Capítulo 2: Técnica histológica y sus aplicaciones

La técnica histológica se ocupa de los métodos utilizados para elaborar preparaciones permanentes de células y de tejidos con la finalidad de analizarlos utilizando diversos tipos de microscopios. Su origen y desarrollo son paralelos al del microscopio óptico y comenzaron en el siglo xvii, y se detallan en el capítulo dedicado a la microscopía.

Los objetivos básicos de la histotecnología son:

1. Producir cortes suficientemente delgados con la mejor preservación morfológica posible, a fin de que logren ser observados con la máxima resolución de los microscopios.

2. Conservar las características biológicas y químicas de las células y tejidos para que sean estudiados utilizando métodos especializados.

3. Permitir que se estudien en un solo corte la mayor parte de las estructuras celulares y tisulares.

4. Conocer la correlación entre la morfología y la función de las estructuras celulares y tisulares.

Pasos de la técnica histológica

El estudio de los especímenes biológicos debe ser ordenado y efectuado con los métodos apropiados; cada uno debe tratarse de forma tan individual como sea posible. Los organismos están formados por órganos, tejidos, células, partículas y sustancias contenidas en la matriz celular.

El desarrollo de nuevas metodologías obliga a diversificar los métodos; sin embargo, en este capítulo se considera la inclusión en parafina, método estándar para preparar cortes de material biológico que comprende varios pasos.

Obtención de la muestra. Si proviene de un individuo vivo recibe el nombre de biopsia; la manera de tomarla puede ser excisional, incisional, por sacabocado, por aspiración, punción, raspado, etc. Cuando la toma de las muestras es de un cadáver, entonces se trata de una necropsia.

Fijación. Puede efectuarse mediante métodos químicos o físicos. Los físicos son principalmente la criofijación a –70 ºC; para que sea eficaz debe ser instantánea a fin de que evite la formación de cristales de hielo; actualmente se usa también el calentamiento en horno de microondas entre 45 y 50 ºC, aunque sólo en biopsias urgentes para un diagnóstico rápido y no definitivo. Sin embargo, aquí se alude solamente a la fijación química. Esta parte del proceso evitará las modificaciones que ocurren después de obtener el tejido e impedirá lo que se conoce como cambios post mortem. Es factible fijar los tejidos por inmersión al sumergirlos en el fijador, o bien, por perfusión —que en la actualidad es el mejor método—, mediante formar un circuito al introducir por vía sanguínea el fijador de manera que llegue al tejido deseado vía la arteria.

El fijador más empleado es el formol al 10%. En algunos casos, de acuerdo al componente celular que se desee observar, varía la manera de fijar el tejido.

• Lavado. Se hace con el fin de eliminar el exceso de formol.

• Deshidratación. Se realiza por lo general con alcoholes en concentraciones crecientes.

• Inclusión en parafina. Es posible cortar el tejido fijado, pero dicho corte no es lo delgado que sí se puede hacer una vez impregnado con un medio. Este medio puede ser la parafina, que es una mezcla de hidrocarburos sólidos que proporcionan una consistencia firme para hacer cortes sin que se distorsione la imagen del tejido y, por último, permitir el paso de la luz para ser observado en el microscopio óptico. Es preciso orientar el tejido para su corte, a fin de que la resistencia que el tejido ofrece a la cuchilla vaya en un gradiente de menor a mayor según se vaya cortando el bloque, así las estructuras tubulares (como las venas) deben incluirse de manera que la cuchilla corte en forma perpendicular el tejido, además de que las superficies epiteliales deben colocarse a manera que el plano de corte pase a través de todas las capas del tejido.

• Corte. Por lo general se hacen de 3 a 5 micras, con micrótomos ya sean de rotación o de deslizamiento.

• Tinción. Se utiliza para examinar al microscopio óptico, con detalle, los tejidos.

• Montaje. Se utiliza para conservar las preparaciones de manera permanente, y en esta etapa se cubre el corte del tejido ya procesado, y adherido a un portaobjetos, con un cubreobjetos.

• Etiquetado. En este paso se realiza la preparación de tal manera que se identifique con precisión de qué material se trata.

Considere la elaboración de preparaciones histológicas dirigidas a los profesores como apoyo didáctico para la enseñanza de la histología, y a los estudiantes, como apoyo para facilitar el reconocimiento de las estructuras celulares y los tejidos, tanto por su forma como por sus propiedades físicas y químicas.

