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Un medio de cultivo adecuado debe contener todos los nutrientes necesarios para el microorganismo a cultivar y tales factores incluyen pH, temperatura y aireación que deben ser controlados con gran cuidado. Se utiliza un medio de cultivo líquido; al medio de cultivo puede añadirse agar o gel de sílice para que adquiera consistencia de gel para situaciones especiales. El agar es un polisacárido extraído de algas marinas que es singular para el cultivo microbiano por su resistencia a la acción microbiana y porque se disuelve a 100°C pero no forma placas de gel hasta que se encuentra por debajo de 45°C; las células pueden suspenderse en el medio a 45°C y enfriar con rapidez dicho medio de cultivo hasta que adquiera la consistencia de gel, sin lesionar a las bacterias.
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En páginas previas se describe cada tipo de nutriente y se presenta una lista de sustancias apropiadas. En general, debe suministrarse lo siguiente: 1) donadores y aceptores de hidrógeno, casi 2 g/L; 2) fuente de carbono, casi 1 g/L; 3) fuente de nitrógeno, casi 1 g/L; 4) minerales: azufre, fósforo, casi 50 mg/L de cada uno y oligoelementos, 0.1 a 1 mg/L de cada uno, y 5) factores de crecimiento: aminoácidos, purinas y pirimidinas, casi 50 mg/L de cada uno y vitaminas, 0.1 a 1 mg/L de cada uno.
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Para estudios del metabolismo microbiano, por lo general es necesario preparar un medio completamente sintético en el cual se conozcan las características y concentraciones exactas de cada uno de los ingredientes. Es mucho menos costoso y más simple utilizar materiales naturales como extractos de levaduras, proteínas ingeridas o sustancias similares. La mayor parte de los microbios de vida libre se desarrolla bien en extractos de levaduras; las formas parasitarias pueden necesitar sustancias especiales que se encuentran sólo en la sangre o en extractos de tejidos de animales. Sin embargo, hay microbios parasitarios (p. ej., Treponema pallidum) que no pueden cultivarse in vitro o que crecen en el interior de células eucariotas (p. ej., Chlamydia trachomatis).
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Para muchos microorganismos, un compuesto simple (como un aminoácido) puede actuar como fuente de energía, de carbono y de nitrógeno, en tanto que otros requieren compuestos separados para cada uno de estos elementos. Si los materiales naturales para medios no sintéticos son deficientes en algún nutriente particular, deben realizarse complementaciones.
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Concentración de iones hidrógeno (pH)
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La mayor parte de los microorganismos tiene un pH óptimo muy estrecho. El pH óptimo debe determinarse empíricamente para cada especie. La mayor parte de los microorganismos (neutrolófilos) prolifera mejor en un pH de 6.0 a 8.0, aunque algunas formas (microorganismos acidófilos) encuentran su cifra óptima con pH de 3.0 y otros (alcalófilos) tienen un pH óptimo de hasta 10.5.
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Los microorganismos regulan su pH interno pese a la amplia gama de cifras de pH externo mediante el bombeo de protones hacia el interior o al exterior de la célula. Los microorganismos acidófilos mantienen su pH interno en casi 6.5 sobre un pH externo de 1.0 a 5.0; los microorganismos neutrolófilos con pH neutro mantienen un pH interno cercano a 7.5 sobre intervalos externos de pH de 5.5 a 8.5; los microorganismos alcalófilos mantienen un pH interno de casi 9.5 sobre intervalos externos de 9.0 a 11.0. El pH interno está regulado por un grupo de sistemas de transporte de protones en la membrana citoplásmica, lo que incluye una bomba de protones controlada por ATP y un intercambiador de Na+/H+. El sistema de intercambio de K+/H+ parece contribuir a la regulación del pH interno en microorganismos con pH neutro.
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La temperatura óptima para el cultivo de las distintas especies microbianas varía (fig. 5-2): los psicrófilos crecen mejor a temperaturas bajas (−5 a −15°C) y por lo general se encuentran en ambientes de este tipo como las regiones del Ártico y la Antártida; para los psicrotrofos, la temperatura óptima es entre 20 y 30°C, pero también crecen bien a temperaturas menores. Constituyen una causa importante de desperdicio alimentario. Los mesófilos crecen mejor entre 30 a 37°C, y la mayor parte de los termófilos crece mejor entre 50 a 60°C. Algunos microorganismos son hipertermófilos y pueden desarrollarse a temperatura de ebullición, la cual existe en sitios con alta presión como en las profundidades del océano. La mayor parte de los microorganismos son mesófilos; 30°C es la temperatura óptima para muchas formas de vida libre y la temperatura corporal del hospedador es óptima para simbiontes homeotermos.
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El extremo superior de las temperaturas toleradas por cualquier especie dada se correlaciona bien con la estabilidad térmica general de las proteínas de dicha especie, medidas en extractos celulares. Los microorganismos comparten con las plantas y animales la respuesta al golpe de calor, que consiste en la síntesis transitoria de un grupo de “proteínas de golpe de calor” cuando se exponen a incrementos súbitos en la temperatura por arriba de la óptima de proliferación. Tales proteínas parecen ser inusualmente resistentes a la temperatura y estabilizan a proteínas celulares sensibles al incremento térmico.
