Capítulo 6: Metabolismo microbiano

El crecimiento microbiano requiere la polimerización de bloques bioquímicos de construcción para dar origen a proteínas, ácidos nucleicos, polisacáridos y lípidos. Los bloques de construcción pueden encontrarse preformados en el medio de cultivo o pueden sintetizarlo las células en crecimiento. Las demandas biosintéticas adicionales dependen de las necesidades de coenzimas para que participen en la catálisis enzimática. Las reacciones biosintéticas de polimerización requieren la transferencia de enlaces anhídrido a partir del ATP. Para el crecimiento es necesaria una fuente de energía metabólica para la síntesis de enlaces anhídrido y para la conservación de los gradientes transmembrana de iones y metabolitos.

El metabolismo tiene dos componentes, catabolismo y anabolismo (fig. 6-1). El catabolismo comprende procesos que albergan energía liberada a partir de la degradación de compuestos (p. ej., glucosa) y utilizando esa energía para sintetizar ATP. Por el contrario, el anabolismo o biosíntesis, comprende procesos que utilizan la energía almacenada en el ATP para sintetizar y formar las subunidades, o bloques de construcción, de macromoléculas que componen la célula.

La secuencia de bloques de construcción en una macromolécula depende de una de dos vías. En los ácidos nucleicos y proteínas es dirigida por una plantilla: el DNA actúa como plantilla para su propia síntesis y para la síntesis de diversos tipos de RNA; el RNA mensajero actúa como plantilla para la síntesis de proteínas. Por otra parte, para los carbohidratos y lípidos la disposición de los bloques de construcción depende en su totalidad de enzimas específicas. Una vez que se han producido las macromoléculas, se ensamblan para dar origen a estructuras supramoleculares de la célula; por ejemplo, ribosomas, membranas, pared celular, flagelos y pilosidades.

La tasa de síntesis de macromoléculas y la actividad de las vías metabólicas debe ser regulada de forma que la biosíntesis permanezca en equilibrio. Todos los componentes necesarios para la síntesis de macromoléculas deben estar presentes para un crecimiento ordenado y debe ejercerse control de forma tal que los recursos de la célula no deben dar origen a productos que no contribuyan al crecimiento o supervivencia de la célula.

El capítulo contiene una revisión del metabolismo microbiano y su regulación. Los microorganismos representan extremos de la divergencia de la evolución y se encuentra una amplia gama de vías metabólicas en este grupo. Por ejemplo, cualquiera de más de media docena de vías metabólicas diferentes puede utilizarse para la asimilación de benzoato, un compuesto relativamente simple, y una vía simple para la asimilación de benzoato puede ser regulada por más de media docena de mecanismos de control. El objetivo de los autores es ilustrar los principios subyacentes a las vías metabólicas y su regulación. El principio fundamental que determina las vías metabólicas es el logro de unas cuantas reacciones bioquímicas relativamente organizadas en un orden específico. Muchas vías biosintéticas pueden deducirse al examinar las estructuras químicas del material inicial, el producto terminal y quizá uno o dos intermediarios metabólicos. El principio subyacente principal de la regulación metabólica es que las enzimas tienden a participar sólo cuando se demanda su actividad catalítica. La actividad de una enzima puede cambiarse al modificarse las cantidades de la misma o la cantidad de sustrato. En algunos casos, las actividades enzimáticas se alteran al unirse a efectores específicos, metabolitos que modulan la actividad enzimática.

Interconversiones de glucosa 6-fosfato y carbohidratos

Los orígenes biosintéticos de los bloques de construcción y coenzimas provienen de unos cuantos precursores, llamados metabolitos focales. En las figuras 6-2 y 6-5 se ilustra la manera como los metabolitos focales respectivos, glucosa 6-fosfato (G6PD), fosfoenolpiruvato, oxaloacetato y α-cetoglutarato originan la mayor parte de los productos biosintéticos terminales.

En la figura 6-2 se ilustra la forma en que la G6PD se convierte a diversos productos terminales a través de ésteres de fosfato o de carbohidratos con diferentes longitudes de cadena. Los carbohidratos poseen la fórmula empírica (CH₂O) y el objetivo primario del metabolismo de los carbohidratos es modificar n, es decir, la longitud de la cadena de carbonos. El mecanismo por el cual la longitud de la cadena de fosfatos de carbohidrato se interconvierte se resume en la figura 6-6. En un caso se utilizan reacciones de oxidación para eliminar un carbono de la molécula de G6PD, produciendo un derivado pentosa, la ribulosa 5-fosfato. Las reacciones de isomerasa y epimerasa transforman las formas bioquímicas más comunes de las pentosas: ribulosa 5-fosfato, ribosa 5-fosfato y xilulosa 5-fosfato. Las transcetolasas transfieren un fragmento de los carbonos de una molécula donadora a una aceptora. Estas reacciones permiten que se produzcan pentosas o que éstas se formen a partir de carbohidratos con diferentes longitudes de cadena. Como se muestra en la figura 6-6, dos moléculas de pentosa 5-fosfato (n = 5) se interconvierten con triosa 3-fosfato (n = 3) y heptosa 7-fosfato (n = 7); la pentosa 5-fosfato (n = 5) y tetrosa 4-fosfato (n = 4) se interconvierten con triosa 3-fosfato (n = 3) y hexosa 6-fosfato (n = 6).

