Capítulo 5: Cultivo de microorganismos

El cultivo es el proceso de proliferación de microorganismos al proporcionarles un entorno con condiciones apropiadas. Los microorganismos en proliferación producen réplicas de sí mismos y necesitan los elementos presentes en su composición química. Los nutrientes deben proporcionar estos elementos en una forma que sea accesible desde el punto de vista metabólico. Además, los microorganismos requieren energía metabólica para sintetizar macromoléculas y mantener gradientes químicos esenciales a través de sus membranas. Los factores que deben controlarse durante la proliferación incluyen nutrientes, pH, temperatura, aireación, concentración de sales y fuerza iónica del medio.

La mayor parte del peso seco de los microorganismos es materia orgánica que contiene elementos como carbono, hidrógeno, nitrógeno, oxígeno, fósforo y azufre. Además, se necesitan iones inorgánicos como potasio, sodio, hierro, magnesio, calcio y cloruro para facilitar los procesos enzimáticos y mantener los gradientes químicos a través de la membrana celular.

En su mayor parte, la materia orgánica consiste en macromoléculas formadas por enlaces anhidro entre los bloques de construcción. La síntesis de enlaces anhidro requiere energía química, que es proporcionada por dos enlaces fosfodiéster contenidos en el trifosfato de adenosina (ATP, cap. 6). La energía adicional necesaria para mantener la composición citoplásmica relativamente constante durante la proliferación se deriva de la fuerza motriz protónica, que consiste en energía potencial que puede derivarse del paso de protones a través de una membrana. En células eucariotas la membrana puede ser parte de las mitocondrias o de los cloroplastos. En células procariotas la membrana corresponde a la membrana citoplásmica de la célula.

La fuerza motriz protónica es un gradiente electroquímico con dos componentes: una diferencia en pH (concentración de iones hidrógeno) y diferencia en la carga iónica. La carga en el exterior de la membrana bacteriana es más positiva que en el interior, y la diferencia en las cargas contribuye a la liberación de energía libre cuando un protón entra al citoplasma desde fuera de la membrana. El proceso metabólico que genera la fuerza motriz protónica se revisa en el capítulo 6. La energía libre puede utilizarse para el desplazamiento de la célula, para mantener los gradientes iónicos o moleculares a través de la membrana, para sintetizar enlaces anhidro en el ATP o para diversos propósitos combinados. Asimismo, la célula puede utilizar una fuente de ATP con sus enlaces anhidro de energía para crear una fuerza motriz protónica que a su vez puede utilizarse para desplazar la célula y conservar los gradientes químicos.

Para su desarrollo, un microorganismo requiere todos los elementos en su materia orgánica y cantidades adecuadas de iones para la producción de energía y reacciones catalíticas. Además, debe haber una fuente de energía para establecer la fuerza motriz protónica y permitir la síntesis de macromoléculas. Los microorganismos varían ampliamente en sus demandas nutricionales y sus fuentes de energía metabólica.

Los tres mecanismos principales para la generación de energía metabólica son fermentación, respiración y fotosíntesis. Para el desarrollo del microorganismo debe utilizarse al menos uno de estos mecanismos.

Fermentación

La transformación de ATP en la fermentación no se acopla con la transferencia de electrones. La fermentación se caracteriza por la fosforilación del sustrato, un proceso enzimático en el cual los enlaces de pirofosfato se donan directamente al trifosfato de adenosina (ATP) por un intermediario metabólico fosforilado. El intermediario fosforilado se forma por procesos metabólicos de sustrato susceptibles de fermentación como la glucosa, lactosa o arginina. La fermentación no se acompaña de cambios en el estado general de oxidación-reducción del sustrato fermentable y por lo tanto, la composición elemental de los productos de fermentación debe ser idéntica a la de los sustratos. Por ejemplo, la fermentación de una molécula de glucosa (C₆H₁₂O₆) por la vía de Embden-Meyerhof (cap. 6) produce una ganancia neta de dos enlaces de pirofosfato en el ATP y produce dos moléculas de ácido láctico (C₃H₆O₃).

Respiración

La respiración es análoga a los procesos de acoplamiento dependientes de energía para descargar una batería. La reducción química de un oxidante (aceptor de electrones) a través de una serie específica de transportadores de electrones en la membrana establece la fuerza motriz protónica a través de la membrana bacteriana. El reductor (donador de electrones) puede ser un compuesto orgánico o inorgánico (p. ej., el ácido láctico actúa como reductor en algunos microorganismos, en tanto que el gas hidrógeno es un reductor para otros). A menudo se utiliza oxígeno gaseoso (O₂) como oxidante, pero algunos microorganismos pueden utilizar oxidantes alternativos como dióxido de carbono (CO₂), sulfato (SO₄²⁻) y nitrato (NO₃⁻).

