Capítulo 146: Genómica y la enfermedad infecciosa

Tal como la microscopia abrió el mundo de la microbiología al proporcionar una herramienta con la cual visualizar los microorganismos, los avances tecnológicos en la genómica proporcionan a los microbiólogos nuevos métodos poderosos con los cuales caracterizar el mapa genético de todos los microbios con una resolución sin precedentes, lo que aclara sus interacciones complejas y dinámicas entre sí, con el ambiente y con la salud humana. El campo de la genómica en la enfermedad infecciosa abarca una vasta frontera de investigación activa que tiene la capacidad para transformar la práctica clínica en relación con las enfermedades infecciosas. Aunque desde hace mucho la genética participa en la elucidación del proceso de la infección y el tratamiento de las enfermedades infecciosas clínicas, la posibilidad de ampliar el pensamiento y las estrategias más allá del estudio de genes individuales para examinar la secuencia, estructura y función de genomas completos abre nuevas posibilidades para la investigación y oportunidades para cambiar la práctica clínica. A partir del desarrollo de diagnósticos con sensibilidad, especificidad y velocidad sin precedentes que permiten diseñar nuevas intervenciones de salud pública, las innovaciones genómicas técnicas y estadísticas están modificando el conocimiento que se tenía sobre la influencia del mundo microbiano en la salud humana, y se cuenta con nuevas herramientas para combatir la infección. Este capítulo explora la aplicación de los métodos genómicos a los patógenos microbianos y las infecciones que causan (cuadro 146-1). Se revisan las innovaciones que impulsan el desarrollo de estrategias diagnósticas y el descubrimiento de nuevos patógenos; aporta información sobre nuevos tratamientos y paradigmas, y proporciona métodos para la epidemiología de las enfermedades infecciosas y el estudio de la evolución de los patógenos que permiten desarrollar medidas para el control de infecciones, respuestas de salud pública a los brotes y generar vacunas. Se presentan ejemplos de la práctica actual y de la bibliografía científica reciente como señales que indican las formas en que la genómica de los patógenos puede influir en las enfermedades infecciosas en el corto y el largo plazos. El cuadro 146-2 presenta definiciones de diversos términos importantes usados en la genómica.

Los objetivos básicos del laboratorio de microbiología clínica son establecer la presencia de un patógeno en una muestra clínica, identificar al patógeno y cuando es posible, aportar más información que ayude a guiar la conducta clínica, incluso el pronóstico, como los perfiles de susceptibilidad antimicrobiana o la presencia de factores de virulencia. Hasta ahora, los laboratorios de microbiología clínica han alcanzado estos objetivos con métodos fenotípicos mediante pruebas basadas en el crecimiento y análisis bioquímicos. Por ejemplo, las bacterias se agrupan de manera algorítmica en especies con base en su apariencia microscópica característica, requerimientos nutricionales para crecer y su capacidad para catalizar ciertas reacciones. En la mayoría de los casos, la susceptibilidad antibiótica se identifica mediante la valoración del crecimiento en presencia de antibiótico.

Con la revolución de la secuenciación que allana el camino al acceso fácil de los genomas completos de los patógenos (fig. 146-1), ahora es posible aclarar de manera más sistemática la base genómica de estos fenotipos observables. En comparación con los métodos diagnósticos usuales basados en el crecimiento que predominan en el laboratorio de microbiología clínica, el diagnóstico basado en el ácido nucleico promete mayor velocidad, sensibilidad, especificidad y amplitud de información. Ya comenzaron las adaptaciones en los laboratorios clínicos y de investigación para establecer tecnologías genómicas que cumplan esta promesa.

LIMITACIONES HISTÓRICAS Y PROGRESO MEDIANTE TÉCNICAS GENÉTICAS

La revolución diagnóstica molecular en el laboratorio de microbiología clínica ya comenzó, resultado de la necesidad en un esfuerzo por identificar a los microbios resistentes a los métodos de cultivo habituales. Hasta ahora, el diagnóstico de muchos patógenos llamados imposibles de cultivar depende sobre todo de análisis serológicos y detección de antígenos. Sin embargo, estos métodos sólo proporcionan información clínica limitada porque su sensibilidad y especificidad no son óptimas, además de los largos retrasos que reducen su utilidad para el tratamiento del paciente en tiempo real. Las nuevas pruebas para detectar patógenos basadas en el contenido del ácido nucleico ya ofrecen mejorías en los pocos casos en los que se han aplicado hasta ahora.

A diferencia de la detección directa del patógeno, el diagnóstico serológico (medición de la respuesta del hospedador a la exposición al patógeno) casi siempre puede hacerse en retrospectiva, requiere suero de la fase aguda y de la convaleciente. La diferenciación entre infecciones crónicas y la infección latente, o la identificación de una nueva exposición sólo con análisis serológicos puede ser difícil o imposible, según el síndrome. Además, la sensibilidad del diagnóstico serológico varía según el microorganismo y el estado inmunitario del paciente. Por ejemplo, la tuberculosis es muy difícil de identificar por métodos serológicos; la prueba cutánea con tuberculina que usa un derivado proteínico purificado (PPD, purified protein derivative) es muy insensible en la enfermedad activa y puede tener reacción cruzada con vacunas y otras micobacterias. Incluso las nuevas pruebas de interferón y liberación (IGRA, interferon gamma release assay), que miden la liberación de citocina de los linfocitos T in vitro como respuesta a antígenos específicos de Mycobacterium tuberculosis, tiene sensibilidad limitada en hospedadores inmunodeprimidos. Ni la prueba PPD ni la IGRA pueden distinguir la infección latente de la activa. El diagnóstico serológico de la enfermedad de Lyme tiene limitaciones semejantes: en pacientes de regiones endémicas, la presencia del anticuerpo IgG contra Borrelia burgdorferi puede reflejar una exposición previa, en lugar de enfermedad activa, mientras que los anticuerpos IgM tienen sensibilidad y especificidad imperfectas (50 y 80%, respectivamente, en la enfermedad temprana). La naturaleza compleja de estas pruebas, sobre todo en vista de los síntomas inespecíficos que pueden acompañar a la enfermedad de Lyme, ha tenido implicaciones sustanciales en las percepciones públicas de esta infección y el uso inapropiado de antibióticos en zonas endémicas. De igual manera, es muy difícil estadificar la sífilis, una infección crónica causada por Treponema pallidum, sólo con recursos serológicos; además de la sospecha clínica se requiere el uso de múltiples pruebas no treponémicas (p. ej., reagina proteínica rápida) y treponémicas (p. ej., anticuerpo treponémico fluorescente). Como complemento al análisis serológico, la detección de antígeno permite mejorar la sensibilidad y especificidad en algunos casos, pero sólo se ha validado en un pequeño grupo de infecciones. Por lo general se detectan elementos estructurales de los patógenos, como componentes de la envoltura viral (p. ej., antígeno superficial de hepatitis B, antígeno p24 de VIH), marcadores celulares superficiales de ciertas bacterias (p. ej., Streptococcus pneumoniae, Legionella pneumophila serotipo 1) u hongos (p. ej., Cryptococcus, Histoplasma) y componentes menos específicos de la pared celular micótica, como el galactomanano y el glucano β (p. ej., Aspergillus y otros hongos dimórficos).

Debido a lo impráctico del cultivo y a la falta de sensibilidad o de información clínica suficiente que proporcionan los métodos serológicos y antigénicos, se generó un impulso hacia el diagnóstico basado en ácido nucleico de virus y bacterias difíciles de cultivar, lo que ya se convirtió en parte del estándar de atención para algunos organismos en hospitales estadounidenses. Estas pruebas, que incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, polymerase chain reaction) y otras pruebas con amplificación de ácidos nucleicos (NAAT, nucleic acid amplification tests) ya se usan a menudo para muchas infecciones virales crónicas (p. ej., VIH) y agudas (p. ej., gripe [influenza]). Esta técnica proporciona información esencial sobre el diagnóstico inicial y la respuesta terapéutica, y en ocasiones permite predecir la resistencia farmacológica con bases genotípicas. En realidad, el avance de la detección del antígeno a la PCR transformó la comprensión de la evolución natural de la infección por VIH, lo que tuvo profundas implicaciones terapéuticas (fig. 146-2). En los primeros años de la pandemia del sida, se detectaba la antigenemia p24 en la infección aguda por VIH, pero luego desaparecía por años antes de surgir de nuevo con la progresión al sida (fig. 146-2B). Sin un marcador que demostrara la viremia, la función del tratamiento durante la infección por VIH antes del desarrollo del sida clínico era incierta, y era difícil vigilar la eficacia del tratamiento. Con el surgimiento de la PCR como prueba cada vez más sensible (ahora capaz de detectar desde 20 copias del virus por mililitro de sangre), la viremia se reconoció como un rasgo casi universal de la infección por VIH. Este avance transformó la guía para iniciar y ajustar el tratamiento, además de permitir el desarrollo de regímenes menos tóxicos, y ayudó a dar forma a los lineamientos que ahora favorecen el inicio más temprano del tratamiento antirretroviral para la infección por VIH.

