Capítulo 47: Principios de microbiología médica diagnóstica

La microbiología médica diagnóstica se ocupa del diagnóstico etiológico de las infecciones. Los métodos de laboratorio usados en el diagnóstico de dichas enfermedades en los seres humanos incluyen:

1. Identificación morfológica del agente en muestras o cortes de tejidos teñidos (observados con microscopio de luz o electrónico).

2. Aislamiento en cultivo e identificación del microorganismo.

3. Detección del antígeno propio del agente, por métodos inmunitarios (aglutinación en látex, enzimoinmunoanálisis [EIA, enzyme immunoassays] y otros) o por medio de métodos de tinción de anticuerpos marcados con fluoresceína (o con peroxidasa).

4. Hibridación a base de DNA-DNA o DNA-RNA para detectar genes específicos de microorganismos patógenos en muestras de los pacientes.

5. Detección y amplificación del ácido nucleico de un microorganismo en muestras del paciente.

6. Demostración de respuestas inmunitarias importantes mediadas por anticuerpos o células, contra un agente infeccioso.

En el terreno de la infectología, los resultados de pruebas de laboratorio dependen en gran medida de la buena calidad de la muestra, la fecha oportuna y el cuidado con que se obtuvo, así como de la eficiencia y la experiencia técnicas del personal de laboratorio. Muchos médicos son competentes en la prácti- ca de algunos métodos sencillos y definitivos de tipo microbiológico, es decir, elaborar y teñir un frotis, examinarlo con el microscopio o inocular la muestra en un medio de cultivo, pero los detalles de los métodos más complejos casi siempre son del dominio del bacteriólogo o del virólogo y de los técnicos del personal especializado. Los médicos que tratan cuadros infecciosos deben saber el momento y la forma de obtener las muestras, el tipo de pruebas de laboratorio que han de solicitar y la forma de interpretar los resultados.

El capítulo presente se ocupa de los aspectos de la microbiología diagnóstica en enfermedades originadas por bacterias, hongos, clamidias y virus. El diagnóstico de parasitosis se expuso en el capítulo 46.

La microbiología diagnóstica comprende la identificación y la definición de miles de microorganismos que causan enfermedades infecciosas o que están vinculados con ellas. Las técnicas para definir los agentes infecciosos varían en gran medida con cada síndrome clínico y con el tipo de microorganismo en consideración, sean virus, bacterias, hongos u otros parásitos. Con una sola prueba será imposible el aislamiento o la definición de todos los agentes patógenos posibles y por ello la información clínica adquiere mayor importancia en la microbiología diagnóstica, que en la bioquímica o la hematología clínica. El médico debe elaborar un diagnóstico preliminar y no esperar a que se obtengan los resultados de los análisis de laboratorio. Cuando se solicitan tales procedimientos, debe señalarse al personal de laboratorio el diagnóstico anticipado (tipo de infección o agente infeccioso sospechado). El etiquetado preciso de las muestras incluye los datos clínicos en cuestión y también los que identifican a cada paciente (como mínimo, dos métodos de identifica- ción definitiva), el nombre del médico solicitante y la información pertinente para el contacto.

Muchos microorganismos patógenos proliferan con lentitud y pueden transcurrir días o semanas para su aislamiento e identificación. Será mejor no diferir el tratamiento mientras se completa el proceso mencionado. Después de obtener las muestras apropiadas y de señalar al personal de laboratorio el diagnóstico clínico preliminar, el médico comienza el tratamiento con fármacos que combatan el microorganismo que, en su opinión, ha causado la enfermedad. Conforme dicho personal comienza a obtener resultados, se los transmite al médico, que en ese momento puede revalorar el diagnóstico y la evolución clínica de su paciente y tal vez cambiar el plan terapéutico. Esta información “de retroalimentación” desde el laboratorio comprende los informes preliminares de los resultados de etapas individuales en el aislamiento y la identificación del agente causal.

Muestras

Los métodos de laboratorio por lo común comprenden el estudio microscópico de materiales obtenidos en fresco sin teñir y con tinción, así como la preparación de cultivos con medios idóneos para la proliferación de agentes muy diversos, incluido el tipo de microorganismo que muy probablemente causa la enfermedad, con base en los datos clínicos. Una vez aislado el microorganismo, se intenta su identificación cabal. Los agentes aislados se someten a pruebas de susceptibilidad a antimicrobianos (antibiograma). Una vez aislados los microorganismos patógenos importantes, antes del tratamiento, quizá sea conveniente que se repitan análisis de laboratorio como formas de vigilancia durante el plan terapéutico y después de concluirlo.

La muestra obtenida de la manera más adecuada constituye el elemento más importante para el diagnóstico de una infección, porque los resultados de los procedimientos de ese tipo, en el caso de enfermedades infecciosas, dependen de la selección, la fecha adecuada y los métodos de recolección de muestras. Las bacterias y los hongos proliferan y mueren, son susceptibles a muchas sustancias químicas y pueden hallarse en sitios anatómicos diversos y en líquidos y tejidos corporales diferentes en el curso de las enfermedades infecciosas. El aislamiento del microorganismo asume tanta importancia en la confirmación de un diagnóstico que la muestra debe obtenerse del sitio con mayores probabilidades de incluirlo en la etapa particular de la enfermedad, y aquélla debe manejarse de forma tal que permita y facilite la supervivencia y la proliferación del agente. En los párrafos siguientes y más adelante en el apartado de Diagnóstico con base en el sitio anatómico, se señalan las sugerencias para un manejo óptimo de cada tipo de muestra.

El aislamiento de las bacterias y los hongos tiene máxima importancia si el agente se obtiene de un sitio en el cual, de modo normal, no hay microorganismos (un área estéril). Cualquier tipo de microorganismo cultivado de sangre y líquidos cefalorraquídeo o sinovial o de las cavidades pleural o peritoneal constituye un dato diagnóstico importante. Por lo contrario, muchas zonas del cuerpo normalmente tienen microbiotas (cap. 10) que pueden ser alteradas por influencias endógenas o exógenas. Es importante considerar dentro del contexto de las microbiotas normales de cada sitio particular, el aislamiento de posibles agentes patógenos de vías respiratorias, tubo digestivo o genitourinarias, así como de heridas o la piel. Es necesario establecer correlación de los datos microbiológicos con la información clínica y así obtener una interpretación significativa de los resultados.

Algunas normas generales válidas para todas las muestras son:

1. La cantidad del material debe ser adecuada.

2. La muestra debe ser representativa del cuadro infeccioso (p. ej., esputo, no saliva; pus de la lesión subyacente y no de un trayecto fistuloso; material para frotis del plano profundo de la herida y no de su superficie.

3. Es necesario no contaminar la muestra y para ello habrá que utilizar sólo equipo estéril y precauciones asépticas.

4. La muestra debe ser transportada de inmediato al laboratorio y allí analizarla. Algunos medios especiales de transporte quizá sean útiles.

5. Es importante contar con muestras suficientes para diagnosticar infecciones bacterianas y micóticas, antes de administrar cualquier antibiótico. Si se administran dichos fármacos antes de obtener muestras para estudio microbiológico, habrá que interrumpir la farmacoterapia y repetir la obtención varios días después.

El tipo de muestra por estudiar depende del cuadro clínico inicial. Si los síntomas y los signos denotan la afectación de cualquier órgano o sistema, las muestras se toman de esa fuente. En caso de no haber signos o síntomas de localización, en primer lugar se obtienen muestras repetidas de sangre y se considera la recolección en serie de muestras de otros sitios, según la zona en que hay mayor posibilidad de afectación de un órgano o sistema particular en un paciente preciso y, en parte, según la facilidad para obtener dichas muestras.

Análisis microscópico y tinciones

El estudio microscópico de muestras teñidas o no teñidas es un método relativamente sencillo y barato, pero menos sensible que el cultivo para la detección de un número pequeño de bacterias. La muestra debe contener como mínimo 10⁵ microorganismos por mililitro para detectar los microorganismos en un frotis. El medio líquido que contiene 10⁵ microorganismos por mililitro no es turbio a simple vista. Las muestras que presentan 10² a 10³ microorganismos por mililitro permiten la proliferación de éstos en medios sólidos y las que tienen 10 bacterias o menos por mililitro pueden inducir la proliferación en medios líquidos.

La tinción con el método de Gram es una técnica muy útil en la microbiología diagnóstica. En los casos con sospecha de infección bacteriana, la mayoría de las muestras debe colocarse en laminillas (portaobjetos), teñirse con el método de Gram y estudiarse de forma microscópica. En el cuadro 47-1 se señalan los materiales y el método para efectuar tal tinción. En el análisis microscópico se identifica en primer lugar la reacción de Gram en las bacterias (el color azul violáceo denota la presencia de microorganismos grampositivos; el color rojo, gramnegativos) y sus características estructurales (formas: cocos, bacterias, fusiformes u otras; cap. 2). Además, es importante detectar y cuantificar la presencia o la ausencia de células inflamatorias y su tipo. De forma similar, tal vez sea útil la presencia de material en apariencia no inflamatorio, como las células del epitelio pavimentoso de una muestra de vías respiratorias o una herida, para valorar lo adecuado de la obtención de muestras. El aspecto de las bacterias en los frotis teñidos con el método de Gram no permite identificar la especie. Señalamientos de cocos grampositivos sugieren (pero no son prueba definitiva) la presencia de especies de estreptococos; los cocos grampositivos en cúmulos indican especies de estafilococos. Los bacilos gramnegativos pueden ser grandes, pequeños o incluso corresponder a cocobacilos. Algunas bacterias grampositivas no viables captan colorantes como si fueran gramnegativas. De forma típica, se ha definido la estructura bacteriana mediante microorganismos que proliferan en agar. Sin embargo, se advierte enorme variación en las características morfológicas de bacterias en líquidos o tejidos corporales.

Es necesario emplear tinciones para microorganismos acidoresistentes en todas las muestras enviadas para la búsqueda de micobacterias. En estos casos, hay que usar colorantes fluorescentes muy sensibles para detectarlas, como la auramina-rodamina. Por lo regular, la confirmación de que un microorganismo capta el colorante fluorescente se consigue con alguna de las tinciones no fluorescentes para acidorresistentes, como la de Ziehl-Neelsen o la de Kinyoun (cuadro 47-1). Estas tinciones se utilizan en vez de las fluorescentes para detectar micobacterias en laboratorios que no cuentan con microscopios fluorescentes (cap. 23). La tinción con anticuerpos inmunofluorescentes (IF) es útil para la identificación de muchos microorganismos. La técnica en cuestión es más específica que otras de tinción, pero su realización es más lenta y difícil. Los anticuerpos marcados con fluoresceína de uso común se elaboran a partir de antisueros obtenidos al inyectar animales con microorganismos comple- tos o mezclas enteras de antígenos. Los anticuerpos policlonales resultantes pueden reaccionar a múltiples antígenos en el agente que se inyectó y quizá también presenten reacciones cruzadas con antígenos y otros microorganismos o tal vez con células de origen humano en la muestra. El control de calidad es importante para llevar al mínimo la tinción IF inespecífica. El empleo de anticuerpos monoclonales puede evitar el problema de las tinciones inespecíficas. La técnica de IF es muy útil para confirmar la presencia de microorganismos específicos, como Bordetella pertussis o Legionella pneumophila en colonias aisladas en medios de cultivo. La tinción IF directa en muestras de pacientes es más difícil y menos específica y la han sustituido en gran medida las técnicas de amplificación de ácido nucleico (NAAT, nucleic acid amplification techniques).

Colorantes como el calcoflúor blanco, la metenamina argéntica y a veces el ácido peryódico y colorante de Schiff (PAS, periodic acid Schiff) y otros más se utilizan en muestras de tejido y de otro tipo en que están presentes hongos u otros parásitos. Los colorantes mencionados no son específicos de algún microorganismo particular, pero pueden definir su estructura para que se utilicen criterios morfológicos en la identificación. El calcoflúor blanco se une a la celulosa y la quitina en las paredes de los hongos, que mostrarán fluorescencia a la longitud de onda de la luz ultravioleta. Con él se demuestran contornos morfológicos que son característicos o diagnósticos de la especie (p. ej., las esférulas en las esporas en caso de infección por Coccidioides immitis). Los quistes de Pneumocystis jiroveci se identifican gracias a sus características estructurales en muestras teñidas con plata. El PAS se utiliza para teñir cortes de tejido si se sospecha una micosis. Después del aislamiento primario de los hongos, se emplean colorantes, como el azul de lactofenol (algodón), para diferenciar la proliferación de hongos e identificar los microorganismos con base en su estructura.

Las muestras en que se intenta identificar hongos se pueden estudiar sin teñir después de tratarlas con una solución de hidróxido de potasio al 10%, la cual disgrega los tejidos que rodean los micelios del hongo; así, se obtiene una imagen mejor de las hifas. En muestras sin teñir, a veces es útil el uso del microscopio de contraste de fase. El microscopio de campo oscuro se utiliza para detectar Treponema pallidum de material obtenido de lesiones sifilíticas primaria o secundaria u otras espiroquetas como Leptospira.

Sistemas de cultivo

En la bacteriología diagnóstica, se necesita usar tipos diversos de medios para el cultivo corriente, en particular si los posibles microorganismos incluyen bacterias aerobias, anaerobias facultativas y anaerobias obligadas. En el cuadro 47-2 se incluyen las muestras y los medios de cultivo utilizados para diagnosticar las infecciones bacterianas más comunes. El medio corriente para las muestras es el agar sangre, que casi siempre se elabora con 5% de sangre de carnero y en él proliferan muchos microorganismos aerobios y anaerobios facultativos. El agar chocolate, medio que contiene sangre calentada, con complementos o sin ellos, es el segundo medio necesario; algunos microorganismos no proliferan en el agar sangre, incluidos Neisseria y Haemophilus patógenos, pero que sí se multiplican en el agar chocolate. Un medio selectivo para los bacilos gramnegativos entéricos (agar de MacConkey o agar eosina-azul de metileno [EMB, eosin-methylene blue]) es el tercer tipo de medio que se utiliza en el trabajo diario. Las muestras donde se harán cultivos en busca de anaerobios obligados deben “cultivarse” o inocularse en dos tipos más de medios, como mínimo, como sería el agar fuertemente complementado, por ejemplo el agar-brucela con hemina y vitamina K, y otro medio selectivo que contiene sustancias que inhiben la proliferación de bacilos gramnegativos entéricos, anaerobios facultativos o cocos anaerobios grampositivos.

Otros muchos medios especializados se utilizan en la bacteriología diagnóstica y su selección depende del diagnóstico clínico y del microorganismo en estudio. El personal de laboratorio elige los medios específicos con base en la información que el médico aportó en la solicitud del cultivo. De ese modo, el medio fresco de Bordet-Gengou o el que contiene carbón vegetal se utilizan para cultivar B. pertussis en el diagnóstico de la tos ferina y se usan otros medios especiales para cultivar Vibrio cholerae, Corynebacterium diphtheriae, Neisseria gonorrhoeae y Campylobacter. Se utilizan a menudo medios sólidos y líquidos especiales para el cultivo de micobacterias. Estos medios pueden contener inhibidores de la proliferación de otras bacterias. Muchos microorganismos de este tipo proliferan con lentitud y por ello es necesario incubar los cultivos y estudiarlos de forma periódica, durante semanas (cap. 23).

Los cultivos en caldo, que son medios altamente enriquecidos, son importantes como formas de “respaldo” de los resultados de los tejidos para biopsia y líquidos corporales, como el líquido cefalorraquídeo. Con los caldos se pueden obtener resultados positivos si no proliferan los microorganismos en medios sólidos, ante el escaso número de bacterias que tiene el inóculo (véase antes).

Muchas levaduras proliferan en agar sangre. Los hongos en fase bifásica y de micelio crecen mejor en los medios elaborados de modo específico para hongos. El agar con infusión de cerebro-corazón con antibióticos y sin ellos y el agar para inhibir mohos han sustituido en gran medida al empleo tradicional del agar-dextrosa de Sabouraud para la proliferación de hongos. Los medios elaborados con materiales vegetales y de plantas que constituyen el hábitat natural de muchos hongos permiten también la multiplicación de muchos hongos patógenos. Los cultivos para hongos casi siempre se expenden en juegos pares y un juego es incubado a 25 a 30°C y el otro a 35 a 37°C. En el cuadro 47-3, se señalan las muestras y otras técnicas para utilizar en el diagnóstico de las micosis.