Fotosíntesis

La fotosíntesis es similar a la respiración en el sentido de que la reducción de un oxidante a través de una serie específica de transportadores de electrones establece una fuerza motriz protónica. La diferencia en los dos procesos consiste en que en la fotosíntesis se crean el reductor y el oxidante de modo fotoquímico por medio de energía luminosa absorbida por los pigmentos en la membrana; así, la fotosíntesis continúa en tanto exista una fuente de energía luminosa. Las plantas y algunas bacterias son capaces de invertir cantidades sustanciales de energía luminosa para hacer del agua un reductor para el dióxido de carbono. El oxígeno participa en este proceso y se produce materia orgánica. La respiración, oxidación favorable desde el punto de vista energético de la materia orgánica por un aceptor de electrones como el oxígeno, puede proporcionar a los microorganismos con capacidad de fotosíntesis energía en ausencia de una fuente luminosa.

La nutrición en medios de cultivo debe contener todos los elementos necesarios para la síntesis biológica de un nuevo microorganismo. En la siguiente revisión, los nutrientes se clasifican con base en los elementos que proporcionan.

Fuentes de carbono

Como se mencionó antes, las plantas y algunas bacterias son capaces de utilizar energía de fotosíntesis para reducir el dióxido de carbono a expensas del agua. Estos microorganismos pertenecen al grupo de microorganismos autótrofos, seres vivos que no necesitan nutrientes orgánicos para su desarrollo. Otros microorganismos autótrofos son los quimiolitótrofos, que utilizan sustratos inorgánicos como hidrógeno y tiosulfato como reductor y dióxido de carbono como fuente de carbono.

Los microorganismos heterótrofos, para su desarrollo, requieren carbono orgánico que debe encontrarse en una forma que puedan asimilar. Por ejemplo, el naftaleno proporciona todo el carbón y energía necesarios para el desarrollo de microorganismos heterótrofos respiratorios, pero muy pocos microorganismos poseen la vía metabólica necesaria para la asimilación de naftaleno. Por otra parte, la glucosa puede sustentar el desarrollo mediante procesos de respiración o fermentación en muchos microorganismos. Es importante que los sustratos de crecimiento se suministren a niveles apropiados para la cepa microbiana que se está cultivando: las concentraciones que sostienen el desarrollo del microorganismo pueden inhibir el desarrollo de otro.

El dióxido de carbono es necesario para varias reacciones de fotosíntesis. Muchos microorganismos respiratorios producen más del dióxido de carbono necesario para satisfacer sus necesidades, en tanto que otros requieren fuentes de dióxido de carbono en su medio de cultivo.

Fuentes de nitrógeno

El nitrógeno es un constituyente importante de las proteínas, ácidos nucleicos y otros compuestos, y constituye casi 5% del peso seco de una bacteria típica. El nitrógeno inorgánico molecular (N₂), es muy prevalente pues constituye casi 80% de la atmósfera terrestre. Es un compuesto muy estable, principalmente porque se requieren altas cantidades de energía de activación para romper su triple enlace entre ambos átomos de nitrógeno. Sin embargo, éste puede proporcionarse en diversas formas y los microorganismos varían en cuanto a su capacidad para asimilarlo (cuadro 5-1). El producto terminal de todas las vías para la asimilación de nitrógeno es la forma más reducida del elemento, el amoniaco (NH₃). Cuando se cuenta con NH₃, se difunde hacia el interior de la mayor parte de las bacterias a través de conductos transmembrana como gas disuelto NH₃⁺ en lugar de forma de ion amonio (NH₄⁺).

La capacidad de asimilar N₂ en forma reducida como NH₃, proceso denominado fijación de nitrógeno, es una propiedad singular de las células procariotas y muy pocas bacterias son capaces de desdoblar el triple enlace entre ambos átomos de nitrógeno. Este proceso (cap. 6) necesita grandes cantidades de energía metabólica y se desactiva con facilidad por el oxígeno. La capacidad de fijación de nitrógeno se encuentra en bacterias muy divergentes que han evolucionado con estrategias bioquímicas bastante diferentes para proteger sus enzimas fijadoras de nitrógeno de la exposición con el oxígeno.

La mayor parte de los microorganismos puede utilizar NH₃ como única fuente de nitrógeno y muchos microorganismos poseen la capacidad de producir NH₃ a partir de aminas (R—NH₂) o a partir de aminoácidos (RCHNH₂COOH), por lo común en el interior de la célula. La producción de NH₃ por desaminación de aminoácidos se denomina amonificación. El amoniaco se introduce en la materia orgánica por vías bioquímicas que incluyen al glutamato y glutamina. Estas vías se revisan en el capítulo 6.

