CAPÍTULO 4: Proteínas: determinación de la estructura primaria

Las proteínas son macromoléculas complejas desde los puntos de vista físico y funcional, que desempeñan múltiples funciones de importancia crucial. Por ejemplo, una red de proteína interna, el citoesqueleto (capítulo 51), mantiene la forma y la integridad física celulares. Filamentos de actina y miosina forman la maquinaria contráctil del músculo (capítulo 51). La hemoglobina transporta oxígeno (capítulo 6), mientras que los anticuerpos circulantes defienden contra invasores extraños (capítulo 52). Las enzimas catalizan reacciones que generan energía, sintetizan biomoléculas y las degradan, replican genes y los transcriben, procesan mRNA (ácido ribonucleico mensajero), entre otras funciones (capítulo 7). Los receptores permiten a las células detectar hormonas y otros indicios ambientales, así como mostrar respuesta a los mismos (capítulos 41 y 42). Las proteínas están sujetas a cambios físicos y funcionales que reflejan el ciclo de vida de los organismos en los cuales residen. Una proteína típica “nace” en el momento de la traducción (capítulo 37), madura a través de eventos de procesamiento postraduccional, como proteólisis selectiva (capítulos 9 y 37), alterna entre estados de trabajo y de reposo por medio de la intervención de factores reguladores (capítulo 9), envejece por oxidación, desamidación, etc. (capítulo 58), y muere cuando se degrada hacia los aminoácidos que la componen (capítulo 29). Un objetivo importante de la medicina molecular es la identificación de biomarcadores como proteínas y la modificación de proteínas cuya presencia, ausencia o deficiencia se relaciona con estados fisiológicos o enfermedades específicos (figura 4-1).

La proteína altamente purificada es esencial para el examen detallado de sus propiedades físicas y funcionales. Las células contienen miles de proteínas distintas, cada una en cantidades ampliamente variables. Así, el aislamiento de una proteína específica en cantidades suficientes para analizar sus propiedades plantea un formidable desafío que puede requerir la aplicación sucesiva de múltiples técnicas de purificación. La precipitación selectiva explota diferencias de la solubilidad relativa de proteínas individuales en función del pH (precipitación isoeléctrica), la polaridad (precipitación con etanol o con acetona), o la concentración de sal (separación de sustancias disueltas al añadir sulfato de amonio a la solución). Las técnicas cromatográficas separan una proteína de otra con base en la diferencia de su tamaño (cromatografía de exclusión de tamaño), la carga (cromatografía de intercambio iónico), hidrofobicidad (cromatografía de interacción hidrofóbica), o capacidad para unirse a un ligando específico (cromatografía de afinidad).

Cromatografía de columna

En la cromatografía de columna la matriz de fase estacionaria consta de cuentas pequeñas cargadas en un recipiente cilíndrico de vidrio, plástico o acero llamado una columna. Fritas permeables a líquido confinan las cuentas dentro de este espacio mientras que permiten que el líquido de fase móvil fluya o se filtre a través de la columna. Por medio de procedimientos químicos se pueden preparar derivados de las cuentas de fase estacionaria para cubrir su superficie con los grupos ácido, básico, hidrofóbico o tipo ligando requeridos para cromatografía de intercambio iónico, de interacción hidrofóbica, o de afinidad. A medida que el líquido de fase móvil sale de la columna, es recolectado de manera automática en una serie de porciones pequeñas llamadas fracciones. En la figura 4-2 se describe la disposición básica de un sistema de cromatografía sencillo para mesa de trabajo.

HPLC, cromatografía líquida de alta presión

Para la cromatografía en columna de primera generación las matrices constaban de polímeros de oligosacárido entrelazados, largos, conformados hacia cuentas esféricas de aproximadamente una décima de milímetro de diámetro. Por desgracia, su tamaño relativamente grande perturbaba el flujo de fase móvil y limitaba el área de superficie disponible. La reducción del tamaño de las partículas ofreció el potencial de aumentar mucho la resolución. Sin embargo, la resistencia creada por la matriz más estrechamente empacada requirió el uso de presiones muy altas que aplastarían las cuentas de polisacárido blandas y esponjosas y materiales similares, por ejemplo, polisacáridos y acrilamida. Finalmente, se crearon métodos para manufacturar partículas de silicón del tamaño y la forma necesarios para preparar derivados de su superficie con diversos grupos funcionales, y para empacarlas en columnas de acero inoxidable capaces de soportar presiones de varios miles de libras por pulgada (psi). Debido a su mayor poder de resolución, los sistemas de cromatografía líquida de alta presión han desplazado en su mayor parte las columnas de vidrio alguna vez familiares en el laboratorio de purificación de proteína.

