmunodetección se transfieren los antígenos específicos a soportes sólidos (papel de nitrocelulosa) y se evalúan (challenge) con el suero de los pacientes sospechosos. Luego se añaden anticuerpos (anticuerpos secundarios) que contienen alguna enzima (por lo regular, peroxidasa o fosfatasa alcalina) y se guían contra las IgG que pudieran haber estado presentes en los sueros de los pacientes que se encuentren unidas a las proteínas específicas. La reacción se revela al añadir el sustrato de la enzima utilizada, lo cual genera una reacción colorimétrica visible en el papel de nitrocelulosa. La aparición de la señal indica las muestras positivas.

Esta técnica es menos sensible que la de hibridación, pero tiene la ventaja de ser menos costosa, más sencilla y puede aplicarse a varias muestras a la vez porque el papel de nitrocelulosa puede ser cortado en tiras de 0.5 a 1 cm de ancho y servir cada una de ellas para el diagnóstico de un paciente (figura 42-7). También es importante el hecho de que una vez transferida la proteína al papel de nitrocelulosa, es posible almacenar este último a −20 °C o −70 °C por largo tiempo.

Prueba ELISA

La prueba ELISA se optimizó con el uso de antígenos específicos para el diagnóstico. La prueba se basa en el reconocimiento de los antígenos parasitarios por parte de los anticuerpos presentes en los sueros de los pacientes. El reconocimiento se logra mediante un anticuerpo secundario utilizando el mismo principio del Western blot. Con esta prueba se puede determinar cuantitativamente la reacción antígeno-anticuerpo (figura 42-8). La sensibilidad es similar a la de Western blot, pero la sencillez de la técnica y la facilidad de aplicarla a grandes cantidades de muestras la convierten en la prueba de elección para muchas enfermedades, sobre todo cuando se utiliza en estudios epidemiológicos extensos.

El punto débil de esta prueba serían las reacciones cruzadas que producen falsos positivos o los falsos negativos obtenidos por no existir una respuesta inmunitaria apropiada en el huésped. Es muy importante contar con controles positivos y negativos que se apliquen en cada prueba practicada. La prueba es muy valiosa si se cuenta con una proteína específica para el parásito que se desee diagnosticar, pero sobre todo que sea una proteína inmunógena que genere una adecuada respuesta inmunitaria en el huésped.

Radioinmunoensayo

Las proteínas recombinantes se utilizan para generar anticuerpos específicos que las reconozcan en animales de experimentación. Los anticuerpos específicos generados contra las proteínas de diagnóstico se usan para analizar muestras de tejidos en busca de parásitos intracelulares y de otros microorganismos patógenos. La técnica se basa en la permeabilización de las células del tejido por analizar con objeto de que los anticuerpos entren al espacio intracelular y se unan a las proteínas del parásito que se encuentran en la membrana externa de éste. Después se utilizan anticuerpos secundarios marcados con enzimas colorimétricas, oro coloidal o radiactividad, los cuales sirven para la identificación.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

A principios de la década de 1970-1979 fue descubierta una polimerasa de DNA que trabaja a elevadas temperaturas, lo que permitió elaborar una de las técnicas más difundidas y utilizadas para diagnosticar numerosas enfermedades de los últimos tiempos. Esta técnica se llama reacción en cadena de la polimerasa (PCR, del inglés polimerase chain reaction). La polimerasa de Thermus aquaticus (polimerasa de Taq) tiene su punto óptimo de actividad a 72 °C y resiste temperaturas de más de 94 °C, lo que permite obtener temperaturas adecuadas para la desnaturalización del DNA y proporciona la oportunidad de alcanzar temperaturas de alineamiento elevadas, lo cual ofrece la facultad de diseñar iniciadores específicos para detectar secuencias de DNAA de los parásitos sujetos a diagnóstico.

La amplificación exponencial de las secuencias blanco aumenta la sensibilidad del método de manera importante, ya que permite detectar hasta más de 1/20 000 de parásito por muestra que habrá de ser analizada, que puede ser sangre, tejido, orina, líquido cefalorraquídeo, etcétera.