Muchos microorganismos poseen la capacidad de asimilar nitrato (NO₃^–) y nitrito (NO₂^–) mediante la conversión de estos iones en NH₃. Tales procesos se conocen como reducción de nitratos por asimilación y reducción de nitritos por asimila ción, respectivamente. Estas vías para la asimilación difieren de las vías utilizadas para catabolizar nitratos y nitritos. Las vías catabólicas utilizadas por microorganismos emplean estos iones como aceptores terminales de electrones en la respiración. Algunas bacterias autótrofas (p. ej., Nitrosomonas, Nitrobacter) son capaces de convertir NH₃ a N₂ gaseoso bajo condiciones anaerobias; este proceso se conoce como desnitrificación. Continúa en evolución la comprensión del ciclo del nitrógeno. A mediados del decenio de 1990 se descubrió la reacción de oxidación anaerobia del ion amonio (anammox). La reacción

en la cual un nitrito oxida al amoniaco, es un proceso microbiano que ocurre en aguas anóxicas en el océano y es la principal vía por la cual regresa el nitrógeno hacia la atmósfera.

Fuentes de azufre

Al igual que el nitrógeno, el azufre es un componente de muchas sustancias orgánicas de las células. Forma parte de la estructura de varias coenzimas y se encuentra en las cadenas laterales de cisteinil y metionil de las proteínas. El azufre en su forma elemental no puede utilizarse por plantas o animales. Sin embargo, algunas bacterias autótrofas pueden oxidarse a su forma de sulfato (SO₄^2–). La mayor parte de los microorganismos pueden utilizar sulfato como fuente de azufre, al reducir el sulfato al nivel de ácido sulfhídrico (H₂S). Algunos microorganismos pueden asimilar H₂S directamente del medio de cultivo, pero este compuesto puede ser tóxico para muchos de ellos.

Fuentes de fósforo

El fosfato (PO₄^3–) es necesario como componente del ATP, ácidos nucleicos y coenzimas como NAD, NADP y flavinas. Además, muchos metabolitos, lípidos (fosfolípidos, lípido A), componentes de las paredes celulares (ácido teicoico), algunos polisacáridos capsulares y algunas proteínas sufren fosforilación. El fosfato siempre se asimila en forma de fosfato inorgánico libre (P_i).

Fuentes de minerales

Numerosos minerales son necesarios para la función de las enzimas. El magnesio (Mg²⁺) y el ion ferroso (Fe²⁺) también se encuentran en derivados de porfirina: el magnesio en las moléculas de clorofila, el hierro como parte de las coenzimas de los citocromos y peroxidasas. Mg²⁺ y K⁺ son esenciales para la función e integridad de los ribosomas. El calcio es necesario como constituyente de las paredes celulares de bacterias grampositivas, aunque es indispensable para las bacterias gramnegativas. Muchos microorganismos marinos requieren Na⁺ para su desarrollo. Durante la elaboración de un medio para el cultivo de la mayor parte de los microorganismos, es necesario proporcionar fuentes de potasio, magnesio, calcio y hierro, por lo general en sus formas iónicas (K⁺, Mg²⁺, Ca²⁺ y Fe²⁺). Son necesarios muchos otros minerales (p. ej., Mn²⁺, Mo²⁺, Co²⁺, Cu²⁺ y Zn²⁺); éstos con frecuencia pueden suministrarse en agua corriente o como contaminantes de otros ingredientes de los medios de cultivo.

La captación de hierro, que forma hidróxidos insolubles a pH neutro, es facilitada en muchas bacterias y hongos por la producción de sideróforos, compuestos que tienen la capacidad de generar y favorecer su transporte en forma de complejo soluble. Esto incluye a los hidroxamatos (−CONH₂OH) conocidos como sideraminas y derivados de catecoles (p. ej., 2,3-dihidroxibenzoilserina). Los sideróforos determinados por plásmidos desempeñan una función importante en la capacidad de invasión de algunos patógenos bacterianos (cap. 7). Los mecanismos de captación de hierro dependientes de sideróforos y de no sideróforos por las bacterias se revisan en el capítulo 9.

Factores de crecimiento

Un factor de crecimiento es un compuesto orgánico que debe contener la célula a fin de desarrollarse, pero que es incapaz de sintetizar. Muchos microorganismos que reciben los nutrientes mencionados antes son capaces de sintetizar todos los bloques para la construcción de macromoléculas (fig. 5-1): aminoácidos, purinas, pirimidinas y pentosas (precursores metabólicos de ácidos nucleicos); carbohidratos adicionales (precursores de polisacáridos) y ácidos grasos y compuestos isoprenoides. Además, los microorganismos de vida libre deben ser capaces de sintetizar complejos vitamínicos que actúan como precursores de coenzimas.

