Capítulo 43: Técnicas para visualización de parásitos mediante microscopia

La observación microscópica de los microorganismos es una necesidad en el campo de la parasitología. Se le utiliza para fines de diagnóstico o investigación; para ello se usan microscopios sencillos y complejos que sean funcionales para los fines de observación que se persiguen. Por consiguiente, cualquier avance o aspecto técnico de la microscopia impacta la forma de observación y la información que de ella se obtenga. Las tecnologías de observación microscópica están en continua evolución, pues con frecuencia se busca obtener las mejores imágenes, la mejor definición para apreciar los detalles con el mayor aumento posible, observaciones en tiempo real y las imágenes más reales que impliquen menor manipulación de las muestras por observar. Bajo estas circunstancias se considera que habría mejor posibilidad de comprender mejor lo que sucede en el ámbito microscópico de los organismos en estudio.

Las formas de observación varían por las estrategias que se emplean y van desde la observación a nivel micrométrico hasta el nanométrico; por consiguiente, se requieren diferentes tipos de microscopio, como el fotónico y el electrónico (tanto el de barrido como el de transmisión y el de energía atómica). Con tales tecnologías de observación los microorganismos pueden ser analizados inmediatamente después de algún tratamiento y no sólo de manera superficial, sino que es posible explorar su interior o el de las células o tejidos (Tsien, 2003). La decisión de la estrategia depende del estado, profundidad, rapidez y resolución de observación de lo que se desea; por ejemplo, si es necesario observar la muestra a bajo aumento sin recibir tratamiento alguno y de forma inmediata, se requerirá de un sistema de microscopia fotónica en la que se empleen sistemas en los que varía la intensidad o la composición de la luz que se hace incidir. Sin embargo, si se desea observar a mayor aumento (a nivel nanométrico), es posible hacerlo sin que se trate a la muestra mediante la microscopia de energía atómica o la microscopia electrónica de barrido por ultracongelación rápida. De hecho, en los últimos años, mediante la microscopia electrónica de transmisión combinada con la congelación ultrarrápida (tomografía crioelectrónica) se obtienen imágenes seriadas con las que se generan reconstrucciones de los componentes interiores de los organismos y con las imágenes reconstruidas es posible visualizar su interior desde diferentes ángulos.

Ya es posible correlacionar lo obtenido en las reconstrucciones digitales mediante la microscopia electrónica con lo visto para las mismas muestras por microscopia de fluorescencia; esto implica que hay posibilidades de integrar los niveles de observación microscópica con la nanoscópica (Lucic et al. 2008). Sin embargo, esto no significa que el poder de la resolución de los microscopios ópticos sea suficiente para alcanzar visualizaciones en los niveles ultraestructurales. El hecho de contar con tecnología de video y fotografía digital, que permiten mejorar las amplificaciones de las imágenes, no mejora la resolución; lo único que se consigue es superar la definición de las imágenes. A pesar de ello, cuando se combinan las observaciones por microscopia de fluorescencia con videomicroscopia bajo condiciones especiales, se ha demostrado que es posible alcanzar niveles de observación nanométrica (Westphal et al., 2008). No está lejano el día en que esto pueda ser aplicado para observar cómo los parásitos invaden las células o tejidos, o la manera en que se multiplican.

En la actualidad no sólo es posible la observación de imágenes fijas y, con apoyo en ellas, intentar definir su dinámica o funcionalidad. El desarrollo de la videomicroscopia, su acoplamiento a la microscopia de fluorescencia (entre la que ya se incluye la microscopia multifotónica) y el desarrollo de marcadores fluorescentes que pueden ser adicionados a los organismos en estudio, o que han sido introducidos como promotores dentro de su genoma (marcadores intravitales), ha abierto un campo de observación excitante que permite no sólo la grabación de imágenes con la dinámica de los organismos en tiempo real, sino que es posible determinar el comportamiento de componentes estructurales definidos durante el movimiento de los organismos y los cuales no sólo pueden ser observados en células aisladas y mantenidas en cultivo in vitro, sino incluso dentro de los tejidos u órganos, como en el caso de las células del sistema inmune y los nódulos linfáticos, tal como podría presentarse en la vida real (Nitschke et al., 2008).