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La relación de la tasa de proliferación con la temperatura para cualquier microorganismo dado se observa en el gráfico típico de Arrhenius (fig. 5-3). Arrhenius demostró que el logaritmo de la velocidad de cualquier reacción química (log k) es una función lineal del recíproco de la temperatura (1/T); como el crecimiento celular es consecuencia de un grupo de reacciones químicas, cabría esperar que se observe esta relación. En la figura 5-3 se muestra el caso de temperaturas por arriba de intervalos normales para una especie dada; el log k disminuye linealmente con 1/T. Por arriba y por abajo del intervalo normal, log k disminuye con rapidez, de forma que se definen las temperaturas máxima y mínima.
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Además de sus efectos sobre la tasa de proliferación, las temperaturas extremas matan a los microorganismos. La temperatura muy elevada se utiliza para esterilizar preparaciones (cap. 4); el frío extremo también destruye microorganismos, aunque no puede utilizarse con seguridad con fines de esterilización. Las bacterias también muestran el fenómeno conocido como cho que de enfriamiento, en el que las células mueren con el enfriamiento rápido (a diferencia de lo que ocurre con el enfriamiento lento). Por ejemplo, el enfriamiento rápido de Escherichia coli de 37 a 5°C puede destruir 90% de las células. Varios compuestos protegen a las células del choque de calor o de congelamiento; a menudo se utilizan glicerol y dimetil sulfóxido.
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En el capítulo 6 se revisa la función del oxígeno como aceptor de hidrógeno. Muchos microorganismos son aerobios obligados, esto es, necesitan oxígeno como aceptor de hidrógeno; otros son anaerobios facultativos, es decir, tienen la capacidad de vivir en forma aeróbica o anaeróbica; en tanto que otros son anaerobios obligados, pues necesitan una sustancia distinta al oxígeno como aceptor de hidrógeno y son sensibles a la inhibición de oxígeno; otros más son microaerófilos, que necesitan pequeñas cantidades de oxígeno (2 a 10 %) para la respiración aerobia (la concentración más elevada es inhibidora); y otros son anaerobios aerotolerantes, pues son indiferentes al oxígeno. Éstos pueden crecer en su presencia pero no lo utilizan como aceptor de hidrógeno (fig. 5-4).
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Los productos secundarios naturales del metabolismo aerobio son compuestos reactivos de peróxido de hidrógeno (H2O2) y superóxido (O2–). En presencia de hierro estas sustancias generan radicales hidroxilo (•OH) que pueden dañar cualquier macromolécula biológica:
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Muchos microorganismos anaerobios y anaerobios tolerantes al aire se protegen de estos productos por la presencia de superóxido dismutasa, una enzima que cataliza la reacción
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y por la presencia de una catalasa, una enzima que cataliza la reacción
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Algunos microorganismos fermentados (p. ej., Lactobacillus plantarum) son tolerantes al aire pero no contienen catalasa o superóxido dismutasa. No hay reducción del oxígeno y por lo tanto no se producen H2O2 y O2–. Todos los anaerobios estrictos carecen de superóxido dismutasa y catalasa. Algunos microorganismos anaerobios (p. ej., Peptococcus anaerobius) tienen tolerancia considerable al oxígeno como consecuencia de su capacidad para producir cifras elevadas de la enzima (NADH oxidasa) que reduce oxígeno a agua con base en la reacción
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El peróxido de hidrógeno debe gran parte de su toxicidad al daño que causa al DNA. Los mutantes con reparación deficiente del DNA son excepcionalmente sensibles al peróxido de hidrógeno; el producto génico recA participa en la recomendación genética y en la reparación, y ha mostrado tener más importancia que la catalasa o la superóxido dismutasa para proteger células de E. coli contra la toxicidad por peróxido de hidrógeno.
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El proporcionar aire a los cultivos de bacterias aerobias es un problema técnico mayor. Por lo común se lleva a cabo un mezclado mecánico para introducir oxígeno al medio de cultivo, o bien, se fuerza el paso de aire a través del medio de cultivo por medio de presión. La difusión de oxígeno a menudo se vuelve un factor limitante en la proliferación de bacterias aerobias; cuando se alcanza una concentración de 4 a 5 × 109/ml de células, la tasa de difusión de oxígeno limita la tasa de proliferación de las células en gran medida.
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Por otra parte, los anaerobios obligados presentan el problema de la eliminación del oxígeno. Se dispone de muchos métodos para lograr esto: pueden añadirse agentes reductores como el tioglicolato de sodio a los cultivos líquidos; los tubos de agar pueden sellarse con una capa de vaselina y parafina; las placas de cultivo deben colocarse en un contenedor al cual se le retira el oxígeno por medio de vacío o por agentes químicos, o bien el microorganismo puede manipularse en una caja cerrada en un medio anaerobio.
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Concentración iónica y presión osmótica
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En menor grado, deben controlarse factores como la presión osmótica y concentración de sales. Para la mayor parte de los microorganismos, las propiedades de los medios de cultivo ordinarios son satisfactorias; sin embargo, para formas marinas y microorganismos adaptados para crecer en soluciones hipertónicas de azúcar, por ejemplo, deben tomarse en consideración tales factores. Los microorganismos que requieren concentraciones elevadas de sales se denominan halófilos; aquellos que requieren presiones osmóticas elevadas se denominan osmófilos.
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La mayor parte de las bacterias son capaces de tolerar amplias variaciones de presión osmótica externa y de fuerza iónica debido a su capacidad para regular la osmolalidad interna y la concentración iónica. La osmolalidad está regulada por transporte activo de iones de K+ hacia el interior de la célula; la concentración iónica interna se mantiene constante debido a la excreción compensadora de putresceína, una poliamina orgánica con carga positiva. Como la putresceína transporta varias cargas positivas por molécula, una gran reducción en la concentración iónica se lleva a cabo con un pequeño costo en la concentración osmótica.