La cadena hexosa (de seis carbonos) de la fructosa 6-fosfato puede convertirse a dos moléculas de triosa (tres carbonos) por la acción consecutiva de cinasas y aldolasas que actúan sobre la fructosa 6-fosfato. También las aldolasas actúan en combinación con las fosfatasas que en conjunto pueden utilizarse para incrementar la longitud de las moléculas de carbohidratos: las moléculas de triosa-fosfato pueden dar origen a fructosa 6-fosfato; una triosa-fosfato y tetrosa 4-fosfato pueden dar origen a heptosa 7-fosfato. La forma final de la interconversión en la longitud de la cadena del carbohidrato es la reacción de transaldolasa, en la cual ocurre la interconversión de heptosa 7-fosfato y triosa 3-fosfato a tetrosa 4-fosfato y hexosa 6-fosfato.

La vía alternativa de las hexosas monofosfatadas (fig. 6.7) ilustra la coordinación de diferentes reacciones que implican la reestructuración (o el reordenamiento) de carbohidratos para cumplir con un objetivo metabólico. Las cianobacterias utilizan este ciclo para reducir la molécula dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD⁺, nicotinamide adenine dinucleotide) en dinucleótido de nicotinamida y adenina reducido (NADH, reduced ni cotinamide adenine dinucleotide), el cual funciona como agente reductor para procesos de respiración que ocurren durante la oscuridad. Numerosos organismos utilizan la vía alternativa de las hexosas monofosfatadas para reducir el dinucleótido de noctinamida y adenina fosfatado (NADP⁺, nicotinamide ade nine di nucleotide phosphate) en dinucleótido de noctinamida y adenina fosfatado reducido (NADPH, reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate), una molécula que se usa en reacciones de reducción biosintéticas. El primer paso en la vía de monofosfato de hexosa son las reacciones de oxidación que acortan las moléculas de hexosa 6-fosfato (abreviado como C₆ en la figura 6-7) a pentosa 5-fosfato (abreviado como C₅). Las reacciones de redisposición de los carbohidratos convierten seis moléculas de C₅ a cinco moléculas de C₆, de forma que puede continuar el ciclo de oxidación.

Claramente, todas las reacciones para la interconversión de carbohidratos con incremento de la longitud de las cadenas no se llevan a cabo al mismo tiempo. La selección de grupos específicos de enzimas, que en esencia determinan la vía metabólica a seguir, depende de la fuente de carbono y de las demandas biosintéticas de las células. Por ejemplo, una célula que utiliza triosa-fosfato como fuente de carbohidratos utilizará una combinación de aldolasa-fosfatasa para dar origen a fructosa 6-fosfato; no es de esperarse que la cinasa que actúa sobre la fructosa 6-fosfato en su interconversión a triosa-fosfato se active bajo tales circunstancias. Si las demandas para pentosa 5-fosfato son elevadas, como en el caso de la asimilación fotosintética de dióxido de carbono, las transcetolasas pueden dar origen a pentosa 5-fosfato que son muy activas.

En suma, la G6PD puede considerarse como un metabolito focal porque actúa como precursor directo para la construcción de bloques metabólicos y como fuente de carbohidratos de longitud variable que se utilizan con fines biosintéticos. La G6PD misma puede ser generada a partir de otros carbohidratos fosforilados por la selección de vías a partir de un grupo de reacciones para la interconversión de la longitud de las cadenas de carbohidratos. Las reacciones elegidas dependen del potencial genético de la célula, de la fuente primaria de carbono y de las demandas biosintéticas del organismo. Es necesaria la regulación metabólica para asegurar que las reacciones satisfagan las necesidades del organismo.

Formación y utilización de fosfoenolpiruvato

Las moléculas de triosa-fosfato se forman por la interconversión de fosfoésteres de carbohidrato y sufren interconversión a fosfoenolpiruvato por una serie de reacciones que se muestran en la figura 6-8. La oxidación de gliceraldehído 3-fosfato por NAD⁺ se acompaña de la formación de enlaces anhídrido en uno de los carbonos de la molécula de 1,3-difosfoglicerato. Este anhídrido de fosfato se transfiere en una fosforilación de sustrato a difosfato de adenosina (ADP, adenosine diphosphate), dando origen a enlaces ricos en energía en el ATP. Otro enlace de fosfato rico en energía se forma por la deshidratación del 2-fosfoglicerato a fosfoenolpiruvato; a través de otra fosforilación de sustrato, el fosfoenolpiruvato puede donar enlaces ricos en energía al ADP, dando origen a la formación de ATP y piruvato. Así, pueden obtenerse dos enlaces ricos en energía en el ATP por medio de interconversión metabólica de triosa-fosfato a piruvato. Este es un proceso oxidativo y en ausencia de un aceptor exógeno de electrones, el NADH generado por la oxidación de gliceraldehído 3-fosfato debe oxidarse a NAD⁺ por medio de piruvato o por metabolitos derivados a partir del piruvato. Los productos formados como consecuencia de este proceso varían y se describen más tarde en este capítulo y pueden utilizarse en la identificación de bacterias de importancia clínica.

La formación de fosfoenolpiruvato a partir de piruvato requiere cantidades sustanciales de energía metabólica e invariablemente en el proceso se invierten dos enlaces anhídrido de ATP. Algunos microorganismos (p. ej., Escherichia coli) producen directamente la fosforilación del piruvato con ATP, dando origen a monofosfato de adenosina (AMP, adenosine monophosphate) y fosfato inorgánico (P_i, inorganic phosphate). Otros organismos utilizan dos pasos metabólicos: se invierte un enlace de pirofosfato de ATP en la carboxilación del piruvato a oxaloacetato y un segundo enlace de pirofosfato (a menudo donado por trifosfato de guanosina [GTP, guanosine triphosphate], en vez de ATP) para generar fosfoenolpiruvato a partir de oxaloacetato.