Debido a que las células y el material intracelular son transparentes, es necesario utilizar colorantes, mismos que son identificables en función de su afinidad por las diferentes estructuras celulares, aprovechando sus propiedades físicas y químicas. Los fenómenos físicos pueden ser: fuerzas de capilaridad y ósmosis, absorción y adsorción. En cambio, las reacciones químicas, por lo general, tienen que ver con cromógenos que poseen la propiedad de reducirse con facilidad. Aprovechando esta capacidad, cabe utilizar diversos métodos de tinción y referirse a los más comunes. La manera en que se combinan estos colorantes con los tejidos permite adentrarse en la fascinante área de las tinciones de rutina y especiales que se mencionan a continuación.

Hematoxilina y eosina

La combinación de estos dos colorantes tiñe los núcleos de azul, los citoplasmas en rosa, el músculo en tonos rojizos a rosados fucsia, los glóbulos rojos en naranja o rojo y la fibrina en rosa intenso: la hematoxilina tiñe los núcleos de azul oscuro y es el colorante natural más utilizado, el cual se extrae del palo de Campeche (especie nativa de Centroamérica). En 1860 comenzó a usarse para tinciones de tejidos, la solución de este colorante combinado con aluminio, tungsteno, hierro y otros elementos, es utilizada para teñir núcleos. La eosina es el colorante más usado en soluciones alcohólicas, mismo que tiñe el citoplasma en diferentes tonos de rosa; es la tinción más útil y rutinaria en la mayoría de los laboratorios (figura 2-1).

Métodos tricrómicos

Se emplean tres colorantes para teñir distintos componentes en diversos colores. Muchos métodos tricrómicos pueden utilizarse para poner de manifiesto la arquitectura general, resaltar las fibras de sostén o diferenciar el tejido conjuntivo de las fibras musculares, el colágeno y las fibras reticulares se tiñen en medios muy ácidos con colorantes ácidos.

Entre ellas, la técnica más común es el tricrómico de Masson (figura 2-2), que requiere fijación o posfijación en Bouin, y permite ver:

1. Núcleos en negro.

2. Músculo, citoplasma y queratina en rojo.

3. Colágena en azul o verde dependiendo del contraste que se use.

El tricrómico de Gallego (figura 2-3) le sigue en importancia y permite observar:

1. Núcleos en azul.

2. Fibras elásticas en magenta.

3. Eritrocitos en verde limón.

4. Otras estructuras en verde.

Tricrómico de Gomori (figura 2-4), se usa tanto para tejidos como para extendidos celulares y se visualizan:

1. Fibras musculares en rojo.

2. Colágeno en verde.

3. Núcleos de azul a negro.

4. Fibras elásticas, células β de los islotes pancreáticos y los gránulos de la hipófisis, en tonos que van desde el violeta hasta el morado.

Para fibras elásticas se utiliza la tinción de Verhoeff (figura 2-5) que permite ver:

1. Fibras elásticas negras.

2. Núcleos en negro.

3. Colágeno en rojo.

4. Otras estructuras en amarillo.

Una modificación a la tinción de Mallory (figura 2-6) permite utilizarla para tejido nervioso y permite observar:

1. Núcleos, mielina y eritrocitos en rojobrillante.

2. Tejido conjuntivo, astrocitos, moco, amiloide, matriz ósea, cartilaginosa y otras sustancias hialinas en diferentes tonos de azul.

3. Fibras elásticas en rosa.

Métodos argénticos

En condiciones apropiadas, determinados componentes biológicos reducen el nitrato de plata, que se precipita en forma de depósitos negros de plata metálica en el lugar donde se produce la reducción química, la cual requiere de la ayuda de agentes reductores. Si se modifican las condiciones de la solución de nitrato de plata que se utilice, es factible emplearla para manifestar una amplia variedad de estructuras como membranas basales, fibras reticulares y melanina.

En el tejido nervioso también se emplea el nitrato de plata, seguido de la plata amoniacal; en el caso de bloques de parafina con tejido se realiza una impregnación por largos lapsos, utilizando otros reactivos como cloruro de oro e hiposulfito de sodio y después se hacen los cortes, lo que las convierte en técnicas muy costosas. Considere a continuación varios ejemplos:

Gros-Bielschowsky (figura 2-7), observe:

1. Axones en negro.

2. Neurofibrillas en negro.

Río-Hortega (figura 2-8), neurofibrillas en negro.

Grimelius (figura 2-9).

Los gránulos en las siguientes células se aprecian en negro.