Independientemente del método de observación, en la actualidad las imágenes pueden ser manejadas como se desee; se adquieren de forma simple, pueden ser almacenadas en el formato más conveniente y, cuando se les requiera y con apego a la ética, es factible editarlas para fines de investigación, educativos o de difusión. Asimismo, con la tecnología actual, las observaciones se pueden mejorar, analizar, ampliar o detallar mediante estrategias digitales, y que a simple vista podrían resultar invisibles o difíciles de destacar en un mar de estructuras distintas. El ejemplo más representativo de la evolución que ha tenido la observación microscópica está asociado con el desarrollo de la tecnología computacional; hace unos años las imágenes obtenidas con microscopios convencionales tenían que ser capturadas y editadas mediante trabajo manual fotográfico, lo que hacía de las imágenes obtenidas un verdadero trabajo artesanal, pues el trabajo mediante computadoras aún no había evolucionado lo suficiente ni era del dominio público. Los cuartos oscuros eran una infraestructura necesaria para ello y se requería invertir mucho tiempo en la búsqueda de las mejores imágenes. De hecho, como no existía la posibilidad de hacer filmaciones y llevar el registro de las secuencias observadas, se recurría al dibujo para ilustrar lo observado.

Con la tecnología moderna, ahora no sólo se adquieren las imágenes en tiempo real, sino que incluso es posible reconstruir y obtener animaciones dinámicas que ilustran lo observado, pues los libretos de las historias de la dinámica de lo que sucede a nivel microscópico ya están escritos y sólo falta encontrar la forma de presentarlo (McGill, 2008). En el campo de la parasitología se han generado diversas animaciones mediante las cuales se ilustran fenómenos como la infección por los parásitos que producen la malaria.^1,2

Los sistemas de observación indicados facilitan la obtención de imágenes de gran calidad y su captura, almacenaje y edición resultan de lo más sencillo, con lo que es posible disponer de ellas cuando se les requiera. Adicionalmente a la forma de obtención de las imágenes, con la tecnología actual también es posible mejorar las observaciones gracias a las innovaciones digitales, esto permite observar estructuras que no son perceptibles a simple vista o que no destacan entre infinidad de distintas estructuras. En el pasado tampoco era factible realizar filmaciones mediante videomicroscopia y registrar tales imágenes con la precisión con que se obtienen hoy en día. Es tal el avance de la tecnología actual que las imágenes obtenidas pueden ser analizadas, reconstruidas, proyectadas y hasta visualizadas en tres dimensiones (3D) con la aplicación de paquetes computacionales. Tales paquetes hacen posible realizar viajes virtuales al interior de las células y los tejidos, e incluso generar animaciones de lo observado, como se ha venido haciendo con Plasmodium falciparum (Wickert, Krohne, 2007). Este tipo de estrategias tiene un potencial importante que podrá encontrar su aplicación en todos los aspectos de la biomedicina relacionados con la investigación científica, la docencia o la difusión.

Con la finalidad de ofrecer mejores opciones de observación microscópica y mostrar las diferentes formas de observación disponibles tanto en microscopia fotónica como electrónica, se han generado sitios en internet que permiten manejar en forma interactiva la información y en donde es posible encontrar simulaciones en tiempo real, con ejemplos abiertos a todo público que muestran situaciones de diversos tipos de observación microscópica y el alcance de las mismas.^3,4 Con la finalidad de presentar la información visual de lo que se logra paso a paso mediante la microscopia y otras estrategias experimentales, y que no puede ser presentada de manera dinámica en publicaciones convencionales, surgió una revista electrónica: Journal of Visualized Experiments.⁵ Sin embargo, en la mayoría de las revistas especializadas de parasitología ya se ofrece material suplementario en video.

La evolución de la tecnología asociada con los microscopios ha sido tal que en el caso de la microscopia de campo claro, con el uso de microchips, no hay necesidad de hacer observaciones directas de las muestras y, por consiguiente, no se requiere emplear oculares ni otros elementos ópticos de un microscopio convencional. Parece paradójico que se hagan observaciones microscópicas sin recurrir para ello a un microscopio clásico. Este tipo de observación presenta varias ventajas en comparación con la observación clásica, entre ellas las siguientes: a) las observaciones ya no son individualizadas; b) no requieren de la capacidad visual del observador; c) hay mayor precisión en la estimación del tamaño y la forma de las estructuras u organismos que se observan; d) los registros de las imágenes se realizan de manera digital, lo cual permite su mejor preservación y optimización con programas computacionales de acceso público o particular. La observación con el sistema de microscopia sin microscopio se efectúa tanto con sistema fotónico como electrónico. La observación con sistema electrónico se basa en el uso de monitores.