Cromatografía de exclusión de tamaño

En la cromatografía de exclusión de tamaño —o filtración en gel— se separan las proteínas con base en su radio de Stokes, el radio de la esfera que ocupan a medida que entran en solución. El radio de Stokes es una función de la masa y la forma moleculares. Una proteína alargada que cae ocupa un mayor volumen que una proteína esférica de la misma masa. En la cromatografía de exclusión de tamaño se emplean cuentas porosas (figura 4-3). Los poros son análogos a irregularidades en una ribera de río. A medida que los objetos se mueven torrente abajo, los que entran en una irregularidad se retrasan hasta que regresan a la corriente principal. De modo similar, las proteínas con radios de Stokes demasiado grandes como para entrar en los poros (proteínas excluidas) permanecen en la fase móvil que está fluyendo y salen antes que las que pueden entrar en los poros (proteínas incluidas). Así, las proteínas surgen a partir de una columna de filtración en gel en orden descendente de sus radios de Stokes.

Cromatografía de intercambio iónico

En la cromatografía de intercambio iónico, las proteínas interactúan con la fase estacionaria mediante interacciones de carga-carga. Las proteínas con una carga positiva neta a un pH dado se adherirán estrechamente a cuentas con grupos funcionales que tienen carga negativa, como carboxilatos o sulfatos (intercambiadores catiónicos). De modo similar, las proteínas con una carga negativa neta se adhieren a cuentas que tienen grupos funcionales con carga positiva, típicamente aminas terciarias o cuaternarias (intercambiadores aniónicos). Las proteínas no adherentes fluyen a través de la matriz y se eliminan por medio de lavado. A continuación, las proteínas unidas son desplazadas de manera selectiva al aumentar gradualmente la fuerza iónica de la fase móvil, lo que debilita interacciones entre una carga y otra. Hay elusión de proteínas en orden inverso de la fuerza de sus interacciones con la fase estacionaria.

Cromatografía de interacción hidrofóbica

Separa a proteínas con base en su tendencia a asociarse con una matriz de fase estacionaria cubierta con grupos hidrofóbicos (p. ej., fenil Sepharose, octil Sephadex). Las proteínas que tienen superficies hidrofóbicas expuestas se adhieren a la matriz por medio de interacciones hidrofóbicas que se aumentan mediante una fase móvil de fuerza iónica alta. Las proteínas no adherentes primero se eliminan mediante lavado. A continuación se disminuye la polaridad de la fase móvil al reducir de manera gradual la concentración de sal. Si la interacción entre proteína y fase estacionaria es en particular fuerte, puede añadirse etanol o glicerol a la fase móvil para disminuir su polaridad y debilitar más las interacciones hidrofóbicas.

Cromatografía de afinidad

La cromatografía de afinidad explota la alta selectividad de casi todas las proteínas para sus ligandos. Las enzimas pueden purificarse mediante cromatografía de afinidad usando sustratos, productos, coenzimas o inhibidores, inmovilizados. En teoría, sólo las proteínas que interactúan con el ligando inmovilizado se adhieren. A continuación hay elusión de proteínas unidas sea mediante competencia con ligando soluble libre o, de manera menos selectiva, al alterar interacciones entre proteína y ligando al usar urea, clorhidrato de guanidina, pH levemente ácido, o concentraciones altas de sal. Las matrices de fase estacionaria disponibles comercialmente contienen ligandos como análogos de NAD⁺ o ATP. La purificación de proteínas expresadas de manera recombinante suele facilitarse al modificar el gen clonado para añadir un nuevo dominio de fusión designado para interactuar con un ligando unido a matriz específico (capítulo 7).