Cada uno de estos compuestos esenciales se sintetiza por una secuencia de reacciones enzimáticas; cada enzima se produce bajo el control de un gen específico. Cuando un microorganismo sufre una mutación genética que da origen a la falla en una de estas funciones enzimáticas, la cadena se rompe y ya no se elabora el producto terminal. El microorganismo debe obtener el compuesto de su entorno: el compuesto se transforma en un factor de crecimiento para el microorganismo. Este tipo de mutación puede inducirse con facilidad en el laboratorio.

Diferentes especies microbianas varían ampliamente en cuanto a sus necesidades de factores de crecimiento. Los compuestos involucrados se encuentran y son esenciales en todos los microorganismos; las diferencias en cuanto a necesidades refleja las diferencias en sus capacidades de síntesis. Algunas especies no requieren factores de crecimiento, en tanto que otras (p. ej., los lactobacilos) perdieron durante su evolución la capacidad de sintetizar hasta 30 a 40 compuestos esenciales y, por tanto, necesitan obtenerlos de su medio ambiente.

Un medio de cultivo adecuado debe contener todos los nutrientes necesarios para el microorganismo a cultivar y tales factores incluyen pH, temperatura y aireación que deben ser controlados con gran cuidado. Se utiliza un medio de cultivo líquido; al medio de cultivo puede añadirse agar o gel de sílice para que adquiera consistencia de gel para situaciones especiales. El agar es un polisacárido extraído de algas marinas que es singular para el cultivo microbiano por su resistencia a la acción microbiana y porque se disuelve a 100°C pero no forma placas de gel hasta que se encuentra por debajo de 45°C; las células pueden suspenderse en el medio a 45°C y enfriar con rapidez dicho medio de cultivo hasta que adquiera la consistencia de gel, sin lesionar a las bacterias.

Nutrientes

En páginas previas se describe cada tipo de nutriente y se presenta una lista de sustancias apropiadas. En general, debe suministrarse lo siguiente: 1) donadores y aceptores de hidrógeno, casi 2 g/L; 2) fuente de carbono, casi 1 g/L; 3) fuente de nitrógeno, casi 1 g/L; 4) minerales: azufre, fósforo, casi 50 mg/L de cada uno y oligoelementos, 0.1 a 1 mg/L de cada uno, y 5) factores de crecimiento: aminoácidos, purinas y pirimidinas, casi 50 mg/L de cada uno y vitaminas, 0.1 a 1 mg/L de cada uno.

Para estudios del metabolismo microbiano, por lo general es necesario preparar un medio completamente sintético en el cual se conozcan las características y concentraciones exactas de cada uno de los ingredientes. Es mucho menos costoso y más simple utilizar materiales naturales como extractos de levaduras, proteínas ingeridas o sustancias similares. La mayor parte de los microbios de vida libre se desarrolla bien en extractos de levaduras; las formas parasitarias pueden necesitar sustancias especiales que se encuentran sólo en la sangre o en extractos de tejidos de animales. Sin embargo, hay microbios parasitarios (p. ej., Treponema pallidum) que no pueden cultivarse in vitro o que crecen en el interior de células eucariotas (p. ej., Chlamydia trachomatis).

Para muchos microorganismos, un compuesto simple (como un aminoácido) puede actuar como fuente de energía, de carbono y de nitrógeno, en tanto que otros requieren compuestos separados para cada uno de estos elementos. Si los materiales naturales para medios no sintéticos son deficientes en algún nutriente particular, deben realizarse complementaciones.

Concentración de iones hidrógeno (pH)

La mayor parte de los microorganismos tiene un pH óptimo muy estrecho. El pH óptimo debe determinarse empíricamente para cada especie. La mayor parte de los microorganismos (neutrolófilos) prolifera mejor en un pH de 6.0 a 8.0, aunque algunas formas (microorganismos acidófilos) encuentran su cifra óptima con pH de 3.0 y otros (alcalófilos) tienen un pH óptimo de hasta 10.5.

Los microorganismos regulan su pH interno pese a la amplia gama de cifras de pH externo mediante el bombeo de protones hacia el interior o al exterior de la célula. Los microorganismos acidófilos mantienen su pH interno en casi 6.5 sobre un pH externo de 1.0 a 5.0; los microorganismos neutrolófilos con pH neutro mantienen un pH interno cercano a 7.5 sobre intervalos externos de pH de 5.5 a 8.5; los microorganismos alcalófilos mantienen un pH interno de casi 9.5 sobre intervalos externos de 9.0 a 11.0. El pH interno está regulado por un grupo de sistemas de transporte de protones en la membrana citoplásmica, lo que incluye una bomba de protones controlada por ATP y un intercambiador de Na⁺/H⁺. El sistema de intercambio de K⁺/H⁺ parece contribuir a la regulación del pH interno en microorganismos con pH neutro.