Al igual que con los virus, las pruebas basadas en ácido nucleico se han convertido en las pruebas diagnósticas de elección para bacterias difíciles de cultivar, como los patógenos intracelulares frecuentes de transmisión sexual Neisseria gonorrhoeae y Chlamydia trachomatis, además de la Ehrlichia chaffeensis y Anaplasma phagocytophilum, transmitidas por garrapatas. Desde hace poco tiempo, la detección basada en la amplificación del ácido nucleico permite un diagnóstico sensible del patógeno intrahospitalario relevante Clostridium difficile; las NAAT aportan información relevante sobre la presencia de citotoxinas A y B, así como de marcadores moleculares de hipervirulencia, como los que caracterizan al recién detectado pulsotipo 1 norteamericano (NAP1), más frecuente en casos de enfermedad grave. La importancia de la genómica en la selección de loci para pruebas diagnósticas y para vigilar la sensibilidad de la prueba resultó evidente en fecha reciente por el surgimiento de una nueva variante de C. trachomatis en Suecia, la cual tiene una deleción que incluye el gen en el que se basan varias NAAT comerciales. La falta de detección de esta bacteria debido a esta deleción (lo que impide el inicio del tratamiento) permitió que esta cepa se volviera muy prevalente en algunas áreas de Suecia. Aunque las pruebas basadas en ácido nucleico se mantienen como la herramienta diagnóstica de elección para las bacterias difíciles de cultivar, este ejemplo sirve como recordatorio de la necesidad del desarrollo cuidadoso y la vigilancia continua del diagnóstico molecular.

En contraste, respecto a los patógenos bacterianos típicos para los que hay métodos de cultivo bien establecidos, las pruebas basadas en el crecimiento seguidas de análisis bioquímicos aún dominan en el laboratorio clínico. Con la información de décadas de microbiología clínica, estas pruebas basadas en el crecimiento bacteriano le han funcionado bien a los médicos, aunque sus limitaciones dejan lugar a mejoras, en particular el tiempo de espera para el crecimiento. El diagnóstico molecular, alimentado con la enorme cantidad de secuencias genómicas microbianas generadas en los últimos años, ofrece un avance. Primero, los estudios de secuenciación permiten identificar genes clave (o ácidos nucleicos no codificantes) que pueden convertirse en blancos de procedimientos de PCR o plataformas de hibridación. Segundo, es posible que la secuenciación misma al final resulte tan rápida y barata que sea un procedimiento de rutina en las muestras clínicas, con la detección segura de patógenos consecuente.

IDENTIFICACIÓN DE ORGANISMOS

Para adaptar la detección de ácido nucleico a las pruebas diagnósticas y así identificar patógenos a gran escala, es preciso identificar secuencias que se conserven lo suficiente en una especie para identificar la diversidad de cepas que pudieran encontrarse en diversas situaciones clínicas, pero lo bastante divergentes para distinguir una especie de otra. Hasta hace poco, este problema se había resuelto para las bacterias al enfocarse en el elemento de un genoma bacteriano más conservado en una especie: la subunidad de RNA ribosómico (rRNA) 16S. En la actualidad, la amplificación mediante PCR de 16S en las muestras de tejido puede hacerse en laboratorios especializados, aunque su sensibilidad y utilidad clínica todavía son limitadas. Las razones de esto incluye, por ejemplo, la presencia de moléculas inhibidoras que a menudo existen en las muestras clínicas de tejido e impiden la amplificación confiable y sensible mediante PCR. Conforme se salven estas barreras con los avances tecnológicos y conforme se aclaren las causas de infecciones con cultivos negativos (quizá en parte mediante esfuerzos de secuenciación), es probable que estas pruebas se vuelvan más accesibles y útiles.

Con la abundancia de datos de secuenciación que ya existen, pueden considerarse otras regiones parte del rRNA 16S para la identificación de especies bacterianas. Estos otros loci genómicos pueden aportar información adicional sobre un aislado clínico que sea relevante para el tratamiento del paciente. Por ejemplo, detección de la presencia (o quizá incluso de la expresión) de genes tóxicos, como los de las toxinas A y B de C. difficile o la toxina shiga, pueden aportar a los médicos más información que ayuda a distinguir entre las bacterias comensales o colonizadoras de las patógenas, lo que es útil para el pronóstico y el diagnóstico.

Aunque las pruebas de amplificación, como la PCR, ejemplifican una técnica para detección de ácido nucleico, existen otras como la detección por hibridación. Aunque por ahora no se usan en la clínica, las técnicas para detección e identificación de patógenos mediante hibridación con micromatrices están en desarrollo para otros fines. Hay que señalar que estas técnicas de detección distintas requieren varios grados de conservación. Los métodos de amplificación muy sensibles necesitan un alto grado de identidad de secuencia entre los pares del cebador para PCR y sus secuencias blanco cortas específicas; la discrepancia incluso en un solo par de bases (sobre todo cerca del extremo 3′ del cebador) puede interferir con la detección. En cambio, las pruebas basadas en la hibridación son más tolerantes a la discrepancia, por lo que pueden usarse para detectar regiones importantes que se conservan con menos precisión en una especie, y esto permite la detección de aislados clínicos de una especie determinada con mayor diversidad entre los aislados. Estas pruebas aprovechan las interacciones de unión predecibles de los ácidos nucleicos. La aplicabilidad de los métodos basados en la hibridación en el DNA o RNA abre la posibilidad de establecer el perfil de expresión, lo que descubriría la información fenotípica del contenido del ácido nucleico.

Los métodos de PCR y los de hibridación se dirigen a organismos conocidos específicos. En el otro extremo, conforme disminuyen los costos y el tiempo de la secuenciación, cada vez es más factible la secuenciación metagenómica directa de las muestras del paciente. Esta estrategia de secuenciación masiva está libre de sesgos, o sea que puede detectar cualquier secuencia microbiana, sin importar que sea divergente o inesperada. Sin embargo, esta nueva técnica conlleva su propio conjunto de dificultades, como la necesidad de reconocer las secuencias patógenas contra un fondo de secuencias esperadas del hospedador y los comensales, y la de distinguir a los patógenos reales de los colonizadores o los contaminantes del laboratorio. En un ejemplo sólido de esta nueva frontera de diagnóstico clínico basado en la secuenciación, los investigadores diagnosticaron neuroleptospirosis en un niño con un síndrome encefalítico sin explicación al encontrar secuencias correspondientes al género Leptospira en el líquido cefalorraquídeo del paciente. La secuenciación y el análisis rápidos (<48 h) aportaron información para la atención del paciente en tiempo real, lo que permitió iniciar el tratamiento antibiótico salvador dirigido a un diagnóstico que era imposible de hacer con pruebas de laboratorio estándar. El diagnóstico se confirmó de manera retrospectiva mediante análisis serológico en la convalecencia y PCR con cebadores diseñados con base en los datos de la secuenciación.

DESCUBRIMIENTO DE PATÓGENOS

Además de las aplicaciones diagnósticas clínicas, las nuevas tecnologías genómicas, incluida la secuenciación de genomas enteros, se aplican en la investigación clínica con la finalidad de identificar nuevos patógenos en diversas circunstancias. La enorme sensibilidad y naturaleza imparcial de la secuenciación también es ideal para examinar patógenos desconocidos o insospechados en muestras clínicas.

La inferencia causal en las enfermedades infecciosas ha evolucionado desde la época de Koch, cuyos postulados históricos establecieron un marco riguroso para atribuir una enfermedad a un microorganismo. Según una versión actualizada de los postulados de Koch, un organismo, cultivable o no, debe causar enfermedad mediante su introducción en un hospedador sano para considerarse un patógeno causal. Las tecnologías de secuenciación actuales son ideales para mejorar esta versión moderna de los postulados de Koch porque permiten identificar posibles patógenos causales con sensibilidad sin precedentes y de manera imparcial, sin las limitaciones de la posibilidad de cultivo. Aun así, conforme la secuenciación directa en muestras primarias del paciente amplía la capacidad para descubrir relaciones entre microbios y enfermedades, el pensamiento crítico y la experimentación seguirán siendo vitales para establecer la causalidad.