Formación y utilización de oxaloacetato

Como se describió antes, muchos organismos producen oxaloacetato por una carboxilación de piruvato dependiente de ATP. Otros organismos, como E. coli, que forman fosfoenolpiruvato directamente a partir de piruvato, sintetizan oxaloacetato por carboxilación de fosfoenolpiruvato.

La succinil-CoA es necesaria como precursor biosintético para la síntesis de porfirinas y de otros compuestos esenciales. Algunos organismos forman succinil-CoA por la reducción de oxaloacetato a través de malato y fumarato. Estas reacciones representan un flujo metabólico invertido que se observa en el ciclo del ácido tricarboxílico (fig. 6-11).

Formación de cetoglutarato α a partir de piruvato

Las conversiones de piruvato a cetoglutarato α requieren de una vía metabólica que diverge y más tarde converge (fig. 6-9). En una vía, se forma oxaloacetato por carboxilación de piruvato o fosfoenolpiruvato. En la otra vía, se oxida el piruvato a acetil-CoA. Cabe hacer notar que, sin importar el mecanismo enzimático utilizado para la formación de oxaloacetato, se necesita acetil-CoA como efector metabólico positivo para este proceso. Así, la síntesis de oxaloacetato se equilibra con la producción de acetil-CoA. La condensación de oxaloacetato con acetil-CoA da origen a la formación de citrato. La isomerización de la molécula de citrato produce isocitrato, el cual sufre descarboxilación oxidativa para dar origen a cetoglutarato α.

Crecimiento con acetato

El acetato se metaboliza a través de acetil-CoA, y muchos organismos poseen la capacidad de formar acetil-CoA (fig. 6-10). La molécula de acetil-CoA se utiliza para la biosíntesis de cetoglutarato α y en la mayor parte de los organismos con mecanismos respiratorios, los fragmentos acetilo de acetil-CoA sufren oxidación completa a dióxido de carbono a través del ciclo de los ácidos tricarboxílicos (fig. 6-11). La capacidad de utilizar acetato como fuente neta de carbono se limita a unos cuantos microorganismos y plantas. La síntesis neta de precursores biosintéticos a partir de acetato se logra a través de reacciones de acoplamiento del ciclo del ácido tricarboxílico con dos reacciones adicionales catalizadas por isocitrato liasa y malato sintasa. Como se muestra en la figura 6-12, estas reacciones permiten la conversión oxidativa neta de dos radicales acetilo a partir de acetil-CoA a una molécula de succinato. El succinato puede utilizarse con fines biosintéticos después de su conversión a oxaloacetato, cetoglutarato α, fosfoenolpiruvato o G6PD.

Crecimiento con dióxido de carbono: ciclo de Calvin

Al igual que las plantas y algas, varias especies microbianas pueden utilizar dióxido de carbono como única fuente de carbono. En casi todos estos organismos, la vía primaria de asimilación de carbono es a través del ciclo de Calvin, en el cual el dióxido de carbono y el difosfato de ribulosa se combinan para formar dos moléculas de 3-fosfoglicerato (fig. 6-13A). El 3-fosfoglicerato sufre fosforilación a 1,3-difosfoglicerato y este compuesto se reduce a gliceraldehído 3-fosfato, un derivado triosa. Las reacciones de la disposición de carbohidratos (fig. 6-6) permiten que los fosfatos de triosa se conviertan a ribulosa 5-fosfato, un derivado pentosa, el cual sufre fosforilación para regenerar la molécula aceptora, ribulosa 1,5-difosfato (fig. 6-13B). El carbono adicional reducido, formado por la asimilación de reducción del dióxido de carbono, se convierte a metabolitos focales para las vías de biosíntesis.

Las células que utilizan dióxido de carbono como única fuente de carbono se denominan autótrofas y las demandas para este patrón de asimilación de carbono pueden resumirse brevemente como sigue: además de las reacciones primarias de asimilación que dan origen a 3-fosfoglicerato, debe existir un mecanismo para la regeneración de la molécula aceptora, ribulosa 1,5-difosfato. Este proceso demanda una reducción dependiente de energía del 3-fosfoglicerato hasta el nivel de carbohidrato. Así, para los mecanismos autótrofos se requieren dióxido de carbono, ATP, NADPH y un grupo de enzimas específicas.

Despolimerasas

Muchos sustratos potenciales para el crecimiento se encuentran en forma de bloques de construcción en la estructura de polímeros biológicos. Estas moléculas grandes no se transportan con facilidad a través de la membrana celular y a menudo permanecen fijas a estructuras celulares incluso más grandes. Muchos microorganismos producen despolimerasas que hidrolizan proteínas, ácidos nucleicos, polisacáridos y lípidos. El patrón de las actividades de despolimerasas puede ser útil en la identificación de microorganismos.

Oxigenasas

Muchos compuestos en el medio ambiente son relativamente resistentes a la modificación enzimática; la utilización de estos compuestos como sustratos para el crecimiento demanda una clase especial de enzimas, las oxigenasas. Tales enzimas utilizan directamente el oxígeno molecular, un oxidante potente, como sustrato para las reacciones que convierten compuestos relativamente intratables a una forma en la cual pueden asimilarse, lo que es favorecido por reacciones termodinámicas. En la figura 6-14 se ilustra la acción de las oxigenasas y se muestra la participación de dos oxigenasas diferentes en la utilización del benzoato.