Además de los medios corrientes y selectivos mencionados, se cuenta con agares que incorporan antibióticos y sustratos en enzimas cromógenas que dan color a microorganismos específicos de interés, como S. aureus resistente a meticilina y Candida, entre otros. Los medios en cuestión, más costosos, mejoran la sensibilidad al inhibir microbiota “nativa” y al permitir que el agente patógeno de interés se identifique con mayor facilidad. De manera típica, los agares cromógenos se utilizan para muestras como las de cultivos de vigilancia y de orina.

Detección de antígeno

En el diagnóstico de infecciones específicas, es posible usar sistemas inmunitarios diseñados para detectar antígenos de microorganismos. Los métodos de IF directos e indirectos constituyen formas de detección de antígeno y se señalan en secciones separadas de este capítulo, que tratan del diagnóstico de infecciones por bacterias, clamidias y virus, así como en los capítulos sobre los microorganismos específicos.

Los EIA, incluidos el enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA, enzyme–linked immunosorbent assay) y las pruebas de aglutinación, se utilizan para detectar antígenos de agentes infecciosos presentes en muestras clínicas. Aquí se describen de forma somera los principios de dichas pruebas.

Hay innumerables variaciones de EIA para detectar antígenos. Un formato de uso frecuente es la fijación de un anticuerpo de captura, específico para el antígeno en cuestión, a las paredes del equipo de material plástico para microdilución. La muestra que contiene el antígeno se incuba en los cuencos y después éstos se lavan. Para encontrar el antígeno, se utiliza un segundo anticuerpo para el antígeno marcado con la enzima. La adición del sustrato correspondiente a la enzima permite hallar el antígeno fijado, gracias a una reacción colorimétrica. Una modificación considerable de los EIA es la creación de formatos de membrana inmunocromatográficos para detectar antígenos. En dicho formato, se utiliza una membrana de microcelulosa que absorbe el antígeno presente en la muestra. En la membrana, surge directamente una reacción colorimétrica, con la adición seriada de conjugado, seguido por el sustrato. En algunos formatos, el antígeno es captado por el anticuerpo fijado, dirigido contra dicho antígeno. Los métodos en cuestión poseen la ventaja de su rapidez y de incluir un control positivo autointegrado. Ejemplo de este tipo de evaluación es el método del antígeno de Streptococcus pneumoniae llamado Binax NOW. En algunos EIA, no se necesita el anticuerpo inicial porque el antígeno se fija directamente al material plástico de los cuencos. Los EIA se utilizan para detectar antígenos de virus, bacterias, clamidias, protozoos y hongos en diversos tipos de muestras, como heces, líquido cefalorraquídeo, orina y material obtenido de vías respiratorias. Se muestran ejemplos de ellos en los capítulos que describen los agentes etiológicos específicos.

En los métodos de aglutinación de látex, en las cuentas de este material, se fija el anticuerpo específico para un antígeno (policlonal o monoclonal). Al agregar la muestra química a una suspensión de las cuentas de látex, los anticuerpos se fijan a los antígenos en el microorganismo y así se forma una estructura reticular y se produce la aglutinación de las cuentas. La coaglutinación es similar a la aglutinación de látex, salvo que se utilizan estafilococos con abundante proteína A (cepas Cowan I), en lugar de las partículas de látex; la coaglutinación es menos eficaz para la detección de antígeno, en comparación con la aglutinación de látex, pero es un método útil si se aplica a la identificación de bacterias en cultivos, como S. pneumoniae, Neisseria meningitidis, N. gonorrhoeae y estreptococos hemolíticos β.

Con los métodos de aglutinación de látex, se busca hallar de modo fundamental antígenos de carbohidratos de microorganismos encapsulados. La detección antigénica se utiliza más a menudo en el diagnóstico de la faringitis por estreptococo del grupo A. La detección del antígeno de criptococo es útil para diagnosticar la meningitis por dicho microorganismo en sujetos con sida u otras enfermedades inmunodepresoras.

La sensibilidad de los métodos de aglutinación del látex en el diagnóstico de meningitis bacteriana tal vez no sea mejor que la de la tinción de Gram, que es en promedio de 100 000 bacterias por mililitro. Por esa causa no se recomienda usar el método de aglutinación de látex para estudios en muestras directas.

Métodos de inmunotransferencia

Éstos por lo común se realizan para detectar anticuerpos contra antígenos específicos de un microorganismo particular; se basan en la separación electroforética de grandes proteínas de los microorganismos en cuestión, en un gel de agarosa bidimensional. Por medios mecánicos o químicos, se modifican los microorganismos y el antígeno solubilizado resultante se coloca en un gel de poliacrilamida. Se aplica una corriente eléctrica y las proteínas grandes se separan con arreglo a su tamaño (las proteínas de menor tamaño viajan con mayor rapidez). Las bandas proteínicas se transfieren a tiras de papel de microcelulosa y, después de incubar estas últimas con la muestra del paciente que contiene el anticuerpo (por lo general suero), éste se liga a las proteínas en la tira y se detecta de manera enzimática de una forma semejante a la de los métodos de EIA ya descritos. Los métodos de inmunotransferencia se utilizan como técnicas específicas para detectar anticuerpos en la infección VIH y en la enfermedad de Lyme.

Diagnóstico molecular

El principio que sustentó los primeros métodos moleculares fue la hibridación de una sonda de ácido nucleico caracterizada, destinada a una secuencia específica de ácidos nucleicos en una muestra analítica, seguida de detección del par de híbridos. Por ejemplo, se utilizó la sonda monocatenaria de DNA (o de RNA) para encontrar RNA complementario o DNA desnaturalizado en una muestra de estudio. De forma típica, se marca la sonda de ácido nucleico con enzimas, sustratos antigénicos, moléculas quimioluminescentes o radioisótopos, para facilitar la de- tección del producto de hibridación. Al seleccionar con cuidado la sonda o sintetizar un oligonucleótido específico y realizar la hibridación de una forma muy estricta, la detección del ácido nucleico en la muestra de estudio puede ser notablemente específica. Las pruebas en cuestión se utilizan de preferencia para la confirmación rápida de la identidad de un agente patógeno una vez que se detectó su proliferación, por ejemplo la identificación de Mycobacterium tuberculosis en cultivo mediante la sonda de DNA (disponible en el comercio). Dicho método es un ejemplo del formato de hibridación en que están en solución la sonda y la molécula o el elemento “destinatario”. Gran parte de las aplicaciones que se usan en laboratorios de microbiología clínica utilizan formatos de hibridación en solución. La hibridación in situ comprende el empleo de sondas de DNA o de RNA marcadas, para detectar ácidos nucleicos complementarios en tejidos incluidos en parafina y fijados con formol, tejidos congelados o preparados citológicos realizados en laminillas. Desde el punto de vista técnico, esta prueba quizá sea difícil y casi siempre se realiza en laboratorios de histología y no en los de microbiología clínica. Sin embargo, la técnica en cuestión ha ampliado los conocimientos de los aspectos biológicos de innumerables enfermedades infecciosas, en particular las hepatitis y las causadas por virus oncógenos, y es útil aun en el diagnóstico de los trastornos infecciosos. En una técnica nueva que en cierta medida es una modificación de la hibridación in situ, se usan sondas de ácidos nucleicos y péptidos. Las sondas de este tipo son fragmentos sintetizados de DNA en el cual el esqueleto de fosfato-azúcar del DNA (que tiene normalmente carga negativa), es sustituido por una poliamida de unidades repetitivas (carga neutra). Al esqueleto neutro, se pueden unir bases de nucleótidos individuales, con lo cual la hibridación es más rápida y específica con ácidos nucleicos complementarios. Las sondas son sintéticas y por ello no las degradadan las nucleasas ni otras enzimas. Una compañía comercial ha elaborado diversas técnicas aprobadas por la Food and Drug Administration (FDA), para confirmar la presencia de Staphylococcus aureus, enterococos, Candida y algunos bacilos gramnegativos, hallados en frascos de cultivos de sangre. La hibridación por sondas se detecta por fluorescencia y recibe el nombre de hibridación in situ de fluorescencia con ácido nucleico péptido (PNA-FISH, peptide nucleic acid-fluorescence in situ hybridization).

A. Identificación de bacterias por medio del rRNA 16S

El rRNA 16S de cada especie de bacteria posee zonas estables o conservadas de la secuencia. En cada microorganismo hay innumerables copias. Se agregan sondas marcadas con especificidad para el rRNA 16S de la especie y se mide la cantidad del producto marcado en el híbrido bicatenario. La técnica en cuestión se utiliza ampliamente para la identificación rápida de muchos microorganismos. Entre los ejemplos están las especies más comunes e importantes de Mycobacterium, C. immitis, Histoplasma capsulatum y otras.

En diversas especies de microorganismos, se conservan partes de rRNA 16S. La amplificación del rRNA 16S por medio de cebadores (iniciadores o primeros) de estas regiones conservadas permite el aislamiento y la definición de secuencias de las regiones variables de las moléculas; dichas secuencias variables son marcadores con especificidad de género o de especie, que permiten la identificación de los microorganismos. Con dicha técnica, se han definido los agentes patógenos cuyo cultivo en el laboratorio era difícil o imposible. Un ejemplo es Tropheryma whipplei, el agente causal de la enfermedad de Whipple.

Los métodos de diagnóstico molecular que utilizan amplificación del ácido nucleico se utilizan ampliamente y están en fase de perfeccionamiento rápido. Los sistemas de amplificación pertenecen a algunas categorías básicas, como se señala más adelante.

B. Sistemas de amplificación del DNA o RNA preescogidos

En estos métodos, se amplifica muchas veces el DNA o el RNA preelegidos. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR, polymerase chain reaction) se utiliza para amplificar cantidades considerablemente pequeñas de DNA específico que está presente en la muestra clínica y así es posible detectar las cantidades que inicialmente eran pequeñísimas de DNA. La PCR utiliza una DNA polimerasa termoestable para producir una amplificación doble de DNA “preseleccionado” en cada sitio de temperatura. La PCR corriente utiliza tres reacciones seriadas: desnaturalización, hibridación y extensión del cebador, en la forma en que más adelante se explica. El DNA extraído de la muestra clínica, junto con los oligonucleótidos específicos de los iniciadores, nucleótidos, la DNA polimerasa termoestable y el amortiguador se calientan a 90 a 95°C para separar o desnaturalizar las dos cadenas del DNA seleccionado. Se disminuye la temperatura de la reacción, por lo común a 45 a 60°C, con base en los cebadores para permitir la hibridación de éstos con el DNA preseleccionado. Hecho lo anterior, se extiende cada cebador por medio de la DNA polimerasa termoestable al agregar nucleótidos complementarios del DNA preseleccionado y de esta forma se genera la amplificación doble. El ciclo se repite 30 a 40 veces hasta obtener la amplificación del segmento de DNA preseleccionado, incluso 10⁵ a 10⁶ veces. El segmento amplificado se identifica en el gel por electroforesis o se detecta en los análisis de inmunotransferencia de Southern mediante sondas de DNA marcadas que son específicas para el segmento o por una variedad de técnicas comerciales de patente. En fecha reciente, los protocolos de PRC de tiempo real han sustituido a estos métodos de detección final (véase más adelante).

La PCR puede realizarse también en segmentos de RNA, método que se ha denominado PCR de transcriptasa inversa. Esta enzima se utiliza en la transcripción del RNA en el DNA complementario para amplificación.

En el comercio, se cuenta con métodos de PCR para identificar bacterias y virus patógenos muy diversos, como Chlamydia trachomatis, N. gonorrhoeae, M. tuberculosis, citomegalovirus, enterovirus y otros más. Se cuenta con un método para evaluar el número (carga) de virus VIH-1. Se conocen otras PCR creadas en laboratorios individuales para diagnosticar infecciones. Estas pruebas son las más indicadas para el diagnóstico de innumerables infecciones, en particular cuando no son útiles las técnicas corrientes de cultivo y detección de antígeno; entre los ejemplos están la búsqueda del virus de herpes simple en líquido cefalorraquídeo para el diagnóstico de encefalitis herpética y la valoración del líquido de lavado nasofaríngeo para identificar una infección por B. pertussis (tos ferina).

Un aspecto importante en el caso de los laboratorios que practican métodos de PCR es evitar la contaminación de los reactivos o las muestras con DNA del entorno, que quizá obstaculice la diferenciación entre los resultados positivos verdaderos y los positivos falsos, debido a la contaminación.

C. Sistemas de amplificación de sondas

La reacción en cadena de la ligasa es un sistema de amplificación distinto de aquél de la PCR. La reacción de ligasa utiliza DNA polimerasa y DNA ligasa termoestable. La técnica requiere cuatro sondas de oligonucleótidos que tienen cada una 20 a 24 bases. Cada par de oligonucleótidos tienen como función unirse a un segmento de DNA desnaturalizado, con una distancia de unas cuantas bases. Los oligonucleótidos se mezclan con el DNA objetivo extraído de la muestra y otros reactivos y después se calienta hasta desnaturalizarlo. Se inicia después una reacción de enfriamiento para que se fijen las sondas del oligonucleótido con DNA preseleccionado. La corta distancia entre las dos sondas se llena con la DNA polimerasa y se une con la DNA ligasa y de ello se generan moléculas de DNA bicatenarias de 40 a 50 bp de longitud. El ciclo se repite 30 a 40 veces y así se genera un gran número de moléculas de DNA. Dicho sistema comercial incluye la detección automatizada de DNA amplificado, el cual puede utilizarse para la detección de C. trachomatis y N. gonorrhoeae y se consigue sólo fuera de Estados Unidos.

D. Técnicas de amplificación de señales

Los métodos en cuestión refuerzan la señal al amplificar el elemento marcador (p. ej., fluorocromos, enzimas) que se agrega al ácido nucleico preseleccionado. El sistema de DNA ramificado (bDNA, branched DNA) incluye sondas primarias y una secundaria ramificada, marcada con la enzima. Las sondas de oligonucleótidos múltiples, que son específicas para el RNA preseleccionado (o DNA), se fijan a una superficie sólida, como la cubeta de microdilución. Éstas constituyen las sondas de captura. Se agrega la muestra preparada y las moléculas de RNA se unen a la sondas de captura en la cubeta de microdilución. Las sondas de ese tipo adicionales se ligan a la sonda preseleccionada, pero no a la cubeta. Las sondas de amplificación de bDNA marcadas con enzima se agregan y se unen a las sondas preseleccionadas. Se agrega un sustrato quimioluminiscente y la luz emitida se mide para cuantificar la cantidad de RNA preseleccionado presente. Ejemplos de este tipo de técnica incluyen la medición cuantitativa de los virus VIH-1 y de las hepatitis C y D.

E. Métodos de amplificación no basados en PCR

La amplificación mediada por transcripción (TMA, transcription mediated amplification) y la amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA, nucleic acid sequence-based amplification) amplifican grandes cantidades de RNA en métodos isotérmicos que de manera coordinada utilizan las enzimas transcriptasa inversa, RNasa H y RNA polimerasa. Se permite que un cebador oligonucleótido que contiene el promotor de RNA polimerasa se fije al RNA preelegido. La transcriptasa inversa elabora una copia de cDNA monocatenario del RNA. La RNasa H destruye el RNA del híbrido RNA-cDNA y un segundo cebador se empalma al segmento de cDNA. La actividad de DNA polimerasa que depende de DNA (propia de la transcriptasa inversa) extiende el DNA del primer cebador y así se genera una copia de DNA bicatenario con RNA polimerasa intacta; esta última después genera muchas copias del RNA monocatenario. Ejemplo del empleo de tales métodos es la detección de C. trachomatis, N. gonorrhoeae y M. tuberculosis, así comola cuantificación del número de partículas de VIH-1.