La pureza de las proteínas se evalúa mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE)

El método más ampliamente usado para determinar la pureza de una proteína es la SDS-PAGE, electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) en presencia del detergente aniónico dodecil sulfato de sodio (SDS). La electroforesis separa biomoléculas cargadas con base en los índices a los cuales migran en un campo eléctrico aplicado; en cuanto a la SDS-PAGE, la acrilamida se polimeriza y se entrecruza para formar una matriz porosa. La SDS se une a proteínas a una proporción de una molécula de SDS por cada dos enlaces peptídicos, lo que causa que el polipéptido se desdoble o se desnaturalice. Cuando es utilizada en forma conjunta con 2-mercaptoetanol o ditiotreitol para reducir enlaces disulfuro y romperlos (figura 4-4), la SDS-PAGE separa los polipéptidos componentes de proteínas multiméricas. El gran número de moléculas de SDS aniónicas, cada una de las cuales porta una carga de −1, abruma las contribuciones de carga de los grupos funcionales aminoácidos endógenos a los polipéptidos. Dado que la proporción entre carga y masa de cada complejo de SDS-polipéptido es más o menos igual, la resistencia física que cada péptido encuentra a medida que se mueve por la matriz de acrilamida determina el índice de migración. Dado que los complejos grandes encuentran mayor resistencia, los polipéptidos se separan con base en su masa molecular relativa (M_r, también conocida como peso molecular). Es factible visualizar polipéptidos individuales atrapados en el gel de acrilamida después de removerlos del campo eléctrico, tiñéndolos con colorantes como azul de Coomassie (figura 4-5).

Enfoque isoeléctrico (IEF)

Se usan amortiguadores iónicos llamados anfolitos y un campo eléctrico aplicado para generar un gradiente de pH dentro de una matriz de poliacrilamida. Las proteínas aplicadas migran hasta que llegan a la región de la matriz donde el pH coincide con su punto isoeléctrico (pI), el pH al cual la carga neta de una molécula es cero. El IEF se usa de manera conjunta con SDS-PAGE para la electroforesis bidimensional, que separa polipéptidos con base en el pI en una dimensión y con base en la M_r en la segunda (figura 4-6). La electroforesis bidimensional resulta idónea para separar los componentes de mezclas de proteínas complejas.

La insulina madura consta de la cadena A de 21 residuos y la cadena B de 30 residuos unidas mediante enlaces disulfuro. Frederick Sanger redujo los enlaces disulfuro (figura 4-4), separó las cadenas A y B, y dividió cada cadena hacia péptidos de menor tamaño usando tripsina, quimotripsina y pepsina. Los péptidos resultantes después fueron aislados y tratados con ácido para hidrolizar una porción de los enlaces peptídicos y generar péptidos con apenas 2 o 3 aminoácidos. Cada péptido se hizo reaccionar con 1-fluoro-2,4-dinitrobenceno (reactivo de Sanger), que deriva los grupos α-amino expuestos de los residuos amino terminal. Después fue determinado el contenido de aminoácidos de cada péptido e identificado el aminoácido amino terminal. El grupo є-amino de la lisina también reacciona con el reactivo de Sanger, pero dado que una lisina amino terminal reacciona con 2 mol de dicho reactivo, es fácil distinguirla de una lisina en el interior de un péptido. Al trabajar desde dipéptidos y tripéptidos en adelante por fragmentos de tamaño progresivamente mayor, Sanger logró reconstruir la secuencia completa de la insulina, logro por el cual recibió un premio Nobel en 1958. Sanger, quien recibió un segundo premio Nobel por su trabajo en el desarrollo de las técnicas de secuenciación de DNA, murió en 2013 a la edad de 95 años.

Pehr Edman introdujo el fenilisotiocianato (reactivo de Edman) para marcar de manera selectiva el residuo amino terminal de un péptido. En contraste con el reactivo de Sanger, el derivado feniltiohidantoína (PTH) puede eliminarse en condiciones leves para generar un nuevo residuo amino terminal (figura 4-7). Por consiguiente, pueden usarse rondas sucesivas de obtención de derivados con reactivo de Edman para secuenciar muchos residuos de una muestra única de péptido. Aun así, la determinación de la secuencia completa de una proteína mediante métodos químicos persiste como un proceso que consume tiempo y es laborioso.