El microscopio optofluídico (OFM, del inglés optofluidic microscopy) es un equipo desarrollado recientemente y equivale a un microscopio de campo claro que integra la tecnología microfluida y una técnica de óptica basada en apertura que permite efectuar observaciones de alta resolución en un equipo de bajo costo para capturar imágenes microscópicas. Este sistema registra y almacena en un chip lo que el equipo “ve” a lo largo de un canal que conduce una microcorriente fluida que se observa a través de pequeños agujeros en la base del canal. Una vez decodificada la señal se reconstruye lo observado y logran “visualizarse” hasta las estructuras internas de los organismos. Debido a que con esta tecnología se logran observaciones de cientos de nanómetros, se le considera como un microscopio óptico de alta resolución contenido en un chip (Heng et al., 2006). Su costo es tan bajo y su tamaño tan compacto que se ha considerado que este aparato debería ser imprescindible en los maletines de laboratorios portátiles, los cuales serían de suma utilidad en casos de epidemias, guerras o hasta viajes espaciales; este tipo de microscopia es aún incipiente en el campo de la parasitología. Se ha reportado la utilidad del sistema en la observación del nematodo Caenorhabditis elegans (Lee et al., 2008), así como de trofozoítos y quistes de Gardia lamblia (Lee et al., 2009), para el cual se ha encontrado que tiene un plano focal de resolución de 0.8 micras (figura 43-1). Se considera que este sistema de observación es de uso potencial en la investigación biomédica y cuya tecnología puede ser usada de forma autónoma, con bajo costo y con un equipo compacto para monitorear suplementos de agua o alimentos y para realizar diagnósticos.

Es un sistema de observación que está consolidándose como una herramienta indispensable para la captura y el registro de sucesos microscópicos mediante microfilmaciones. El sistema está constituido por un microscopio compuesto de filtros de luz definidos (para generar observaciones bajo contraste de fases o de contraste de interferencia diferencial), así como una videocámara sofisticada equipada con dispositivo CCD (del inglés charge-coupled device, o circuito de cargas eléctricas interconectadas) que requiere ser enfriada y con la calidad necesaria para filmar películas con alta sensibilidad y durante largos periodos. Algunos ejemplos de videofilmaciones microscópicas obtenidas bajo las condiciones indicadas pueden ser consultadas en internet.

La videomicroscopia se ha convertido en una herramienta vital y necesaria en el campo de la parasitología (junto con la combinación de técnicas microscópicas de fluorescencia, las cuales se refieren más adelante) para visualizar y registrar las interacciones entre patógenos y sus hospederos. Con esta tecnología no sólo se ha registrado el comportamiento de los patógenos aislados, sino que también es posible monitorearlos y determinar su conducta directamente en los tejidos en que se encuentren, principalmente cuando a los organismos se les ha aplicado algún tipo de marcaje intravital, lo que reviste gran importancia para la mayor comprensión de los procesos infecciosos (Melican, Richter-Dahlfors, 2009). Diversos trabajos publicados refuerzan la importancia de visualizar el marcaje intravital de los parásitos y su seguimiento dentro de sus hospederos. Además, dicha estrategia es útil porque permite evaluar directamente el efecto de sustancias preparadas con fines terapéuticos, como en los casos de Schistosoma mansoni o de Leishmaniasis murina (Mehta et al., 2008).

El empleo de esta tecnología ha demostrado de manera contundente su utilidad, cuyo uso en el campo de la microscopia depende de los requerimientos de la observación. Entre las variantes de la microscopia basada en fluorescencia destacan la de epifluorescencia de amplio campo, la de barrido confocal y la multifotónica (Lang et al., 2009). Sin embargo, el empleo de todas ellas se basa en la utilización de marcadores fluorescentes sintéticos o biosintéticos, los cuales sin duda han favorecido los estudios de la dinámica de localización de moléculas definidas en células vivas y permitido un incremento en la comprensión de los procesos celulares (Asan, Drenchkhahn, 2008). Los marcadores fluorescentes sintéticos por lo general están elaborados con proteínas o sustancias específicas conjugadas a fluoróforos, los cuales poseen una composición química que les permite emitir luz fluorescente cuando incide en ellas un haz de luz de cierta longitud de onda.

En los ensayos de inmunocitoquímica se emplean fluoróforos que emiten luz fluorescente de colores contrastantes, lo que permite evidenciar estructuras específicas de las células en una misma observación. Existen variedades de fluoróforos que emiten luz fluorescente de diferente color, lo cual ha sido aprovechado para obtener imágenes que muestran marcajes fluorescentes diversos en una misma célula u organismo. (Al respecto, se recomienda una visita a la página de internet de Invitrogen para consultar el texto digital Molecular Probes. The Handbook.)⁶ En la actualidad, con el empleo de microscopia de barrido confocal puede determinarse espacialmente la distribución de los marcadores fluorescentes e incluso, mediante programas de computadora, pueden hacerse reconstrucciones tridimensionales que permiten definir los sitios dentro de las células en los que se encuentran tales fluoróforos.