Las técnicas de desplazamiento de cadenas (SDA, strand displacement assays) son métodos de amplificación isotérmica que utilizan endonucleasa restrictiva y DNA polimerasa. La endonucleasa restrictiva “hace muescas” en sitios específicos del DNA y así permite a la DNA polimerasa comenzar la réplica en tales depresiones de la molécula efectora y, de forma simultánea, desplazar la cadena “truncada”. Las cadenas desplazadas una a una sirven como plantillas para amplificación adicional.

La amplificación isotérmica mediada por bucles (LAMP, loop mediated isothermal amplification) recibe su nombre del hecho de que el producto de amplificación final consiste en una estructura que contiene repeticiones dobles o múltiples de la secuencia efectora. La reacción es isotérmica y consiste en la síntesis de DNA por desplazamiento autocíclico de cadenas y para ello se utiliza el Bst de la DNA polimerasa y cuatro a seis “cebadores”. Los productos de amplificación se detectan en tiempo real al precipitar DNA por adición de pirofosfato de magnesio a la reacción y así crear enturbiamiento que puede captarse y cuantificarse visualmente o con la utilización de un espectrofotómetro. Este método es muy sensible y hace posible detectar incluso 10 copias “buscadas” por reacción. Se cuenta con una técnica comercial que permite un método de LAMP para detectar C. difficile en muestras de heces.

F. PCR de tiempo real

Los progresos tecnológicos que han permitido contar con la “amplificación de tiempo real” poseen plataformas de amplificación directa de ácido nucleico, con mejoría de la sensibilidad de las técnicas de amplificación y han disminuido de modo notable la posibilidad de contaminación. Los instrumentos de tiempo real han sustituido al bloque sólido utilizado en los termocicladores corrientes con ventiladores que permiten el ciclado más rápido de la PCR. Los perfeccionamientos impresionantes en los aspectos químicos de las reacciones de amplificación de ácidos nucleicos han hecho posible contar con mezclas de reacción homogénea, en las cuales aparecen compuestos fluorógenos en el mismo tubo de reacción en que ocurre la amplificación. Se utilizan diversas moléculas fluorógenas; éstas incluyen colorantes inespecíficos como el verde de SYBR, que se fija al surco pequeño de DNA bicatenario y métodos de detección específicos con amplicón que utilizan sondas de oligonucleótidos marcadas con sustancias fluorescentes, que pertenecen a tres categorías: sondas TaqMan o de hidrólisis; sondas de transferencia de energía fluorescente (FRET, fluorescente energy transfer) y señalamientos moleculares. Rebasa los límites de este capítulo hacer un análisis completo de los métodos en cuestión y convendría que el lector interesado consulte la obra coordinada por Persing et al., incluida en la bibliografía. Todos los métodos hacen posible medir la fluorescencia en cada ciclo de amplificación y ello constituye la evaluación de “tiempo real” de los resultados. No es necesario abrir el tubo de la reacción para analizar los productos de PCR en un gel y por ello existe menor peligro de transportar amplicón residual, que influya en la reacción siguiente.

Espectrometría de masas

La espectrometría de masas (MS, mass spectrometry) es una técnica utilizada para analizar proteínas de DNA y ha revolucionado los métodos para identificar microorganismos en los laboratorios clínicos. La MS utiliza recursos, como la radiación ionizante, para disgregar material que forma partículas cargadas, las cuales se identifican de diversas formas con base en su masa o la razón masa-carga. Las aplicaciones en microbiología han sido consecuencia de progresos de la tecnología, como la desorción-ionización por láser asistida por una matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF MS, matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectroscopy). Se describen de forma somera algunos métodos de este tipo.

La PCR con MassTag incorpora un “marbete” de masa conocida (en el comercio, se dispone de una biblioteca de 64 marbetes de masa) en un producto de PCR. Los marbetes más utilizados en las reacciones de PCR múltiples son liberados por radiación ultravioleta (UV) y analizados por espectrometría de masas. El tamaño del marbete es el factor que determina la identidad de las moléculas efectoras deseadas.

La espectrometría de masas con ionización de electronebulización de PCR (PCR-ESI-MS, PCR electrospray ionization mass spectrometry) (Ibis Biosciences, Inc., Carlsbad, CA) utiliza un principio singular. En resumen, en lo que se refiere a microorganismos particulares, se diseña un conjunto de cebadores de PCR que amplifica regiones fundamentales del genoma microbiano. Las reacciones de PCR múltiple se realizan en una lámina de microtítulos para analizar cada muestra y algunas de las depresiones contienen dos o más pares de cebadores. Después de PCR, se coloca la lámina de microtítulos en un instrumento completamente automatizado y se hace un análisis de ESI-MS. El espectrómetro de masas es un instrumento analítico que pesa de modo eficaz los amplicones, o una muestra de ellos, con suficiente precisión de masa, al grado que es posible deducir la composición de A, G, C y T de cada amplicón en la reacción de PCR. El paso siguiente es el análisis de la composición determinada y para ello se utiliza una base de datos registrada, que es un componente de los programas de la plataforma Ibis.

Las dos plataformas mencionadas permiten la detección directa del ácido nucleico de microorganismos directamente de nuestras clínicas, sin necesidad de cultivo previo, porque utilizan una reacción de PCR. Otra aplicación con el empleo de MALDI-TOF es la identificación de bacterias y levaduras obtenidas en cultivos de material humano. Dos plataformas comerciales, el llamado MALDI Biotyper (Bruker Daltonics, Billerica, MA) y el Shimadzu (bioMerieux, Inc., Durham, NC), detectan las proteínas ribosómicas de bacterias y levaduras. Los principios básicos de los sistemas comprenden la elaboración de un frotis fino de una laminilla metálica, del microorganismo por identificar, con aplicación de una matriz ácida. La laminilla se coloca en el instrumento, en el cual la mezcla del microorganismo es “bombardeada” por pulsos de láser. Las moléculas desorbidas y desionizadas pequeñas se aceleran a través del campo electrostático y se arrastran en un tubo al vacío hasta que entran en contacto con el detector del espectrómetro. Las moléculas de masas y cargas diferentes “vuelan” con velocidad distinta (“tiempo de vuelo”). Se genera un dato característico espectral, por lo regular en los límites de una proporción masa-carga (M/Z) de 1 000 a 20 000; la señal espectral se compara con otras en la base de datos registradas de cada instrumento para así seleccionar el género o la especie de microorganismo que le corresponde. Conviene que el lector consulte el trabajo de Emonent et al., en busca de mayores detalles.

Se considera que los microorganismos, como M. tuberculosis, Salmonella typhi y Brucella, son patógenos siempre que se les detecte en los pacientes. Sin embargo, muchas infecciones son causadas por microorganismos que son miembros permanentes o transitorios de la microbiota normal. Por ejemplo, Escherichia coli es parte de la microbiota normal del tubo digestivo y también es el agente patógeno más frecuente que causa las infecciones de las vías urinarias. De forma semejante, la mayor parte de las infecciones bacterianas mixtas con anaerobios se originan de microorganismos que pertenecen a la microbiota normal.

El número relativo de microorganismos específicos detectados en un cultivo adquiere importancia cuando miembros de la microbiota normal son los que originan la infección. Cuando se identifican innumerables bacilos gramnegativos de especies, como Klebsiella pneumoniae, mezclados con unas cuantas bacterias normales de la nasofaringe en el cultivo de esputo, existe una fuerte sospecha de que los bacilos gramnegativos causen la neumonía porque de modo normal no hay gran cantidad de ellos en el esputo ni en la microbiota nasofaríngea; es necesario identificar los microorganismos e informar al médico. A diferencia de esto, los abscesos abdominales suelen poseer una distribución normal de microorganismos aerobios, anaerobios facultativos y anaerobios obligados, que constituyen la microbiota del tubo digestivo. En esos casos, no se justifica identificar a todos los agentes presentes y, en vez de ello, es mejor notificar que existe “microbiota normal del tubo digestivo”.

Las levaduras en cantidades pequeñas suelen ser parte de la microbiota microbiana normal. Sin embargo, otros hongos no constituyen una fracción habitual de ese conglomerado y, por ello, habrá que identificarlos y señalarlos al médico. Los virus casi nunca son parte de la microbiota normal tal como se detectan en los laboratorios de microbiología diagnóstica. Sin embargo, algunos microorganismos latentes, como el del herpes simple o los virus vivos de vacunas como el de poliomielitis, aparecen a veces en los cultivos para detectar tales partículas. En algunas zonas del mundo, las muestras de heces suelen aportar datos de parasitosis; en tales casos, el número relativo de parásitos se correlaciona con el cuadro clínico, lo cual es importante.

Los miembros de la microbiota normal que aparecen más a menudo en muestras del paciente y que pueden calificarse de “microbiota normal” se exponen en el capítulo 10.

El antibiótico que se utiliza para iniciar el tratamiento de una infección se elige con base en la impresión clínica después de que el médico está convencido de que hay una infección y ha planteado de forma tentativa un diagnóstico etiológico con sustentación clínica. Con base en esta “suposición orientada”, es posible elegir un fármaco conveniente (cap. 28). Antes de la administración del medicamento, se obtienen muestras para aislar en el laboratorio el agente causal. Los resultados de los estudios en cuestión a veces obligan a cambiar el fármaco. La identificación de algunos microorganismos que de modo uniforme son susceptibles a un medicamento elimina la necesidad de más estudios y permite seleccionar fármacos con eficacia óptima sólo con base en la experiencia. En otras circunstancias, quizá sean útiles los estudios para valorar la susceptibilidad a fármacos de los microorganismos aislados (cap. 28).

El método muy practicado de susceptibilidad de difusión en disco debe utilizarse de forma juiciosa e interpretarse con gran cautela. En general, éste contiene sólo un miembro de cada clase importante de fármacos. En el caso de los estafilococos, se utilizan penicilina G, oxacilina, cefazolina, eritromicina, gentamicina y vancomicina. En el caso de bacilos gramnegativos, se incluyen ampicilina, cefazolina y cefalosporinas de segunda y tercera generaciones, piperacilina y otras “penicilinas contra pseudomonas”, carbapenémicos, trimetoprim-sulfametoxazol, fluoroquinolonas y aminoglucósidos (amikacina, tobramicina, gentamicina). En el caso de infecciones de vías urinarias por bacilos gramnegativos, se pueden agregar nitrofurantoína, quinolonas y trimetoprim. La selección de fármacos por incluir en un conjunto de pruebas sistemáticas de susceptibilidad (antibiograma) se basa en los perfiles de susceptibilidad de microorganismos en laboratorio, el tipo (contagio comunitario o nosocomial) y el origen de la infección, así como el análisis de rentabilidad correspondiente a la población de pacientes. El Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (Wayne, PA) ha planteado recomendaciones sobre los agentes por estudiar, con base en el microorganismo recuperado y el tipo de muestra.

La magnitud de las zonas de inhibición de la proliferación varía con las características moleculares de cada fármaco. Con tal base, es imposible comparar el tamaño de dicha zona en un fármaco, con el tamaño de la zona de otro medicamento que actúa en el mismo microorganismo. Sin embargo, en el caso de cualquier fármaco, se puede comparar el tamaño de la zona con otra normativa, a condición de que se regulen con gran detalle los medios de cultivo, el tamaño del inóculo y otros factores; de esta forma, para cada fármaco será posible definir un diámetro mínimo de zona de inhibición que denote la “susceptibilidad” de un agente mediante difusión de disco.

El método de disco mide la capacidad de los fármacos para inhibir la proliferación de bacterias. Los resultados muestran una correlación razonable con la respuesta terapéutica a las enfermedades en el caso en que las defensas corporales eliminen con frecuencia los microorganismos infecciosos.

En unos cuantos tipos de infecciones en seres humanos, los resultados de las técnicas de disco brindan poco auxilio (y quizá sean desorientadores), porque se necesita el efecto de un bactericida para la curación. Ejemplos sobresalientes de esto son la endocarditis infecciosa, la osteomielitis aguda y las infecciones graves en un hospedador cuyas defensas antibacterianas son inadecuadas, como en personas con neoplasias que han sido tratadas con radiación y antineoplásicos o sujetos que han recibido altas dosis de corticoesteroides y muestran inmunodepresión.

En lugar de la técnica del disco, cabe utilizar un método semicuantitativo de concentración inhibidora mínima (MIC, minimum inhibitory concentration). En circunstancias definidas, éste mide con mayor exactitud la concentración necesaria de un antibiótico para inhibir la proliferación de un inóculo estandarizado. Se usa un método de microdilución semiautomatizado en la cual se disuelven cantidades definidas del fármaco en un volumen pequeño y medido de caldo y se inocula con un número estandarizado de microorganismos. Se considera como punto final o MIC la última vasija de caldo (la concentración mínima del fármaco) que permanece clara, es decir, sin proliferación microbiana. Con este método, se obtiene una mejor estimación de la cantidad probable de fármaco necesaria para inhibir la proliferación in vivo y de este modo es útil para ajustar el régimen posólogico necesario para el paciente.

Como se mencionó, los laboratorios de microbiología clínica realizan los métodos de difusión de disco y otros basados en la valoración del MIC e interpretan sus resultados con base en directrices establecidas por el CLSI en Wayne, Pennsylvania. Además, para orientar mejor la selección empírica de tratamientos antes de contar con los resultados de susceptibilidad antimicrobiana (antibiograma), el CLSI recomienda que cada año el laboratorio publique un antibiograma que contenga los resultados de los estudios de susceptibilidad en conjunto, correspondiente a combinaciones particulares de microorganismos y fármacos. Por ejemplo, tal vez sea importante tener conocimientos del antibiótico lactámico β más activo que actúa contra Pseudomonas aeruginosa en sujetos en la unidad de cuidados intensivos en un hospital particular, para así usar dicho fármaco si surge una infección de la persona durante su permanencia en dicha unidad.

Se conocen otros métodos para valorar la eficacia del tratamiento antimicrobiano. Se pueden estimar los efectos bactericidas con el cultivo especializado (subcultivo) del caldo transparente en medios sólidos sin antibióticos. Por consiguiente, por ejemplo, una disminución de las unidades formadoras de colonias de 99.9% por debajo de la reducción testigo se llama concentración bactericida mínima (MBC, minimal bactericidal concentration).

La selección de un bactericida o una combinación de fármacos para cada paciente puede orientarse con los datos de técnicas especializadas de laboratorio, pues miden la rapidez de muerte (técnica de tiempo de destrucción o muerte) o la proporción de la población microbiana destruida en un tiempo fijo (métodos bactericidas en suero).

En infecciones de vías urinarias, la actividad antibacteriana en orina es más importante que la observada en el suero. Como sucede con las infecciones del sistema nervioso central, sólo se deben llevar a cabo estudios e informes para los antibióticos que atraviesen la barrera hematoencefálica (cap. 28).

Heridas, tejidos, huesos, abscesos y líquidos corporales

Los datos del estudio microscópico del frotis y los cultivos de muestras obtenidas de heridas o abscesos suelen indicar de forma temprana e importante la naturaleza del microorganismo infectante y es un medio útil para la selección de antibióticos. Las muestras enviadas para biopsias histológicas diagnósticas deben ser objeto de análisis bacteriológicos y también histológicos. Las muestras para el estudio bacteriológico no deben entrar en contacto con fijadores ni desinfectantes y se fragmentan finamente y cultivan por medio de métodos diversos.

El pus en los abscesos cerrados, no drenados, de tejidos blandos a menudo contiene sólo un microorganismo como agente infectante; en aquéllos, muy a menudo hay estafilococos, estreptococos o bacilos entéricos gramnegativos. La misma situación priva en la osteomielitis aguda, en que es posible cultivar los microorganismos provenientes de la sangre antes de que la infección se torne crónica. En abscesos abdominales y los que surgen junto a superficies mucosas y en heridas abiertas, con frecuencia se identifican microorganismos múltiples. Cuando las lesiones supuradas profundas, como la osteomielitis crónica, drenan al exterior a través de una fístula o un fondo de saco, es importante distinguir la microbiota de la superficie a través de la cual la lesión vierte pus u otro material, respecto de la microbiota propia de la lesión profunda. Para evitar ese problema, hay que aspirar muestras de la infección primaria, a través de tejido no infectado.