Vías de reducción

Algunos microorganismos viven en entornos extremadamente reductores que favorecen reacciones químicas que no ocurrirían en organismos que utilizan oxígeno como aceptor de electrones. En estos organismos pueden utilizarse reductores potentes para favorecer reacciones que permitan la asimilación de compuestos relativamente intratables. Un ejemplo es la asimilación por reducción del benzoato, un proceso en el cual el anillo aromático sufre reducción y se rompen sus enlaces para dar origen a pimelato de ácido dicarboxílico. Reacciones metabólicas adicionales convierten el pimelato en metabolitos focales.

Asimilación de nitrógeno

La asimilación reductiva de nitrógeno molecular, también conocida como fijación de nitrógeno es necesaria para la continuación de la vida en este planeta. La fijación de nitrógeno se logra por diversas bacterias y cianobacterias utilizando varios componentes del complejo enzimático de nitrogenasas. Pese a los diversos microorganismos capaces de fijar nitrógeno, el complejo de nitrogenasas es similar en la mayor parte de ellos (fig. 6-15). La nitrogenasa es un complejo de dos enzimas: una enzima contiene hierro (dinitrogenasa reductasa) y otra contiene hierro y molibdeno (dinitrogenasa). En conjunto, estas enzimas catalizan la siguiente reacción:

Por la alta energía de activación para el desdoblamiento del triple enlace, que es muy fuerte y que une los dos átomos de nitrógeno, esta asimilación de reducción de nitrógeno demanda una cantidad sustancial de energía metabólica. Se hidrolizan entre 20 y 24 moléculas de ATP para que se reduzca una sola molécula de N₂ a dos moléculas de NH₃.

Demandas fisiológicas adicionales dependen del hecho de que la nitrogenasa se desactiva con facilidad en presencia de oxígeno. Los microorganismos aerobios que utilizan nitrogenasa han desarrollado un elaborado mecanismo para proteger la enzima contra la desactivación. Algunos organismos crean células especializadas en las cuales tienen lugar la fijación de nitrógeno y en otras se ha desarrollado una cadena de transporte de electrones para proteger las nitrogenasas contra la desactivación por el oxígeno. Las baterías de mayor importancia en la agricultura son las Rhizobiaceae, que fijan nitrógeno en forma simbiótica en nódulos de la raíz de plantas leguminosas.

La capacidad de utilizar amoniaco como fuente de nitrógeno se encuentra ampliamente distribuida entre los microorganismos. El sitio primario de entrada del nitrógeno en el metabolismo del carbono es el glutamato, el cual se forma por aminación reductiva de cetoglutarato α. Como se muestra en la figura 6-16, hay dos mecanismos bioquímicos por los cuales puede llevarse esto a cabo. El primero de ellos es la reducción en un solo paso catalizada por la glutamato deshidrogenasa (fig. 6-16A), la cual es eficaz en ambientes en los cuales existe un suministro amplio de amoniaco. El otro mecanismo es un proceso de dos pasos en el cual la glutamina es un producto intermedio (fig. 6-16B), que se utiliza en ambientes con escacez de suministro de amoniaco. Este último mecanismo muestra que las células invierten energía libre formada por la hidrólisis de enlaces de pirofosfato en el ATP para la asimilación de amoniaco del medio ambiente.

El nitrógeno amida de la glutamina es un intermediario en el proceso de asimilación de dos pasos del amoniaco a glutamato (fig. 6-16B), el cual se transfiere directamente en el nitrógeno orgánico que aparece en las estructuras de purinas, pirimidinas, arginina, triptófano y glucosamina. La actividad y síntesis de la glutamina sintasa está regulada por el suministro de amoniaco y por la disponibilidad de metabolitos que contengan nitrógeno derivado directamente del nitrógeno amida de la glutamina.

La mayor parte del nitrógeno orgánico en las células se deriva del grupo amino α del glutamato y la transaminación es el mecanismo principal por el cual se transfiere el nitrógeno. El aceptor habitual en estas reacciones es un cetoácido α, que se transforma al aminoácido α correspondiente. El cetoglutarato α es otro producto de reacciones de transaminación y puede convertirse en glutamato por aminación reductiva (fig. 6-16).

Seguimiento de las estructuras de precursores biosintéticos: glutamato y aspartato

En muchos casos, los esqueletos de carbono de un producto metabólico terminal pueden rastrearse hasta sus orígenes biosintéticos. La glutamina es un ejemplo obvio que se deriva claramente del glutamato (fig. 6-17). El esqueleto del glutamato en la estructura de arginina y prolina (fig. 6-17) es menos obvio pero se identifica con facilidad. De la misma forma, el esqueleto de carbono del aspartato, que se deriva directamente del metabolito focal oxaloacetato, es evidente en las estructuras de asparagina, treonina, metionina y pirimidinas (fig. 6-18). En algunos casos, diferentes esqueletos de carbono se combinan en una vía sintética. Por ejemplo, el semialdehído de aspartato y el piruvato se combinan para dar origen a precursores metabólicos de lisina, ácido diaminopimélico y ácido dipicolínico (fig. 6-19). Los dos últimos compuestos se encuentran sólo en células procariotas. El ácido diaminopimélico es componente del peptidoglucano en la pared celular, en tanto que el ácido dipicolínico constituye un componente importante en las endosporas.