Las propiedades químicas heterogéneas de los aminoácidos significaron que cada paso en el procedimiento representó un término medio entre la eficiencia para cualquier aminoácido o grupo de aminoácidos particular, y la flexibilidad necesaria para adaptarse a los 20. En consecuencia, cada paso en el proceso opera a eficiencia de menos de 100%, lo cual lleva a la acumulación de fragmentos polipeptídicos con N terminales variables. Finalmente, se hace imposible distinguir entre el aminoácido PTH correcto para esa posición en el péptido, de los contaminantes. Como resultado, la longitud de lectura para secuenciación de Edman varía desde 5 hasta 30 residuos de aminoácidos, dependiendo de la cantidad del péptido y la pureza del mismo.

A fin de determinar la secuencia completa de un polipéptido de varios cientos de residuos de longitud, una proteína primero debe dividirse en péptidos de menor tamaño, usando una proteasa o un reactivo como bromuro de cianógeno. Después de purificación mediante cromatografía líquida de alta presión (HPLC) de fase reversa, estos péptidos son analizados mediante secuenciación de Edman. Para montar estas secuencias peptídicas cortas a fin de resolver la secuencia completa del polipéptido intacto, es necesario analizar péptidos cuya secuencia se superpone. Esto se logra al generar múltiples juegos de péptidos usando más de un método de división. Las grandes cantidades de proteína purificada que se requieren para probar múltiples condiciones de fragmentación de proteína y de purificación de péptido constituyen la segunda desventaja importante de las técnicas químicas directas de secuenciación de proteína.

Las reacciones en las que se obtienen derivados de aminoácidos PTH, y se dividen estos últimos desde el extremo amino terminal de un péptido, de manera secuencial, típicamente se realizan en un secuenciador automatizado. En contraste, la secuenciación de DNA es tanto mucho más rápida como más económica. Las técnicas recombinantes permiten a los investigadores manufacturar un aporte casi infinito de DNA usando la muestra original como plantilla (capítulo 39). Los métodos de secuenciación de DNA, cuyas propiedades químicas también fueron desarrolladas por Sanger, permiten de manera sistemática determinar las secuencias de polidesoxirribonucleótidos de algunos cientos de residuos de longitud en un análisis único, mientras que los secuenciadores automatizados pueden “leer” secuencias de varios miles de nucleótidos de longitud. El conocimiento del código genético permite determinar la secuencia del polipéptido codificado simplemente al traducir la secuencia de oligonucleótidos de su gen. Por el contrario, los primeros biólogos moleculares diseñaron sondas de oligonucleótido complementarias para identificar la clona de DNA que contiene el gen de interés al revertir este proceso y usar como plantilla un segmento de secuencia de aminoácidos determinada químicamente. De este modo, el advenimiento de la clonación de DNA introdujo el uso difundido de un método híbrido en el cual se empleó la química de Edman para secuenciar una porción pequeña de la proteína, y después explotar esta información para determinar la secuencia restante por medio de clonación de DNA y secuenciación del mismo.

En la actualidad el número de organismos para los cuales se ha identificado la secuencia de DNA completa de su genoma y puesto a disposición de la comunidad científica asciende a cientos (capítulo 10). Estas secuencias abarcan casi todos los “organismos modelo” comúnmente empleados en laboratorios de investigación biomédica: Homo sapiens, ratón, rata, Escherichia coli, Drosophila melanogaster, Caenorhabiditis elegans, levadura, etc., así como muchos organismos patógenos. Mientras tanto, en todo el mundo, disposiciones de secuenciadores de DNA automatizados siguen generando datos sobre la secuencia del genoma con rapidez y economía aún mayores. Así, para la mayoría de los científicos investigadores la secuencia de la o las proteínas con las cuales están trabajando ya se ha determinado, y se podrá acceder a ella en una base de datos como GenBank (capítulo 10). Lo único que el científico necesita es adquirir suficiente información sobre la secuencia de aminoácidos a partir de la proteína; a veces bastan 5 o 6 residuos consecutivos para hacer una identificación inequívoca. Si bien la información sobre la secuencia de aminoácidos requerida puede obtenerse usando la técnica de Edman, en la actualidad la espectrometría de masa (MS) ha surgido como el mejor método para la identificación de proteína.