La técnica se basa en la identificación de una secuencia específica en el genoma del microorganismo de interés y que de preferencia se repita muchas veces en su DNA para que la técnica sea más sensible. Una vez identificada la secuencia, se diseñan iniciadores que la flanqueen, pero que estén dirigidos en sentido contrario entre sí. Se recomienda que éstos contengan cantidades similares de G y C, de modo que la temperatura de alineamiento con la secuencia blanco sea similar, ya que a mayor contenido de G y C, mayor sería la temperatura de alineamiento permitida (figura 42-9). Las muestras de DNA obtenidas del paciente (DNA del paciente y DNA del parásito) se someten a varios ciclos de reacción en presencia de la polimerasa de Taq, cada uno de los cuales consiste en un tiempo de desnaturalización delDNA, que puede ser de 15 segundos a 1 minuto, tiempo de alineamiento cuya temperatura depende del contenido de G y C de los iniciadores (a mayor temperatura, mayor especificidad), y un tiempo de elongación durante el cual se sintetizan las cadenas del DNA blanco. La reacción puede ser de 25 a 40 ciclos, según la abundancia de la secuencia por diagnosticar.

Otra ventaja que ofrece este método de diagnóstico es la pequeña cantidad de DNA necesario para realizarlo, ya que la reacción exponencial permite utilizar hasta un mínimo de 10 ng de DNA en la reacción. Las desventajas son la necesidad de un equipo especializado y contar con áreas absolutamente especiales para el aislamiento y preparación de las muestras, puesto que un área o un manejo inadecuado puede favorecer con mucha facilidad la contaminación de las muestras, lo que originaría diagnósticos positivos falsos.

Los productos de la amplificación se observan en geles de agarosa o poliacrilamida, y la presencia de una banda del tamaño esperado se interpreta como una reacción positiva (figura 42-10).

PCR in situ

Una aplicación de la técnica de PCR es su uso en tejidos, lo que recibe el nombre de PCRin situ; esta técnica es muy útil para detectar hasta 10 copias de DNA del parásito por célula en cortes de tejidos frescos o en parafina. Para la técnica se requiere fijar o preparar los tejidos, permeabilizar las membranas celulares y la detección. Los tejidos que están embebidos en parafina primero deben ser tratados para retirar la parafina y los tejidos frescos se fijan con formalina al 10%. La permeabilización de las membranas se realiza de manera enzimática y la reacción de amplificación se lleva a cabo según la técnica normal de PCR. Aunque la metodología puede llegar a detectar hasta una copia de un gen en 1 µg de DNA celular, es necesario contar con un equipo especializado para efectuar la reacción (figura 42-11).

La PCRin situ es una herramienta invaluable para el diagnóstico de parásitos intracelulares en situaciones donde la infección es tan baja que no puede ser detectada por otros medios, sobre todo cuando los parásitos ya no se encuentran circulando en sangre periférica, como ocurre en el caso de la enfermedad de Chagas. Sin embargo, el costo del equipo para realizarla es un impedimento para utilizar esta técnica en países no desarrollados y laboratorios de investigación.

Con el avance de las técnicas se han creado paquetes comerciales aplicables en casi cualquier laboratorio de diagnóstico e investigación, por lo que es fácil comprender que cada vez están más al alcance los métodos de vanguardia de diagnóstico molecular, que permitirán establecer diagnósticos certeros y oportunos de las enfermedades parasitarias que aquejan a América Latina. Junto con los programas de salud adecuados, estas herramientas serán útiles para tener una panorámica epidemiológica real de los padecimientos ocasionados por parásitos que sufren los habitantes de estos países, e impulsarán los programas adecuados de control y erradicación de estas enfermedades.

PCR en tiempo real

En 1992, Russell Higuchi y colaboradores describieron una modificación de la técnica de PCR, permitiendo la detección simultánea de más de una secuencia específica de DNA y dando paso al desarrollo de la técnica de PCR en tiempo real.

La reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (o PCR cuantitativa) permite amplificar y cuantificar en forma absoluta varias secuencias específicas al mismo tiempo. El principio de la técnica se basa en la reacción de PCR, utilizando DNA como molde, deoxinucleótidos, enzima Taq polimerasa (o transcriptasa reversa) y cebadores específicos; sin embargo, la diferencia con la PCR convencional es que la PCR en tiempo real utiliza fluorocromos, que son detectados en diferentes longitudes de onda por los sensores habilitados en un termociclador de tiempo real.

Cada señal es medida en cada ciclo de amplificación, lo que le da la característica de ser una medición “en tiempo real”, y cada fluorómetro utilizado representa la amplificación de una secuencia específica.

Entre las ventajas que presenta el PCR en tiempo real comparado con el PCR convencional pueden mencionarse la capacidad de análisis simultáneo de más de una secuencia específica, su mayor sensibilidad (que reduce el riesgo de falsos negativos), menor tiempo requerido para el resultado y menor probabilidad de contaminación, con lo que disminuye los falsos positivos.