Síntesis de peptidoglucano de la pared celular

En la figura 2-16 se muestra la estructura del peptidoglucano; en la figura 6-20A se muestra una forma simplificada del mecanismo por el cual se sintetiza. La síntesis de peptidoglucano inicia con una síntesis escalonada en el citoplasma de UDP-ácido N-acetilmurámico-pentapéptido. La N-acetilglucosamina se une en primer lugar al difosfato de uridina (UDP, uridine diphosphate) y más tarde se convierte a UDP-ácido N-acetilmurámico por condensación con fosfoenolpiruvato y reducción. Los aminoácidos del pentapéptido se añaden de manera secuencial, con cada adición catalizada por una enzima diferente y cada una participando en el desdoblamiento de ATP a ADP + P_i.

El complejo UDP-ácido N-acetilmurámico-pentapéptido se une al bactoprenol (un lípido de la membrana celular) y recibe una molécula de N-acetilglucosamina de UDP. Algunas bacterias (p. ej., Staphylococcus aureus) forman un derivado pentaglicina en una serie de reacciones que utilizan glicil-tRNA como donador; el polisacárido completo se polimeriza a un intermediario oligomérico antes de ser transferido al extremo en crecimiento de un polímero de glucopéptido en la pared celular.

Los enlaces cruzados finales (fig. 6-20B) se llevan a cabo por una reacción de transpeptidación en la cual el grupo amino libre de residuos de pentaglicina desplaza el residuo terminal d-alanina del pentapéptido vecino. La transpeptidación es catalizada por un grupo de enzimas denominadas proteínas de unión a la penicilina (PBP, penicillin-binding proteins), que producen la unión covalente de la penicilina y otros antibióticos lactámicos β en forma covalente debido, en parte, a similitudes estructurales entre estos antibióticos y precursores pentapeptídicos. Algunos PBP tienen actividad de transpeptidasa o carboxipeptidasas, y quizá sus tasas relativas controlan el grado de formación de enlaces cruzados en el peptidoglucano (un factor importante en la tabicación celular).

La vía biosintética es de particular importancia en la medicina, porque proporciona la base para la acción antibacteriana selectiva de los fármacos quimioterapéuticos. A diferencia de las células hospedadoras, las bacterias no son isotónicas con los líquidos corporales. Su contenido se encuentra bajo altas presiones osmóticas y su viabilidad depende de que se conserve la integridad de la capa de peptidoglucano en la pared celular a lo largo del ciclo celular. Cualquier compuesto que inhiba algún paso en la biosíntesis de peptidoglucano ocasiona que la pared de la célula bacteriana en crecimiento se debilite con destrucción subsiguiente de la célula. En la figura 6-20A y B se muestran los sitios de acción de varios antibióticos.

Síntesis de los lipopolisacáridos de la envoltura celular

En la figura 2-20 se muestra la estructura general de los lipopolisacáridos antigénicos de la envoltura celular de bacterias gramnegativas. La biosíntesis de grupos terminales de repetición, que proporciona a la envoltura celular su especificidad antigénica, se muestra en la figura 6-21. Obsérvese la similitud con la síntesis de peptidoglucano. En ambos casos, un grupo de subunidades se unen con un líquido transportador en la membrana y más tarde son transferidos al extremo del polímero en crecimiento.

Síntesis de polímeros capsulares extracelulares

Los polímeros capsulares, de los cuales se enumeran unos cuantos ejemplos en el cuadro 2-1, se sintetizan por medios enzimáticos a partir de subunidades activas. No se ha implicado en este proceso a transportadores de lípidos unidos a la membrana. La presencia de una cápsula a menudo está determinada por situaciones ambientales; por ejemplo, los dextranos y levanos sólo pueden sintetizarse al utilizar el disacárido sacarosa (fructosa-glucosa) como la fuente de la subunidad apropiada y, por lo tanto, su síntesis depende de la presencia de sacarosa en el medio.

Síntesis de gránulos alimenticios de reserva

Cuando los nutrientes están presentes en cantidades excesivas con respecto a las necesidades para crecimiento, las bacterias convierten algunos nutrientes a gránulos alimenticios de reserva. Los principales incluyen almidón, glucógeno, poli-β-hidroxibutirato y volutina, que consiste principalmente de polifosfato inorgánico (cap. 2). El tipo de gránulo formado es específico para una especie dada. Los gránulos sufren degradación cuando hay agotamiento de los nutrientes exógenos.

Como se menciona en el capítulo 5, hay dos mecanismos metabólicos principales para la generación de enlaces de pirofosfato ácido ricos en energía en el ATP: fosforilación del sustrato (transferencia directa de enlaces de fosfato anhídrido a partir de un donador orgánico para el ADP) y la fosforilación de ADP por un fosfato inorgánico. Esta última reacción es desfavorable desde el punto de vista energético y debe ser estimulada por un gradiente electroquímico transmembrana, la fuerza motriz protónica. En la respiración, el gradiente electroquímico se crea a partir de oxidantes y reductores proporcionados del medio externo. La energía liberada por transferencia de electrones de sustancias reductoras a oxidantes a través de transportadores unidos a la membrana se acopla para la formación de un gradiente electroquímico transmembrana. En la fotosíntesis, la energía luminosa genera reductores y oxidantes relacionados con la membrana; la fuerza motriz protónica se genera conforme los electrones se transportan de regreso a un estado de equilibrio. Estos procesos se revisan más adelante.

