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El empleo de esta tecnología ha demostrado de manera contundente su utilidad, cuyo uso en el campo de la microscopia depende de los requerimientos de la observación. Entre las variantes de la microscopia basada en fluorescencia destacan la de epifluorescencia de amplio campo, la de barrido confocal y la multifotónica (Lang et al., 2009). Sin embargo, el empleo de todas ellas se basa en la utilización de marcadores fluorescentes sintéticos o biosintéticos, los cuales sin duda han favorecido los estudios de la dinámica de localización de moléculas definidas en células vivas y permitido un incremento en la comprensión de los procesos celulares (Asan, Drenchkhahn, 2008). Los marcadores fluorescentes sintéticos por lo general están elaborados con proteínas o sustancias específicas conjugadas a fluoróforos, los cuales poseen una composición química que les permite emitir luz fluorescente cuando incide en ellas un haz de luz de cierta longitud de onda.
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En los ensayos de inmunocitoquímica se emplean fluoróforos que emiten luz fluorescente de colores contrastantes, lo que permite evidenciar estructuras específicas de las células en una misma observación. Existen variedades de fluoróforos que emiten luz fluorescente de diferente color, lo cual ha sido aprovechado para obtener imágenes que muestran marcajes fluorescentes diversos en una misma célula u organismo. (Al respecto, se recomienda una visita a la página de internet de Invitrogen para consultar el texto digital Molecular Probes. The Handbook.)6 En la actualidad, con el empleo de microscopia de barrido confocal puede determinarse espacialmente la distribución de los marcadores fluorescentes e incluso, mediante programas de computadora, pueden hacerse reconstrucciones tridimensionales que permiten definir los sitios dentro de las células en los que se encuentran tales fluoróforos.
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Los marcadores biosintéticos también son conocidos como marcadores fluorescentes intravitales porque se sintetizan como parte de la maquinaria proteica celular y forman parte de la vida de la célula; sólo se requiere del estímulo fotónico adecuado para que estas proteínas fluorescentes emitan su luz fluorescente.
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La utilización de los marcadores fluorescentes permite grabar eventos biológicos que suceden dentro de los organismos microscópicos vivos, lo cual en otras circunstancias sería difícil de apreciar. Entre los fenómenos que han sido estudiados destacan los relacionados con la dinámica intracelular, tales como la división celular o el movimiento vesicular.7 Es tal la variedad de marcadores fluorescentes con los que se cuenta en la actualidad, que es posible visualizar en un instante varios componentes intracelulares marcados. Los resultados se reflejan en imágenes de células, en cuyo interior hay una variedad de marcajes fluorescentes coloridos, como los que se obtienen con el empleo de proteínas fluorescentes.8
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El descubrimiento y la caracterización de una de ellas, la proteína verde fluorescente (GFP, green fluorescence protein), le valió la obtención del premio Nobel en 2008 por este trabajo pionero al doctor R. Tsien,9 y a partir de dicho trabajo se han obtenido diversos genes que codifican para proteínas fluorescentes de diferentes colores.10
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El fundamento de las observaciones por sustancias fluorescentes se basa en que este tipo de proteínas poseen ciertas características químicas que les permiten absorber energía luminosa de cierta longitud de onda, lo cual produce la excitación de sus átomos y emiten una energía luminosa de otra longitud de onda menor, la cual se visualiza como energía fluorescente. Por ser proteínas de muy bajo peso molecular y a las que se les ha caracterizado completamente hasta la obtención de la secuencia génica correspondiente, ya se comercializan promotores génicos de las diferentes proteínas fluorescentes. Estos promotores se introducen en combinación con genes que se expresan de manera constitutiva (como los de actina o tubulina) en los núcleos de las células, se incorporan al material genético en los sitios correspondientes, y después las células resultantes modificadas genéticamente presentan como característica la expresión de la proteína constitutiva, pero asociada con la proteína fluorescente.
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Ha sido tan evidente el éxito del empleo de los marcadores fluorescentes producidos con proteínas modificadas que en la actualidad se generan moléculas sintéticas no proteicas con características específicas (figura 43-2). Su utilidad se basa en que cuando las células expresan a las proteínas modificadas, no sufren cambios importantes que alteren su funcionalidad. Los resultados que se han obtenido de la evaluación de la dinámica de infección de Leishmania amazonensis transfectada con GFP en ratones vivos infectados experimentalmente son las aplicaciones del uso de proteínas acopladas a GFP en el campo de la parasitología, el seguimiento del desarrollo de estructuras como el apicoplasto durante la evolución de los parásitos que producen malaria, y la evaluación de sustancias antiparasitarias como en el caso de Leishmania panamensis (figura 43-3).