Los marcadores biosintéticos también son conocidos como marcadores fluorescentes intravitales porque se sintetizan como parte de la maquinaria proteica celular y forman parte de la vida de la célula; sólo se requiere del estímulo fotónico adecuado para que estas proteínas fluorescentes emitan su luz fluorescente.

La utilización de los marcadores fluorescentes permite grabar eventos biológicos que suceden dentro de los organismos microscópicos vivos, lo cual en otras circunstancias sería difícil de apreciar. Entre los fenómenos que han sido estudiados destacan los relacionados con la dinámica intracelular, tales como la división celular o el movimiento vesicular.⁷ Es tal la variedad de marcadores fluorescentes con los que se cuenta en la actualidad, que es posible visualizar en un instante varios componentes intracelulares marcados. Los resultados se reflejan en imágenes de células, en cuyo interior hay una variedad de marcajes fluorescentes coloridos, como los que se obtienen con el empleo de proteínas fluorescentes.⁸

El descubrimiento y la caracterización de una de ellas, la proteína verde fluorescente (GFP, green fluorescence protein), le valió la obtención del premio Nobel en 2008 por este trabajo pionero al doctor R. Tsien,⁹ y a partir de dicho trabajo se han obtenido diversos genes que codifican para proteínas fluorescentes de diferentes colores.¹⁰

El fundamento de las observaciones por sustancias fluorescentes se basa en que este tipo de proteínas poseen ciertas características químicas que les permiten absorber energía luminosa de cierta longitud de onda, lo cual produce la excitación de sus átomos y emiten una energía luminosa de otra longitud de onda menor, la cual se visualiza como energía fluorescente. Por ser proteínas de muy bajo peso molecular y a las que se les ha caracterizado completamente hasta la obtención de la secuencia génica correspondiente, ya se comercializan promotores génicos de las diferentes proteínas fluorescentes. Estos promotores se introducen en combinación con genes que se expresan de manera constitutiva (como los de actina o tubulina) en los núcleos de las células, se incorporan al material genético en los sitios correspondientes, y después las células resultantes modificadas genéticamente presentan como característica la expresión de la proteína constitutiva, pero asociada con la proteína fluorescente.

Ha sido tan evidente el éxito del empleo de los marcadores fluorescentes producidos con proteínas modificadas que en la actualidad se generan moléculas sintéticas no proteicas con características específicas (figura 43-2). Su utilidad se basa en que cuando las células expresan a las proteínas modificadas, no sufren cambios importantes que alteren su funcionalidad. Los resultados que se han obtenido de la evaluación de la dinámica de infección de Leishmania amazonensis transfectada con GFP en ratones vivos infectados experimentalmente son las aplicaciones del uso de proteínas acopladas a GFP en el campo de la parasitología, el seguimiento del desarrollo de estructuras como el apicoplasto durante la evolución de los parásitos que producen malaria, y la evaluación de sustancias antiparasitarias como en el caso de Leishmania panamensis (figura 43-3).

Aun cuando es factible el empleo de marcajes fluorescentes con la proteína GFP, en muchos de los casos sólo se obtienen marcajes pobres, fugaces o inestables, lo que ha motivado a buscar otros tipos de fluorocromos, como los nanocristales (conocidos como QD, o “quantum dots”). Estos nanocristales se diseñan de forma tan precisa que su visualización en el interior de las células brinda marcajes fluorescentes de gran brillo (hasta 3 000 veces más que los fluoróforos convencionales), calidad por su fotoestabilidad, y son producidos en una amplia variedad de colores (Medintz et al., 2005). Además, por su diseño se les puede seleccionar por los intervalos de excitación y de emisión estrecha, y pueden ser maniobrables para los fines experimentales que se deseen (Molokanova et al., 2008).

El uso de los nanocristales tiene la ventaja adicional de que, al ser electrodensos al microscopio electrónico, se les ha utilizado como marcadores que pueden ser vistos tanto en microscopios de fluorescencia como en electrónicos de transmisión, por lo cual sirven como puente de unión entre ambos tipos de sistemas de observación. Debido a ello, los nanocristales permiten visualizar al mismo tiempo la marca fluorescente y electrodensa, con lo cual es posible cotejarla en las células, con lo que se identifican los sitios blancos en que se depositan los nanocristales (Giepmans, 2008). Como los QD no destruyen a los parásitos, se les ha utilizado para evaluar el desarrollo de organismos como Leishmania (Lang et al., 2009).