La sensibilidad, rapidez y versatilidad superiores de la MS han reemplazado a la técnica de Edman como el principal método para determinar las secuencias de péptidos y proteínas. La MS es significativamente más sensible y tolerante de variaciones de la calidad de la muestra. Más aún, puesto que la masa y la carga son propiedades comunes de una amplia gama de biomoléculas, la MS puede usarse para analizar metabolitos, carbohidratos y modificaciones postraduccionales, como fosforilación o hidroxilación que añaden incrementos de masa fácilmente identificados a una proteína (cuadro 4-1). Estas modificaciones son difíciles de detectar usando la técnica de Edman y son indetectables en la secuencia de aminoácidos derivada de DNA.

En un espectrómetro de masa sencillo, de cuadrupolo único, se coloca una muestra bajo vacío, y se permite que se vaporice en presencia de un donador de protón para impartir una carga positiva. A continuación, un campo eléctrico propulsa los cationes hacia un tubo de vuelo curvo donde encuentran un campo magnético, que los desvía a un ángulo recto respecto a su dirección de vuelo original (figura 4-8). La corriente que da energía al electroimán se aumenta de manera gradual hasta que la vía de cada ion se desvía lo suficiente como para que golpee un detector montado en el extremo del tubo de vuelo. Para iones de carga neta idéntica, la fuerza requerida para desviar su trayectoria al mismo grado es proporcional a su masa.

El tubo de vuelo para un espectrómetro de masa de tiempo de vuelo (TOF) es lineal. Después de la vaporización de la muestra en presencia de un donador de protón, se aplica brevemente un campo eléctrico para acelerar los iones hacia el detector en el extremo del tubo de vuelo. Para moléculas de carga idéntica, la velocidad a la cual son aceleradas —y, por ende, el tiempo requerido para que lleguen al detector— es inversamente proporcional a su masa.

Los espectrómetros de masa de cuadrupolo por lo general se usan para determinar las masas de moléculas de 4 000 Da o menos, mientras que los espectrómetros de masa de tiempo de vuelo se usan para determinar las masas grandes de proteínas complejas. Diversas combinaciones de cuadrupolos múltiples, o el reflejo de iones de regreso por el tubo de vuelo lineal de un espectrómetro de masa de TOF, se usan para crear instrumentos más sofisticados.

Los péptidos pueden volatilizarse para análisis mediante ionización de electroespray o desorción láser asistida por matriz

El análisis de péptidos y proteínas mediante espectrometría de masa inicialmente estuvo obstaculizado por dificultades para volatilizar moléculas orgánicas grandes. Si bien las moléculas orgánicas pequeñas podían vaporizarse fácilmente mediante calentamiento en un vacío (figura 4-9), las proteínas, los oligonucleótidos, etc., quedaban destruidos en estas condiciones. Sólo cuando se idearon técnicas fiables para dispersar péptidos, proteínas y otras biomoléculas grandes hacia la fase de vapor, fue posible aplicar la MS para su análisis estructural y determinación de secuencia. La dispersión hacia la fase de vapor se logra mediante tres métodos: ionización de electroespray, desorción e ionización láser asistida por matriz (MALDI) y bombardeo atómico rápido (FAB). En la ionización de electroespray, las moléculas que se van a analizar se disuelven en un solvente volátil y se introducen en la cámara de muestra en un chorro pequeño a través de un capilar (figura 4-9). A medida que la gotita de líquido surge hacia la cámara de muestra, el solvente se dispersa con rapidez y deja la macromolécula suspendida en la fase gaseosa. La sonda cargada sirve para ionizar la muestra. A menudo se utiliza la ionización de electroespray para analizar péptidos y proteínas conforme muestran elusión desde una HPLC u otra columna de cromatografía ya disuelta en un solvente volátil. En la MALDI, la muestra se mezcla con una matriz líquida que contiene un colorante que absorbe luz y una fuente de protones. En la cámara de muestra, la mezcla es excitada usando un láser, lo que hace que la matriz circundante se disperse hacia la fase de vapor con rapidez tal que evite el calentamiento de péptidos o proteínas embebidos (figura 4-9). En el bombardeo atómico rápido, grandes macromoléculas dispersadas en glicerol u otra matriz protónica son bombardeadas por una oleada de átomos neutrales, por ejemplo, xenón, que han sido acelerados a alta velocidad. La ionización “suave” mediante FAB a menudo es aplicada para voltilizar grandes macromoléculas intactas.