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Aun cuando es factible el empleo de marcajes fluorescentes con la proteína GFP, en muchos de los casos sólo se obtienen marcajes pobres, fugaces o inestables, lo que ha motivado a buscar otros tipos de fluorocromos, como los nanocristales (conocidos como QD, o “quantum dots”). Estos nanocristales se diseñan de forma tan precisa que su visualización en el interior de las células brinda marcajes fluorescentes de gran brillo (hasta 3 000 veces más que los fluoróforos convencionales), calidad por su fotoestabilidad, y son producidos en una amplia variedad de colores (Medintz et al., 2005). Además, por su diseño se les puede seleccionar por los intervalos de excitación y de emisión estrecha, y pueden ser maniobrables para los fines experimentales que se deseen (Molokanova et al., 2008).
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El uso de los nanocristales tiene la ventaja adicional de que, al ser electrodensos al microscopio electrónico, se les ha utilizado como marcadores que pueden ser vistos tanto en microscopios de fluorescencia como en electrónicos de transmisión, por lo cual sirven como puente de unión entre ambos tipos de sistemas de observación. Debido a ello, los nanocristales permiten visualizar al mismo tiempo la marca fluorescente y electrodensa, con lo cual es posible cotejarla en las células, con lo que se identifican los sitios blancos en que se depositan los nanocristales (Giepmans, 2008). Como los QD no destruyen a los parásitos, se les ha utilizado para evaluar el desarrollo de organismos como Leishmania (Lang et al., 2009).
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El poder de marcaje específico de los compuestos fluorescentes en general se incrementa cuando se les conjuga con otro tipo de sustancias, como los anticuerpos u otras de naturaleza química. De esa forma se generan conjugados con capacidad de interacción con blancos definidos.11 Por estas razones su utilidad es evidente en casos de estudios de colocalización, cuando se desea evaluar el marcaje fluorescente de dos o más fluorocromos distintos (figura 43-2). Si durante el marcaje fluorescente se hace uso al mismo tiempo de alguna de las otras técnicas de microscopia, como la iluminación de contraste de fases o de interferencia de contraste diferencial (DIC, del inglés diferencial interference contrast), bajo la cual sólo destacan estructuras intracelulares y se delimita la forma de las células, se logra una localización precisa en el interior de las células de los marcajes fluorescentes en estudio, como lo demostrado en la expresión del GFP en Leishmania (Varela et al., 2009), o la detección de lisosomas en T. cruzi (Sant’Anna et al., 2008) (figura 43-4).
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Además de la utilidad de los marcadores fluorescentes, la tecnología de microscopia confocal por barrido con rayos láser (MC) se ha consolidado como la forma de observación de las marcajes fluorescentes con las cuales se logran excelentes condiciones de observación y se obtienen imágenes de gran nitidez, las cuales pueden ser combinadas con observaciones de los mismos tejidos o células en ausencia de algún tipo de marcaje. Debido a que con el uso de los rayos láser es posible hacer barridos en la orientación “Z” (en dirección de la profundidad de las muestras), a diferencia de la microscopia de fluorescencia convencional, se logran obtener series de imágenes que pueden ser integradas y reconstruidas para capturar imágenes que muestren la distribución espacial de los marcajes fluorescentes. Como se indica más adelante, las imágenes obtenidas pueden ser procesadas para lograr reconstrucción en tercera dimensión (3D) de los objetos observados (figura 43-4C).
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Aunque en la actualidad los microscopios fotónicos se han complementado con sistemas fotográficos complejos, prevalece la resolución con la que se obtienen las observaciones y aún no se han logrado en otro nivel que no sea el micrométrico. Los sistemas fotográficos han dotado de mayor capacidad a los equipos para lograr amplificaciones más nítidas de las imágenes obtenidas, así como preservarlas en distintos formatos para su posterior edición.