Temperatura

La temperatura óptima para el cultivo de las distintas especies microbianas varía (fig. 5-2): los psicrófilos crecen mejor a temperaturas bajas (−5 a −15°C) y por lo general se encuentran en ambientes de este tipo como las regiones del Ártico y la Antártida; para los psicrotrofos, la temperatura óptima es entre 20 y 30°C, pero también crecen bien a temperaturas menores. Constituyen una causa importante de desperdicio alimentario. Los mesófilos crecen mejor entre 30 a 37°C, y la mayor parte de los termófilos crece mejor entre 50 a 60°C. Algunos microorganismos son hipertermófilos y pueden desarrollarse a temperatura de ebullición, la cual existe en sitios con alta presión como en las profundidades del océano. La mayor parte de los microorganismos son mesófilos; 30°C es la temperatura óptima para muchas formas de vida libre y la temperatura corporal del hospedador es óptima para simbiontes homeotermos.

El extremo superior de las temperaturas toleradas por cualquier especie dada se correlaciona bien con la estabilidad térmica general de las proteínas de dicha especie, medidas en extractos celulares. Los microorganismos comparten con las plantas y animales la respuesta al golpe de calor, que consiste en la síntesis transitoria de un grupo de “proteínas de golpe de calor” cuando se exponen a incrementos súbitos en la temperatura por arriba de la óptima de proliferación. Tales proteínas parecen ser inusualmente resistentes a la temperatura y estabilizan a proteínas celulares sensibles al incremento térmico.

La relación de la tasa de proliferación con la temperatura para cualquier microorganismo dado se observa en el gráfico típico de Arrhenius (fig. 5-3). Arrhenius demostró que el logaritmo de la velocidad de cualquier reacción química (log k) es una función lineal del recíproco de la temperatura (1/T); como el crecimiento celular es consecuencia de un grupo de reacciones químicas, cabría esperar que se observe esta relación. En la figura 5-3 se muestra el caso de temperaturas por arriba de intervalos normales para una especie dada; el log k disminuye linealmente con 1/T. Por arriba y por abajo del intervalo normal, log k disminuye con rapidez, de forma que se definen las temperaturas máxima y mínima.

Además de sus efectos sobre la tasa de proliferación, las temperaturas extremas matan a los microorganismos. La temperatura muy elevada se utiliza para esterilizar preparaciones (cap. 4); el frío extremo también destruye microorganismos, aunque no puede utilizarse con seguridad con fines de esterilización. Las bacterias también muestran el fenómeno conocido como cho que de enfriamiento, en el que las células mueren con el enfriamiento rápido (a diferencia de lo que ocurre con el enfriamiento lento). Por ejemplo, el enfriamiento rápido de Escherichia coli de 37 a 5°C puede destruir 90% de las células. Varios compuestos protegen a las células del choque de calor o de congelamiento; a menudo se utilizan glicerol y dimetil sulfóxido.

Aireación

En el capítulo 6 se revisa la función del oxígeno como aceptor de hidrógeno. Muchos microorganismos son aerobios obligados, esto es, necesitan oxígeno como aceptor de hidrógeno; otros son anaerobios facultativos, es decir, tienen la capacidad de vivir en forma aeróbica o anaeróbica; en tanto que otros son anaerobios obligados, pues necesitan una sustancia distinta al oxígeno como aceptor de hidrógeno y son sensibles a la inhibición de oxígeno; otros más son microaerófilos, que necesitan pequeñas cantidades de oxígeno (2 a 10 %) para la respiración aerobia (la concentración más elevada es inhibidora); y otros son anaerobios aerotolerantes, pues son indiferentes al oxígeno. Éstos pueden crecer en su presencia pero no lo utilizan como aceptor de hidrógeno (fig. 5-4).

Los productos secundarios naturales del metabolismo aerobio son compuestos reactivos de peróxido de hidrógeno (H₂O₂) y superóxido (O₂^–). En presencia de hierro estas sustancias generan radicales hidroxilo (•OH) que pueden dañar cualquier macromolécula biológica:

Muchos microorganismos anaerobios y anaerobios tolerantes al aire se protegen de estos productos por la presencia de superóxido dismutasa, una enzima que cataliza la reacción

y por la presencia de una catalasa, una enzima que cataliza la reacción

Algunos microorganismos fermentados (p. ej., Lactobacillus plantarum) son tolerantes al aire pero no contienen catalasa o superóxido dismutasa. No hay reducción del oxígeno y por lo tanto no se producen H₂O₂ y O₂^–. Todos los anaerobios estrictos carecen de superóxido dismutasa y catalasa. Algunos microorganismos anaerobios (p. ej., Peptococcus anaerobius) tienen tolerancia considerable al oxígeno como consecuencia de su capacidad para producir cifras elevadas de la enzima (NADH oxidasa) que reduce oxígeno a agua con base en la reacción

El peróxido de hidrógeno debe gran parte de su toxicidad al daño que causa al DNA. Los mutantes con reparación deficiente del DNA son excepcionalmente sensibles al peróxido de hidrógeno; el producto génico recA participa en la recomendación genética y en la reparación, y ha mostrado tener más importancia que la catalasa o la superóxido dismutasa para proteger células de E. coli contra la toxicidad por peróxido de hidrógeno.