El poder de marcaje específico de los compuestos fluorescentes en general se incrementa cuando se les conjuga con otro tipo de sustancias, como los anticuerpos u otras de naturaleza química. De esa forma se generan conjugados con capacidad de interacción con blancos definidos.¹¹ Por estas razones su utilidad es evidente en casos de estudios de colocalización, cuando se desea evaluar el marcaje fluorescente de dos o más fluorocromos distintos (figura 43-2). Si durante el marcaje fluorescente se hace uso al mismo tiempo de alguna de las otras técnicas de microscopia, como la iluminación de contraste de fases o de interferencia de contraste diferencial (DIC, del inglés diferencial interference contrast), bajo la cual sólo destacan estructuras intracelulares y se delimita la forma de las células, se logra una localización precisa en el interior de las células de los marcajes fluorescentes en estudio, como lo demostrado en la expresión del GFP en Leishmania (Varela et al., 2009), o la detección de lisosomas en T. cruzi (Sant’Anna et al., 2008) (figura 43-4).

Además de la utilidad de los marcadores fluorescentes, la tecnología de microscopia confocal por barrido con rayos láser (MC) se ha consolidado como la forma de observación de las marcajes fluorescentes con las cuales se logran excelentes condiciones de observación y se obtienen imágenes de gran nitidez, las cuales pueden ser combinadas con observaciones de los mismos tejidos o células en ausencia de algún tipo de marcaje. Debido a que con el uso de los rayos láser es posible hacer barridos en la orientación “Z” (en dirección de la profundidad de las muestras), a diferencia de la microscopia de fluorescencia convencional, se logran obtener series de imágenes que pueden ser integradas y reconstruidas para capturar imágenes que muestren la distribución espacial de los marcajes fluorescentes. Como se indica más adelante, las imágenes obtenidas pueden ser procesadas para lograr reconstrucción en tercera dimensión (3D) de los objetos observados (figura 43-4C).

Aunque en la actualidad los microscopios fotónicos se han complementado con sistemas fotográficos complejos, prevalece la resolución con la que se obtienen las observaciones y aún no se han logrado en otro nivel que no sea el micrométrico. Los sistemas fotográficos han dotado de mayor capacidad a los equipos para lograr amplificaciones más nítidas de las imágenes obtenidas, así como preservarlas en distintos formatos para su posterior edición.

A pesar de lo exitoso que ha sido el empleo de microscopios de fluorescencia como los mencionados, tienen varias desventajas que no favorecen su uso en ciertas condiciones. Los diferentes tipos de microscopios que emplean luz (aun seleccionada en ciertos intervalos de longitud de onda para generar los rayos láser de uso en la MC) generan cierto grado de fluorescencia contaminante, lo que hace necesario el empleo de filtros o la disminución de la intensidad de los rayos láser, con la consiguiente pérdida de la fluorescencia emitida por las células o los tejidos en estudio. Otro problema adicional por el cual se tienen que hacer observaciones en células fijadas o en intervalos muy cortos es la cantidad de fototoxicidad que se genera tanto por el calor como por la concentración de los rayos, lo que afecta la viabilidad y las condiciones fisiológicas de las células. Si a lo anterior se asocian los problemas relacionados con la infraestructura tanto para el uso de luz fotónica, proveniente tanto de lámparas de mercurio (en el caso del uso de microscopios de fluorescencia), como de las fuentes productoras de los rayos láser (en el caso del uso de MC), los costos de adquisición de los equipos, su mantenimiento y la infraestructura que necesitan (por ejemplo, se requiere de temperatura ambiental controlada, de un cuarto oscuro, de suficiente espacio para acomodar el microscopio y los monitores, y de un sistema antivibración que no genere ningún movimiento) demandan altos costos, con lo que se reduce la posibilidad de utilizarlos a nivel de campo o en laboratorios modestos.

Con la finalidad de resolver los problemas del uso de equipo de microscopia de fluorescencia como los referidos y con la intención de utilizar sus bondades para el diagnóstico en campo, recientemente se han diseñado microscopios de fluorescencia basados en fuentes de diodos que emiten luz (LED, del inglés light-emitting diodes). Estos equipos tienen la capacidad de contar con un sistema que genera el suficiente poder de intensidad de luz para estimular a los fluoróforos. Son equipos sencillos que brindan alta resolución de las imágenes, y se les encuentra a precios accesibles. El sistema de LED se basa en el aprovechamiento de la energía luminosa de un intervalo específico y definido de longitud de onda, la cual es transmitida por los diodos. Los intervalos de luz están dados por diversos colores de los LED, ya que éstos emiten luz en longitudes de onda específicas, y la intensidad de la luz es suficiente para estimular la emisión de la fluorescencia (figura 43-5).

Además de los intervalos definidos de luz, el sistema no produce calor y es lo suficientemente estable para mantener la intensidad de la luz por el tiempo que el fluoróforo emita su luz fluorescente. Debido a la eficiencia de los LED, es posible utilizar varios de ellos en un mismo equipo y con ello activar distintos fluoróforos a un mismo tiempo, o bien cambiar de uno a otro sin que haya pérdida de tiempo o de intensidad de la fluorescencia de la muestra.