1. Células α del páncreas.

2. Células gastrointestinales enterocromafines.

3. Células C de la tiroides.

4. Células productoras de adrenalina y noradrenalina.

5. Células de la hipófisis relacionadas con la secreción de ACTH.

6. Las demás estructuras se ven del color del contraste utilizado, como en el caso de la eosina, que se observa en tonos rosa-rojos.

Sevier-Munger (figura 2-10).

1. Fibras nerviosas en negro.

2. Otras estructuras en diferentes tonos de café.

Para fibras reticulares se utiliza la técnica de Gordon-Sweet (figura 2-11), que está sustituyendo a la de Wilder, ya que en esta última se emplea nitrato de uranio, muy difícil de manipular y desechar, con lo cual se observan:

1. Fibras reticulares en negro.

2. Núcleos en rosa-rojo.

3. Fondo en rosa pálido.

Otras técnicas para tejido nervioso

No requieren el uso de sales de plata y facilitan la diferenciación de sus estructuras. A continuación se listan algunas.

El método de Luxol Fast Blue (figura 2-12) es un colorante soluble en alcohol en el cual la base de la lipoproteína reemplaza la base del colorante y permite que el tejido se tiña. Es factible contrastarlo con reactivo de Schiff y es ampliamente utilizado para tejido nervioso, en el cual se observa:

1. Mielina en azul.

2. Membranas basales, hongos y cuerpos neuronales en rosa.

Nissl distingue (2-13).

1. Células nerviosas en azul brillante.

2. Fondo menos azul.

Kluver Barrera (figura 2-14).

1. Mielina, fosfolípidos en azul.

2. Células en tonos que van del rosa al violeta.

Métodos para carbohidratos

Ácido peryódico de Schiff (PAS) (figura 2-15).

Algunos de los múltiples usos de la reacción incluyen:

1. Demostración de fibras reticulares y membranas basales.

2. Demostración de hongos.

3. Demostración de ciertos tipos de mucosustancias secretadas por el epitelio de varios órganos del tracto digestivo, respiratorio y genital femenino (cérvix).

Todas ellas se pueden ver en PAS positivas en color magenta con núcleos azules.

Técnicas que utilizan azul alciano

El azul alciano es un colorante básico polivalente soluble en agua y tiñe en azul por la presencia de moléculas de cobre. En soluciones acuosas reacciona con compuestos que contienen grupos aniónicos, tales como mucosustancias ácidas, mucinas ácidas y ácido desoxirribonucleico (DNA); se utiliza con diferente pH.

Con pH 2.5 se tiñen (figura 2-16):

1. Mucosustancias carboxiladas y sulfatadas, las mucinas ligeramente ácidas las tiñe en azul.

2. Núcleos rojos.

3. Citoplasma rosa pálido.

Con pH 1 se tiñen (figura 2-17):

1. Mucosustancias sulfatadas en azul.

2. El resto del tejido puede verse rosa, según el contraste que se decida utilizar.

Métodos metacromáticos

Ciertos colorantes reaccionan con diferentes componentes del tejido, tiñéndolos en diferente color al del colorante que originalmente había sido utilizado. Algunos ejemplos de este fenómeno ocurren con: azul de metileno, azul de toluidina, azure A, B, C, tionina, café de Bismarck, safranina, cristal violeta y violeta de metilo. Las sustancias que se tiñen de forma metacromática son llamadas cromótropos, y su propiedad común es el ser estructuras con un alto peso molecular. En este grupo se encuentran el amiloide, los glucosaminoglucanos, los gránulos de las células cebadas, los mucopolisacáridos sulfatados, así como los ácidos nucleicos.

Son de uso común las tinciones de Giemsa o Wright (figura 2-18), ambas con resultados similares; se observan:

1. Núcleos en azul.

2. Eritrocitos en rojo.

3. Cromatina y glóbulos blancos en morado.

4. Gránulos de eosinófilos en rosa.

5. Gránulos de neutrófilos en morado.

6. Bacterias en azul oscuro.

7. Núcleos de parásitos protozoarios en rojo.

8. Citoplasma basofílico en linfocitos y monocitos; para los protozoarios en azul.

Métodos para demostrar pigmentos

Los pigmentos son componentes identificables en las células normales, aunque también en condiciones patológicas. Se clasifican en dos grupos:

1. Como artefactos, al fijar el tejido; los más comunes son los que ocasionan precipitados: debido al formaldehído, al mercurio presente en fijadores como Zenker y Helly, y depósitos por cromo presente en fijadores como Orth, Müller y Kolmer, por mencionar algunos.