El proporcionar aire a los cultivos de bacterias aerobias es un problema técnico mayor. Por lo común se lleva a cabo un mezclado mecánico para introducir oxígeno al medio de cultivo, o bien, se fuerza el paso de aire a través del medio de cultivo por medio de presión. La difusión de oxígeno a menudo se vuelve un factor limitante en la proliferación de bacterias aerobias; cuando se alcanza una concentración de 4 a 5 × 10⁹/ml de células, la tasa de difusión de oxígeno limita la tasa de proliferación de las células en gran medida.

Por otra parte, los anaerobios obligados presentan el problema de la eliminación del oxígeno. Se dispone de muchos métodos para lograr esto: pueden añadirse agentes reductores como el tioglicolato de sodio a los cultivos líquidos; los tubos de agar pueden sellarse con una capa de vaselina y parafina; las placas de cultivo deben colocarse en un contenedor al cual se le retira el oxígeno por medio de vacío o por agentes químicos, o bien el microorganismo puede manipularse en una caja cerrada en un medio anaerobio.

Concentración iónica y presión osmótica

En menor grado, deben controlarse factores como la presión osmótica y concentración de sales. Para la mayor parte de los microorganismos, las propiedades de los medios de cultivo ordinarios son satisfactorias; sin embargo, para formas marinas y microorganismos adaptados para crecer en soluciones hipertónicas de azúcar, por ejemplo, deben tomarse en consideración tales factores. Los microorganismos que requieren concentraciones elevadas de sales se denominan halófilos; aquellos que requieren presiones osmóticas elevadas se denominan osmófilos.

La mayor parte de las bacterias son capaces de tolerar amplias variaciones de presión osmótica externa y de fuerza iónica debido a su capacidad para regular la osmolalidad interna y la concentración iónica. La osmolalidad está regulada por transporte activo de iones de K⁺ hacia el interior de la célula; la concentración iónica interna se mantiene constante debido a la excreción compensadora de putresceína, una poliamina orgánica con carga positiva. Como la putresceína transporta varias cargas positivas por molécula, una gran reducción en la concentración iónica se lleva a cabo con un pequeño costo en la concentración osmótica.

Deben considerarse dos problemas: elección del medio de cultivo apropiado y aislamiento de un microorganismo bacteriano.

Medios de cultivo

La técnica y medio de cultivo utilizados dependen de la naturaleza de la investigación. En términos generales, pueden encontrarse tres situaciones: 1) tal vez sea necesario cultivar un grupo de células de una especie en particular que se encuentran a la mano; 2) puede ser necesario establecer el número y tipo de microorganismos presentes en un material dado, o 3) podría desearse el aislamiento de un tipo particular de microorganismo a partir de una fuente natural.

A. Desarrollo celular de una especie dada

Los microorganismos observados en el microscopio pueden proliferar en su ambiente natural y pueden ser extremadamente difíciles de hacer crecer en un medio de cultivo artificial puro. Ciertas formas parasitarias nunca han sido cultivadas fuera del hospedador. Sin embargo, en términos generales puede diseñarse un medio de cultivo apropiado para reproducir cuidadosamente las condiciones encontradas en el entorno natural del microorganismo. El pH, temperatura y aireación son fáciles de duplicar; los nutrientes presentes constituyen el mayor problema. La contribución por el entorno en que se desarrolla el microorganismo es importante y difícil de analizar; un parásito podría necesitar un extracto de tejido del hospedador; una forma de vida libre podría necesitar una sustancia excretada por un microorganismo y con la cual se encuentra asociada. Podría ser necesaria una gran cantidad de experimentación para establecer las necesidades del microorganismo y el éxito depende de proporcionar una fuente apropiada de cada uno de los nutrientes mencionados al inicio de este capítulo. El cultivo de parásitos obligados como clamidias se revisa en el capítulo 27.

B. Estudio microbiológico de materiales naturales

Un material dado puede contener muchos microambientes diferentes y cada uno proporciona un nicho para diferentes especies. El cultivo de una muestra de material bajo cierto grupo de condiciones permitirá que un grupo selecto de formas produzca colonias, pero podría ocasionar que se pasen por alto muchos otros tipos. Por tal razón, se acostumbra cultivar las muestras de mar utilizando diversos medios de cultivo con diferentes condiciones de incubación, según sea posible en condiciones prácticas. No es irracional utilizar seis u ocho medios de cultivo y condiciones de cultivo diferentes si se van a identificar la mayor parte de las formas presentes.