En particular, el descubrimiento de virus se ha facilitado mucho con la nueva tecnología de ácido nucleico. Fue en este campo donde se hicieron las primeras exploraciones con micromatrices de alta densidad que contenían secuencias ordenadas de un conjunto filogenético diverso de virus. Aunque hay un sesgo hacia los virus con cierta homología a los ya conocidos, se identificaron virus nuevos en muestras clínicas con base en su capacidad para formar híbridos con estas secuencias ya conocidas. Como fue bien sabido, esta metodología contribuyó a la identificación del coronavirus que causa el síndrome respiratorio agudo grave (SARS, severe acute respiratory syndrome). Una vez descubierto, en poco tiempo se obtuvo la secuencia del coronavirus del SARS: el genoma completo se ensambló en abril de 2003, menos de seis meses después de la identificación del primer caso. Este logro ilustró el poder y velocidad de las nuevas tecnologías diagnósticas.

Con el advenimiento de la secuenciación de nueva generación, ahora es posible descubrir patógenos de manera imparcial mediante un proceso llamado ensamble metagenómico (fig. 146-3). Es posible determinar las secuencias de fragmentos nucleotídicos aleatorios a partir de muestras clínicas sin conocimiento previo de la identidad del patógeno mediante un proceso llamado secuenciación generalizada. Luego, esta recolección de secuencias se alinea con ayuda de una computadora con las secuencias del hospedador (humanas), las cuales se retiran y las secuencias restantes se comparan con otros genomas conocidos para detectar la presencia de microorganismos conocidos. Los fragmentos de secuencias que quedan sin alinear sugieren la presencia de un organismo adicional que no se equipara con un genoma caracterizado ya conocido; estos resultados pueden ensamblarse en segmentos de ácido nucleico contiguos que se comparan con secuencias conocidas para construir el genoma de un posible organismo nuevo. Los genomas ensamblados (o partes de genomas) pueden compararse con los genomas conocidos para inferir la filogenia de los organismos nuevos e identificar las clases o rasgos relacionados. Por tanto, este proceso no sólo identifica patógenos inesperados, incluso puede identificar organismos no conocidos hasta entonces. Algunas aplicaciones iniciales de la secuenciación en las muestras clínicas se enfocan en el descubrimiento de nuevos virus, incluidos los patógenos emergentes como el virus del Nilo occidental, el coronavirus del SARS y el coronavirus del síndrome respiratorio del Medio Oriente (MERS-CoV, Middle East respiratory syndrome coronavirus) que causa enfermedades respiratorias graves en adultos sanos, así como los virus causantes de una miríada de padecimientos más, desde fiebres hemorrágicas tropicales hasta diarrea en recién nacidos. En fecha más reciente, el ensamble metagenómico se amplió con éxito al descubrimiento de patógenos bacterianos. Los investigadores identificaron una nueva especie bacteriana relacionada con “colitis en cordón”, una forma rara de colitis con cultivos negativos que responde a los antibióticos y se desarrolla en receptores de células madre de sangre de cordón umbilical, mediante la secuenciación de muestras de biopsia colónica de pacientes afectados y grupo testigo. Una sola especie dominante surgió del ensamble metagenómico de los pacientes que estaba ausente en las muestras del grupo testigo. La presencia de esta especie se confirmó mediante PCR e hibridación in situ con fluorescencia en las muestras de tejido primario. Con base en su similitud con otras especies conocidas, el organismo se denominó Bradyrhizobium enterica, una especie nueva de un género que había sido difícil de cultivar y por tanto, habría sido difícil de identificar por otros medios. La correlación con la causa todavía no está confirmada, por lo que se requieren esfuerzos adicionales para establecer este vínculo.

Parece que conforme la secuenciación metagenómica y las técnicas de ensamble se vuelvan más robustas, esta tecnología permitirá identificar microorganismos relacionados con enfermedades de causa desconocida. Los métodos convencionales ya han vinculado de manera inesperada muchos trastornos con agentes infecciosos específicos, como los cánceres cervicouterino y bucofaríngeo con el virus del papiloma humano, el sarcoma de Kaposi con el virus herpes humano 8 y ciertos linfomas con el virus Epstein-Barr. Las técnicas de secuenciación ofrecen sensibilidad y especificidad sin precedentes para la identificación de secuencias de ácido nucleico ajenas que podrían sugerir otros trastornos (desde tumores malignos hasta trastornos inflamatorios, fiebres inexplicables y otros síndromes clínicos) relacionados con organismos, ya sean virus, bacterias o parásitos. Conforme crecen los descubrimientos derivados de la secuenciación, es posible que se encuentren microbios relacionados con enfermedades que no se habían considerado infecciosas. Los estudios de la flora intestinal en animales de laboratorio, incluso en seres humanos, ya empiezan a sugerir una relación entre la composición microbiana y varios aspectos de la salud metabólica y cardiovascular. Los mejores métodos para detección de patógenos continuarán los descubrimientos de relaciones inesperadas entre microbios y enfermedades, pero la mera presencia de un microorganismo no establece la causalidad. Por fortuna, una vez que la secuenciación metagenómica relativamente laboriosa con gran ayuda computacional y la tarea de ensamble identifican un patógeno, la detección puede facilitarse con métodos enfocados, como la PCR o la hibridación, que son mucho más directos y escalables. Esta capacidad debe facilitar la investigación cuidadosa adicional que se necesitará para avanzar más allá de una correlación y establecer una inferencia causal.

RESISTENCIA ANTIBIÓTICA

Hoy en día, la resistencia antibiótica de las bacterias y hongos se determina mediante el aislamiento de una sola colonia de una muestra clínica cultivada para probar su crecimiento en presencia de un fármaco. La necesidad de varios pasos de crecimiento con estas pruebas convencionales tiene varias consecuencias. Primera, sólo pueden procesarse los patógenos cultivables. Segunda, este proceso requiere una infraestructura considerable para mantener el ambiente estéril necesario para los cultivos de diversos organismos. Por último y quizá lo más importante, incluso los organismos de crecimiento más rápido necesitan uno o dos días de procesamiento para su identificación, y dos a tres días más para la determinación de su susceptibilidad antibiótica. Los microorganismos de crecimiento más lento tardan aún más: deben pasar semanas para poder identificar el fenotipo de crecimiento de una cepa de M. tuberculosis resistente a fármacos. Dada la urgencia clínica de iniciar pronto el tratamiento efectivo de una enfermedad grave, este retraso inherente en la determinación de la susceptibilidad tiene implicaciones evidentes para el uso empírico de antibióticos; a menudo deben elegirse fármacos de amplio espectro en situaciones en las que más tarde se demuestra habrían sido eficaces fármacos con espectro más estrecho, incluso que no se requerían antibióticos (infecciones virales). Con esta estrategia, la elección empírica puede ser incorrecta, a menudo con consecuencias devastadoras. La identificación en tiempo real del organismo infectante y la información sobre su perfil de susceptibilidad guiarían el tratamiento inicial y apoyarían el uso prudente de antibióticos, lo que en el caso ideal mejoraría los resultados del paciente al tiempo que se ayuda en la lucha siempre creciente contra la resistencia antimicrobiana al reservar los fármacos de amplio espectro para casos en los que en realidad se necesitan.

El diagnóstico molecular y la secuenciación ofrecen una forma de acelerar la detección del perfil de susceptibilidad antibiótica de un patógeno. Si puede identificarse un genotipo que confiere resistencia, este genotipo puede ser el blanco de la detección molecular. En la enfermedad infecciosa, esta estrategia ha tenido los mejores resultados con el VIH (fig. 146-2A). (En una aplicación paralela del análisis genómico, la detección molecular de ciertos determinantes de resistencia en tumores malignos empieza a permitir la selección informada de la quimioterapia.) La secuenciación extensa de cepas de VIH y las correlaciones entre los genotipos virales y la resistencia fenotípica permitieron conocer la mayoría de las mutaciones en los genes clave de VIH, como la transcriptasa inversa, la proteasa y la integrasa, que confieren resistencia a los antirretrovirales dirigidos contra esas proteínas. Por ejemplo, la sustitución del gen para un solo aminoácido K103N de la transcriptasa inversa de VIH predice la resistencia contra efavirenz, un inhibidor de la transcriptasa inversa no nucleosídico de primera línea, por lo que su detección indica al clínico que debe elegir otro fármaco. Los efectos de estas mutaciones frecuentes en la susceptibilidad del VIH a varios fármacos, y en las condiciones del virus, se registran en las bases de datos disponibles al público. Por tanto, ahora se usan los genotipos de manera habitual para predecir la resistencia farmacológica de VIH, ya que las pruebas de resistencia fenotípica son mucho más complejas que la secuenciación dirigida. En realidad, las recomendaciones actuales en Estados Unidos son obtener la secuencia del virus de la sangre del paciente antes de iniciar el tratamiento antirretroviral, que luego se ajusta al fenotipo de resistencia anticipado. Conforme se introducen nuevos tratamientos enfocados, es probable que esta estrategia basada en la secuenciación dirigida para la resistencia farmacológica sea importante en otras infecciones virales (p. ej., hepatitis C).