Vías de fermentación

A. Estrategias para la fosforilación del sustrato

En ausencia de respiración o de fotosíntesis, las células dependen por completo de la fosforilación de sustrato para la producción de energía: la generación de ATP debe acoplarse con modificaciones químicas de compuestos orgánicos. Muchos compuestos pueden actuar como sustratos fermentables y para su fermentación varias vías han evolucionado. Estas vías tienen tres etapas generales: 1) conversión de un compuesto fermentable a un donador de fosfato por fosforilación del sustrato. Esta etapa a menudo contiene reacciones metabólicas en las cuales el NAD⁺ se reduce a NADH. 2) Fosforilación de ADP por un donador de fosfato rico en energía. 3) Pasos metabólicos que dan origen a productos de la fermentación en equilibrio químico con los materiales iniciales. La necesidad más frecuente en esta última etapa es un mecanismo para la oxidación de NADH, generado en el primer paso de fermentación, a NAD⁺, de forma que pueda continuar la fermentación. En la siguiente sección se consideran ejemplos de cada una de las tres etapas de fermentación.

B. Fermentación de la glucosa

La diversidad de las vías de fermentación se ilustra al tomar en consideración algunos de los mecanismos utilizados por los microorganismos para lograr la fosforilación del sustrato a expensas de la glucosa. En principio, la fosforilación de ADP a ATP puede acoplarse para alguna de dos transformaciones químicas equilibradas:

Los mecanismos bioquímicos por medio de los cuales ocurren estas transformaciones pueden variar de manera considerable.

En general, la fermentación de la glucosa se inicia por la fosforilación a G6PD. Hay dos mecanismos por medio de los cuales ocurre esto: 1) la glucosa extracelular puede transportarse a través de la membrana citoplásmica hacia el interior de la célula donde más tarde se fosforila por el ATP para dar origen a G6PD y ADP. 2) En muchos microorganismos, la glucosa extracelular sufre fosforilación conforme se transporta a través de la membrana citoplásmica por un sistema enzimático que produce la fosforilación extracelular de la glucosa a expensas de fosfoenolpiruvato, dando origen a G6PD y piruvato intracelulares. Este último proceso es un ejemplo de metabolismo vectorial, un grupo de reacciones bioquímicas en las cuales se alteran la estructura y ubicación del sustrato. Cabe hacer notar que la elección de ATP o de fosfoenolpiruvato como agente de fosforilación no altera la cantidad de ATP producido por la fermentación, porque el fosfoenolpiruvato se utiliza como fuente de ATP en etapas avanzadas de la fermentación (fig. 6-8).

C. Vía de Embden-Meyerhof

Esta vía (fig. 6-22) que con frecuencia se encuentra como mecanismo para la fermentación de la glucosa, utiliza una cinasa y una aldolasa (fig. 6-6) para transformar el fosfato de hexosa (C₆) a dos moléculas de fosfato de triosa (C₃). Hay cuatro reacciones de fosforilación del sustrato que acompañan la conversión de la triosa-fosfato a dos moléculas de piruvato. Así, al tomar en consideración los dos enlaces de pirofosfato de ATP necesarios para la formación de triosa-fosfato a partir de glucosa, la vía de Embden-Meyerhof produce una cantidad neta de dos enlaces de pirofosfato de ATP. La formación de piruvato a partir de triosa-fosfato es un proceso oxidativo en el cual se forma NADH en el primer paso metabólico (fig. 6-22) que debe convertirse a NAD⁺ para que continúe la fermentación; en la figura 6-23 se ilustran dos mecanismos simples para lograr este objetivo. La reducción directa de piruvato por NADH produce lactato como producto terminal de la fermentación, lo que da origen a la acidificación del medio. El piruvato también puede ser descarboxilado para formar acetaldehído, que más tarde se utiliza para oxidar el NADH, dando origen a la producción del etanol, un producto neutro. La vía tomada depende de los antecedentes evolutivos del organismo y, en algunos microorganismos, de las condiciones de crecimiento.

D. Fermentaciones de Entner-Doudoroff y de heterolactato

Las vías alternativas para la fermentación de glucosa incluyen algunas acciones enzimáticas especializadas, que se muestran en la figura 6-24. La vía de Entner-Doudoroff difiere de otras vías del metabolismo de carbohidratos por una deshidratación de 6-fosfogluconato seguido de una reacción de aldolasa que produce piruvato y triosa-fosfato (fig. 6-24A). La fermentación de heterolactato y algunas otras vías de fermentación dependen de una reacción de fosfocetolasa (fig. 6-24B) que produce el desdoblamiento fosforolítico de cetosafosfato para producir acetil fosfato y triosa-fosfato. El anhídrido ácido de acetil fosfato puede utilizarse para la síntesis de ATP o puede permitir la oxidación de dos moléculas de NADH a NAD⁺ como ocurre con la reducción hacia etanol.

En las figuras 6-25 y 6-26 se muestran las generalidades de las vías de Entner-Doudoroff y de heterolactato. Mediante estas vías se produce sólo una molécula de triosa-fosfato a partir de glucosa y, por lo tanto, la energía obtenida es baja. A diferencia de la vía de Embden-Meyerhof, las vías de Entner-Doudoroff y heterolactato producen sólo un sustrato neto de fosforilación de ADP por molécula de glucosa fermentada. ¿Por qué se han elegido vías alternativas para la fermentación de glucosa en el ambiente natural? Para responder esta pregunta deben tenerse en mente dos hechos. En primer lugar, en la competencia directa por la proliferación de dos especies microbianas, la tasa de utilización del sustrato puede ser más importante que la cantidad de crecimiento. En segundo lugar, la glucosa es uno de los varios carbohidratos encontrados por los microorganismos en su ambiente natural. Por ejemplo, las pentosas pueden ser fermentadas con bastante eficiencia a través de la vía de heterolactato.

E. Variaciones adicionales en la fermentación de carbohidratos

Las vías para la fermentación de carbohidratos pueden dar cabida a diversos sustratos que se describen a continuación y los productos terminales pueden ser más diversos de lo que podría sugerirse.

