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Las estrategias de transferencia génica para enfermedades genéticas generalmente involucran tratamientos de adición génica, un enfoque caracterizado por la transferencia del gen faltante a la célula objetivo fisiológicamente relevante. Sin embargo, son posibles otras estrategias, incluyendo insertar un gen que tenga un efecto biológico similar a través de una vía alternativa (p. ej., factor VIIa para hemofilia A), administrar un oligonucleótido no codificante para eliminar un exón mutante si la secuencia no es crítica para la función de la proteína (como se ha hecho con el gen de la distrofina en la distrofia muscular de Duchenne) o regular a la baja una respuesta nociva a través de un siRNA (RNA de interferencia pequeño). Se utilizan dos estrategias diferentes para lograr una expresión génica duradera: una es transducir células madre con un vector que se integre, de tal manera que todas las células hijas portarán el gen donado; la otra es transducir células de vida larga, como las de músculo estriado o células nerviosas. En el caso de células de vida larga, no es necesaria la integración en el genoma de la célula en la que se ejerce el efecto. En lugar de eso, como las células no se dividen, el DNA donado, si se estabiliza en una forma episomal, puede dar origen a la expresión para la vida de la célula; esto evita los problemas relacionados con la mutagénesis de integración e inserción.
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TRASTORNOS DE INMUNODEFICIENCIA: PRUEBA DE PRINCIPIO
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Los intentos tempranos para efectuar la sustitución genética en células madre hematopoyéticas (HSC, hematopoietic stem cells) fueron frustrados por la relativamente baja eficiencia de transducción de los vectores retrovirales que requieren células en división para poder integrarse. Como las HSC se encuentran inactivas en condiciones normales, son un blanco formidable para transducción. Sin embargo, la identificación de citocinas que inducen la división celular sin promover la diferenciación de células madre, junto con mejoras técnicas en el aislamiento y la transducción de HSC, llevó a mejoras modestas pero reales en la eficiencia de transducción.
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El primer efecto terapéutico convincente de la transferencia génica se produjo en la inmunodeficiencia grave combinada (SCID, severe combined immunodeficiency disease) ligada al cromosoma X, producida por las mutaciones en el gen (IL2RG), que codifica la subunidad γc del receptor de citocinas que se requiere para el desarrollo normal de los linfocitos T y linfocitos citolíticos naturales (NK) (cap. 374). Los niños afectados se presentan en los primeros meses de vida con infecciones graves, retraso en el crecimiento o ambas. En este trastorno, se reconoció que las células transducidas, aun en números pequeños, tenían ventajas proliferativas en comparación con las células no transducidas, que carecen de los receptores para citocinas requeridos para el desarrollo y maduración de linfocitos. En la mayoría de los niños tratados ocurrió reconstitución completa del sistema inmunitario, incluyendo respuestas documentadas a las vacunas que suelen administrarse de la niñez, resolución de infecciones e incremento notable en el crecimiento. Sin embargo, entre los 20 niños tratados en dos estudios clínicos separados, cinco desarrollaron un síndrome similar a la leucemia linfocítica aguda de linfocitos T, con esplenomegalia, leucocitosis y la aparición de un clon único de linfocitos T. Los estudios moleculares revelan que, en la mayoría de estos niños, el vector retroviral se integró en un gen, el LMO-2, que codifica un componente de un factor de transcripción involucrado en el desarrollo hematopoyético. La repetición larga terminal incrementa la expresión de LMO-2 y el resultado es la leucemia de linfocitos T.
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Los estudios sobre inmunodeficiencia grave combinada ligada al cromosoma X supusieron un hito en la evolución de la genoterapia. Demostraron de manera concluyente que esta modalidad terapéutica podría curar una enfermedad; de los 20 niños finalmente tratados en estos estudios clínicos, 18 alcanzaron la corrección de su trastorno de inmunodeficiencia. Por desgracia, cinco desarrollaron un trastorno tipo leucemia y un paciente falleció por esta complicación, pero el resto están vivos y sin complicaciones después de hasta 14 años del tratamiento inicial. Tales estudios también demostraron que la mutagénesis insercional que produce cáncer era más que una posibilidad hipotética (cuadro 91e-2). Como resultado de la experiencia de dichos estudios, todos los protocolos que usan vectores de integración en células hematopoyéticas deben incluir un plan para vigilar los sitios de inserción y la proliferación clonal. Las estrategias para superar esta complicación han incluido emplear cassette génico “suicida” en el vector, de tal manera que los clones fallidos puedan ser eliminados rápidamente, o usar elementos “aisladores” en el cassette, que puedan limitar la activación de los genes que rodean al sitio de inserción. Los vectores lentivirales, que pueden transducir eficientemente a células que no están en división y en la que ejercerán sus efectos, pueden demostrar ser más seguros que los vectores retrovirales, con base en los patrones de integración; por tanto, más a menudo se están utilizando gradualmente éstos como una alternativa a los vectores retrovirales.