Por varias razones, el desafío de predecir la susceptibilidad antibiótica a partir del genotipo todavía no se resuelve en las bacterias tanto como para el VIH. En general, las bacterias han desarrollado diversos mecanismos de resistencia a la mayoría de los antibióticos; por tanto, la tarea no puede reducirse a buscar una sola lesión, blanco o mecanismo genético. Por ejemplo, se conocen al menos cinco modos de resistencia a las fluoroquinolonas: reducción de su ingreso, aumento de su salida, mutación del sitio de acción, modificación del fármaco y protección de los sitios de acción mediante la expresión de otra proteína. Además, se carece de un compendio integral de los elementos genéticos que confieren resistencia y surgen nuevos mecanismos y genes con regularidad ante el despliegue antibiótico. Como el genoma de las bacterias es mucho más complejo que el de los virus, con miles de genes en sus cromosomas y la capacidad de adquirir muchos más mediante transferencia génica horizontal de plásmidos y elementos genéticos móviles dentro e incluso entre especies, la tarea de no sólo definir en un plano genético todos los mecanismos actuales sino también de predecir los futuros resulta abrumadora, quizá imposible.

A pesar de estas dificultades, en unos cuantos casos en los que se conoce bien la base genotípica de la resistencia, ya se introdujeron pruebas genotípicas de resistencia antibiótica en la práctica clínica. Un ejemplo importante es la detección de Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA, methicillin-resistant Staphylococcus aureus). S. aureus es uno de los patógenos bacterianos más frecuentes y graves en los seres humanos, sobre todo en instituciones de salud. La resistencia a la meticilina, el antibiótico antiestafilocócico más eficaz, se ha vuelto muy frecuente, incluso en las cepas adquiridas en la comunidad. La alternativa a la meticilina, la vancomicina, es eficaz contra MRSA, pero es inferior que la meticilina contra S. aureus susceptible a meticilina (MSSA). El análisis de los aislados clínicos de MRSA demostró que la base molecular de la resistencia a la meticilina en todos los casos se debe a la expresión de una proteína alternativa para unión con penicilina (PBP2A) codificada por el gen mecA, que se encuentra en un elemento genético transferible llamado mec. Este casete móvil se diseminó con rapidez en la población de S. aureus mediante transferencia génica horizontal y selección por el uso diseminado de antibióticos. Como la resistencia siempre se debe a la presencia del casete mec, MRSA es susceptible a la detección molecular. En años recientes, la U.S. FDA aprobó una prueba PCR para detectar la presencia del casete mec, lo que ahorra horas o días en comparación con los métodos estándar basados en cultivos.

Hay otros métodos diagnósticos moleculares que se usan para la evaluación de la resistencia antibiótica bacteriana. Los enterococos resistentes a vancomicina (VRE, vancomycin-resistant enterococci) tienen uno de varios genes van causantes de resistencia a este importante antibiótico que altera el mecanismo para formar enlaces cruzados en la pared celular que inhibe la vancomicina. La detección de uno de estos genes mediante PCR indica resistencia. La identificación de dos plásmidos codificantes de carbamapenemasa (NDM-1 y KPC), causantes de un porcentaje significativo de la resistencia al carbapenem (aunque no todos los casos) condujo al desarrollo de una prueba de PCR múltiple para detectar estos elementos de resistencia relevantes. Como los carbapenémicos son antibióticos de amplio espectro, a menudo se reservan para bacterias resistentes a múltiples fármacos (en particular bacilos entéricos gramnegativos) y muchas veces se usan como antibióticos de último recurso, la aparición de resistencia y el aumento subsiguiente en la prevalencia de ésta ha causado una preocupación considerable. Por tanto, aunque existen otros mecanismos de resistencia al carbapenem, se desarrolló una prueba de PCR rápida para los dos plásmidos que codifican estas dos carbapenemasas a fin de ayudar en el diagnóstico y los esfuerzos para controlar la infección. Existen trabajos en proceso para extender esta prueba PCR múltiple a otras carbapenemasas transmitidas por plásmidos y hacerla más completa.

La capacidad y aplicación de las pruebas de genética molecular no se limitan a instituciones con recursos abundantes. Con la carga creciente de tuberculosis resistente a fármacos en los países en vías de desarrollo, ya se creó una prueba diagnóstica molecular para detectar la tuberculosis resistente a rifampicina. La base genética de la resistencia a la rifampicina se definió mediante secuenciación dirigida: casi todas las cepas de M. tuberculosis resistentes a rifampicina tienen mutaciones en la molécula donde actúa la rifampicina, la RNA polimerasa. En fecha reciente se desarrolló un análisis por PCR que permite detectar tanto al organismo M. tuberculosis como un alelo resistente a rifampicina de la RNA polimerasa en muestras clínicas. Como la resistencia a la rifampicina a menudo acompaña a la resistencia a otros antibióticos, esta prueba sugiere la posible presencia de M. tuberculosis resistente a múltiples fármacos en unas horas, en lugar de semanas.

A pesar de las diferencias en la complejidad relativa del genoma, la detección genotípica de resistencia del VIH a los antirretrovirales ofrece un marco para ampliar las pruebas de genotipificación a la resistencia antibiótica no viral. Conforme la secuenciación del genoma completo de los patógenos se vuelve cada vez más factible y menos costosa (fig. 146-1), se inician esfuerzos significativos para completar la secuenciación de cientos a miles de aislados sensibles y resistentes a antibióticos de un patógeno determinado para alcanzar una definición más integral de los elementos genéticos que confieren resistencia. En paralelo con el avance en las tecnologías de secuenciación, serán necesarios el progreso en las técnicas computacionales, bioinformática, estadística y almacenamiento de datos, así como experimentos confirmatorios de las hipótesis para avanzar hacia el objetivo ambiguo de un compendio completo de determinantes de la resistencia antibiótica. El compartimiento y el acervo cuidadoso de la nueva información de secuencias serán cruciales.

Sin importar con qué minuciosidad y cuidado se conserve esta base de datos de genotipos, la historia sugiere que el catálogo de la resistencia de los patógenos no virales, con surgimiento constante de nuevos mecanismos, será difícil en el mejor de los casos. Incluso la identificación y catalogación de las mutaciones de resistencia actuales es un prospecto abrumador: los genomas no virales son mucho más grandes que los virales y su abundancia y diversidad son tales que a menudo existen cientos a miles de diferencias genéticas entre los aislados clínicos, de los cuales quizá sólo uno cause resistencia. Por ejemplo, el aumento en la resistencia a la artemisinina, uno de los nuevos fármacos más eficaces contra el paludismo, dio lugar a enormes esfuerzos para identificar la base de esta resistencia. Aunque los estudios identificaron indicios alentadores, no se ha descubierto un mecanismo claro; en realidad, es probable que un solo cambio genético no explique del todo la resistencia. En particular con los mecanismos de resistencia múltiples para un antibiótico determinado, junto con la presión evolutiva constante en el desarrollo y adquisición de nuevos modos de resistencia, es probable que una estrategia genotípica para diagnosticar la resistencia antibiótica sea imperfecta.

Ya se ha observado la acumulación de modos nuevos o inesperados de resistencia por la presión evolutiva que ejerce el uso clínico diseminado de antibióticos. Incluso para el MRSA, quizá el caso mejor estudiado de resistencia antibiótica y un modelo de sencillez relativa con un solo determinante de resistencia monogénico conocido (mecA), la estrategia para detectar resistencia basada en el genotipo resultó defectuosa. Una limitación fue la devolución de la prueba comercial inicial para detección de resistencia genotípica que se difundió para la identificación del MRSA. Surgió un aislado clínico de S. aureus en Bélgica que expresaba una variante del casete mec no detectada con los cebadores de la prueba por PCR. Se agregaron nuevos cebadores para detectar esta nueva variante y la prueba se aprobó de nuevo para su uso. En fecha reciente se encontró un gen aún más divergente, pero con función análoga, llamado mecC que confiere resistencia a la meticilina, pero evade la detección por PCR en esta prueba. Esta serie de eventos ejemplifica la necesidad de vigilancia continua de cualquier prueba genotípica de resistencia. Una segunda limitación es que puede haber una contradicción entre la resistencia genotípica y fenotípica de resistencia. Hasta 5% de las cepas MSSA tiene una copia del gen mecA que no es funcional o no se expresa. Por tanto, la identificación errónea de estas cepas como MRSA en la detección genotípica derivaría en la administración del antibiótico inferior vancomicina, y no el uso de un lactámico β, que es el tratamiento preferido.