2. Los que están presentes dentro de las células llamados pigmentos endógenos; entre ellos los más comunes son: hemoglobina (que es una proteína básica ligada al hierro de color rojizo), melanina (la cual consta de grupos que forman de manera natural polímeros complejos de color café-negros) y lipofuscina (cuya composición química es variable y compleja de color amarillo-café resultantes de la oxidación y polimerización de lípidos insaturados).

El método de Perls (figura 2-19) se utiliza para demostrar hemosiderina, que es un producto de la degradación de la hemoglobina (pigmento endógeno rico en hierro).

1. Hierro en azul de Prusia.

2. Fondo en rosa-rojo.

El método de Fontana-Masson (figura 2-20) identifica melanina en color negro.

1. Gránulos argentafines en negro.

2. Núcleos y citoplasma de rosa a rojo.

La lipofuscina (figura 2-21) fue demostrada con el método del PAS y se aprecia en rojo-magenta.

Métodos para detectar ácidos nucleicos

Cuando el tejido se trata con ácido clorhídrico (figura 2-22), el ácido ribonucleico (RNA) se degrada, pero el DNA mantiene mejor su estructura, por lo que es la técnica de preferencia para identificar las fases en el ciclo celular, haciendo evidentes la posición de los cromosomas en el citoplasma durante la mitosis. Los cromosomas se observan de color magenta.

Métodos para demostrar microorganismos

Los microorganismos de importancia médica son subdivididos en los siguientes grupos:

1. Bacterias; organismos unicelulares cuya talla varía entre 0.2 y 5 micrómetros.

2. Hongos; de los cuales existe una gran variedad y se clasifican por su forma.

3. Virus; organismos diminutos, la mayoría son visibles sólo mediante el microscopio electrónico.

4. Protozoarios, mismos que parecen poseer estructuras muy simples pero tienen funcionalidad muy compleja.

Brown-Brenn para demostrar bacterias.

1. Células grampositivas azul-negro.

2. Células gramnegativas rosa-rojo.

3. Citoplasma amarillo-café.

4. Tejido conjuntivo rojo.

5. Tejido necrótico café amarillento.

Ziehl-Neelsen (figura 2-23) para bácilos ácido-rápidos. Se utiliza la fuscina en una solución de fenol que es el responsable de resaltar la tinción y aparentemente se combina dentro del bacilo ácido-rápido, también funciona como solvente, existen diversas opiniones del porqué ocurre, pero muchos investigadores piensan que se debe a la permeabilidad selectiva de la membrana celular, además, parece que hay una correlación entre el contenido de lípidos y la habilidad para teñirse, esto permite visualizar:

1. Bacilos ácido-rápidos rojo brillante.

2. Otros elementos tisulares azules.

Grocott para hongos (figura 2-24). El primer paso en el procedimiento es la oxidación del tejido y polisacáridos del hongo a grupos aldehído que después son reducidos con nitrato de plata a plata metálica, reacción propiciada por la adición de metenamina (que tiene propiedades alcalinizadoras) y la solución de borato (la cual funciona como un búfer), el cloruro de oro para revelar a la plata metálica, el tiosulfato para fijar la reacción de la plata en el tejido y detenerla, por último, se utiliza un contraste que por lo general es el verde rápido, de manera que permite ver:

1. Hongos en negro.

2. El resto del tejido en verde.

Antes de cerrar este capítulo es preciso recalcar la dificultad que implica obtener tejido normal en óptimas condiciones de fijación y que personal experto lo haya procesado, por lo cual se requiere que el estudiante trate con sumo cuidado las preparaciones que tiene el privilegio de observar en las aulas-laboratorio de su escuela o facultad, pues ello permitirá que futuras generaciones también las utilicen y continúen enriqueciendo su aprendizaje sobre la Histología.

Correlación clínica

En 1981, Robert Knodell propuso una clasificación histológica para evaluar la actividad de la enfermedad en el caso de la hepatitis crónica activa asintomática, en biopsias de hígado. Su propuesta incluyó el uso de tres parámetros. Con la hematoxilina y la eosina se identificaba la inflamación y otros cambios. Utilizando la tinción tricrómico de Masson calificaba la cantidad de tejido conjuntivo fibroso. Con estos datos se puede realizar el seguimiento de la progresión de la enfermedad en los pacientes.