Con el empleo del estímulo multifotónico de los LED, sólo los fluoróforos involucrados son estimulados, brillan con toda su intensidad y hay ausencia casi total de fluorescencia contaminante. El uso de la microscopia de fluorescencia por LED se ha vuelto indispensable para detectar la fluorescencia de determinados marcajes fluorescentes débiles (como en el caso de modificaciones genéticas de los organismos), o la que emiten células vivas en el momento de su desplazamiento. En la microscopia de fluorescencia convencional (o MC) se produce fototoxicidad, lo que genera calor; además, hay movimientos vibratorios producidos por los filtros usados para bloquear la fluorescencia no deseada, y dichos factores alteran el comportamiento de las células y les producen daños irreversibles.¹²

Debido a lo anterior, los sistemas de LED empiezan a dominar el ámbito de la investigación de microscopia de fluorescencia y, en el caso de los microscopios convencionales de fluorescencia, se considera que deben reemplazarse las lámparas de mercurio pues producen mucho calor, tienen una vida media corta, generan color de fondo indeseable, producen fluorescencia indeseable y no son fáciles de instalar en varios tipos de microscopios fotónicos.¹³ Aun cuando la microscopia de fluorescencia en la que se usan LED aparente ser una alternativa cómoda, eficiente y barata para la observación de marcajes fluorescentes, todavía se encuentra en etapa de desarrollo; por consiguiente, aún hay aspectos que no se han evaluado y para los cuales la microscopia de fluorescencia convencional y la MC parecen ser superiores. El uso de microscopios de fluorescencia basado en LED constituye una herramienta poderosa para realizar diagnósticos en campo, como se propuso en la detección de eritrocitos infectados con P. falciparum y teñidos con naranja de acridina (Jones et al., 2007), lo cual demuestra su gran versatilidad.

La microscopia electrónica (ME) es sin duda una de las herramientas de observación indispensable en el campo de la parasitología. Su uso permite obtener información de la morfología y la estructura de los organismos y las células a nivel ultraestructural. Tanto la microscopia electrónica de transmisión (MET) como la de barrido (MEB) mantiene su hegemonía en la obtención de información tanto de las muestras seccionadas como enteras. Con la MET se obtiene información del interior de las muestras en observación y con MEB se capturan imágenes en 3D de su superficie, pero con la ventaja de que es posible observar dichas muestras desde diferentes planos. No obstante, las bondades del análisis morfológico que ofrecen estos tipos de microscopia, permanecen algunos inconvenientes que no será fácil superar; por ejemplo, las muestras sometidas a observación requieren de un procesamiento largo, complejo y costoso.

En el caso de MET, si se desea utilizar las secciones o cortes de las muestras para hacer reconstrucciones de su interior (a fin de comparar lo obtenido con las observaciones al MEB de la misma muestra), es necesario efectuar gran cantidad de cortes, obtener las imágenes seriadas y unirlas una a una, lo que demandaría gran cantidad de trabajo y tiempo, lo que además podría generar errores. Además, el observador debe estar bien entrenado y conocer lo que está bajo observación, con la finalidad de que pueda extraer toda la información del caso. Por desgracia, en ambos tipos de microscopia podría darse el caso que si el tratamiento de las muestras no es el adecuado o se aplica de manera incorrecta, es muy probable que se generen alteraciones morfológicas que deriven en equivocaciones e interpretaciones inadecuadas. A pesar de tales inconvenientes, la ME es una herramienta vital de observación ultraestructural, pues en torno a ella se han realizado avances para ahondar en múltiples padecimientos en busca de su solución.

A continuación se refieren las nuevas tecnologías de observación ultraestructural con equipos de microscopia electrónica de vanguardia, con los cuales se han logrado nuevos avances. Mediante congelamiento ultrarrápido con etano líquido (el cual permite alcanzar temperaturas de congelación por abajo de los −180 °C en fracción de nanosegundos) y al alto vacío, es posible la vitrificación inmediata de las muestras, y la preservación de casi todas sus estructuras como se encontraban al momento de ser procesadas. Las muestras son observadas de inmediato (si así se requiere) sin otro tipo de procesamiento. Esta estrategia de observación ultraestructural se denomina tomografía crioelectrónica (Lucic et al., 2008) y se basa en la forma de congelación de las muestras, ya que así se evita la formación de cristales de hielo, que altera las estructuras de los tejidos y las células. Después de la congelación, las muestras pueden ser procesadas y cortadas en secciones “gruesas” de unos 400 nm (en la MET convencional se emplean cortes de aproximadamente 0.5-1 nm de grosor) y así ser observadas al microscopio.