El análisis bacteriológico del pus de lesiones cerradas o profundas debe incluir cultivo para detectar anaerobios. Las bacterias de ese tipo (Bacteroides, peptoestreptococos) a veces constituyen los agentes causales esenciales y a menudo hay mezclas de anaerobios.

Los métodos utilizados en los cultivos deben ser adecuados para la identificación semicuantitativa de bacterias comunes y también para la identificación de microorganismos especializados que incluyen micobacterias y hongos. La piel y las mucosas erosionadas suelen ser los sitios de asiento de infecciones por levaduras y hongos. A veces, con métodos microscópicos en frotis o preparaciones de material de raspado de zonas sospechosas, se detectan Candida, Aspergillus y otras levaduras u hongos que pueden proliferar en los cultivos. El tratamiento con hidróxido de potasio y calcoflúor blanco mejora en gran medida la observación de levaduras y hongos en la muestra.

El material de exudado que se ha reunido en los espacios pleural, peritoneal, pericárdico o sinovial debe obtenerse mediante aspiración con una técnica aséptica. Si el material es evidentemente purulento, se llevan a cabo directamente el frotis y los cultivos. Cuando el líquido es transparente, éste se centrifuga a alta velocidad durante 10 min y el sedimento se usa en frotis teñidos y en cultivo. El método de cultivo debe ser idóneo para la proliferación de microorganismos cuya presencia se sospecha con bases clínicas, por ejemplo micobacterias, anaerobios y también las bacterias piógenas de aparición frecuente. Algunas muestras de líquido se coagulan y a veces se necesita cultivar una muestra con anticoagulantes. Los siguientes resultados bioquímicos y hematológicos sugieren infección: densidad >1.018; contenido proteínico >3 g/100 ml (que a menudo origi- na coagulación) y recuento celular >500 a 1 000 células/μl. En las infecciones piógenas agudas no tratadas predominan los polimorfonucleares; lo mismo ocurre con los linfocitos o los monocitos en caso de infección crónica. El trasudado que surge por la proliferación neoplásica a simple vista puede semejar el exudado infeccioso, al tener un aspecto sanguinolento o purulento y coagularse en reposo. El análisis citológico del frotis o las secciones de células centrifugadas puede corroborar la naturaleza neoplásica del trastorno.

Sangre

La bacteriemia casi siempre denota alguna enfermedad que puede ser letal, razón por la cual es esencial su detección temprana. El cultivo de sangre constituye la técnica más importante para encontrar infección sistémica por bacterias; aporta información útil para tratar a sujetos febriles con cuadros agudos, con síntomas y signos de localización o sin ellos y su práctica es esencial para todo sujeto en quien se sospecha endocarditis infecciosa, incluso si el cuadro al parecer no es agudo ni muy grave. Además de su importancia diagnóstica, la identificación del agente infeccioso en la sangre constituye un elemento auxiliar utilísimo para seleccionar los antibióticos para el régimen terapéutico. Por tal razón, se lleva a cabo todo intento de aislar los microorganismos causales de la bacteriemia.

En personas sanas, las muestras de sangre obtenidas de manera cuidadosa son estériles. A pesar de que los microorganismos de la microbiota normal de vías respiratorias y el tubo digestivo a veces penetran en la sangre, aquéllos se eliminan casi de inmediato gracias al sistema reticuloendotelial. Esta situación rara vez altera la interpretación de los resultados de los cultivos de sangre. Si con esta técnica se identifican microorganismos, el hecho asume enorme importancia clínica, a condición de que se excluya la contaminación en el laboratorio. La contaminación de los cultivos de sangre con la microbiota cutánea normal muy a menudo depende de errores en la técnica de obtención de dicho líquido. Por consiguiente, es esencial efectuar un cultivo de sangre con la técnica más adecuada.

Las normas siguientes aplicadas de modo estricto generan resultados fiables:

1. Usar una técnica rigurosamente aséptica. Con guantes que no tienen que ser estériles por necesidad.

2. Aplicar el torniquete y por el tacto identificar una vena fija. Liberar el torniquete mientras se trata la piel de modo aséptico.

3. Preparar la piel para punción venosa al limpiarla de manera vigorosa con alcohol isopropílico al 70 a 95%. Después de utilizar tintura de yodo al 2% o clorhexidina al 2%, el técnico debe comenzar en el sitio de punción venosa y limpiar la piel en círculos concéntricos de diámetro cada vez mayores. Se permite que los materiales de la preparación antiséptica se sequen durante 30 s, como mínimo. Una vez preparada la piel, no debe tocarse.

4. Aplicar de nuevo el torniquete, realizar la punción venosa (adultos) y extraer unos 20 ml de sangre.

5. Colocar la sangre en recipientes de cultivo “etiquetados” para aerobios y anaerobios.

6. Llevar las muestras al laboratorio de inmediato o colocarlas en una incubadora a 37°C.

El que los cultivos de sangre generen resultados positivos depende de algunos factores: volumen de sangre cultivada, dilución de la sangre en el medio de cultivo, empleo de medios de cultivos para aerobios y anaerobios y duración de la incubación. En los adultos, por lo común se obtienen 20 a 30 ml por cultivo y la mitad de ese volumen se coloca en un recipiente para culti- vo aeróbico de sangre y la otra mitad para anaerobios; un par de recipientes deben contener un solo cultivo de sangre. Sin embargo, se necesitan volúmenes diferentes de sangre para los diversos sistemas de cultivo que existen en ella. Un sistema de cultivo de sangre muy usado utiliza recipientes que contienen 5 y no 10 ml de sangre. Una dilución óptima de sangre en un medio líquido de cultivo es de 1:300 a 1:150; de este modo se llevan al mínimo los efectos de los sistemas de anticuerpos, complemento y antibacterianos contra leucocitos que están presentes. Las grandes diluciones no son prácticas en los cultivos de sangre y por ello los medios en cuestión contienen 0.05% de polianetolsulfonato de sodio (SPS, sodium polyanetholesulfonate) que inhibe los sistemas antibacterianos de leucocitos. Sin embargo, el SPS también inhibe la proliferación de algunas neiserias y cocos grampositivos anaerobios y de Gardnerella vaginalis. Si se sospecha la presencia de cualquiera de los microorganismos mencionados, se utilizan otros sistemas de cultivo de sangre sin SPS.

Los cultivos de sangre se incuban durante cinco a siete días. Los sistemas de cultivo automatizados usan métodos diversos para detectar cultivos positivos; tales métodos automatizados hacen posible la revisión frecuente de los cultivos (incluso en el transcurso de unos minutos) y la detección más temprana de los positivos. Los medios en los sistemas de cultivo automatizado de sangre están tan enriquecidos y la detección es tan sensible que no es necesario procesar los cultivos de sangre por más de cinco días. En general, los cultivos secundarios (subcultivos) están indicados sólo si el aparato indica que un cultivo es positivo. Los sistemas de cultivo manuales de sangre son obsoletos y quizá se utilicen sólo en laboratorios en países en desarrollo que no cuentan con los recursos para adquirir sistemas automatizados de hemocultivo. En los sistemas manuales, se revisan los recipientes del cultivo de sangre dos o tres veces al día durante los primeros dos días y a diario luego de esa fecha durante una semana. En el método manual, a veces se necesitan los subcultivos ciegos de todos los recipientes del hemocultivo en el segundo y séptimo días.

El número de muestras de sangre que es necesario extraer para los cultivos y el lapso en el cual se lleva a cabo la técnica dependen en parte de la gravedad de la enfermedad clínica. En infecciones hiperagudas, como la septicemia por gramnegativos con estado de choque o por estafilococos, conviene practicar como mínimo dos cultivos de sangre obtenida de dos sitios anatómicos distintos. Publicaciones recientes sugieren que a veces se necesitan tres a cuatro cultivos de sangre. En otras infeccio- nes bacteriémicas, como la endocartidis subaguda, se recolectan tres muestras de sangre en el transcurso de 24 h. El total de tres cultivos de sangre permite identificar la bacteria infectante en más de 95% de los pacientes bacteriémicos. Si los tres cultivos iniciales arrojan resultados negativos y se sospecha algún absceso oculto, fiebre de origen no identificado u otra infección no esclarecida, se cultivan más muestras de sangre, cuando sea posible, antes de emprender el régimen antimicrobiano.

Se cuenta con diversos tipos de recipientes para cultivo de sangre que contienen resinas u otras sustancias que absorben casi todos los antibióticos y también algunos factores del hospedador contra los microorganismos. Las indicaciones para utilizar recipientes que contienen resina comprenden las siguientes: el enfermo séptico desde el punto de vista clínico que recibe antibióticos y que, en los cultivos de sangre efectuados, no hay resultados positivos; el enfermo con signos clínicos de endocarditis y cultivos de sangre negativos, que recibe antibióticos, y el paciente hospitalizado con septicenia, al que se administraron antibióticos antes del internamiento. Para las revisiones de vigilancia de la eficacia del tratamiento es importante no utilizar recipientes que contengan resina, porque ésta puede absorber antibióticos en la muestra y hacer que el cultivo se torne positivo, a pesar de que el plan terapéutico sea eficaz desde una perspectiva clínica.

Es necesario valorar la importancia de un cultivo de sangre positivo. Los criterios siguientes quizá sean útiles para diferenciar los “cultivos positivos verdaderos” de las muestras contaminadas:

1. La proliferación del mismo microorganismo en cultivos repetidos de material obtenido en fechas diferentes de sitios anatómicos separados sugiere fuertemente bacteriemia real.

2. La proliferación de microorganismos diferentes en frascos de cultivo distintos sugiere contaminación, pero a veces es consecuencia de problemas clínicos como la infección de la herida o el estallamiento de intestinos.

3. La proliferación de la microbiota cutánea normal, como estafilococos coagulasa-negativos, difteroides (corinebacterias y propionibacterias) o cocos anaerobios grampositivos sólo en uno de grandes cultivos, sugiere contaminación. La proliferación de tales microorganismos en varios cultivos o de muestras de un sujeto con prótesis vascular o un catéter en vena central incrementa la posibilidad de que exista bacteriemia importante desde el punto de vista clínico.

4. Es posible que microorganismos, como los estreptococos viridans o los enterococos, proliferen en cultivos de sangre obtenida de sujetos en quienes se sospecha endocarditis, y bacilos gramnegativos, como E. coli, en cultivos de sangre de individuos con septicemia clínica por gramnegativos. Por tal razón, cuando se identifican los microorganismos “esperados”, lo más probable es que tengan importancia etiológica.

Se señalan las especies bacterianas que se identifican más a menudo en cultivos positivos de sangre: estafilococos, que incluyen S. aureus; estreptococos viridans; enterococos, que incluyen Enterococcus faecalis; bacterias entéricas gramnegativas, que abarcan E. coli y K. pneumoniae; P. aeruginosa; neumococos y H. influenzae. En los cultivos de sangre, proliferan Candida, otras levaduras y algunos hongos dimórficos, como H. capsulatum, pero rara vez, si es que así ocurre, se identifican muchos hongos en sangre. A veces se observan citomegalovirus y virus del herpes simple en cultivos de sangre, pero no se detectan muchos virus, rickettsias y clamidias por cultivo en sangre. Los protozoos parásitos y los helmintos no se multiplican en cultivos de sangre.

En casi todos los tipos de bacteriemia, no es de utilidad el análisis de los frotis directos de sangre. La exploración diligente de la capa de leucocitos de sangre anticoagulada, en frotis teñidos con técnica de Gram, a veces permite detectar bacterias en sujetos con infecciones por S. aureus, septicemia por clostridios o fiebre recurrente. En algunas infecciones por microorganismos (p. ej., carbunco, peste, fiebre recurrente, rickettsiosis, leptospirosis, espirilosis y psitacosis), la inoculación de sangre en animales puede generar resultados positivos con mayor facilidad, que el mismo cultivo. En cuanto a aspectos prácticos, esto casi nunca se lleva a cabo en los laboratorios clínicos.

Orina

El análisis bacteriológico de la orina se realiza cuando los signos o los síntomas clínicos orientan hacia la presencia de una infección de vías urinarias, insuficiencia renal o hipertensión. Se lleva a cabo siempre en quienes se sospeche infección sistémica o fiebre de origen indeterminado. Es importante estudiar a las mujeres en el primer trimestre del embarazo en busca de bacteriuria asintomática.

La orina que secretan los riñones es estéril, salvo que tales órganos estén infectados. Por lo regular, la orina vesical no contaminada también es estéril; sin embargo, la uretra contiene microbiota normal, de modo que la orina expulsada de forma habitual contiene un número pequeño de bacterias. Es necesario diferenciar los microorganismos contaminantes de otros que tengan importancia en la causa de la enfermedad, razón por la cual sólo los estudios cuantitativos de orina pueden generar resultados importantes.

Las fases siguientes son esenciales en el análisis apropiado de la orina.

A. Obtención correcta de la muestra

La obtención apropiada de la muestra constituye la medida más importante dentro de un cultivo de orina y la más difícil. Las muestras satisfactorias obtenidas de mujeres suelen generar problemas.

1. Se debe tener a la mano un recipiente con tapa de rosca estéril para colocar la muestra y dos a tres torundas de gasa humedecidas con solución salina no bacteriostática (no se recomienda utilizar jabones antibacterianos para la limpieza).

2. Con dos dedos, se separarán con delicadeza los labios (vulvares) y se conservan a los lados durante la fase de limpieza y recolección de la muestra. Hay que secar la uretra una vez desde el frente hacia atrás con cada una de las gasas con solución salina.

3. Al iniciar la expulsión de orina, con un recipiente de recolección, se recolecta la muestra a mitad del chorro. Es importante etiquetar con exactitud dicho recipiente.

El mismo método se utiliza para obtener las de varones; en aquellos sin circuncisión, se mantiene retraído el prepucio.

La aplicación de una sonda conlleva el peligro de introducir microorganismos en la vejiga, pero a veces esta situación es inevitable. Durante la cistoscopia, el urólogo puede obtener con un catéter muestras separadas del riñón derecho y el izquierdo y los uréteres correspondientes. Cuando está colocada una sonda a permanencia y un sistema de recolección cerrado, se obtiene la orina por aspiración estéril del catéter con aguja y jeringa y no del depósito de recolección. Para resolver problemas de diagnóstico, la orina se puede aspirar de forma aséptica directamente de la vejiga llena por medio de punción suprapúbica de la pared abdominal. Por lo general, este procedimiento se realiza en lactantes.

En lo que se refiere a muchos estudios, bastan 0.5 ml de orina uretral o 5 ml de orina expulsada. Muchos tipos de microorganismos se multiplican a muy breve plazo en la orina si se la deja a temperatura ambiente o corporal; por esta razón, es necesario llevar con rapidez al laboratorio las muestras de orina o refrigerarlas por un lapso no mayor de una noche. Otra posibilidad es utilizar tubos de transporte que contengan ácido bórico, cuando es imposible refrigerar las muestras.

B. Análisis microscópico

El estudio microscópico sencillo de la orina enseña mucho al médico. Una gota de orina recién obtenida no centrifugada, que se deposita en una laminilla, se cubre con el cubreobjetos y se analiza con la intensidad restringida de luz con el objetivo seco de alta amplificación en un microscopio corriente, puede mostrar leucocitos, células epiteliales y bacterias en caso de que el número de ellos rebase los 10⁵/ml. La detección de dicho número de microorganismos por mililitro en una muestra de orina reunida y estudiada de manera apropiada es una prueba de peso de que existe una infección activa de vías urinarias. La presencia de bacilos gramnegativos en una muestra de orina no centrifugada, obtenida a mitad de chorro, en un frotis teñido con el método de Gram, conlleva el diagnóstico de infección de vías urinarias.

Las centrifugación breve de la orina permite sedimentar con facilidad células de pus que pueden portar bacterias y, de este modo, facilitar el diagnóstico microscópico de infección. La presencia de otros elementos formes en el sedimento o detectar proteinuria es poco útil para la identificación específica de una infección activa de vías urinarias. Las células de pus tal vez aparezcan sin bacterias y, por lo contrario, puede haber bacteriuria sin piuria. La presencia de innumerables células del epitelio escamoso, lactobacilos o microbiota mixta en los cultivos sugiere que la recolección de orina fue inapropiada.