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Se ha alcanzado un éxito más claro con un estudio de genoterapia para otra forma de inmunodeficiencia grave combinada, la deficiencia de adenosina desaminasa (ADA, adenosine desaminase) (cap. 374). La adenosina desaminasa-inmunodeficiencia grave combinada es clínicamente similar a la inmunodeficiencia grave combinada ligada al cromosoma X; sin embargo, puede tratarse mediante sustitución enzimática con una forma conjugada con polietilénglicol de la enzima (PEG-ADA), que lleva a la reconstitución inmunitaria pero no siempre a recuentos normales de linfocitos T. El tratamiento con remplazo enzimático es costoso (costes anuales: 200 000 a 300 000 USD). Los estudios iniciales de tratamiento para adenosina desaminasa-inmunodeficiencia grave combinada no fueron exitosos, hasta que se implementaron las modificaciones de este protocolo como la inclusión del uso de HSC en lugar de linfocitos T, como sitio para la transducción; la interrupción de PEG-ADA al momento de la administración del vector, de tal manera que las células transducidas tuvieran una ventaja proliferativa sobre las no transducidas y el uso de un régimen acondicionador para facilitar la implantación de las células transducidas ha resultado exitoso sin las complicaciones observadas en los estudios de inmunodeficiencia grave combinada relacionada al cromosoma X. No ha habido complicaciones en los 10 niños tratados con el protocolo de Milán, con una mediana de seguimiento de más de 8 años. La adenosina desaminasa-inmunodeficiencia grave combinada, es un ejemplo en donde la genoterapia ha cambiado las opciones terapéuticas para los pacientes. Para aquellos con un hermano con HLA (human leukocyte antigen) idéntico, el trasplante de médula ósea aún es la mejor opción terapéutica, pero se aplica a sólo una minoría de los afectados. Para aquellos sin una compatibilidad HLA idéntica, la genoterapia tiene eficacia comparable a la PEG-ADA, no requiere la repetición de inyecciones y no corre el riesgo de anticuerpos neutralizantes contra la enzima bovina.
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ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS: EXTENSIÓN DE PRINCIPIO
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Los estudios de enfermedad de inmunodeficiencia combinada grave apoyaron la hipótesis de que podía usarse la transferencia génica a células madre hematopoyéticas para tratar cualquier enfermedad para la que el alotrasplante de médula ósea fuera terapéutico. Además, el uso de células autólogas con modificación genética implicaba varias ventajas, como la ausencia del riesgo de enfermedad de injerto contra hospedador, disponibilidad garantizada de un donante (a menos que la enfermedad misma dañara la población de células madre del paciente) y baja probabilidad de falla del injerto. Cartier y Aubourg capitalizaron estas ideas para realizar el primer estudio de transducción de HSC con un vector lentiviral para un trastorno neurodegenerativo, la adrenoleucodistrofia (ALD) ligada a X. Esta última es una enfermedad desmielinizante mortal del sistema nervioso central causada por mutaciones en el gen que codifica un transportador de cassette de unión con trifosfato de adenosina. La deficiencia de esta proteína conduce a la acumulación de ácidos grasos de cadena muy larga en los oligodendrocitos y la microglia, lo que altera el mantenimiento de la mielina que realizan estas células. Los niños afectados desarrollan evidencia clínica y radiográfica de la enfermedad entre los seis y ocho años de edad, y casi siempre mueren antes de la adolescencia. Después de la transducción lentiviral de células madre hematopoyéticas autólogas a niños pequeños con la enfermedad, se produjo una estabilización drástica del trastorno, lo que demostró que la transducción de células madre podría funcionar en trastornos neurodegenerativos, como en los inmunitarios. Los investigadores en Milán llevaron este hallazgo un paso más lejos al desarrollar un tratamiento para otro trastorno neurodegenerativo que antes respondía muy poco al trasplante de médula ósea. La leucodistrofia metacromática es un trastorno por almacenamiento lisosómico causado por mutaciones en el gen que codifica la arilsulfatasa A (ARSA). La forma infantil tardía de la enfermedad se caracteriza por daño motor y cognitivo progresivo; la muerte sobreviene pocos años después a causa de la acumulación del sustrato sulfatida de la ARSA en los oligodendrocitos, microglia y algunas neuronas. Al reconocer que la producción endógena de ARSA era demasiado baja para permitir la corrección cruzada con el trasplante alógeno, Naldini et al., diseñaron un vector lentiviral que indujera niveles mayores a los fisiológicos en la expresión de ARSA en las células transducidas. La transducción de células madre hematopoyéticas autólogas de niños con la enfermedad en un momento en que aún se encuentran asintomáticos permitió la conservación y logro continuado de los hitos motores y cognitivos por periodos de hasta 32 meses después que los hermanos afectados habían comenzado a perder tales avances. Estos resultados ilustran que la capacidad para modificar los niveles de expresión permite diseñar terapias génicas exitosas en casos en los que el trasplante alógeno de médula ósea no es eficaz. Es probable que se use una estrategia similar en otras enfermedades neurodegenerativas.
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La transducción de células madre hematopoyéticas para tratar hemoglobinopatías es una extensión obvia de los estudios ya realizados, pero representa un obstáculo mayor en términos de la magnitud de la transducción requerida para lograr un efecto terapéutico. Ya hay estudios en proceso para talasemia y para varios trastornos hemáticos más, como el síndrome de Wiskott-Aldrich y la enfermedad granulomatosa crónica.