Estos ejemplos ilustran uno de los principales desafíos de ir más allá de las pruebas basadas en el crecimiento: el genotipo es sólo un sustituto del fenotipo de resistencia que aporta información para atender al paciente. Una alternativa en desarrollo intenta salvar las limitaciones de las pruebas de resistencia genotípica al regresar a una técnica fenotípica, aunque una informada por métodos genómicos: los perfiles de transcripción sirven como una firma fenotípica rápida de la respuesta a antibióticos. Como las células que mueren tienen una transcripción distinta a las células que van a sobrevivir, las bacterias susceptibles tienen perfiles de transcripción distintos después de la exposición al antibiótico, diferentes a los perfiles de las cepas resistentes, sin importar el mecanismo de resistencia. Estas diferencias pueden medirse y como la transcripción es una de las respuestas más rápidas a la tensión fisiológica (minutos a horas), puede usarse para determinar si las células son resistentes o susceptibles en mucho menos tiempo del que se ocuparía en esperar el crecimiento en presencia de los antibióticos (días). Como el DNA, el RNA puede detectarse con facilidad mediante reglas predecibles que controlan el emparejamiento de bases a través de métodos de amplificación o hibridación. Los cambios en un conjunto bien seleccionado de transcritos constituyen una firma de expresión que puede representar la respuesta celular total al antibiótico sin que se requiera la caracterización del transcriptoma completo. Los estudios preliminares para probar el concepto sugieren que esta estrategia puede identificar la susceptibilidad antibiótica con base en el fenotipo transcripcional de manera mucho más rápida que con pruebas basadas en el crecimiento.

Debido a su sensibilidad para detectar incluso fragmentos raros de ácido nucleico, ahora la secuenciación permite estudios con una profundidad sin precedentes sobre poblaciones complejas de células y tejidos. El poder de esta profundidad y sensibilidad se aplica no sólo a la detección de patógenos raros nuevos en un mar de señales del hospedador, sino también a la identificación de las subpoblaciones de patógenos heterogéneas en un solo hospedador que podrían diferir en perfiles de resistencia farmacológica o en determinantes patogénicos, por ejemplo. Se necesitan estudios que aclaren la relevancia clínica de estas subpoblaciones variables, ahora que la secuenciación profunda permite alcanzar niveles nuevos de detalles sobre los miembros mayoritarios y minoritarios de esta población.

DIAGNÓSTICO BASADO EN EL HOSPEDADOR

Mientras el diagnóstico basado en el patógeno se mantiene como la base para diagnosticar la infección, desde hace tiempo las pruebas serológicas han sido la base de una estrategia para diagnosticar la infección mediante la medición de las respuestas del hospedador. También en este campo se explora la aplicación de la genómica para mejorar tal estrategia, dadas las limitaciones ya descritas de las pruebas serológicas. En lugar de usar las respuestas de anticuerpos como un biomarcador retrospectivo de infección, los esfuerzos recientes se enfocan en el análisis transcriptómico de la respuesta del hospedador como nueva dirección con implicaciones diagnósticas para la enfermedad humana. Por ejemplo, las pruebas diagnósticas basadas en el patógeno para distinguir entre la tuberculosis activa y la latente han tenido resultados elusivos, pero el trabajo reciente muestra que el perfil de transcripción de los leucocitos circulantes tiene un patrón de expresión diferencial de casi 400 transcritos que distinguen la tuberculosis activa de la latente; este patrón de expresión se debe en parte a los cambios en los genes inducibles por interferón en el linaje mieloide. En un grupo validado, esta firma transcripcional permitió distinguir a los pacientes con enfermedad activa de aquellos con enfermedad latente; distinguir la tuberculosis de otros estados inflamatorios o infecciones pulmonares, y seguir las respuestas al tratamiento después de sólo dos semanas, con normalización de la expresión hasta ser semejante a la de pacientes sin enfermedad activa luego de seis meses de tratamiento eficaz. Esta prueba podría tener una función importante, no sólo en el tratamiento de pacientes sino también como marcador de la eficacia en estudios clínicos de nuevos fármacos. De igual manera, otros investigadores intentan identificar firmas transcripcionales del hospedador en las células sanguíneas circulantes distintivas de la infección por influenza A para distinguirla de las infecciones respiratorias superiores por otros virus o bacterias. Estas firmas también variaron según la fase de la infección y fueron prometedoras para distinguir a los sujetos expuestos que desarrollarán síntomas de los que permanecerán asintomáticos. Tales resultados sugieren que el conocimiento del perfil de la dinámica transcripcional del hospedador podría aumentar la información obtenida de los estudios de patógenos, tanto para mejorar el diagnóstico como para vigilar la progresión de la enfermedad y la respuesta al tratamiento.

En esta era de estudios de relación con el genoma entero e intentos para avanzar hacia la medicina personalizada, las técnicas genómicas también se aplican a la identificación de loci genéticos en el hospedador y factores que contribuyen a la susceptibilidad de la infección. Estos loci se han sometido a una estricta selección entre poblaciones en las que la enfermedad es endémica. Al identificar los alelos genéticos beneficiosos entre personas que sobreviven en tales situaciones, se descubren marcadores de susceptibilidad o resistencia. Dichos marcadores pueden traducirse en pruebas diagnósticas para identificar a las personas susceptibles a fin de implementar intervenciones preventivas o profilácticas. Además, tales estudios pueden ofrecer información sobre los mecanismos patogénicos de la infección e informar sobre nuevos métodos de intervención terapéutica. Estas relaciones genéticas provechosas se identificaron mucho antes del advenimiento de la genómica, como en los efectos protectores del grupo sanguíneo Duffy negativo o las anormalidades heterocigóticas en la hemoglobina contra la infección por Plasmodium. Los métodos genómicos permiten hacer investigaciones más sistemáticas y extensas del hospedador, para identificar no sólo a personas con susceptibilidad a muchas enfermedades (p. ej., VIH, tuberculosis y cólera), sino también factores del hospedador que contribuyen y pronostican la gravedad de la enfermedad.

La genómica puede influir en el tratamiento de las enfermedades infecciosas de dos formas. Al transformar la velocidad con la que se obtiene información diagnóstica o el tipo de información diagnóstica que puede obtenerse, lo cual puede influir en la toma de decisiones terapéuticas. Por otra parte, al abrir nuevas vías para comprender la patogenia, contar con nuevas formas para detener una infección y delinear nuevas estrategias para descubrir antibióticos, facilita el desarrollo de nuevos fármacos.

DIAGNÓSTICO GENÓMICO COMO INFORMACIÓN PARA LA TERAPÉUTICA

Los esfuerzos para descubrir antibióticos van en descenso, menos compuestos nuevos están en proceso y menos aún llegan al mercado. Este fenómeno se debe en parte a la falta de incentivos económicos para el sector privado, pero también es atribuible a las enormes dificultades que implican el descubrimiento y desarrollo de los antibióticos. Por razones obvias relacionadas con el mercado, casi todos los esfuerzos se han enfocado en los antibióticos de amplio espectro; el desarrollo de un compuesto con acción contra un amplio grupo de organismos (o sea, más divergentes entre sí de lo que el ser humano lo es de la amiba) es mucho más difícil que el desarrollo de un compuesto diseñado para afectar a una sola especie bacteriana. No obstante, hasta ahora el concepto de los antibióticos de espectro estrecho se ha rechazado por la falta de información diagnóstica temprana que guíe la selección de tales fármacos. Por tanto, un diagnóstico temprano que aporte información sobre la susceptibilidad diagnóstica que guíe la selección del antibiótico en tiempo real puede modificar y simplificar las estrategias antibióticas al permitir que el paradigma se aleje de los fármacos de amplio espectro y se aproxime a los de espectro estrecho. Está claro que este cambio en el paradigma tendría más implicaciones en el incremento actual de la resistencia antibiótica.

En otro paradigma diagnóstico con capacidad para influir en las intervenciones terapéuticas, la genómica abre nuevos caminos para comprender mejor no sólo las distintas susceptibilidades del hospedador a la infección, sino también las respuestas diferentes de los hospedadores al tratamiento. En cierto sentido, la promesa de la “medicina personalizada” ha sido una posible panacea. Algunos signos apuntan al logro de este objetivo. Por ejemplo, desde hace tiempo se debate sobre la participación de los glucocorticoides en la meningitis tuberculosa. En fecha reciente se descubrió que los polimorfismos en el locus genético humano LTA4H, que codifica una enzima modificadora del leucotrieno, modulan la respuesta inflamatoria a la tuberculosis. Los pacientes con meningitis tuberculosa homocigotos para el alelo proinflamatorio LTA4H obtenían un mayor beneficio del tratamiento glucocorticoide adjunto, mientras que los sujetos homocigotos para el alelo antiinflamatorio tenían un efecto adverso con el tratamiento esteroide. Este adjunto antiinflamatorio se convirtió en estándar de tratamiento en la meningitis tuberculosa, pero este estudio sugiere que quizá sólo un subgrupo de pacientes se beneficia y además sugiere un recurso genético para la identificación prospectiva de este subgrupo. Por tanto, es posible que al final, las pruebas genómicas diagnósticas aporten información para el diagnóstico, pronóstico y decisiones terapéuticas al revelar el potencial patógeno del microbio y detectar las respuestas del hospedador a la infección y al tratamiento.