Algunas tiras colorimétricas para orina contienen esterasa de leucocitos y nitrito, las cuales miden los poliformonucleares y las bacterias, respectivamente, en la orina. Las reacciones positivas con tal técnica sugieren fuertemente una infección bacteriana de vías urinarias.

Los laboratorios de microbiología clínica no cuentan con dichos elementos, pero otros de bioquímica han incorporado los instrumentos automatizados o semiautomatizados para elaborar análisis sistemático de orina. Los instrumentos en cuestión utilizan diversas técnicas para detectar leucocitos y bacterias. El desempeño de tales sistemas es variable, pero permiten estandarizar el gran número de muestras por estudiar, cosa que no podría llevarse a cabo con tiras colorimétricas.

C. Cultivos

Para generar resultados importantes, los cultivos de orina deben realizarse de manera cuantitativa. La orina reunida de manera adecuada se cultiva en cantidades medidas de medios sólidos y se cuentan las colonias que surgen después de la incubación, con el propósito de saber el número de bacterias por mililitro. El método ordinario es inocular 0.001 a 0.005 ml de orina sin diluir en cajas con agar sangre y otros medios sólidos, para el cultivo cuantitativo. Los medios se incuban durante toda la noche a 37°C; después se compara el número de microorganismos que proliferaron (densidad de crecimiento) mediante fotografías con diferentes ejemplos del mismo parámetro, en el caso de bacterias similares, y así se obtienen datos semicuantitativos.

En la pielonefritis activa, el número de bacterias en la orina reunida por sondas ureterales es relativamente pequeño. Las bacterias, en tanto se acumulan en la vejiga, se multiplican de modo rápido y pronto su número excede de 10⁵/ml, cifra mucho mayor de la que puede obtenerse como consecuencia de contaminación por la microbiota de la uretra o la piel o del aire. Por esa razón, suele aceptarse que si por cultivo se identifican más de 10⁵ colonias/ml en una muestra de orina reunida y cultivada de manera apropiada, ello constituye una prueba de peso de que existe infección activa de vías urinarias. La presencia de más de 10⁵ bacterias del mismo tipo por mililitro en dos muestras consecutivas corrobora el diagnóstico de infección activa del aparato genitourinario, con una certidumbre de 95%. Si en el cultivo se encuentran menos bacterias, conviene repetir el análisis de la orina para corroborar la presencia de infección.

La identificación de 10⁴ bacterias por mililitro, que incluye diferentes tipos de ellas, sugiere que los microorganismos provienen de la microbiota normal y son contaminantes, casi siempre de una recolección inadecuada de la muestra. La presencia de 10⁴/ml de un solo tipo de bacilos gramnegativos entéricos sugiere fuertemente infección de vías urinarias, en particular en varones. En ocasiones, mujeres jóvenes con disuria aguda e infección de vías urinarias tienen más de 10² a 10³ microorganismos por mililitro. Si en los cultivos no se detectan microbios, pero persisten los signos clínicos de infección de dichas vías, hay que pensar en otras entidades patológicas, como “síndrome uretral”, obstrucción ureteral, tuberculosis vesical, infección gonocócica u otras enfermedades.

Líquido cefalorraquídeo

La meningitis ocupa un lugar prominente entre las urgencias médicas y, en ese caso, es esencial el diagnóstico temprano, rápido y preciso. El diagnóstico de meningitis depende de conservar una fuerte sospecha de su presencia o tener muestras adecuadas y estudiarlas a muy breve plazo. El peligro de muerte o de lesiones irreversi- bles es grande si no se emprende de inmediato el tratamiento y, por ello, casi nunca se cuenta con una nueva oportunidad de obtener muestras previas al régimen terapéutico, situación esencial para el diagnóstico etiológico específico y el tratamiento óptimo.

El aspecto diagnóstico más urgente es hacer la diferenciación entre la meningitis bacteriana purulenta aguda, la meningitis “aséptica” y la granulomatosa. La decisión inmediata por lo común se basa en el recuento celular, la medición de la concentración de glucosa y el contenido proteínico del líquido cefalorraquídeo y los resultados de la búsqueda microscópica de microorganismos (véase caso 1, cap. 48). La impresión inicial se modifica con los resultados del cultivo, los estudios serológicos, las pruebas de amplificación de ácido nucleico y otros métodos de laboratorio. Al valorar las concentraciones de glucosa en líquido cefalorraquídeo, hay que considerar de manera simultánea la glucemia. En algunas neoplasias del sistema nervioso central, las concentraciones de glucosa en dicho líquido son bajas.

A. Muestras

Tan pronto el médico sospecha la posibilidad de infección del sistema nervioso central, debe tomar muestras de sangre para cultivo y también de líquido cefalorraquídeo. Para obtener este último, lleva a cabo una punción lumbar con técnica aséptica estricta y, por todos los medios, ha de evitar la compresión del bulbo raquídeo o la médula espinal por la extracción rápida del líquido cuando hay notable hipertensión intracraneal. El líquido cefalorraquídeo casi siempre se obtiene en tres o cuatro fracciones de 2 a 5 ml cada una, en tubos estériles, lo cual permite la realización más cómoda y fiable de pruebas para obtener las diferentes cifras necesarias con objeto de planificar las medidas asistenciales y terapéuticas.

B. Estudios microscópicos

El laboratorista se encarga de hacer los frotis del sedimento del líquido cefalorraquídeo centrifugado. Para preparar las laminillas que han de teñirse, es recomendable el uso de una centrífuga especial (disponible en el comercio) que concentre con mayor eficacia el material celular y las bacterias, en comparación con la centrifugación corriente. Los frotis se tiñen con el método de Gram. Al estudiar estos frotis con el objetivo de inmersión en aceite, es posible identificar diplococos gramnegativos intracelulares (meningococos), diplococos grampositivos intracelulares y extracelulares en forma de lanceta (neumococos) o pequeños bacilos gramnegativos (H. influenzae o bacilos gramnegativos entéricos).

C. Detección de antígeno

El antígeno de criptococo en el líquido cefalorraquídeo se puede detectar con las pruebas de aglutinación de látex o con EIA; el antígeno de S. pneumoniae puede encontrarse mediante inmunoanálisis de membrana.

D. Cultivo

Los métodos de cultivo deben facilitar la proliferación de microorganismos que suelen hallarse en la meningitis. En el agar sangre de carnero y el agar chocolate, se multiplican casi todas las bacterias y los hongos que causan meningitis. Para el diagnóstico de meningitis tuberculosa, se necesitan cultivos en medios especiales (cuadro 47-2 y cap. 23). En caso de meningitis aséptica o meningoencefalitis, puede intentarse el aislamiento del virus. Es posible aislar con éxito el virus, a partir del líquido cefalorraquídeo, en infecciones causadas por el virus de parotiditis, en la meningitis por herpes simple y en el caso de algunos enterovirus. Muchas de las infecciones del sistema nervioso central por virus se detectan mejor por métodos de amplificación de ácido nucleico.

E. Análisis de líquido cefalorraquídeo de vigilancia

La normalización de la concentración de glucosa y del número de células en el líquido cefalorraquídeo es una prueba satisfactoria de que el tratamiento fue adecuado. La respuesta clínica asume importancia definitiva.

Secreciones de vías respiratorias

Los síntomas o los signos a menudo orientan hacia la afectación de alguna zona particular de las vías respiratorias y, con esa base, el personal elige las muestras. Al interpretar los resultados de las pruebas de laboratorio, es necesario considerar la microbiota normal del área de donde se obtuvo la muestra.

A. Muestras

1. Faringe. Muchas “faringitis” se originan de infecciones por virus. Sólo 5 a 10% de tales casos en adultos y 15 a 20% en niños provienen de infecciones bacterianas. La detección de un exudado amarillento folicular o una membrana grisácea debe despertar en el médico la sospecha de que hay una infección por estreptococo hemolítico β del grupo A de Lancefield o infecciones diftérica, gonocócica, por fusoespiroquetas o Candida; los signos en cuestión también pueden aparecer en infecciones, como la mononucleosis, la generada por adenovirus y otras producidas por virus.

Se obtiene material faríngeo de cada área amigdalina y de la retrofaringe, sin tocar la lengua ni la mucosa vestibular. La microbiota normal en tal región incluye abundantes estreptococos viridans, neiserias, difteroides, estafilococos, bacilos gramnegativos pequeños y otros microorganismos. El estudio microscópico del frotis de exudado faríngeo obtenido con un hisopo es poco útil en infecciones por estreptococos, porque en todos los casos, la faringe alberga estreptococos de manera predominante.

Los cultivos del exudado faríngeo obtenido con hisopo generan resultados más fiables si se inoculan a breve plazo después de su obtención. Los medios selectivos para estreptococos pueden utilizarse para cultivar estreptococos del grupo A. Al sembrar el material en medio selectivos para estreptococos o placas de agar sangre para cultivo, es esencial distribuir un pequeño inóculo de manera uniforme y evitar la proliferación excesiva de microbiota normal; ello se puede lograr con facilidad al tocar el exudado faríngeo del hisopo en una zona pequeña de la placa y utilizar otro hisopo estéril o un asa bacteriológica estéril para llevar a cabo la siembra de esa área. La detección de colonias de estreptococo hemolítico β se facilita al presionar firmemente tramos largos del agar (con objeto de obtener una menor presión de oxígeno) y al incubar la placa dos días a 37°C.

En los últimos 20 años, se han perfeccionado diversos métodos de detección de antígenos, sondas y estudios de amplificación de ácido nucleico para mejorar la detección de Streptococcus pyogenes del exudado faríngeo, obtenido con un hisopo, en sujetos con faringitis estreptocócica aguda. En muchas circunstancias, los métodos de detección rápida han tenido la misma sensibilidad que el cultivo y lo han sustituido en gran cantidad de laboratorios. Es importante que el usuario sepa que tales métodos detectan o descartan sólo S. pyogenes y, de este modo, es imposible depender de sus resultados para el diagnóstico de faringitis bacteriana causada por otros patógenos. Un algoritmo incluiría comenzar con una prueba rápida y enviar para cultivo las muestras que en la prueba rápida no generaron resultados positivos.

2. Nasofaringe. Pocas veces se estudian las muestras de la nasofaringe porque se necesitan técnicas especiales para su obtención (véase más adelante Diagnóstico de infecciones por virus). La tos ferina se diagnostica al cultivar el material de lavado nasofaríngeo o nasal en busca de B. pertussis o por amplificación mediante PCR del DNA de ese microorganismo en la muestra.

3. Oído medio. Rara vez se obtienen muestras del oído medio porque habría que puncionar la membrana del tímpano. En la otitis media aguda, 30 a 50% de los líquidos aspirados son estériles desde el punto de vista bacteriológico. Las bacterias aisladas con mayor frecuencia son neumococos, H. influenzae, Moraxella catarrhalis y estreptococos hemolíticos.

4. Vías respiratorias inferiores. Las secreciones y los exudados bronquiales y pulmonares suelen estudiarse al analizar el esputo. El aspecto más desorientador de tal análisis es la casi inevitable contaminación con saliva y microbiota bucal. Con tal base, la detección de Candida, S. aureus o incluso S. pneumoniae en el esputo de una persona con neumonitis no tiene importancia etiológica, salvo que haya confirmación por los signos clínicos. Las muestras de esputo, para que sean de consideración, deben ser expectoradas y contener material de vías respiratorias inferiores y totalmente diferentes de la saliva. La presencia de innumerables células del epitelio pavimentoso sugiere contaminación importante con saliva; la abundancia de poliformonucleares (PMN, polymorphonuclear leukocytes) sugiere un exudado purulento. La producción de esputo se puede inducir por inhalación durante varios minutos de un aerosol de solución salina hipertónica. En la neumonía acompañada de derrame pleural, en el líquido de esa zona se pueden identificar con mayor fidelidad los microorganismos causales que tiene el esputo. Si se sospecha tuberculosis, en el material de lavado gástrico (esputo deglutido) se pueden encontrar microorganismos si es imposible obtener material expectorado, por ejemplo, en el niño.

5. Aspiración transtraqueal, broncoscopia, biopsia pul- monar y lavado broncoalveolar. La microbiota en las muestras en cuestión suele reflejar con precisión los fenómenos que ocurren en las vías respiratorias inferiores. A veces se necesita obtener muestras por broncoscopia para el diagnóstico de neumonía por Pneumocystis o infección por Legionella u otros microorganismos. Las muestras de lavado broncoalveolar son particularmente útiles en pacientes inmunodeprimidos con neumonía difusa.

B. Estudio microscópico

Los frotis de flemas purulentas o gránulos de esputo, teñidos con los métodos de Gram o para acidorresistentes, pueden indicar la presencia de microorganismos causales y polimorfonucleares. Es posible realizar una prueba directa de hinchazón capsular de neumococos, con suero polivalente en esputo recién obtenido.

C. Cultivos

Los medios utilizados para cultivar esputo deben ser adecuados para la proliferación de bacterias (p. ej., neumococos, Klebsiella), hongos (p. ej., C. immitis), micobacterias (p. ej., M. tuberculosis) y otros microorganismos. Las muestras obtenidas por broncoscopia y por biopsia de pulmón también se cultivan en otros medios (p. ej., el que se usa para anaerobios, Legionella y otros). El operador debe estimar la prevalencia relativa de microorganismos diferentes en la muestra. Sólo detectar un microbio predominante o el aislamiento simultáneo de un microorganismo de esputo en sangre puede definir con nitidez su participación en un proceso neumónico o supurativo. Los laboratorios de hospitales que atienden a gran número de personas que reciben trasplantes poseen algoritmos integrales para muestras obtenidas por broncoscopio, que incluyen diversos métodos diagnósticos, como pruebas de amplificación de ácido nucleico (NAAT, nucleic acid amplification tests) y otras técnicas para la detección amplia de agentes patógenos.

Muestras obtenidas del tubo digestivo

Los síntomas agudos que corresponderían al tubo digestivo, en particular náusea, vómito y diarrea, suelen atribuirse a alguna infección. En realidad muchos de los episodios de ese tipo provienen de intolerancia a alimentos o bebidas, presencia de enterotoxinas, consumo de fármacos o enfermedades sistémicas.

Muchos casos de diarrea infecciosa aguda se originan de virus que no pueden identificarse porque no proliferan en cultivos hísticos. Por otra parte, mucho virus que pueden proliferar en cultivos (p. ej., los adenovirus o los enterovirus), se multiplican en el intestino sin causar síntomas del tubo digestivo. De forma similar algunas bacterias patógenas entéricas persisten en el aparato digestivo después de una infección aguda. Por todo lo expuesto, a veces es difícil atribuir importancia a una bacteria o a un virus cultivado de las heces, en especial en enfermedades subagudas o crónicas.

Estas consideraciones no deben desalentar al médico para que intente el aislamiento de microorganismos entéricos, con métodos de laboratorio, pero han de constituir una advertencia de algunas dificultades frecuentes en la interpretación de los resultados.

La zona ileocólica tiene un número notablemente grande de microorganismos bacterianos en su microbiota normal. Los que más prevalecen son los anaerobios (Bacteroides, bacilos y cocos grampositivos), los microorganismos entéricos gramnegativos y E. faecalis. Cualquier intento de obtener bacterias patógenas de las heces obliga a separar los agentes patógenos de la microbiota normal, casi siempre a través de la utilización de medios selectivos diferenciales y cultivos enriquecidos. Entre las causas importantes de gastroenteritis aguda están virus, toxinas (de estafilococos, clostridios, vibriones y E. coli toxígena), bacilos gramnegativos entéricos invasores, fermentadores lentos de lactosa, shigelas y salmonelas y Campylobacter. La importancia relativa de estos grupos de microorganismos muestra enormes diferencias en diversas zonas del mundo.