La cualidad de los nuevos microscopios electrónicos para este tipo de observaciones es que cuentan con una platina que permite la posibilidad de rotación de la muestra, con lo que se generan varias imágenes de la misma muestra con diferentes ángulos de inclinación. Mediante diversos programas computacionales, las imágenes son integradas, reconstruidas y proyectadas en 3D, con lo cual se logra detallar la observación de las estructuras celulares a un nivel de resolución molecular (MacIntosh et al., 2005). Sólo algunos laboratorios de Estados Unidos, Inglaterra y Japón poseen este tipo de microscopios; sin embargo, es una tecnología que ya se está aplicando en parasitología para estudiar la caracterización de la zona flagelar de T. brucei brucei (figura 43-6), de lisosomas durante el desarrollo de T. cruzi (Sant’Anna et al., 2008) (figura 43-4C) y de otros organelos involucrados en el desarrollo de Leishmania (Lang et al., 2009).

Tecnología que se ha revelado como una excelente estrategia de observación de la topografía de organismos en el plano nanométrico y en muchas partes del mundo se le utiliza con fines de estudio de material biológico, porque en un inicio se usaba en áreas no biológicas. Es una tecnología práctica,¹⁴ rápida, de fácil manejo y, como en el caso de los chips, no requiere del uso de un microscopio convencional; todo se realiza mediante sistemas computacionales.

En la actualidad, ya hay compañías que presentan equipos que combinan la MFA con la MC. El diseño de un MFA permite que una punta que se encuentra adherida a un listón flexible (cantilever) se desplace y barra la superficie de la muestra, lo cual es detectado por un sistema acoplado a un programa computacional, y con ello se generan las imágenes que el equipo interpreta y analiza. Este sistema tiene tal resolución que es posible visualizar en tiempo real la superficie de organismos vivos (para ello se incluye un minimódulo en el sistema, en el que se ajustan las condiciones de humedad, temperatura y gases). Con base en estas adaptaciones, este sistema de observación mejora lo que se puede obtener mediante las MET y MEB, ya que dichas tecnologías exigen la observación de muestras de organismos muertos, fijados, tratados y que hayan sufrido posibles cambios en su estructura debido a los tratamientos.

A pesar de estas bondades, la MFA tiene una gran desventaja: sólo se puede efectuar la visualización de las superficies de las muestras analizadas y, en el caso de las células, sólo es posible analizar algunos nanómetros por abajo de sus membranas plasmáticas. Sin embargo, a pesar de esas limitantes, esta estrategia de observación de las células tiene el mejor poder resolutivo conocido hasta el momento, superior a cualesquiera de las ME, por lo que su uso tiene mayor demanda (Tsien, 2003). Este sistema de observación ha empezado a tener importancia en la visualización de lo que sucede en la superficie de células que son infectadas por parásitos. Ejemplo de ello es la invasión de los protozoarios Babesia bovis (Hutchings et al., 2007) y Plasmodium (Li A et al., 2006) en eritrocitos (figura 43-7), así como la visualización de la superficie de Trypanosoma cruzi. Se han obtenido algunos avances en estudios mediante esta estrategia de células flama de cisticercos de Taenia crassiceps cepa ORF (figura 43-8C).

Tras lo referido en relación con las tecnologías de observación microscópica por fluorescencia y tomografía crioelectrónica, así como por lo expuesto acerca de la MFA, es evidente que una vez que las imágenes se han adquirido, son procesadas mediante computadora. Es ya una práctica común y mediante el uso de programas computacionales específicos se obtiene mayor información que de otra manera no hubiera sido posible adquirir y que permite mayor aproximación respecto de lo que sucede al interior o exterior de lo que se estudia. Sin embargo, debido a que gran parte de la paquetería computacional es especial por la cantidad de información que requiere ser analizada, es necesario contar con equipos de cómputo que tengan suficiente capacidad tanto para almacenar como para efectuar los análisis; asociado a ello, se debe contar con infraestructura humana técnicamente preparada para efectuar lo que se requiera al respecto.¹⁵ En este sentido, es común que en los artículos publicados que incluyen análisis microscópicos y que usan procesos computacionales, estén incluidas unidades o instituciones que realizan cómputo o visualización científica.

En la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) se han desarrollado grupos de investigación multidisciplinarios en los que participan médicos, biólogos, ingenieros en computación, matemáticos, médicos y químicos, quienes realizan estudios en el área biomédica con enfoques hacia el estudio de la biología celular de parásitos, y que incluyen observaciones microscópicas, análisis de tipo bioquímico e inmunoquímico, combinados con análisis matemáticos computacionales que permiten generar imágenes para que sean analizadas mediante visualización científica.