Debido a que cada tipo de microorganismo debe tener la posibilidad de proliferar, se utilizan medios sólidos para evitar el aglomeramiento de colonias. Por otra parte, la competencia evitará que se formen algunos tipos de colonias.

C. Aislamiento de un microorganismo en particular

Una pequeña muestra de tierra, si se manipula de manera apropiada, permite el cultivo de diferentes tipos de microorganismos en cada microentorno presente. Para la tierra fértil (húmeda, aireada, rica en minerales y material orgánico) esto significa que pueden aislarse cientos o incluso miles de tipos bacterianos, lo cual se lleva a cabo al seleccionar el tipo deseado. Por ejemplo, 1 g de tierra se inocula en un frasco de medio de cultivo líquido que se elaboró con el fin de favorecer el crecimiento de un tipo de microorganismo, como bacterias aerobias fijadoras de nitrógeno (azobacterias). En este caso, el medio no contiene nitrógeno combinado y se incuba en un medio aerobio. Si las azobacterias están presentes en la tierra, proliferan bien en este medio de cultivo; las formas incapaces de fijar nitrógeno crecerán sólo en la medida que la tierra tenga contaminantes que fijen nitrógeno en el medio. Cuando el cultivo se ha desarrollado por completo, el porcentaje de azobacterias en la población total se habrá incrementado en gran medida; este método se denomina cultivo enriquecido. La transferencia de una muestra de este cultivo a un medio fresco dará origen a un enriquecimiento adicional de las azobacterias; después de varias transferencias seriadas el cultivo puede colocarse en un medio de cultivo sólido enriquecido, lo que permite el aislamiento de colonias de azobacterias.

El medio líquido se utiliza para permitir la competencia y, por lo tanto, es la selección óptima, incluso cuando el tipo deseado es representado en la tierra por sólo una pequeña cantidad de células en una población de millones. Pueden obtenerse ventajas del “enriquecimiento natural”. Por ejemplo, al observar oxidantes de queroseno, se elige tierra contaminada con aceite, porque este es un medio ya enriquecido para tales formas bacterianas.

El enriquecimiento de cultivos es un procedimiento por medio del cual se prepara el medio de cultivo para duplicar el ambiente natural (“nicho”) del microorganismo deseado, por lo que se permite su selección. Un principio importante involucrado en tal selección es el siguiente: el microorganismo seleccionado será del tipo del cual se han satisfecho sus necesidades nutricionales. Por ejemplo, las azobacterias crecen en un medio de cultivo que contiene nitrógeno orgánico, pero sus necesidades mínimas consisten en la presencia de N₂; por lo tanto, se elige un medio de cultivo que contenga N₂ como la única fuente de nitrógeno. Si se añade nitrógeno orgánico al medio de cultivo, las condiciones ya no serán selectivas para azobacterias, sino que serán para formas para las cuales el nitrógeno orgánico es una necesidad mínima.

Cuando se busca un tipo específico de microorganismo que forma parte de una población mixta, se utilizan medios de cultivo selectivos o diferenciales. Los medios selectivos inhiben el crecimiento de los demás microorganismos fuera del que se está buscando. Por ejemplo, el agar de Thayer-Martin se utiliza para aislar a Neisseria gonorrhoeae, causa de la gonorrea, de las muestras clínicas. Los medios diferenciales contienen sustancias que ciertas bacterias cambian de determinada manera. Por ejemplo, las colonias de E. coli tienen un color verdoso iridiscente característico al cultivarse en agar que contiene eosina y azul de metileno (agar EMB). El agar EMB contiene altas concentraciones de un carbohidrato que ocasiona que los microorganismos que fermentan azúcar formen colonias de color rojizo. Los medios de cultivo diferenciales se utilizan para propósitos como la identificación de bacterias entéricas en agua o leche, y la presencia de ciertos patógenos en muestras clínicas.

En el cuadro 5-2 se muestran ejemplos de condiciones de cultivo enriquecidos y tipos de bacterias que seleccionarán. Sin embargo, pese a los mejores esfuerzos, muchos ambientes contienen numerosas bacterias no cultivadas.

Aislamiento de microorganismos en cultivos puros

A fin de estudiar las propiedades de un microorganismo dado, es necesario manipularlo en cultivos puros sin otros tipos de microorganismos. Para llevar a cabo esto, debe aislarse una sola célula de todas las demás y cultivarse de forma tal que su progenie permanezca aislada. Se dispone de varios métodos.