A. Muestras

Las muestras que se pueden obtener con mayor facilidad son las de heces y las de hisopos rectales. En la bilis obtenida por drenaje duodenal, se puede detectar una infección de los conductos biliares. La presencia de sangre, moco o helmintos se confirma mediante la inspección visual de la muestra. El hallazgo de leucocitos en las suspensiones de heces analizadas por microscopio o la detección de lactoferrina, proteína proveniente de tales células, constituyen formas útiles para diferenciar las diarreas causadas por infecciones de microorganismos invasores, de las producidas por no invasores. Sin embargo, es importante destacar que los leucocitos pueden estar en cuadros inflamatorios no infecciosos del tubo digestivo. Es necesario utilizar técnicas especiales para buscar protozoos y helmintos parásitos y sus huevos. Por medio de frotis teñidos se pueden identificar leucocitos y algunos microorganismos anormales, como Candida o estafilococos, pero son inútiles para diferenciar las bacterias patógenas entéricas, de la microbiota normal.

B. Cultivo

Las muestras se suspenden en caldo y se cultivan en medios tanto corrientes como diferenciales (p. ej., los agares de MacConkey o de EMB) que permiten la separación de bacilos gramnegativos que no fermentan la lactosa respecto de otras bacterias entéricas. En caso de sospechar una salmonelosis, se coloca la muestra en un medio enriquecido (como el caldo de selenita F) durante 18 h antes de inocularlo en medios diferenciales (p. ej., el agar entérico de Hektoen o el agar para Shigella-Salmonella). Hay mayor posibilidad de aislar Yersinia enterocolitica después de almacenar suspensiones fecales durante dos semanas a 4°C, pero se puede aislar en agar para Yersinia o para Shigella-Salmonella incubado a 25°C. Los vibriones se multiplican mejor en el agar sacarosa con sales biliares y citrato de tiosulfato. Campylobacter termófilo se aísla en agar de Campy o en medio selectivo de Skirrow incubados a 40 a 42°C en una atmósfera de 10% de CO₂ con una presión de O₂ muy pequeña. Las colonias bacterianas se identifican con métodos bacteriológicos ordinarios. La aglutinación de bacterias a partir de colonias sospechosas, por antisueros específicos de varios donadores, suele ser el método más rápido para definir la presencia de salmonelas o shigelas en el tubo digestivo.

C. Métodos no basados en cultivos

En la práctica clínica, se cuenta con EIA para detectar patógenos entéricos específicos, de manera directa en muestras de heces o para confirmar su multiplicación en caldo o medios inoculados. También se dispone de EIA que detectan toxinas de Shiga números 1 y 2 en casos sospechosos de colitis causada por E. coli enterohemorrágica (llamada también toxina de Shiga que produce STEC o E. coli) y que son mejores comparados con los cultivos. Se dispone también de EIA para la detección directa de virus patógenos, como rotavirus, adenovirus 40 y 41 y norovirus; bacterias patógenas, como Campylobacter jejuni, así como los protozoos parásitos Giardia lamblia, Cryptosporidium parvum y Entamoeba histolytica. Los datos útiles de tales valoraciones son variables.

Los parásitos intestinales y sus huevos se identifican mediante el análisis microscópico repetido de muestras de heces recién obtenidas; éstas necesitan manejo especial en el laboratorio (cap. 46).

Enfermedades de transmisión sexual

Los microorganismos que ocasionan la secreción de la uretritis en genitales de varones son N. gonorrhoeae, C. trachomatis y Ureaplasma urealyticum. La endocervicitis en mujeres se debe a N. gonorrhoeae y C. trachomatis. Las úlceras genitales, propias de enfermedades en varones y mujeres por igual, suelen ser de herpes simple y, con menor frecuencia, de sífilis y chancroide; en algunas ocasiones se deben a linfogranuloma venéreo y, raras veces, a granuloma inguinal. Cada una de estas entidades patológicas posee su evolución natural característica, propia y de sus lesiones, pero una puede asemejarse a la otra. En otros apartados del libro, se expone el diagnóstico por medio de laboratorio de casi todas las infecciones en cuestión. Más adelante se describen unos cuantos métodos diagnósticos que se incluyen en el cuadro 47-2.

A. Gonorrea

La presencia de diplococos gramnegativos intracelulares en un frotis teñido de exudado uretral o cervicouterino indica con certeza gonorrea. La sensibilidad de tal estudio se acerca a 90% en el caso de varones y a 50% en mujeres; por tal razón, para ellas se recomienda practicar cultivo o un método de amplificación de ácido nucleico. El material del exudado, el obtenido del recto con hisopo o de la faringe deben inocularse de inmediato en los medios especiales para la proliferación de N. gonorrhoeae. También se pueden realizar métodos moleculares para detectar el DNA de dicho diplococo en exudados uretrales, cervicouterinos o en orina, pero a veces surgen pruebas positivas falsas por la detección de secuencias de DNA de neiserias no patógenas y esto varía con el tipo de plataformas comerciales. Los métodos serológicos son inútiles.

B. Infecciones por clamidias en genitales

Véase la sección sobre el diagnóstico de clamidiosis, más adelante.

C. Herpes genital

Véase el capítulo 3, así como el apartado de diagnóstico de infecciones por virus más adelante.

D. Sífilis

El estudio en campo oscuro o por inmunofluorescencia del líquido exprimido de la base del chancro puede indicar la presencia de T. pallidum típico. Las pruebas serológicas de sífilis se tornan positivas tres a seis semanas después de la infección. La prueba positiva de floculación (p. ej., el Venereal Disease Research Laboratory [VDRL] o la reagina plasmática rápida [RPR, rapid plasma reagin]) necesita confirmación. La prueba positiva de anticuerpos inmunofluorescentes contra treponema (p. ej., adsorción de anticuerpos treponémicos fluorescentes [FTA-ABS, fluorescent treponemal antibody-absortion], aglutinación de partículas de T. pallidum [TP-PA, Treponema pallidum particle agglutination] o las nuevas pruebas de EIA para Treponema y quimioluminiscencia; cap. 24) corrobora la infección sifilítica.

E. Chancroide

En los frotis del material supurado de la lesión casi siempre se identifica una microbiota bacteriana mixta. El material de lesiones obtenido con hisopos debe cultivarse a 33°C en dos o tres medios que sean selectivos para Haemophilus ducreyi. Los métodos serológicos son inútiles. Las ténicas moleculares se usan en algunos laboratorios de investigación o especializados.

F. Granuloma inguinal

Klebsiella granulomatis (denominada en el pasado Calymmatobacterium), el agente causal de la lesión proliferativa, granulomatosa y dura, puede proliferar en medios bacteriológicos complejos, pero tal confirmación rara vez se intenta y es muy difícil obtener buenos resultados. La demostración histológica de los “cuerpos de Donovan” intracelulares en material de biopsia suele ser un elemento que refuerza la impresión clínica. Los métodos serológicos son ineficaces. En algunos laboratorios de investigación o especializados, se utilizan técnicas moleculares.

G. Vaginosis-vaginitis

La vaginosis bacteriana posiblemente causada por G. vaginalis o Mobiluncus (cap. 21 y caso 13, cap. 48) se diagnostica en la sala de exploración al revisar la secreción vaginal; dicho material: 1) es grisaseo y a veces espumoso; 2) tiene un pH mayor de 4.6; 3) tiene un olor a aminas (“pescado”) cuando se alcaliniza con hidróxido de potasio, y 4) contiene “células características”, que son células epiteliales grandes cubiertas con bacilos gramnegativos o gramvariables. Se utilizan observaciones similares para diagnosticar la infección por Trichomonas vaginalis (cap. 46); se pueden identificar los microorganismos móviles en preparados húmedos o cultivados de secreción genital. Las sondas de DNA y las NAAT recién aprobadas son mucho más sensibles que los métodos húmedos. La vaginitis por Candida albicans se diagnostica mediante la detección de seudohifas en un preparado con hidróxido de potasio, de la secreción vaginal, por sondas o por cultivo.

La mayor parte de las bacterias que componen la microbiota humana normal es anaerobia. Cuando aquéllas se desplazan de sus sitios normales y pasan a tejidos o espacios corporales pueden ocasionar enfermedades. Algunas características sugieren la infección anaerobia: 1) a menudo surge en zonas contiguas a una superficie mucosa; 2) tiende a aparecer como combinación de microorganismos; 3) estas bacterias tienen proclividad a generar infecciones en espacios cerrados, como abscesos circunscritos (de pulmón, cerebro, pleura, peritoneo o pelvis) o al socavar a través de capas hísticas; 4) el pus de las infecciones por anaerobios es fétido; 5) muchos de los anaerobios importantes desde el punto de vista patogénico, salvo Bacteroides y algunas Prevotella, son muy susceptibles a la penicilina G; 6) las infecciones por anaerobios surgen fácilmente cuando disminuye el riego sanguíneo, si hay tejido necrótico o cuando es bajo el potencial de oxidorreducción, factores que interfieren en la llegada de antibióticos a esa zona; 7) es esencial el uso de métodos especiales de recolección, de medios de transporte y técnicas y medios sensibles a anaerobios para aislarlos. De no seguir tales precauciones, a veces no se identifican en el análisis bacteriológico o sólo se detectan de forma accidental los aerobios (cap. 21).

Loa aparatos y sistemas siguientes constituyen sitios de importantes infecciones por anaerobios.

Aparato respiratorio

Las infecciones periodontales, los abscesos peribucales, la sinusitis y la mastoiditis se originan de manera predominante de Prevotella melaninogenica, Fusobacterium y peptoestreptococos. La aspiración de saliva puede ocasionar neumonía necrosante, abscesos pulmonares y empiema. Para el tratamiento, son esenciales los antibióticos y el drenaje postural o quirúrgico.

Sistema nervioso central

Los anaerobios rara vez causan meningitis, pero son fuente habitual de abscesos cerebrales, empiema subdural y tromboflebitis séptica. Los microorganismos casi siempre provienen de las vías respiratorias y llegan al cerebro, por extensión o por la sangre.

Infecciones intraabdominales y pélvicas

La microbiota del colon comprende de modo predominante anaerobios a razón de 10¹¹ por gramo de heces. Bacteroides flagilis, clostridios y peptoestreptococos tienen una participación muy importante en la formación de abscesos, que surgen en caso de perforación del intestino. En los abscesos pélvicos, que se originan en el aparato genital de la mujer, son importantes Prevotella bivia y Prevotella disiens. A semejanza de B. flagilis, los microorganismos mencionados suelen ser relativamente resistentes a la penicilina y, por tal razón, ha de administrarse clindamicina, metronidazol u otro fármaco eficaz.

Infecciones cutáneas y de tejidos blandos

Los anaerobios y las bacterias aerobias a menudo se complementan para originar infecciones “sinérgicas” (gangrena, fascitis necrosante y celulitis). Las modalidades más importantes de tratamiento en tales casos son el drenaje quirúrgico, la extirpación y la optimación de la circulación, en tanto actúan como complemento los antibióticos. Suele ser difícil atribuir a un solo microorganismo específico la lesión progresiva, porque por lo general participan combinaciones de ellos.

Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae y Chlamydophila psittaci son bacterias, pero son parásitos intracelulares obligados. Para los cultivos y otros métodos diagnósticos de identificación de clamidias se necesitan técnicas muy similares a las usadas en los laboratorios de virologia diagnóstica y no las que se utilizan en los de bacteriología y micología. Por esa razón, el diagnóstico de infecciones por clamidias se expone en una sección separada de este capítulo. El diagnóstico de tales infecciones con técnicas de laboratorio también se señala en el capítulo 27.

Muestras

En el caso de las infecciones oculares y genitales por C. trachomatis, deben recolectarse las muestras de los sitios infectados para análisis directo o cultivo, por medio de presión vigorosa de los hisopos o raspado de la superficie epitelial afectada. Los cultivos de secreciones purulentas no son adecuados y, antes de obtener la muestra, se elimina dicho material. De ese modo, en el caso de la conjuntivitis de inclusión, se lleva a cabo un raspado conjuntival; en pacientes con uretritis, se recolecta una muestra con hisopo, de un tramo que mida algunos centímetros del interior de la uretra y, en personas con cervicitis la muestra se obtiene de la superficie de células cilíndricas del conducto endocervical. Es posible utilizar muestras que se recolectan con hisopo u orina para las pruebas de amplifica- ción de ácido nucleico. Cuando en una mujer se sospecha una infección de la zona superior del aparato genitourinario, una muestra adecuada sería la de raspado del endometrio. El líquido obtenido por culdocentesis o aspiración de la trompa uterina produce escasos microorganismos (C. trachomatis) en el cultivo.

En el caso de C. pneumoniae, conviene utilizar muestras nasofaríngeas recolectadas con hisopo (no de la faringe).

En los pacientes con linfogranuloma venéreo, el material de aspiración de los bubones o los ganglios fluctuantes constituye la mejor muestra para cultivo.

En lo que se refiere a la psitacosis, por medio del cultivo de esputo, sangre o material de biopsia se puede identificar C. psittaci; la técnica anterior no se lleva a cabo de modo habitual en los laboratorios clínicos, porque obliga a efectuar métodos especializados y también por el peligro que conlleva para el personal de laboratorio. Las muestras obtenidas con hisopo, raspado y de tejidos deben colocarse en un medio (de laboratorio) adecuado para el transporte. Uno de ellos, que es útil, incluye sacarosa a razón de 0.2 mol/L en una solución amortiguadora de fosfato al 0.02 M con pH de 7.0 a 7.2, con suero al 5% de feto de ternera. Otros medios de transporte pueden ser igualmente idóneos. El medio de transporte, debe contener antibióticos para suprimir la proliferación de bacterias diferentes de clamidias. Puede usarse en combinación con los siguientes antibióticos porque no se inhibe la proliferación de dicho microorganismo; gentamicina, 10 µg/ml; vancomicina, 100 µg/ml y, anfotericina B, 4 µg/ml. Si es imposible preparar y estudiar rápidamente las muestras, habrá que refrigerarlas durante 24 h; de lo contrario, se les congela a <60°C o una temperatura menor hasta que se trabaje con ellas.

Estudios microscópicos y tinciones

El estudio citológico es importante y eficaz sólo para el estudio de raspados conjuntivales a fin de diagnosticar conjuntivitis de inclusión y tracoma causados por C. trachomatis. Se identifican las típicas inclusiones intracitoplásmicas, de manera clásica en las muestras teñidas con técnica de Giemsa. Cabe emplear los anticuerpos monoclonales conjugados con fluoresceína para el estudio directo de muestras del aparato genitourinario y oculares, pero no tienen la misma sensibilidad que el cultivo o los métodos de diagnóstico molecular cuando se buscan clamidias.

Cultivo

Cuando se necesita cultivo, se recomiendan técnicas idóneas celulares para el aislamiento de Chlamydia. El cultivo para encontrar C. trachomatis y C. psittaci casi siempre comprende la inoculación de las muestras clínicas en células de McCoy tratadas con cicloheximida, en tanto para identificar C. pneumoniae se necesitan células de HL (linfoma histiocítico [hystiocitic lymphoma]) o HEP-2 (células de tumor laríngeo humano [human laringeal tumor cells]) pretratadas. Una técnica utiliza la proliferación confluyente en células de McCoy en cubreobjetos de 3 mm en pequeñas viales desechables. El inóculo se coloca en viales dobles y se centrifuga hasta la aparición de monocapas, a 3 000 × g, a lo que sigue la incubación a 35°C durante 48 a 72 h y se tiñe. Al detectar C. trachomatis, se usa inmunofluorescencia, tinción de Giemsa o de yodo con objeto de identificar las inclusiones intracitoplásmicas. De las tres técnicas anteriores, las inmunofluorescentes son las más sensibles, pero necesitan reactivos inmunofluorescentes especiales y técnicas microscópicas peculiares. El método de Giemsa es más sensible que el yodo, pero la revisión microscópica es más difícil.

La segunda técnica de cultivo utiliza células de McCoy en placas de microdilución con 96 cuencos y tinción con yodo o anticuerpos fluorescentes. El área superficial de la monocapa es menor y también lo es el inóculo, razón por la cual el método de placa por microdilución es menos sensible que la técnica de cubreobjetos-vial.