Las aplicaciones del PCR en tiempo real incluyen la determinación de la carga viral (bacteriana o parasitológica) en una unidad biológica (sangre, líquido cefalorraquídeo, etc.), diagnóstico rápido y certero de varias patologías en una sola reacción, determinación de la expresión génica, detección de polimorfismos genéticos, medicina forense, identificación de organismos genéticamente modificados, entre otras muchas nuevas aplicaciones que cada día se describen en la literatura.

Bancos genómicos y de DNA complementario (DNAC)

Los bancos genómicos y de DNAC son representaciones del material genético de los organismos. Los bancos genómicos se generan con el DNA total de las células, y en ellos se encuentra la representación de la totalidad del material genético. Respecto de los bancos de DNAC, éstos se crean utilizando el RNA (total o mensajero) y son bancos de expresión, es decir, contienen las secuencias que se expresan en un momento determinado en condiciones específicas.

En estos bancos se pueden localizar las secuencias que codifican para los genes de interés en cierto estudio mediante sondas moleculares e hibridación (ya explicadas) y anticuerpos específicos (figura 42-12). La metodología es similar a la descrita para Southern blot y Western blot, respectivamente, en donde primero se obtiene una réplica de DNA o de las proteínas expresadas en soportes sólidos, se fija a la membrana y se evalúan (challenge) con las sondas o anticuerpos de elección.

Con estas herramientas es posible efectuar un estudio sistemático del contenido del material genético y de las proteínas que se expresan en ciertas condiciones controladas. De igual forma, los bancos de DNAC son la fuente ideal para la búsqueda de proteínas específicas que podrían servir para la generación de vacunas, fármacos o nuevos métodos de diagnóstico.

Análisis de polimorfismos génicos

En muchas ocasiones es importante determinar las relaciones filogenéticas o taxonómicas que presentan ciertos parásitos. El análisis del polimorfismo génico se basa en la comparación de las diferencias que presentan los genomas de los parásitos entre sí o entre especies relacionadas.

Entre los métodos más utilizados para este fin está la amplificación al azar del DNA polimórfico (RAPD, del inglés random amplification polimorphic DNA), que consiste en amplificar de modo exponencial el DNA genómico utilizando la técnica de PCR con hexanucleótidos con secuencias arbitrarias. Estas secuencias servirán de iniciadores en la reacción de PCR para amplificar fragmentos de DNA al azar, que luego se comparan en un gel de agarosa (figura 42-13).

Otro método es el del polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP, del inglés restriction fragment lenght polimorphism). La técnica se basa en la utilización de enzimas de restricción, las cuales reconocen secuencias específicas dentro del DNA. La presencia o ausencia de esas secuencias produce fragmentos de diferentes tamaños, que después se analizan en geles de agarosa.

Los espaciadores del cistrón ribosómico, así como el DNA de microsatélites, son otras técnicas utilizadas para este tipo de análisis, ya sea a través de hibridaciones con sondas específicas o por medio de PCR.

Secuenciación

La obtención de la secuencia de fragmentos de DNA de interés es otro método ampliamente empleado en el estudio de parásitos y otros organismos. Este método se basa en el uso de geles de poliacrilamidasa de alta resolución que permiten separar cadenas sencillas de DNA de entre 300 y 1 000 bases con diferencias de un nucleótido entre ellas (figura 42-14). Conocer la secuencia de nucleótidos de un fragmento de DNA particular permite, entre otras cosas, traducir la secuencia de aminoácidos presentes en la proteína en cuestión, ejecutar comparaciones con otras secuencias provenientes de especies relacionadas con el fin de determinar el sitio adecuado para generar un método de diagnóstico específico, producir las proteínas recombinantes para analizar la función que podrían presentar dentro del parásito en estudio y muchas otras aplicaciones prácticas.

La secuenciación se emplea cuando existe duda acerca del origen de una secuencia de DNA en particular, pero no es un método diagnóstico, sino principalmente una técnica de apoyo.

Transcripción inversa/PCR (RT-PCR)

La transcripción inversa es el proceso mediante el cual se genera una molécula de DNA a partir de una de RNA, es decir, lo contrario del proceso básico que ocurre normalmente. El descubrimiento de la transcriptasa inversa, una enzima codificada en el genoma de un virus, dio origen a este método que permite la generación de los bancos de DNAC ya descritos y a otros que se usan en el estudio de los procesos moleculares. Entre ellos se encuentra la RT-PCR. Dicha técnica combina la transcripción inversa con la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (figura 42-15).