A. Cultivo en placa

A diferencia de las células en medio líquido, las células en un medio de gel se encuentran inmobilizadas. Por lo tanto, si se colocan pocas células en un medio de gel, cada célula prolifera en una colonia aislada. El agente ideal para la formación de gel para la mayor parte de los medios de cultivo microbiológico es el agar, un polisacárido ácido extraído de ciertas algas rojas. Una suspensión al 1.5 a 2% en agua se disuelve a 100°C, dando origen a una solución clara que se gelifica a 45°C. Así, una solución de agar estéril puede enfriarse a 50°C, se añaden bacterias u otro microorganismo y más tarde la solución se enfría con rapidez por debajo de 45°C para formar un gel. (Aunque la mayor parte de las células microbianas se destruye a 50°C, el proceso de destrucción es lo suficientemente lento a esta temperatura para permitir que se lleve a cabo el procedimiento; fig. 4-3). Una vez formado el gel, el agar no vuelve a tornarse líquido hasta que se calienta por arriba de 80°C, de manera que cualquier temperatura es apropiada para la incubación de un medio de cultivo microbiano. Para el método de vertido en placa se mezcla una suspensión de células con agar líquido a 50°C y se vierte en una caja de Petri. Cuando el agar se torna sólido, las células permanecen inmóviles en éste y proliferan dando origen a colonias. Si la suspensión celular está lo suficientemente diluida, las colonias se encontrarán bien separadas, de forma que cada una tiene una alta probabilidad de derivarse de una sola célula (fig. 5-5). Sin embargo, para tener la certeza es necesario tomar una colonia del tipo deseado, suspenderla en agua y repetir el procedimiento. La repetición de este procedimiento en varias ocasiones asegura que se obtenga un cultivo puro.

Otro método consiste en crear estrías de la suspensión original sobre una placa de agar con un asa de alambre (técnica de estriado en placa). Conforme se continúa con la creación de estrías, cada vez queda un menor número de células en el asa y por último el asa depositará una sola célula en el agar (fig. 5-6). La placa se incuba y cualquier colonia bien aislada se retira, se vuelve a suspender en agua y se repite el procedimiento en agar. Si la suspensión se vuelve a someter al método de estriado en placa (y no sólo una parte de la colonia), este método es tan fiable y mucho más rápido que el método de vertido en placa.

En la técnica de extensión en placa, un pequeño volumen de suspensión microbiana diluida que contiene 30 a 300 células se transfiere hacia el centro de la placa de agar y se extiende en forma uniforme sobre la superficie con una varilla de cristal estéril, doblada. Las células dispersadas dan origen a colonias. El número de colonias debe ser similar al número de microorganismos viables en la muestra y, por lo tanto, la técnica de extensión en placa puede utilizarse para contar la población microbiana.

B. Dilución

Un método mucho menos fiable es el de la dilución hasta la extinción. Se realizan diluciones seriadas de la suspensión y las muestras de cada dilución se cultivan en placa. Si sólo unas cuantas muestras de una dilución en particular muestran crecimiento, se supone que algunas de las colonias iniciaron a partir de una sola célula. Este método no se utiliza a menos que sea imposible el cultivo en placa por alguna razón. Una característica indeseable de este método es que sólo puede utilizarse para aislar el tipo predominante de microorganismo en una población mixta.

RESUMEN DEL CAPÍTULO

• Un microorganismo necesita todos los elementos en su materia orgánica y el complemento total de iones necesarios para su actividad con el fin de crecer. Los nutrientes se clasifican según los elementos que proporcionan, incluidos una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, una fuente de azufre, una fuente de fósforo y fuentes de minerales.

• Los factores de crecimiento son compuestos orgánicos que debe poseer una célula para crecer pero que no puede sintetizar.

• También es fundamental una fuente de energía para establecer una fuerza protomotriz y poder permitir la síntesis macromolecular. Los tres principales mecanismos para generar energía metabólica son fermentación, respiración y fotosíntesis.

• Ciertos factores ambientales como el pH, la temperatura y la aireación son importantes para el crecimiento. La mayor parte de los microorganismos patógenos para el ser humano son neutrolófilos (crecen mejor a un pH de 6.0 a 8.0) y mesófilos (crecen mejor a 30-37°C).

• La capacidad de los microorganismos para utilizar oxígeno como aceptor de hidrógeno y para desactivar los productos intermedios nocivos del metabolismo aerobio varían mucho entre los microorganismos. Se pueden dividir en aerobios obligados, anaerobios facultativos, anaerobios obligados, microaerófilos y anerobios aerotolerantes.

• Es posible preparar medios microbiológicos para permitir el crecimiento de determinado tipo de microorganismo cuyo número es reducido (medio de cultivo enriquecido), identificar tipos específicos de microorganismos (medio de cultivo diferencial) o aislar a un microorganismo específico en una población mixta (medio de cultivo selectivo).