Las inclusiones de C. trachomatis captan el yodo, pero no lo hacen las de C. pneumoniae y C. psittaci (cap. 27). Estos dos microorganismos se diferencian de C. trachomatis por sus respuestas diferentes a la tinción con yodo y por su susceptibilidad a la sulfonamida. Chlamydophilia pneumoniae en cultivo se detecta por medio de un anticuerpo monoclonal con especificidad de género o, aún mejor, con especificidad de especie. Las técnicas serológicas para diferenciación por especies no son prácticas, aunque C. trachomatis puede identificarse mediante el método de microinmunofluorescencia.

Detección de antígeno e hibridación de ácido nucleico

Los enzimoinmunoanálisis (EIA) se utilizan para detectar antígenos de clamidia en muestras de aparato genitourinario en personas con enfermedades de transmisión sexual. En comparación con las NAAT más sensibles para encontrar clamidias (véase adelante), los EIA tienen una sensibilidad mucho menor. Aún son útiles los métodos de anticuerpos fluorescentes directos (DFA, direct fluorescent antibody) para estudiar algunas muestras de sitios extragenitales, como las conjuntivas en recién nacidos. Se pueden conseguir equipos comerciales con sondas moleculares que no tienen radionúclidos para detectar las secuencias de RNA 16S de C. trachomatis para la identificación directa del microorganismo en muestras clínicas. La sensibilidad y la especificidad globales del método mencionado son 85 y 98 a 99%, respectivamente. También se han creado y distribuido en el comercio métodos de amplificación de ácido nucleico que se basan en la PCR, la amplificación mediada por transcripción o la amplificación del desplazamiento del cordón. Estas pruebas son mucho más sensibles que el cultivo y otros métodos sin amplificación, que necesitaron una redefinición de la sensibilidad en la corroboración de una infección por clamidias, efectuada en el laboratorio. La especificidad de los métodos en cuestión al parecer se acerca a 100% (cap. 27).

Serología

El método de fijación de complemento (CF, complement fixing) se utiliza ampliamente para diagnosticar psitacosis. El diagnóstico serológico de las clamidosis se expone en el capítulo 27.

El método de microinmunofluorescencia es más sensible que el de CF para cuantificar los anticuerpos contra clamidia. Tiene valor de confirmación diagnóstica cuando el título de anticuerpos IgG aumenta cuatro tantos, en los sueros de la fase aguda y de convalecencia. Sin embargo, a veces es difícil demostrar el incremento del título de dicha inmunoglobulina por las elevadas cuantificaciones que posee ya la población sexualmente activa. La medición de anticuerpos IgM es útil en particular en el diagnóstico de neumonía por C. trachomatis en recién nacidos. Los hijos de madres con clamidiosis tienen anticuerpos séricos de tipos IgG anticlamidias, provenientes de la circulación materna. Los recién nacidos con infecciones de ojos o vías respiratorias superiores tienen cuantificaciones pequeñas de IgM contra clamidia, en tanto que quienes padecen neumonía por clamidias poseen cantidades de dicha inmunoglobulina de 1:32 o mayores.

En la virología diagnóstica, se necesita comunicación entre el médico y el personal de laboratorio y aquélla depende de la buena calidad de las muestras y de la información que llegue a ese personal.

La selección de métodos para confirmar la presencia de una infección por virus, por medios de laboratorio, depende de la fase de la enfermedad (cuadro 47-4). Para las pruebas de anticuerpos se necesita obtener muestras a intervalos apropiados y, a menudo, el diagnóstico se confirma sólo en la convalecencia. El aislamiento de un virus o la detección de su antígeno o las NAAT son necesarios: 1) cuando surgen epidemias nuevas, como el caso de la gripe; 2) si los métodos serológicos son inútiles, y 3) cuando la misma enfermedad pueden causarla múltiples virus diferentes. Por ejemplo, la meningitis aséptica (no bacteriana) puede originarse de innumerables virus; de forma similar, los síndromes de vías respiratorias pueden deberse a innumerables virus y también a micoplasmas y otros microorganismos.

Los métodos diagnósticos basados en técnicas de amplificación de ácidos nucleicos pronto sustituirán a algunos de los cultivos en busca de virus, aunque no todos. Sin embargo, no cambiará la necesidad de recolección de una muestra apropiada y la interpretación de los datos de las pruebas. Además, surgen situaciones en que se desea la “recuperación” del agente infeccioso.

Con el aislamiento de un virus tal vez no se defina la causa de una enfermedad particular y, en esos casos, hay que considerar otros muchos factores. Algunos virus persisten en los hospedadores humanos por largo tiempo y, por esa razón, la identificación de virus herpético, de polio, echo o coxsackie de una persona con una enfermedad no diagnosticada no equivale a que el virus la genere. Es importante definir un perfil clínico y epidemiológico congruente antes de afirmar que un agente particular causó un cuadro clínico específico.

Es posible aislar con alguna facilidad muchos virus en los primeros días de la enfermedad. Las muestras por utilizar en los intentos de aislamiento se incluyen en el cuadro 47-5. Una correlación del virus aislado y la presencia de anticuerpos es útil para corroborar el diagnóstico, aunque aquélla es una técnica que pocas veces se practica.

Las muestras se refrigeran incluso 24 h antes de realizar los cultivos en busca de virus, con la excepción de los virus sincitial respiratorio y otros más. De no ser así, habrá que refrigerar el material (de preferencia a <60°C o temperaturas menores), si existe algún retraso en su transporte al laboratorio. Las muestras que no de- ben congelarse incluyen: 1) sangre completa extraída para cuantificación de anticuerpos, a partir de la cual debe separarse el suero antes de congelarla, y 2) tejidos para cultivo de órganos y células que deben conservarse a 4°C y enviarse de inmediato al laboratorio.

El virus aparece en enfermedades de vías respiratorias, en las secreciones de faringe o las vías nasales; su presencia se demuestra en el líquido de la faringe y en el material de raspado de la base de los exantemas vesiculares. En infecciones oculares, puede encontrarse el virus en el material obtenido con hisopos o raspado de conjuntivas y en las lágrimas. Las encefalitis se diagnostican con mayor facilidad si se cuenta con medios serológicos o métodos de amplificación de ácidos nucleicos. Los arbovirus y los herpesvirus casi nunca se detectan en el líquido cefalorraquídeo, pero el tejido encefálico en personas con encefalitis viral puede aportar el agente causal. En las enfermedades generadas por enterovirus, como las del sistema nervioso central, la pericarditis aguda y la miocarditis, es posible aislar el virus de heces, exudado faríngeo obtenido con hisopo o líquido cefalorraquídeo. Sin embargo, como se comentó, las NAAT constituyen uno de los métodos preferidos para hallar enterovirus en el líquido cefalorraquídeo. Las pruebas con anticuerpos fluorescentes directos quizá posean la misma sensibilidad que los cultivos para identificar infecciones de vías respiratorias por virus sincitial respiratorio, de las gripes A y B, de parainfluenzas y adenovirus. Los estudios en cuestión generan datos esclarecedores horas después de haber reunido la muestra, en comparación con los días que deben transcurrir para obtener los resultados del cultivo de virus. Sin embargo, dichos métodos de detección rápida de antígeno han sido sustituidos poco a poco por técnicas igualmente rápidas de PCR en tiempo real y de micromatriz multigénica que permiten la detección simultánea de diversos virus de interés.

Examen directo del material clínico: técnicas microscópicas y tinciones

Entre las enfermedades por virus en que ha sido útil el estudio microscópico directo de “impresiones” o frotis están la rabia y la infección por herpes simple y las infecciones cutáneas por varicela-zóster. El método más indicado para el diagnóstico corriente de rabia es teñir los antígenos virales por inmunofluorescencia en frotis de tejido encefálico e impresiones corneales del animal rabioso y de la piel de la nuca de los seres humanos.

Cultivo del virus

A. Preparación de los inóculos

Es posible inocular directamente en cultivos celulares o después de dilución con solución de fosfato amortiguada (pH 7.6) los líquidos sin bacterias como el cefalorraquídeo, el sanguíneo total, el plasma o la capa de leucocitos. Sólo en laboratorios especializados se practica la inoculación de huevos embrionados o de animales para aislar el virus.

El tejido se lava en medios idóneos o agua estéril, se fragmenta en segmentos pequeños con tijeras y se muele para hacer una pasta homogénea. Se le agrega diluyente en cantidades suficientes para obtener una concentración de 10 a 20% (peso/volumen); la suspensión se centrifuga a una velocidad que no exceda de 2 000 revoluciones por minuto (rpm) durante 10 min, para que se sedimenten los restos celulares insolubles. El líquido sobrenadante puede inocularse y, si incluye bacterias, éstas se eliminan.

Los tejidos también pueden tratarse con tripsina y la suspensión celular resultante puede: 1) inocularse en una monocapa celular de un cultivo hístico existente, o 2) cultivarse de manera conjunta con otras suspensiones de células, en las que se tenga la certeza de que no hay virus.

Si el material por estudiar contiene bacterias (de lavado faríngeo, heces, orina, tejido infectado o insectos), éstas deben inactivarse o eliminarse antes de la inoculación.

1. Bactericidas. Los antibióticos suelen utilizarse en combinación con la centrifugación diferencial (véase más adelante).

2. Métodos mecánicos

a. Filtros. Se prefieren los filtros de membrana de tipo millipore, de acetato de celulosa o de un material inerte similar.

b. Centrifugación diferencial. Constituye un método cómodo para eliminar muchas bacterias, de preparados de virus pequeños, fuertemente contaminados. Las bacterias se sedimentan a baja velocidad, la cual no logra sedimentar a los virus, pero con la centrifugación a gran velocidad sí se sedimentan estos últimos. Después de ello, el sedimento con los virus se suspende de nuevo en un volumen pequeño de la solución.

B. Cultivo en cultivo celular

Se han sustituido las técnicas de cultivo celular por métodos de detección de antígeno y técnicas de NAAT. No obstante, aquéllas siguen siendo útiles y se les utiliza en laboratorios clínicos y de salud pública especializados en virología. Cuando los virus se multiplican en un cultivo celular originan efectos biológicos (p. ej., cambios citopáticos, interferencia viral, producción de una hemaglutinina), los cuales permiten identificar el microorganismo.

Los cultivos en tubos de ensayo se preparan al adicionar células suspendidas en 1 a 2 ml de líquido nutriente que contiene soluciones salinas “equilibradas” y varios factores de crecimiento (casi siempre suero, glucosa, aminoácidos y vitaminas). Las células de naturaleza fibroblástica o epitelial se fijan y proliferan en la pared del tubo de ensayo, donde se les puede examinar con un microscopio de baja potencia.

En el caso de muchos virus, la proliferación del agente ocurre de modo simultáneo a la degeneración de tales células (fig. 47-1). Algunos virus generan un efecto citopático (CPE, cytopathic effect) característico en el cultivo celular (contracción, turgencia, redondeamiento de las células, formación de sincitios o grupos) lo cual permite un diagnóstico presuncional rápido cuando se conoce el síndrome clínico. Por ejemplo, el virus sincitial respiratorio de manera característica genera células gigantes multinucleadas (sincitios), en tanto que los adenovirus producen cúmulos “estafiloides” de grandes células redondas. Algunos virus (como el de rubéola) no originan efectos citopáticos directos, pero se les detecta al interferir en el CPE de un segundo virus estimulante (interferencia viral). Los virus de gripe y algunos paramixovirus pueden detectarse en un plazo de 24 a 48 h si se agregan eritrocitos a los cultivos infectados. Los virus que maduran en la membrana celular producen una hemaglutinina que permite a los eritrocitos adsorberse en la superficie celular (hemadsorción). Es posible identificar la identidad del virus aislado mediante un antisuero con especificidad del tipo que inhibe la proliferación del virus o que reacciona con sus antígenos.

Algunos virus pueden proliferar en cultivo, pero se trata de un proceso muy lento y difícil. Para diagnosticar las infecciones de ese tipo se recurre a otros estudios en vez del cultivo (véase adelante).

C. Método de centrifugación y cultivo para el diagnóstico temprano del citomegalovirus

Este método permite la detección rápida de virus en muestras clínicas; se le ha adaptado para la identificación de algunos virus como el citomegalovirus (CMV) y el de varicela-zóster. Por ejemplo, es posible detectar el CMV en 18 a 24 h, en comparación con las dos a cuatro semanas que eran necesarias con el clásico cultivo celular; son similares las sensibilidades del método de centrifugación y cultivo y el cultivo clásico en busca de CMV. Se obtienen monocapas de la estirpe celular adecuada por proliferación (p. ej., células MRC-5 [Medical Research Council-5] para CMV) en cubreobjetos de viales de 15 × 45 mm. Después de la inoculación con la muestra, las viales se centrifugan a 700 × g durante 40 min a temperatura ambiental; se incuban a 37°C durante 16 a 24 h, se fijan y se intenta la reacción con un anticuerpo monoclonal que sea específico para una proteína nuclear de CMV, que está presente desde una fase muy temprana en el cultivo; en el comercio, se cuenta con algunos anticuerpos de ese tipo. Se utilizan los métodos de tinción directa o indirecta de anticuerpos y microscopia por fluorescencia para identificar los cultivos positivos con esta técnica. Se deben incluir testigos positivos y negativos en cada análisis. Se ha creado una modificación de esta técnica para la recuperación y la detección simultánea de múltiples virus de vías respiratorias que utilizan células R-Mix. Dicho método se puede obtener en el comercio. Un vial contiene mezcla de dos estirpes celulares, como el carcinoma de pulmón humano A549 y los fibroblastos del pulmón del visón Mv1Lu. De forma típica, el personal de laboratorio inocula a dos viales de ese tipo. Después de la incubación de 18 a 24 h, se tiñe el material de un vial por medio de un reactivo de anticuerpos fluorescentes “de varios donadores” que detecta todos los virus comunes de vías respiratorias. Si la tinción es positiva, como paso siguiente se raspan las células en el cubreobjetos del segundo vial, se inoculan en una laminilla del octavo cuenco y se tiñen luego con reactivos de anticuerpo monoclonal individual que detecta el virus específico. No se obtienen muestras del microorganismo por medio de la técnica de centrifugación y cultivo. Si se necesitan microorganismos para pruebas de susceptibilidad para antivirales, se usa la clásica técnica de cultivo celular.

Sistema viral inducible con enzimas (Elvis, enzyme-linked virus-inducible system)

La estirpe celular mencionada es nueva y se utiliza para detectar virus del herpes simple (HSV, herpes simplex viruses) en cultivo. Se efectuó modificación genética de una estirpe de células renales de hámsters muy jóvenes y para ello se utilizó la secuencia promotora del gen de UL92 de HSV y de E. coli lacZ. La presencia del virus del herpes en muestras clínicas activa al promotor UL97, que a su vez activa al gen lacZ para producir la enzima galactosidasa β. Al agregar un sustrato de la enzima, surge un color azul que denota la presencia del virus. La tipificación del virus de HSV se realiza en cultivos en que existe la partícula, al agregar anticuerpos monoclonales que, por ejemplo, detectan HSV-2.

Detección de antígenos

La detección de antígenos virales se usa ampliamente en virología diagnóstica. Se cuenta con “estuches” comerciales con material para detectar muchos virus, como los del herpes simple I y II, de las gripes A y B, el sincitial respiratorio, el adenovirus, el de parainfluenza, el rotavirus y el citomegalovirus. También se utilizan múltiples tipos de cuantificaciones: EIA, anticuerpos fluorescentes directos o indirectos, aglutinación de látex y otros más. Las técnicas anteriores tienen la ventaja de que permiten detectar virus que no proliferan fácilmente en cultivo celular (p. ej., rotavirus o virus de hepatitis A) o que lo hacen con mucha lentitud (p. ej., el citomegalovirus). En general, las técnicas de detección de antígeno de virus son menos sensibles que los métodos de cultivo y las NAAT. Como se señaló, muchos de estos procedimientos se han sustituido con técnicas moleculares.