Por ejemplo, hay numerosos mecanismos para la oxidación de NADH a expensas de piruvato. Una de tales vías es la formación de succinato por reducción. Muchas bacterias de importancia clínica producen piruvato a partir de la glucosa por medio de la vía de Embden-Meyerhof y deben diferenciarse con base en los productos de reducción formados a partir de piruvato, lo que refleja la constitución enzimática de las diferentes especies. Los principales productos de fermentación, enumerados en el cuadro 6-1, forman la base para muchas pruebas diagnósticas.

F. Fermentación de otros sustratos

Los carbohidratos son el único sustrato susceptible de fermentación. El metabolismo de aminoácidos, purinas y pirimidinas puede permitir que ocurra la fosforilación del sustrato. Por ejemplo, la arginina puede actuar como fuente energética para dar origen a fosfato de carbamoilo, que puede utilizarse para fosforilar el ADP a ATP. Algunos organismos fermentan pares de aminoácidos, utilizando a uno como donador de electrones en tanto que el otro actúa como aceptor.

Patrones de respiración

La respiración requiere de una membrana cerrada. En las bacterias, la membrana es la membrana celular. Los electrones pasan desde un reductor químico a un oxidante químico a través de un grupo específico de transportadores de electrones en la membrana y como consecuencia se establece la fuerza motriz protónica (fig. 6-27); el retorno de protones a través de la membrana se acopla con la síntesis de ATP. Como se sugiere en la figura 6-27, el reductor biológico para la respiración con frecuencia es NADH y el oxidante a menudo es el oxígeno.

En las fuentes de reductores utilizados para generar NADH se muestra una notable diversidad microbiana y muchos microorganismos pueden utilizar aceptores de electrones diferentes al oxígeno. Los sustratos para el crecimiento orgánico se convierten a metabolitos focales que pueden reducir NAD⁺ a NADH ya sea por la vía de monofosfato de hexosa (fig. 6-7) o por el ciclo del ácido tricarboxílico (fig. 6-11). Pueden generarse reductores adicionales durante el desdoblamiento de algunos sustratos de crecimiento; por ejemplo, ácidos grasos (fig. 6-10).

Algunas bacterias, conocidas como quimiolitótrofas, son capaces de utilizar reductores inorgánicos para la respiración. Estas fuentes energéticas incluyen hidrógeno, y hierro ferroso y varias formas reducidas de azufre y nitrógeno. El ATP obtenido por la respiración y por el NADPH generado por los reductores puede utilizarse para favorecer el ciclo de Calvin (fig. 6-13).

Los iones y compuestos diferentes al O₂ pueden utilizarse como oxidantes terminales en la respiración. Esta capacidad para la respiración anaerobia es un rasgo microbiano de amplia distribución. Los aceptores adecuados para los electrones incluyen el nitrato, sulfato y dióxido de carbono. El metabolismo respiratorio que depende de dióxido de carbono como aceptor de electrones es una propiedad que se encuentra en un gran grupo de microbios, las arqueobacterias. Los microorganismos de este grupo poseen, por ejemplo, la capacidad de reducir dióxido de carbono a acetato como un mecanismo para la generación de energía metabólica.

Fotosíntesis bacteriana

Los organismos fotosintéticos utilizan energía luminosa para separar la carga electrónica, crear reductores y oxidantes relacionados con la membrana como consecuencia de un evento fotoquímico. La transferencia de electrones de reductores a oxidantes crea una fuerza motriz protónica. Muchas bacterias llevan a cabo el metabolismo fotosintético sin depender en lo absoluto del oxígeno. La energía luminosa se utiliza como fuente de energía metabólica y el carbono para el crecimiento se obtiene ya sea a partir de compuestos orgánicos (fotoheterótrofos) o a partir de la combinación de reductores inorgánicos (p. ej., tiosulfato) y dióxido de carbono (fotolitótrofos). Estas bacterias poseen un sistema único que, aunque es suficiente para proporcionar energía para la síntesis de ATP y para la generación de gradientes iónicos transmembrana esenciales, no permite la reducción muy exergónica de NADP⁺ a expensas de agua. Dicho proceso es esencial para la fotosíntesis a partir de oxígeno y depende de la energía adicional suministrada proveniente del acoplamiento de los eventos fotoquímicos diferentes, estimuladas por dos sistemas fotoquímicos independientes. En las células procariotas esta característica se encuentra únicamente en las cianobacterias (bacterias azul-verdosas). Entre los microorganismos eucariotas, el rasgo es compartido por algas y plantas en las cuales el organelo esencial para la producción de energía es el cloroplasto.

En su ambiente normal, las células microbianas por lo general regulan sus vías metabólicas de forma que no se produzcan productos intermedios en cantidades excesivas. Cada reacción metabólica es regulada con respecto a las otras en la célula y también con respecto a las concentraciones de nutrientes en el medio ambiente. Así, cuando una fuente de carbono disponible en forma esporádica súbitamente se encuentra en cantidades abundantes, las enzimas necesarias para su catabolismo se incrementan tanto en cantidad como en actividad; por el contrario, cuando un bloque de construcción (p. ej., un aminoácido) se encuentra de manera súbita en cantidades abundantes, las enzimas necesarias para su biosíntesis disminuyen tanto en cantidad como en actividad.