En particular, uno de los principales objetivos de llevar a cabo tales estudios consiste en determinar la dinámica del citoesqueleto o la estructuración del mismo en los parásitos que se han estudiado; para estos fines se han combinado los resultados experimentales de estudios de diferentes tipos de microscopia (de epifluorescencia y confocal), que incluyen evaluaciones inmunocitoquímicas con marcadores fluorescentes, observaciones por microscopia electrónica (tanto de barrido como de transmisión) y se han iniciado observaciones mediante MFA (figuras 43-8 y 43-9). Luego, la información visual y experimental obtenida se procesa para obtener su reconstrucción tridimensional, proyectarla en pantallas especiales para observación en tercera dimensión y efectuar inmersiones virtuales hacia su interior (figura 43-9). Finalmente, usando esta clase de análisis con fines de demostración y aplicación docente, se generan animaciones interactivas tridimensionales de lo observado a nivel microscópico y ya se han producido varios modelos computacionales animados.¹⁶

Las imágenes tridimensionales obtenidas han permitido la navegación virtual dentro de ellas al proyectarlas en salas diseñadas ex profeso para visualización en 3D; las imágenes brindan una sensación envolvente, lo cual es muy diferente a lo que se observa directamente al microscopio. Bajo estas condiciones, la inmersión virtual en un viaje hacia el interior de los organismos rebasa lo que se puede apreciar en imágenes como las que se muestran en este capítulo. Esta forma de admirar lo microscópico es nuevo, está acorde a lo que la tecnología actual ha desarrollado y con el paso de los años sin duda tendrá un importante impacto no sólo en la enseñanza del conocimiento de las ciencias biológicas, sino también en la comprensión global de lo que existe al interior de una célula o un parásito. Con estos avances podrán efectuarse demostraciones de realidad virtual del interior de los parásitos, lo que podría ser utilizado no sólo para conocer lo que sucede en ese sitio, sino para evaluar aspectos que afecten la biología y la fisiología de los parásitos, como los tratamientos terapéuticos.

Con la visualización tridimensional de las imágenes generadas se pueden llevar a cabo análisis computacionales adicionales. Por ejemplo, mediante el programa AMIRA, no sólo se puede reconstruir lo que se encuentra marcado fluorescentemente en las imágenes generadas en MC; si las imágenes de los marcajes fluorescentes se combinaron con observaciones bajo la técnica de DIC o Nomarsky, los espacios que no tienen marcaje también son reconstruidos y se les pueden asignar colores falsos. Además, dado que con el programa es posible efectuar seccionamientos tanto digitales como transversales y un barrido computacional, las imágenes resultantes permiten evaluar la distribución espacial de lo marcado fluorescentemente y la asociación con su entorno.

Es verdad que en primera instancia parece complicado utilizar la tecnología computacional para apoyar lo obtenido mediante observación microscópica —algo semejante a lo que ocurrió al inicio de la microscopia convencional—, pero es importante tener en mente que se encuentra en vías de crecimiento y cabe esperar que en un futuro cercano será de uso general y se le aplicará siempre que sea requerida. No cabe la menor duda de que la tecnología computacional brinda una nueva forma de observación que amplía el conocimiento que antes se adquiría sólo con la observación microscópica. En el campo de la parasitología, el uso que de ella se haga permitirá conocer más acerca de la estructura interna de los organismos durante su desarrollo o de las afecciones que causan.

¹ http://www.molecularmovies.com/movies/berry_malaria_part1.html

² http://www.molecularmovies.com/movies/berry_malaria_part2.html

³ http://www.microscopyu.com/articles/livecellimaging/index.html

⁴ http://www.olympusmicro.com/primer/virtual/virtual.html

⁵ http://www.jove.com/index.stt

⁶ http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/References/Molecular-Probes-The-Handbook.html)

⁷ http://www.microscopyu.com/articles/livecellimaging/fpimaging.html

⁸ http://www.tsienlab.ucsd.edu/Images.htm

⁹ http://www.tsienlab.ucsd.edu/Default.htm

¹⁰ http://www.tsienlab.ucsd.edu/Images/General/IMAGE-%20Composite.jpg

¹¹ http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/References/Molecular-Probes-The-Handbook.html

¹² http://www.photonics.com/Article.aspx?AID=32390

¹³ http://microscopy-uk.org.uk/mag/indexmag.html?http://microscopy-uk.org.uk/mag/artjun08/rp-LEDSUMMARY.html

¹⁴ http://es.wikipedia.org/wiki/AFM

¹⁵ http://www.super.unam.mx

¹⁶ http://lab3d.facmed.unam.mx/?q=node/5