GENÓMICA EN EL DESARROLLO DE FÁRMACOS Y VACUNAS

Las tecnologías genómicas ya produjeron un cambio drástico en la investigación sobre las interacciones entre hospedador y patógeno, el objetivo es influir cada vez más en el proceso de descubrimiento y desarrollo terapéuticos. La secuenciación ofrece varias posibles vías para el descubrimiento terapéutico antimicrobiano. Primero, los métodos moleculares a escala genómica allanaron el camino para la identificación integral de todos los genes esenciales codificados en el genoma de un patógeno, con la identificación sistemática consecuente de todas las posibles vulnerabilidades del patógeno que pudieran ser blancos terapéuticos. Segundo, el perfil de transcripción puede ofrecer información sobre los mecanismos de acción de los fármacos prospectos derivados de las detecciones. Por ejemplo, la firma transcripcional de los agentes que alteran la pared celular (p. ej., lactámicos β) es distinta de la de los que dañan el DNA (p. ej., fluoroquinolonas) o los inhibidores de la síntesis proteínica (p. ej., aminoglucósidos). Por tanto, el análisis transcripcional de la respuesta de un patógeno a un nuevo antibiótico puede sugerir un mecanismo de acción o marcar compuestos para su priorización debido a una actividad potencialmente nueva. En una estrategia genómica alternativa para determinar los mecanismos de acción se ha usado la interferencia del RNA seguida por secuenciación dirigida para identificar los genes necesarios para la eficacia de fármacos contra tripanosomas. Este método proporcionó nueva información sobre el mecanismo de acción de los fármacos que se han usado por décadas para la tripanosomosis africana humana. Tercero, la secuenciación permite identificar con facilidad las regiones más conservadas de los genomas de un patógeno y los productos génicos correspondientes; esta información es valiosa para estrechar los antígenos prospectos para desarrollar vacunas. Estas proteínas superficiales pueden expresarse de manera recombinante y se valoran para conocer su capacidad para inducir una respuesta serológica e inmunidad protectora. Este proceso, llamado vacunología inversa, ha sido muy útil para los patógenos difíciles de cultivar o poco inmunógenos, como ocurrió con el desarrollo de una vacuna para Neisseria meningitidis serogrupo B.

El análisis del contenido génico a gran escala a partir de la secuenciación o el perfil de secuenciación permite avanzar en nuevas direcciones de la investigación que aporten información nueva sobre la interrelación del patógeno y el hospedador durante la infección o la colonización. Un objetivo importante de esta investigación es sugerir nuevas alternativas terapéuticas que alteren esta interrelación en favor del hospedador. En realidad, una de las aplicaciones más inmediatas de la tecnología de secuenciación de la siguiente generación derivó de la simple caracterización de los patógenos humanos y cepas comensales o ambientales relacionadas para luego encontrar vínculos genómicos de la patogenia. Por ejemplo, como Escherichia coli varía desde una simple cepa no patógena adaptada al laboratorio (K-12) hasta un patógeno gastrointestinal enterohemorrágico productor de toxina shiga (O157:H7), tiene una diferencia de hasta 25% en el contenido génico, aunque la clasificación filogenética sea la misma. Aunque éste es un ejemplo extremo, no es un caso aislado. Algunos aislados de Enterococcus, notorios por su mayor incidencia de resistencia a antibióticos comunes como ampicilina, vancomicina y aminoglucósidos, también contienen material genético recién adquirido que conforma hasta 25% del genoma de los elementos genéticos móviles. Este hecho sugiere que la transferencia génica horizontal puede tener una función importante en la adaptación del organismo como patógeno hospitalario. Al estudiarla con más detenimiento se demostró que esta expansión genómica se relaciona con la pérdida de elementos regulatorios llamados CRISPR (clustered, regularly interspaced short palindromic repeats, repeticiones palindrómicas cortas regularmente intercaladas). La pérdida de elementos CRISPR, que protege al genoma bacteriano de la invasión de ciertos materiales genéticos ajenos, facilita la adquisición de elementos genéticos que confieren resistencia a los antibióticos. Aunque parece que la pérdida de esta regulación impone una desventaja competitiva en ambientes sin antibióticos, estas cepas resistentes a los fármacos proliferan incluso en presencia de los agentes antienterocócicos más útiles. Además de la información obtenida de la secuenciación del genoma, la extensión de los esfuerzos de secuenciación del transcriptoma completo sin sesgos (RNA-Seq) a las bacterias empieza a identificar RNA regulatorios no codificantes inesperados en muchas especies diversas. Aunque aún se desconocen las implicaciones funcionales de estos nuevos transcritos, la presencia de tales características, conservadas en muchas especies bacterianas, tiene importancia evolutiva y sugiere áreas para el estudio futuro y posibles vías terapéuticas.

Por tanto, los estudios genómicos ya empiezan a transformar el conocimiento de la infección, aportan evidencia de factores de virulencia o toxinas y proporcionan información sobre la evolución constante de la patogenicidad y la resistencia a los fármacos. Un objetivo de estos estudios es identificar a los agentes terapéuticos que pueden alterar el proceso patogénico; hoy en día existe gran interés en el concepto teórico de fármacos que inhiban los factores de virulencia en lugar de matar al patógeno como una forma de intervenir en la infección. Además, conforme la secuenciación se vuelve cada vez más accesible y eficiente, se inician estudios a gran escala con poder estadístico sin precedente para relacionar los resultados clínicos con los genotipos del patógeno y el hospedador, y así revelar los puntos vulnerables en el proceso de la infección en los que pueda influirse. Aunque esto es sólo el principio, tales estudios apuntan a un futuro tentador en el que el médico cuente con factores predictivos genómicos del resultado de la infección y la respuesta terapéutica para guiar la toma de decisiones clínicas.

Los estudios epidemiológicos de las enfermedades infecciosas tienen varios objetivos principales: identificar y caracterizar los brotes; describir el patrón y dinámica de una enfermedad infecciosa mientras se disemina en las poblaciones, e identificar las intervenciones que pueden limitar o reducir la carga de enfermedad. Un ejemplo paradigmático típico es el descubrimiento de John Snow sobre el origen del brote de cólera en Londres en 1854. Snow hizo un mapeo geográfico cuidadoso sobre los casos para establecer que la fuente probable del brote era el agua contaminada de la bomba de Broad Street y detuvo el brote al retirar la manivela de la bomba. Aunque esa intervención se hizo sin conocer el agente causal del cólera, los avances en la microbiología y la genómica ampliaron el alcance de la epidemiología, que ahora considera no sólo la enfermedad, sino también al patógeno, sus factores de virulencia y las relaciones complejas entre las poblaciones microbianas y del hospedador.

Mediante el uso de herramientas genómicas novedosas, como la secuenciación de alto rendimiento, ya es posible describir con rapidez la diversidad de la población microbiana con una resolución mucho mayor, con discriminación entre los aislados que tienen diferencias en un solo nucleótido en todo el genoma; esto permite avanzar más allá de las técnicas previas que dependían de los fenotipos (como las pruebas de resistencia antibiótica) o marcadores genéticos (como la tipificación de una secuencia de múltiples loci). El desarrollo de métodos estadísticos basados en la genética molecular y la teoría evolutiva dio lugar a técnicas analíticas que traducen las descripciones de la diversidad y estructura de la población microbiana en información sobre el origen e historial de diseminación del patógeno. Al vincular la reconstrucción filogenética con datos epidemiológicos y demográficos, la epidemiología genómica proporciona la oportunidad de rastrear la transmisión de una persona a otra; inferir los patrones de transmisión de los patógenos y los elementos de la secuencia que generan los fenotipos de interés, y calcular la dinámica de transmisión de los brotes.