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A pesar de lo exitoso que ha sido el empleo de microscopios de fluorescencia como los mencionados, tienen varias desventajas que no favorecen su uso en ciertas condiciones. Los diferentes tipos de microscopios que emplean luz (aun seleccionada en ciertos intervalos de longitud de onda para generar los rayos láser de uso en la MC) generan cierto grado de fluorescencia contaminante, lo que hace necesario el empleo de filtros o la disminución de la intensidad de los rayos láser, con la consiguiente pérdida de la fluorescencia emitida por las células o los tejidos en estudio. Otro problema adicional por el cual se tienen que hacer observaciones en células fijadas o en intervalos muy cortos es la cantidad de fototoxicidad que se genera tanto por el calor como por la concentración de los rayos, lo que afecta la viabilidad y las condiciones fisiológicas de las células. Si a lo anterior se asocian los problemas relacionados con la infraestructura tanto para el uso de luz fotónica, proveniente tanto de lámparas de mercurio (en el caso del uso de microscopios de fluorescencia), como de las fuentes productoras de los rayos láser (en el caso del uso de MC), los costos de adquisición de los equipos, su mantenimiento y la infraestructura que necesitan (por ejemplo, se requiere de temperatura ambiental controlada, de un cuarto oscuro, de suficiente espacio para acomodar el microscopio y los monitores, y de un sistema antivibración que no genere ningún movimiento) demandan altos costos, con lo que se reduce la posibilidad de utilizarlos a nivel de campo o en laboratorios modestos.
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Con la finalidad de resolver los problemas del uso de equipo de microscopia de fluorescencia como los referidos y con la intención de utilizar sus bondades para el diagnóstico en campo, recientemente se han diseñado microscopios de fluorescencia basados en fuentes de diodos que emiten luz (LED, del inglés light-emitting diodes). Estos equipos tienen la capacidad de contar con un sistema que genera el suficiente poder de intensidad de luz para estimular a los fluoróforos. Son equipos sencillos que brindan alta resolución de las imágenes, y se les encuentra a precios accesibles. El sistema de LED se basa en el aprovechamiento de la energía luminosa de un intervalo específico y definido de longitud de onda, la cual es transmitida por los diodos. Los intervalos de luz están dados por diversos colores de los LED, ya que éstos emiten luz en longitudes de onda específicas, y la intensidad de la luz es suficiente para estimular la emisión de la fluorescencia (figura 43-5).
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Además de los intervalos definidos de luz, el sistema no produce calor y es lo suficientemente estable para mantener la intensidad de la luz por el tiempo que el fluoróforo emita su luz fluorescente. Debido a la eficiencia de los LED, es posible utilizar varios de ellos en un mismo equipo y con ello activar distintos fluoróforos a un mismo tiempo, o bien cambiar de uno a otro sin que haya pérdida de tiempo o de intensidad de la fluorescencia de la muestra.
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Con el empleo del estímulo multifotónico de los LED, sólo los fluoróforos involucrados son estimulados, brillan con toda su intensidad y hay ausencia casi total de fluorescencia contaminante. El uso de la microscopia de fluorescencia por LED se ha vuelto indispensable para detectar la fluorescencia de determinados marcajes fluorescentes débiles (como en el caso de modificaciones genéticas de los organismos), o la que emiten células vivas en el momento de su desplazamiento. En la microscopia de fluorescencia convencional (o MC) se produce fototoxicidad, lo que genera calor; además, hay movimientos vibratorios producidos por los filtros usados para bloquear la fluorescencia no deseada, y dichos factores alteran el comportamiento de las células y les producen daños irreversibles.12
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Debido a lo anterior, los sistemas de LED empiezan a dominar el ámbito de la investigación de microscopia de fluorescencia y, en el caso de los microscopios convencionales de fluorescencia, se considera que deben reemplazarse las lámparas de mercurio pues producen mucho calor, tienen una vida media corta, generan color de fondo indeseable, producen fluorescencia indeseable y no son fáciles de instalar en varios tipos de microscopios fotónicos.13 Aun cuando la microscopia de fluorescencia en la que se usan LED aparente ser una alternativa cómoda, eficiente y barata para la observación de marcajes fluorescentes, todavía se encuentra en etapa de desarrollo; por consiguiente, aún hay aspectos que no se han evaluado y para los cuales la microscopia de fluorescencia convencional y la MC parecen ser superiores. El uso de microscopios de fluorescencia basado en LED constituye una herramienta poderosa para realizar diagnósticos en campo, como se propuso en la detección de eritrocitos infectados con P. falciparum y teñidos con naranja de acridina (Jones et al., 2007), lo cual demuestra su gran versatilidad.