La regulación de la actividad y síntesis enzimáticas proporciona control fino y control grueso de las vías metabólicas. Por ejemplo, la inhibición de la actividad enzimática por un producto secundario de una vía constituye un mecanismo de control fino, porque el flujo de carbono a través de dicha vía se regula de manera instantánea y con precisión. La inhibición de la síntesis enzimática por el mismo producto terminal constituye un mecanismo de control grueso. Las moléculas preexistentes de enzima continúan funcionando hasta que se diluyen a causa del crecimiento celular adicional, aunque la síntesis proteínica innecesaria se interrumpe de inmediato.

Los mecanismos por los cuales la célula regula la actividad enzimática se revisan en la siguiente sección. En el capítulo 7 se revisa la regulación de la síntesis enzimática.

Regulación de la actividad enzimática

A. Enzimas como proteínas alostéricas

En muchos casos, la actividad de una enzima que cataliza un paso metabólico temprano en la vía metabólica es inhibida por un producto terminal de dicha vía. Sin embargo, tal inhibición no puede depender de competencia por el sustrato enzimático porque la estructura del producto terminal y el intermediario temprano (sustrato) por lo común son bastante diferentes. La inhibición depende de la regulación enzimática alostérica: cada enzima posee un sitio catalítico que se une al sustrato y además uno o más sitios que se unen a moléculas reguladoras pequeñas, conocidas como efectores. La unión de un efector a su sitio causa un cambio conformacional en la enzima de forma tal que la afinidad del sitio catalítico para el sustrato se reduce (inhibición alostérica) o se incrementa (activación alostérica).

Las proteínas alostéricas por lo común son oligoméricas. En algunos casos las subunidades son idénticas, cada subunidad posee un sitio catalítico y un sitio efector; en otros casos las subunidades son bastante diferentes y un tipo posee sólo un sitio catalítico y la otra sólo un sitio efector.

B. Inhibición por retroalimentación

El mecanismo general por el cual ha evolucionado en los microorganismos la regulación del flujo de carbono a través de vías biosintéticas es el más eficiente que se pueda imaginar. El producto terminal en cada caso produce inhibición alostérica de la actividad de la primera (y sólo de la primera) enzima en la vía metabólica. Por ejemplo, el primer paso en la biosíntesis de isoleucina, que no implica ninguna otra vía, es la conversión de l-treonina a ácido cetobutírico α, que es catalizada por la treonina desaminasa. La treonina desaminasa es inhibida de manera específica y alostérica por la l-isoleucina y por ningún otro compuesto (fig. 6-28); las otras cuatro enzimas de la vía no se ven afectadas (aunque su síntesis puede verse reprimida).

C. Activación alostérica

En algunos casos es ventajoso para la célula y para un producto terminal o producto intermedio activar en lugar de inhibir una enzima en particular. En el desdoblamiento de la glucosa por E. coli, por ejemplo, la producción excesiva del intermediario G6PD y fosfoenolpiruvato ocasiona la desviación de algunas moléculas de glucosa a la vía de síntesis de glucógeno; esto se realiza por la activación alostérica de la enzima que convierte las moléculas de glucosa 1-fosfato a ADP-glucosa (fig. 6-29).

D. Cooperatividad

Muchas enzimas oligoméricas poseen más de un sitio de unión al sustrato y muestran interacciones cooperativas de las moléculas de sustrato. La unión del sustrato con un sitio catalítico incrementa la afinidad de los otros sitios para moléculas adicionales de sustrato. El efecto neto de esta interacción es producir un incremento exponencial en la actividad catalítica en respuesta al incremento aritmético en la concentración de sustrato.

E. Modificación covalente de las enzimas

Las propiedades reguladoras de algunas enzimas se alteran por modificaciones covalentes de la proteína. Por ejemplo, la respuesta de la glutamina sintetasa a los efectores metabólicos se altera por la adenililación, la unión covalente de ADP a una cadena lateral específica de tirosilo con cada subunidad enzimática. Las enzimas que controlan la adenililación también se controlan por modificaciones covalentes. La actividad de otras enzimas se altera por su fosforilación.

F. Desactivación enzimática

La actividad de algunas enzimas se elimina por medio de su hidrólisis. El proceso puede ser regulado y en ocasiones señalado por modificaciones covalentes de las enzimas dirigidas para la eliminación.

• El metabolismo tiene dos componentes, catabolismo y anabolismo. El catabolismo consta de procesos que albergan energía a partir de la degradación de los compuestos y utilizando esa energía para sintetizar ATP. El anabolismo, o biosíntesis, consta de procesos que utilizan la energía almacenada en el ATP para sintetizar la subunidades (o bloques para la construcción) de macromoléculas que forman la célula.

• El origen biosintético de los bloques de construcción data de unos cuantos precursores, llamados metabolitos focales.

• La biosíntesis de peptidoglucanos es exclusiva de las bacterias. Algunos antibióticos aniquilan bacterias al inhibir de manera selectiva ciertos pasos en la biosíntesis de peptidoglucano.

• Las vías de Embden-Meyerhof, Entner-Doudoroff y de heterolactato son tres vías utilizadas para el catabolismo de la glucosa en las bacterias. El patrón de los productos terminales es una característica utilizada para identificar las diversas especies bacterianas.

• En ausencia de respiración o fotosíntesis, las bacterias dependen por completo de la fosforilación del sustrato para obtener energía.

• Para que la vida continúe en nuestro planeta es necesaria la asimilación reductiva de nitrógeno molecular (o fijación de nitrógeno). Se trata de un proceso altamente energético que llevan a cabo diversas bacterias y cianobacterias utilizando un complejo de multicomponentes de la enzima nitrogenasa.

• La regulación de la actividad enzimática proporciona tanto regulación fina como regulación burda de las vías metabólicas para que no se elabore un exceso de ningún producto intermedio.