Con esta técnica es posible detectar la presencia de cantidades muy pequeñas de la secuencia codificadora de algún gen en particular por medio del empleo de los iniciadores adecuados. Por esta particularidad, en algunos casos se utiliza como método de diagnóstico de algunas enfermedades; sin embargo, por ser el RNA una molécula muy lábil que puede degradarse con mucha facilidad, es necesario contar con espacios adecuados para trabajar, sustancias que inhiban la enzima RN-asa y muchas otras condiciones que sólo permiten la aplicación de la técnica en laboratorios especializados.

Expresión diferencial

En ciertas condiciones los genes de los parásitos se expresan de manera regulada, es decir, pueden presentar una expresión diferencial. Los métodos y técnicas moleculares permiten controlar y medir esta expresión diferencial en condiciones de laboratorio en los parásitos en cultivo, sobre todo cuando se cuenta con una proteína clonada en un vehículo de expresión. En este último caso, el comportamiento de la expresión de la proteína se mide de modo directo en el mismo parásito, o en un huésped indirecto, que puede ser otro parásito o una bacteria.

Uno de los métodos existentes para realizar este tipo de análisis es el de la exposición diferencial (differencial display), en donde puede observarse la expresión diferencial de ciertos genes en respuesta a condiciones controladas y compararlos con los controles. Esta técnica permite conocer algunos aspectos del comportamiento a nivel molecular que presenta el parásito en respuesta a los diferentes estímulos externos. La técnica se basa en la amplificación exponencial de una secuencia o secuencias de DNA obtenido del parásito en condiciones controladas y la utilización de geles de secuenciación en donde se observa en forma simultánea el aumento o la disminución en la expresión de un gen o genes.

Aunque hasta el momento no se vislumbran límites en el desarrollo de nuevas técnicas de biología molecular que refuercen el conocimiento de los procesos biológicos de los parásitos, su uso y los beneficios que traen consigo siempre estarán sujetos a los costos de aplicación. Sin embargo, es innegable el hecho de que han aportado grandes ventajas al género humano en su lucha contra los organismos patógenos que lo aquejan.

Detección de fluorescencia

Existen tres métodos principales para el monitoreo por fluorescencia de la amplificación de DNA:

1. Hidrólisis de iniciadores. Permite la liberación y detección de fluorómetros, los cuales son detectados por equipos especiales y se genera lo que se conoce como PCR en tiempo real.

   Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real. El desarrollo de mejores equipos de PCR con la capacidad de detectar señales luminiscentes de diversos tipos ha dado lugar al desarrollo de una nueva técnica utilizada en el diagnóstico y cuantificación de diversos organismos: la PCR en tiempo real. Esta técnica, junto con el RT-PCR en tiempo real, es de utilidad para el diagnóstico y cuantificación de virus, bacterias y parásitos de importancia médica. La capacidad de detección de este método supera incluso a la de un PCR común. La cuantificación de virus en una carga viral puede ser tan exacta como la de un virus/ml de sangre si las condiciones se encuentran controladas y estandarizadas. Incluso se pueden utilizar varios tipos de fluorómetros a la vez para realizar pruebas “Multiplex”, en donde se utilizan iniciadores de diferentes enfermedades, o variantes serológicas de una misma, con marcadores fluorimétricos diferentes, y la amplificación puede ser monitoreada desde el momento en que comience el aumento exponencial de la secuencia blanco (figura 42-16).

2. Agentes de unión al DNA. La utilización de agentes fluorimétricos que tienen la capacidad de unir DNA es otra manera de realizar la PCR en tiempo real. Estos agentes emiten una señal fluorimétrica que es detectada por el mismo equipo que se utiliza en la hidrólisis de DNA. La desventaja de estos agentes en comparación con el que utiliza la hidrólisis es que puede haber una luminiscencia inespecífica. La ventaja es que no se tienen que diseñar iniciadores especiales, ya que los que se utilizan en una reacción normal de PCR pueden usarse para una reacción de tiempo real con el agente de unión al DNA.

3. Sondas de hibridación. Las sondas de hibridación son secuencia de DNA complementarias a secuencias blanco que se deseen utilizar para el diagnóstico de microorganismos. Las sondas de hibridación trabajan con fluoróforos que son excitados por las longitudes de onda apropiadas, y emiten luminiscencia cuando se encuentran hibridadas con las secuencias blanco. Esta luminiscencia se incrementa con cada ciclo.

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