Amplificación de ácido nucleico y detección

Se cuenta con muy diversas técnicas comerciales cuantitativas para detectar ácido nucleico de virus o para amplificarlo e identificarlo. Los métodos en cuestión rápidamente se han tornado las técnicas normativas en virología diagnóstica y han sustituido a los procedimientos tradicionales de cultivo de virus y detección de antígeno. Los métodos incluyen la PCR; la PCR de transcriptasa inversa y otros métodos patentados. Estos procedimientos permiten detectar virus (p. ej., los enterovirus y otros más) y cuantificarlos (p. ej., VIH-1, citomegalovirus, de Epstein-Barr, de hepatitis B, C y VIH). Se utilizan datos de técnicas cuantitativas para orientar en el tratamiento antiviral en el caso de enfermedades por virus múltiples. Un ejemplo adecuado sería VIH-sida.

Hibridación de ácidos nucleicos

Esta técnica, que se usa para detectar virus, es muy sensible y específica. La muestra se distribuye en gotas pequeñas en una membrana de nitrocelulosa y se logra la fijación del ácido nucleico viral que está en la muestra problema; después se desnaturaliza con álcali in situ, se obtiene la hibridación con un fragmento del ácido nucleico del virus marcado y se detectan los productos de la hibridación. En el caso del rotavirus que contiene RNA bicatenario, el método de hibridación es más sensible que el EIA. El RNA, en muestras de heces desnaturalizadas por calor que contienen el rotavirus, se inmoviliza siguiendo los pasos anteriores y se emprende la hibridación in situ con sondas monocatenarias marcadas obtenidas por la transcripción in vitro del rotavirus.

Medición de la respuesta inmunitaria a la infección por virus

De manera típica, una infección por virus desencadena respuestas inmunitarias dirigidas contra uno o más de los antígenos de la partícula. Por lo regular, surgen las dos respuestas inmunitarias, de tipo celular y humoral, y cabe medir una u otra para diagnosticar la infección por virus. La inmunidad de tipo celular se puede valorar por la técnica de hipersensibilidad dérmica, transformación de linfocitos y citotoxicidad. Las respuestas inmunitarias humorales asumen enorme importancia diagnóstica. En el comienzo, aparecen los anticuerpos de la clase IgM y surgen después los anticuerpos de tipo IgG. Los anticuerpos IgM desaparecen en cuestión de semanas, en tanto que los de tipo IgG persisten años. La confirmación del diagnóstico de una infección por virus se logra mediante métodos serológicos, al demostrar el incremento en el título de anticuerpo contra el virus o al conformar la presencia de anticuerpos de la clase IgM contra el virus (cap. 8). Los métodos utilizados comprenden la prueba de neutralización (Nt), inhibición de la hemaglutinación (HI, hemagglutination inhibition) y las pruebas de inmunofluorescencia, hemaglutinación pasiva e inmunodifusión.

La medición de anticuerpos por métodos diferentes no genera necesariamente resultados en paralelo o equivalentes. Los anticuerpos detectados por fijación de complemento están presentes durante una infección por enterovirus y en el periodo de convalecencia, pero no persisten. Los anticuerpos hallados por neutralización también aparecen durante la infección y persisten muchos años. La valoración de los anticuerpos por diversos métodos en sujetos o en grupos de ellos aporta información diagnóstica y datos de las características epidemiológicas de la enfermedad.

Los métodos serológicos para el diagnóstico viral son más eficaces cuando el virus tiene un largo periodo de incubación antes de que surjan las manifestaciones clínicas. Una lista parcial de estos virus incluyen los de Epstein-Barr, de hepatitis, del Nilo Occidental y el VIH. De forma clásica, la identificación de los anticuerpos contra dichos virus constituye la primera medida en el diagnóstico y más adelante se practica la amplificación de ácido nucleico, para evaluar los títulos del virus circulante, como una estimación del nivel de infección o la respuesta a regímenes antivirales específicos o ambas. Otra utilidad importante de los métodos serológicos es conocer la vulnerabilidad de la persona o la exposición previa a un virus y la posibilidad de que se reactive en el contexto de inmunodepresión o de trasplante de un órgano.

Microscopia inmunoelectrónica

Los virus que no se detectan mediante las técnicas corrientes pueden observarse en la microscopia inmunoelectrónica (IEM, immune electron microscopy). Los complejos antígeno-anticuerpo o los agregados formados entre las partículas de virus en suspensión se originan de la presencia de anticuerpos en el antisuero adicionado y se detectan con mayor facilidad y seguridad que las partículas virales individuales. La IEM se utiliza para buscar virus que causan enteritis y diarrea y que casi nunca pueden cultivarse en los medios habituales para virus. El rotavirus se encuentra por medio de EIA.

Virus de inmunodeficiencia humana (VIH)

El VIH-1 se distribuye a escala mundial, en tanto que la cepa menos patógena, VIH-2, aparece sobre todo en África Occidental y otras cuantas zonas geográficas. La infección por VIH constituye una situación especial en la virología diagnóstica. Es importante confirmar con toda exactitud el diagnóstico por medio de pruebas de laboratorio, de modo que no exista posibilidad de un resultado positivo-falso o que sea mínima tal situación. Una vez corroborado el diagnóstico, se usan métodos de laboratorio para vigilar la evolución de la infección y con ello corroborar la eficacia del régimen terapéutico. Los bancos de sangre usan métodos muy sensibles para detectar ambos virus en sangre donada y así evitar infecciones por VIH provenientes de transfusiones.

Conocer los métodos para diagnosticar infección por VIH y para vigilarla obliga a entender la estructura y la replicación del virus, así como la respuesta inmunitaria a la infección. En el capítulo 44, se exponen con mayor detalle los temas en cuestión que se presentan en este apartado y también el VIH.

El VIH-1 y el VIH-2 son retrovirus; tienen cubierta y cadenas únicas de RNA en sentido positivo. Por la acción de la transcriptasa inversa, enzima viral, el RNA se transcribe en DNA y se integra en el genoma de las célula hospedadora. La proteína viral puede cuantificarse de forma directa y con mayor frecuencia es p24 (de la cápside). Se pueden identificar respuestas de anticuerpos contra otros productos génicos de VIH-1: como env, glucoproteína (gp) 160 (gp160, gp120, gp41); gag, p24, p17, p9, p7 y, pol, p66, p51 y p32. El virus VIH-2 genera productos génicos similares.

Dos a seis semanas después de la infección, 50% de los pacientes o más termina por mostrar un síndrome infeccioso similar a la mononucleosis. Hacia esa fecha se advierten grandes cantidades de VIH-1 en sangre, que se detectan por medio de cultivo o PCR de transcriptasa inversa. Dos a ocho semanas después de la infección, se comienzan a identificar los anticuerpos contra proteínas de VIH-1. Hay una respuesta a base de IgM a los productos del gen gag que cambia poco a poco, a una respuesta a base de IgG. En general, al inicio se advierten reacciones de tipo IgG a p24 y gp120, y continúan estas respuestas a gp41 y otras proteínas. La viremia y las concentraciones de p24 en sangre disminuyen con la reacción a base de anticuerpos y terminan por no ser detectadas en el periodo de latencia de la infección, en tanto que los títulos de anticuerpo contra p24 permanecen en niveles altos. Al final de la enfermedad, los títulos de anticuerpo contra p24 disminuyen, en tanto que aumentan las cantidades de antígeno de igual nombre (p24). En el lapso que sucede a la infección, en que hay una viremia con grandes cantidades de VIH-1, disminuye el recuento de linfocitos T CD4. En los comienzos del periodo de latencia este valor vuelve a niveles normales, sólo para disminuir poco a poco con el paso del tiempo y hacerlo con mayor rapidez en las etapas ulteriores del sida.

Los métodos usados para diagnosticar la infección por VIH-1 incluyen productos que se distribuyen en el comercio y que están altamente refinados y estandarizados. Es posible contar con varios tipos de equipos para la misma clase de pruebas. Éstos se describen de forma genérica a continuación.

Técnicas para identificar anticuerpos contra VIH

A. Enzimoinmunoanálisis de adsorción

El ELISA (o EIA) es un método primario de detección para diagnosticar la infección por VIH-1. En general, los antígenos de VIH-1 se inmovilizan en una superficie sólida, por lo regular cuencos o cuentas de plástico; se agregan el suero del paciente y los reactivos apropiados. De esta forma, se detectan los anticuerpos contra VIH-1 unidos a los antígenos de la misma partícula viral inmovilizados, con una IgG antihumana marcada con enzimas y una reacción colorimétrica. El grado del color es proporcionalmente mayor cuanto más grandes sean las concentraciones de anticuerpo contra VIH-1. Se considera como prueba positiva la aparición de un color que rebasa algún punto de “corte” o límite. El ELISA para VIH-1 tiene una sensibilidad mayor de 99% y una misma tasa de especificidad. Los recién nacidos de madres infectadas por VIH-1 por lo común muestran positividad con las técnicas de ELISA para VIH-1 por la transferencia transplacentaria de anticuerpos. Los resultados en tal caso poco a poco se tornan negativos si el producto no está infectado de verdad por VIH-1. Se cuenta con varias generaciones de los estudios en cuestión, muchas automatizadas, y prácticamente todos los métodos actuales permiten la detección simultánea tanto de VIH-1 como de VIH-2.

La necesidad de identificar con rapidez a los indivíduos que pueden ser VIH-positivos y realizar tal estrategia cuando aún están dentro del entorno clínico, ha obligado a que se generen algunas mejorías en los métodos de EIA. Hay una técnica para estudiar las secreciones de la boca. Además, en Estados Unidos se han aprobado algunos inmunoanálisis rápidos para utilizar en sangre completa, plasma y suero. Todos los estudios rápidos deben tratarse de la misma forma que las técnicas corrientes. Los resultados positivos han de confirmarse mediante técnicas de inmunotransferencia y la persona con alguna prueba negativa, pero con un cuadro clínico fuertemente sospechoso, debe ser objeto de un nuevo análisis si está indicado con bases clínicas o pueden emprenderse NAAT si se cuenta con tal estudio.

B. Inmunotransferencia

Esta técnica (Western blot) se utiliza para medir anticuerpos específicos contra VIH-1 y confirmar el resultado de ELISA positivo. En la inmunotransferencia, se separan por electroforesis proteínas de VIH-1 en una tira de microcelulosa y esta última se incuba con el suero del paciente. Así se detectan los anticuerpos específicos contra VIH-1 y para ello se usa IgG antihumana con enzimas. En el caso de una reacción colorimétrica positiva, se forman bandas en el papel de nitrocelulosa, las cuales corresponden a la posición de antígenos específicos de VIH-1. El criterio para calificar de positiva una prueba es que se identifiquen cualesquiera de las dos bandas que corresponden a p24, gp41 y gp120/160. El hecho de que no aparezcan las bandas constituye un resultado negativo, en tanto que la presencia de bandas que no cumplen con los criterios de una prueba positiva, se califica de resultado indeterminado. Pocas veces se observan resultados positivos o negativos falsos. Los sujetos infectados por VIH-2 pueden generar un perfil poco común en la inmunotransferencia de VIH-1; por esa razón, si se sospecha la presencia de VIH-2, habrá que efectuar otra prueba independiente de inmunotransferencia para tal particula viral. Los individuos con ELISA positivo, pero resultados indeterminados de pruebas de inmunotransferencia necesitan que se repita la prueba en un término de dos semanas a seis meses y ser objeto de valoración clínica. El recién nacido de una madre infectada por VIH-1 puede generar una prueba de inmunotransferencia positiva, pero ésta poco a poco se torna negativa si el niño no está infectado verdaderamente por VIH-1.

Técnicas para la detección directa de la infección por VIH

A. Detección del antígeno p24

La técnica ELISA se utiliza para identificar el antígeno p24. Los anticuerpos contra dicho antígeno se inmovilizan en una superficie sólida y se incuban con el suero del enfermo. La cantidad del antígeno p24 se detecta por medio de IgG contra VIH-1, de tipo enzimático y una reacción colorimétrica. El antígeno p24 se encuentra durante la fase virémica aguda de la infección y en las etapas finales del sida. Un porcentaje pequeñísimo de sujetos asintomáticos infectados por VIH-1 muestra presencia del antígeno p24 (positividad), pero la detección de éste no se utiliza comúnmente en Estados Unidos, aunque a menudo se recurre a ella en países con pocos recursos para diagnosticar VIH, en particular en el recién nacido.

B. Detección de RNA del VIH

Se cuenta con diversos medios comerciales para detectar y cuantificar el RNA de VIH-1; éstos incluyen PCR, NASBA, TMA y bDNA para hallar y cuantificar VIH-1 (véase la sección de Diagnóstico molecular al principio de este capítulo). Las técnicas cualitativas se utilizan para identificar la infección por VIH-1 inmediatamente antes de la etapa de infección, cuando las pruebas de anticuerpos se vuelven positivas, para resolver las técnicas de inmunotransferencia con resultados indeterminados y para diagnosticar infección del recién nacido. Los métodos cuantitativos se utilizan para vigilar de forma “seriada” la eficacia de tratamientos contra VIH-1.

C. Detección de DNA proviral de VIH-1

En esta técnica, se extrae el DNA de mononucleares obtenidos de sangre periférica con anticoagulantes. En un método de PCR, se utilizan los cebadores oligonucleótidos que son específicos para segmentos del DNA proviral de VIH-1 integrado (véase la sección de Diagnóstico molecular al principio este capítulo). Este tipo de técnica se utiliza en el caso de un recién nacido con anticuerpos positivos, hijo de una madre infectada por VIH-1, para saber si él también tiene la infección. Esta prueba constituye un método preferido en todo lactante menor de 18 meses de vida.

D. Cultivo de VIH-1

El cultivo hístico fue el primer método creado para el diagnóstico de la infección por VIH-1; se utilizó para definir que este último era la causa del SIDA. También se cultivan de forma simultánea mononucleares de sangre periférica de un paciente potencialmente infectado con mononucleares de la misma sangre de una persona no infectada, estimulados con fitohemaglutinina e interleucina-2. Los cultivos se observan en busca de la formación de células gigantes multinucleadas, actividad de transcriptasa inversa de VIH-1 o para la producción del antígeno p24 de la misma partícula viral. También pueden realizarse cultivos cuantitativos de células y de plasma. El cultivo de VIH-1 tiene una sensibilidad de 95 a 99%. El cultivo de dicha partícula es lento y costoso y por ello no es rentable para uso diario. Se utilizan modificaciones de técnicas de cultivo en estudios fenotípicos para identificar la resistencia a fármacos antirretrovirales. A pesar de los progresos recientes, los métodos siguen siendo difíciles y sólo se llevan a cabo en muy pocos laboratorios especializados.

Vigilancia seriada del recuento de linfocitos T CD4

El recuento absoluto de dichos linfocitos se utiliza ampliamente para vigilar el estado de sujetos con infecciones por VIH-1. El recuento casi siempre se realiza en células de sangre completa teñida con anticuerpos contra CD4 y marcada con un colorante fluorescente. Como paso siguiente, se logra la lisis de los eritrocitos y se cuentan los linfocitos CD4 por medio de citometría de flujo.

Métodos pronósticos y vigilancia del tratamiento

Una carga viral alta en el cuerpo del paciente es reflejo de los altos niveles de RNA de VIH-1 y conlleva un mal pronóstico. De forma similar, el pequeño número de linfocitos T CD4 denota peligro de que surja una infección por microorganismos oportunistas y también anticipa un mal pronóstico. El número de virus y de linfocitos T CD4 se utiliza para vigilar de manera seriada la eficacia de los antirretrovirales. Hoy día, se recomienda medir la carga viral de inicio antes de comenzar el tratamiendo, cuando se modifica este último y a intervalos sistemáticos para valorar la eficacia continua del régimen de fármacos.

Las técnicas de genotipificación utilizan PCR de transcriptasa inversa para amplificar el RNA de VIH-1 que codifica enzimas virales, las cuales serían las que afectarían los antirretrovirales. El análisis de las secuencias amplificadas permite conocer las mutaciones que codifican la resistencia a los fármacos; los métodos de valoración de resistencia son recomendables cuando el primero o los múltiples regímenes sean ineficaces o en caso de embarazo.