CONOCIMIENTO DE LA TRANSMISIÓN DE UNA PERSONA A OTRA

El uso de comparaciones de la secuenciación del genoma entero para inferir la transmisión entre personas e identificar la fuente de los brotes de patógenos ha sido útil para controlar infecciones en un hospital. Como se informa en un documento crucial en 2010, un estudio de MRSA en un hospital tailandés demostró que la secuenciación del genoma entero puede usarse para inferir la transmisión de un patógeno de un paciente a otro dentro de un hospital mediante la integración del análisis de la acumulación de mutaciones con el tiempo, con fechas y localizaciones de las infecciones dentro del hospital. Desde entonces se han informado múltiples casos en los que se usó la secuenciación del genoma entero para definir y generar las intervenciones enfocadas en interrumpir las cadenas de transmisión. En otro brote de MRSA en una unidad infantil de cuidados especiales en Cambridge, Reino Unido, la secuenciación del genoma entero amplió el análisis habitual para control de la infección, que depende de la tipificación de los organismos con base en su susceptibilidad antibiótica, a la secuenciación de los aislados de muestras clínicas. Esta estrategia permitió identificar el brote por una cepa de MRSA específica, por lo demás no reconocido, que se producía sobre el fondo del patrón usual de infecciones causadas por una población circulante diversa de cepas de MRSA. El análisis aportó evidencia de transmisión entre las madres dentro de la unidad de cuidados especiales infantiles y en la comunidad, y demostró la participación clave de la portación de MRSA en un solo profesional de la salud para la persistencia del brote. La eliminación de la colonización del profesional de salud terminó el brote. En otro ejemplo más, como respuesta a la observación de 18 casos de infección por Klebsiella pneumoniae productor de carbapenemasa durante seis meses en el National Institutes of Health Clinical Research Center, se usó la secuenciación de los aislados para discriminar entre las posibilidades de que estos casos representaran introducciones múltiples e independientes al sistema de salud o una sola introducción con transmisión subsiguiente. Con base en la red y el análisis filogenético de los datos genómicos y epidemiológicos, los autores reconstruyeron las relaciones probables entre los aislados de un paciente a otro y demostraron que la diseminación de la infección por Klebsiella resistente se debía en realidad a la transmisión intrahospitalaria de una sola cepa.

El descubrimiento de fenómenos de transmisión inesperados mediante los estudios de epidemiología genómica motiva un cuestionamiento renovado de la ecología y modos de transmisión de los patógenos. Por ejemplo, el aumento en la prevalencia de infecciones con micobacterias no tuberculosas, incluida Mycobacterium abscessus, en pacientes con fibrosis quística (CF, cystic fibrosis) generó especulación sobre la posible participación de la transmisión entre pacientes en la comunidad con CF. Sin embargo, las técnicas de tipificación convencionales carecían de la resolución necesaria para definir con exactitud la estructura de la población, un componente crucial para inferir la transmisión. Los lineamientos pasados para controlar las infecciones descartaban la posibilidad de contraer micobacterias no tuberculosas en instituciones de salud, ya que no se había descrito evidencia sólida de tal transmisión. En un estudio con secuenciación del genoma entero de aislados de M. abscessus en pacientes con CF, una técnica analítica que utilizó la secuenciación del genoma, epidemiología y un modelo de Bayes permitió examinar la probabilidad de transmisión entre pacientes en un centro para CF. Los autores encontraron aislados casi idénticos en varios pacientes y observaron que estos aislados eran menos diversos que los de un solo individuo. Como no hay un vínculo epidemiológico claro que sitúe a los pacientes infectados en el mismo sitio al mismo tiempo, este hallazgo subraya la necesidad de explorar las ideas preexistentes de las condiciones necesarias para la transmisión y de reconsiderar los lineamientos para controlar la infección por M. abscessus. Estudios similares de otros patógenos (en especial los que infectan al ser humano y otros hospedadores animales, así como sus reservorios ambientales) aumentarán el conocimiento sobre la participación relativa y la importancia de las fuentes de infección, así como las formas de diseminación entre poblaciones, lo cual permitirá establecer estrategias basadas en evidencia para la prevención e intervención.

Conforme más estudios buscan definir con cuidado los orígenes y diseminación de agentes infecciosos bajo la perspectiva de la secuenciación del genoma entero, surgen preguntas fundamentales respecto al conocimiento de la infección en un solo individuo y el proceso de un solo evento de transmisión. Por ejemplo, es indispensable comprender mejor la diversidad de la población de un patógeno en un solo individuo infectado para interpretar la relación entre los aislados de distintos pacientes. Aunque usualmente se considera a las personas infectadas con una sola cepa bacteriana, un estudio reciente de secuenciación de múltiples colonias de S. aureus de un solo individuo mostró una “nube” de diversidad; este hallazgo genera varias preguntas que será importante responder conforme se desarrolle este campo: ¿cuál es la relevancia clínica de esta diversidad? ¿Cuáles son los procesos que generan y limitan la diversidad? ¿Qué grado de diversidad se transmite en distintas condiciones y vías de transmisión? ¿Cómo es que las respuestas a estas preguntas varían según el organismo infectante, tipo de infección, hospedador y respuesta al tratamiento? Los objetivos principales para las investigaciones futuras incluyen descripciones más completas de la diversidad, de la dinámica poblacional, de “cuellos de botella” en la transmisión y de las fuerzas que delinean e influyen en el crecimiento y diseminación de las poblaciones microbianas.

RECONSTRUCCIÓN DE LOS ORÍGENES Y DINÁMICA DE LA DISEMINACIÓN DE PATÓGENOS

Además de reconstruir las cadenas de transmisión de los brotes locales, los métodos epidemiológicos basados en la genómica proporcionan información sobre la diseminación geográfica y temporal de los patógenos a gran escala. Un ejemplo típico es el estudio del cólera, la enfermedad diarreica deshidratante causada por la infección con Vibrio cholerae. Al principio, el cólera se diseminó al mundo a partir del subcontinente indio en el siglo xix y desde entonces ha causado siete pandemias; la séptima continúa desde los años 1960. Una investigación sobre los patrones geográficos de la diseminación del cólera en la séptima pandemia utilizó secuencias del genoma de una recolección global de 154 cepas de V. cholerae, aisladas de 1957 a 2010. Esta investigación reveló que la séptima pandemia ha incluido tres oleadas superpuestas de diseminación desde India (fig. 146-4). Además, el análisis del genoma de un aislado de V. cholerae del brote de 2010 en Haití mostró que tenía una relación más cercana con los aislados del sur de Asia que con los aislados de la vecina Latinoamérica, resultado que apoyó la hipótesis de que el brote se debía al V. cholerae introducido a Haití mediante un viaje humano (probablemente de Nepal) y no de fuentes ambientales o geográficas más próximas. Un estudio subsiguiente que estableció la fecha del ancestro común más reciente de una población de aislados de V. cholerae de Haití apoyó también la introducción de una fuente puntual en Nepal.

Cada vez más investigaciones sobre la diseminación de muchos patógenos (que hasta ahora incluyen cepas de S. aureus, S. pneumoniae, Chlamydia, Salmonella, Shigella, E. coli, C. difficile, virus del Nilo occidental, virus de la rabia y virus del dengue) contribuyen al atlas creciente de mapas que describen rutas, patrones y momentos de diversificación y diseminación microbiana. Los avances en las tecnologías de secuenciación hacen posible los esfuerzos a gran escala, como el 100K Foodborne Pathogen Genome Project que busca determinar la secuencia de los genomas de 100 000 cepas de patógenos transmitidos por alimentos recolectados de fuentes que incluyen alimentos, ambiente y animales de granja. Estos estudios aportarán una gran cantidad de datos que pueden usarse para investigar la diversidad y los vínculos microbiológicos en distintos nichos y patrones de diseminación de un nicho a otro. La adopción cada vez mayor de la secuenciación del genoma en instituciones de atención y salud pública asegurará el crecimiento muy rápido del catálogo disponible de secuencias genómicas y datos epidemiológicos relacionados. La descripción más detallada de la diversidad microbiana, y de la dinámica de esa diversidad en el tiempo y a través de límites epidemiológicos y demográficos permitirá obtener cada vez más información sobre las relaciones entre las vías de transmisión y los patrones de diseminación histórica.

PREDICCIÓN DEL POTENCIAL EPIDÉMICO

La definición de la capacidad de transmisión de un patógeno es un paso crítico para el desarrollo de estrategias de vigilancia e intervención de salud pública, ya que esta información ayuda a predecir el potencial epidémico de un brote. La transmisibilidad puede calcularse por varios métodos, como la inferencia de la tasa de crecimiento de una epidemia junto con el tiempo de generación de una infección (el intervalo medio entre la infección del caso índice y de las personas infectadas por ese caso índice). La secuenciación del genoma y el análisis de una población bien muestreada proporcionan otro método para obtener parámetros epidemiológicos fundamentales similares. Una medida clave de la transmisibilidad es el número de reproducción básica (R0), definido como el número de infecciones secundarias generadas a partir de un solo caso infeccioso primario. Cuando el número de reproducción básica es >1 (R0 >1), el brote tiene potencial epidémico; cuando es <1 (R0 <1), el brote se extinguirá. Con base en las secuencias de muestras de gripe (influenza) obtenidas de pacientes infectados en la parte inicial de la pandemia de gripe H1N1 de 2009, mediante un análisis genómico poblacional se calculó que el número de reproducción básica era 1.2; esto se compara con estimaciones de 1.4 a 1.6 basadas en varios análisis epidemiológicos. Además, con la suposición de un modelo de reloj molecular, se usaron las secuencias de muestras de H1N1 junto con la información sobre cuándo y dónde se obtuvieron las muestras para calcular la fecha y sitio de origen de la pandemia, lo que aporta información sobre los orígenes y dinámica de la enfermedad. Como la magnitud e intensidad de la respuesta de salud pública se guían según el tamaño previsto de un brote, la capacidad de métodos genómicos para aclarar el origen de un patógeno y su potencial epidémico aumentan mucho la dimensión de las contribuciones de estos métodos a la epidemiología de las enfermedades infecciosas.

INFORMACIÓN SOBRE LA EVOLUCIÓN DE UN PATÓGENO

Aparte de describir la transmisión y la dinámica, la genómica de un patógeno puede aportar datos sobre la evolución de los microbios y la interacción de las presiones selectivas, el hospedador y las poblaciones de patógenos, lo que puede tener implicaciones para el desarrollo de vacunas y tratamientos. Desde la perspectiva clínica, este proceso es central para el desarrollo de resistencia antibiótica; el incremento de la patogenicidad o la aparición de nuevos rasgos de virulencia; la evasión de la inmunidad y eliminación del hospedador (lo que causa infección crónica), y la eficacia de una vacuna.

Los genomas microbianos evolucionan por diversos mecanismos que incluyen mutación, duplicación, inserción, deleción, recombinación y transferencia horizontal de genes. Los virus segmentados (p. ej., virus de la gripe) pueden reordenar segmentos génicos dentro de las células infectadas. Por ejemplo, el virus de gripe A H1N1 de la pandemia de 2009 parece haberse generado mediante reordenamiento de varias cepas de gripes aviares, porcinas y humanas. Esta capacidad para la evolución de nuevas cepas pandémicas generó preocupación sobre la posible evolución a la transmisibilidad de cepas virulentas vinculadas con tasas de mortalidad elevadas, pero que aún no muestran una capacidad suficiente para infectar a los seres humanos. Por ejemplo, experimentos controversiales con el virus de gripe aviar H5N1 definieron cinco mutaciones que vuelven al virus transmisible, al menos en hurones, el modelo animal usado en la gripe humana.

La evolución antigénica continua de la gripe estacional ofrece un ejemplo de cómo los estudios de la evolución de patógenos pueden influir en la vigilancia y el desarrollo de vacunas. Se requieren actualizaciones frecuentes a la vacuna anual de gripe para asegurar la protección contra las cepas dominantes. Estas actualizaciones se basan en la capacidad para anticipar qué poblaciones virales de un conjunto de virus circulantes diversos locales y mundiales predominarán en la estación venidera. Con este fin, los estudios sobre la dinámica del virus de gripe basados en la secuenciación aportaron información sobre la diseminación global de la gripe, con datos concretos sobre los patrones de diseminación que ayudan a aclarar los orígenes, surgimiento y circulación de cepas nuevas. Mediante el análisis de más de 1 000 aislados del virus de gripe A H3N2 en las temporadas de influenza 2002-2007, el sureste de Asia se identificó como el sitio usual del que se origina la diversidad y de donde se diseminan a todo el mundo. Estudios adicionales con recolecciones de aislados globales aportaron más información sobre la diversidad del virus circulante, mostraron que algunas cepas persisten y circulan fuera de Asia durante múltiples temporadas.

Los estudios de epidemiología genómica no sólo pueden ayudar a guiar la selección y desarrollo de vacunas; también ayudan a rastrear lo que sucede con los patógenos que circulan en la población como respuesta a la vacunación. Al describir la evolución del patógeno bajo la presión selectiva de una población vacunada, tales estudios pueden tener una participación central en la vigilancia e identificación de determinantes de virulencia y quizá incluso ayuden a predecir la evolución futura del escape de la protección mediante la vacuna. La vacuna conjugada neumocócica heptavalente (PCV-7) se dirige contra los siete serotipos de S. pneumoniae causantes de la mayoría de los casos de enfermedad invasiva al momento de su introducción en 2000; desde entonces, PCV-7 ha reducido mucho la incidencia y mortalidad de la enfermedad neumocócica. El análisis genómico de la población de las secuencias de más de 600 aislados neumocócicos de Massachusetts de 2001 a 2007 mostró que los raros serotipos preexistentes no incluidos en la vacuna están sustituyendo a los serotipos de la vacuna, y que algunas cepas persistieron pese a la vacunación mediante la recombinación del locus de la cápsula, blanco de la vacuna, con un casete de genes de la cápsula de serotipos no incluidos en la vacuna.

Aunque las tecnologías genómicas de vanguardia se implementan sobre todo en países desarrollados, su aplicación para las enfermedades infecciosas quizá ofrece el mayor impacto potencial en regiones menos desarrolladas, donde es mayor la carga de estas infecciones. Dicha globalización de la tecnología y sus extensiones ya comenzó en todas las áreas subrayadas en este capítulo; ha ocurrido mediante la aplicación de tecnologías avanzadas a las muestras obtenidas en países en desarrollo y mediante la adaptación e importación de tecnologías a las naciones en vías de desarrollo para implementarlas en el sitio conforme se vuelven accesibles en todo el mundo. La caracterización genómica de los patógenos causantes de enfermedades globales importantes, como la tuberculosis, paludismo, tripanosomosis y cólera ha aportado información para el diagnóstico, tratamiento y control de infecciones. Por ejemplo, la prueba basada en ácido nucleico para el diagnóstico rápido de la infección por M. tuberculosis y la detección de resistencia a la rifampicina está en proceso de valoración para implementarla en instituciones de campo en África y Asia, donde es muy prevalente la tuberculosis. La capacidad para diagnosticar la tuberculosis resistente a múltiples fármacos en horas, en lugar de semanas o meses, puede revolucionar el tratamiento y el control de esta enfermedad frecuente y devastadora. El rastreo genómico de alta resolución de la diseminación del cólera ha aportado datos sobre cuáles medidas de salud pública pueden ser más efectivas para controlar las epidemias locales. En general, la secuenciación ha disminuido su costo de manera exponencial con cada año que pasa. Como estas tecnologías tienen un efecto sinérgico con los esfuerzos para globalizar los recursos de tecnología de información, la implementación global de los métodos genómicos ofrece difundir los métodos más avanzados para el diagnóstico, tratamiento y rastreo de epidemias en las zonas que más necesitan estas capacidades.

Al aclarar la información genética que codifica los procesos vitales más fundamentales, las tecnologías genómicas transforman muchos aspectos de la medicina. En las enfermedades infecciosas, los métodos como la secuenciación de siguiente generación y el análisis de expresión a escala genómica ofrecen información más profunda que antes sobre microbios individuales y comunidades microbianas. Esta información amplía el conocimiento de las interacciones de los microorganismos y comunidades entre sí, con el hospedador humano y con el ambiente. A pesar del progreso significativo y los abundantes datos genómicos disponibles hoy en día, las barreras tecnológicas y financieras todavía impiden la adopción generalizada de la secuenciación de patógenos a gran escala en instituciones clínicas, de salud pública e investigación. Conforme se generen aún más datos, se necesitarán innovaciones en el almacenamiento, desarrollo de herramientas bioinformáticas para manejar los datos, estandarización de métodos y entrenamiento de usuarios en instituciones de investigación y clínicas. Aún deben estudiarse la rentabilidad y aplicabilidad de la secuenciación del genoma entero, sobre todo en la clínica; además se requerirán estudios sobre el impacto de la secuenciación del genoma en los resultados del paciente para aclarar los contextos en los que estas nuevas tecnologías pueden hacer las mayores contribuciones al bienestar del paciente. Los esfuerzos continuos para salvar las limitaciones mediante la colaboración, enseñanza y reducción de obstáculos financieros deben aplaudirse y ampliarse. Con los avances en las tecnologías genómicas y análisis computacional, la capacidad para detectar, caracterizar, tratar, vigilar, evitar y controlar infecciones ha progresado con rapidez en los últimos años, y así seguirá, con la esperanza de que preceda una nueva era en la que el médico esté mejor equipado para combatir la infección y promover la salud humana.