Los péptidos dentro del espectrómetro de masa se pueden fragmentar hacia unidades de menor tamaño mediante choques con átomos de helio o argón neutros (disociación inducida por colisión), y es posible determinar las masas de los fragmentos individuales. Puesto que los enlaces peptídicos son mucho más lábiles que los enlaces carbono-carbono, los fragmentos más abundantes diferirán uno de otro por unidades equivalentes a uno o dos aminoácidos. Dado que —con las excepciones de 1) leucina e isoleucina, y 2) glutamina y lisina— la masa molecular de cada aminoácido es singular, la secuencia del péptido puede reconstruirse a partir de las masas de sus fragmentos.

Espectrometría de masas en tándem

Aquí se emplea el equivalente de dos espectrómetros de masas enlazados en serie, y ahora permite analizar mezclas de péptidos complejas, sin purificación previa. Por esta razón, tales instrumentos en tándem a menudo se refieren como MS-MS o MS². El primer espectrómetro separa péptidos individuales con base en sus diferencias de masa. Al ajustar la fuerza del campo del primer imán, un péptido único puede dirigirse hacia el segundo espectrómetro de masas, donde se generan fragmentos y se determinan sus masas. De manera alternativa, pueden mantenerse en una trampa iónica colocada entre los dos cuadrupolos, y pasarse de manera selectiva a los segundos cuadrupolos en lugar de perderse cuando los primeros cuadrupolos son ajustados para que seleccionen iones de una masa diferente.

La espectrometría de masas en tándem puede usarse para efectuar pruebas en muestras de sangre provenientes de recién nacidos para detectar la presencia y las concentraciones de aminoácidos, ácidos grasos y otros metabolitos. Las anormalidades de las concentraciones de metabolitos pueden servir como indicadores diagnósticos para diversos trastornos genéticos, como fenilcetonuria, encefalopatía con acidemia etilmalónica y acidemia glutárica tipo 1.

El objetivo de la proteómica es identificar la totalidad de proteínas elaboradas por una célula en diversas condiciones

Si bien se conoce la secuencia del genoma humano, el cuadro proporcionado por la genómica sola es tanto estático como incompleto. A medida que los genes se activan y desactivan, se sintetizan proteínas en tipos de células particulares en momentos específicos del crecimiento o la diferenciación, así como en respuesta a estímulos externos. Las células musculares expresan proteínas no expresadas por células neurales, y el tipo de subunidades presente en el tetrámero de hemoglobina pasa por cambios antes y después del parto. Muchas proteínas pasan por modificaciones postraduccionales durante la maduración hacia formas competentes desde el punto de vista funcional, o como un medio de regular sus propiedades. Por ende, el conocimiento del genoma humano sólo representa el inicio de la tarea de describir organismos vivos en detalle molecular, así como entender la dinámica de procesos como crecimiento, envejecimiento y enfermedad. Dado que el cuerpo humano contiene miles de tipos de células, cada una de las cuales contiene miles de proteínas, el proteoma —el conjunto de todas las proteínas expresadas por una célula individual en un momento particular— representa un blanco en movimiento de formidables dimensiones.

La determinación simultánea de cientos de proteínas es técnicamente desafiante

Un objetivo de la proteómica es la identificación de proteínas cuya magnitud de expresión se correlaciona con eventos de importancia médica. Se presume que las proteínas cuya aparición o desaparición se asocia con un estado fisiológico o una enfermedad específico están enlazadas, de manera sea directa o indirecta, a sus causas y mecanismos originales. Si bien los investigadores han desarrollado múltiples herramientas para detectar y evaluar la presencia y las cantidades de proteínas seleccionadas usando anticuerpos, valoraciones de enzimas, etc., su especificidad las hizo poco idóneas para determinar simultáneamente cientos o miles de proteínas en una muestra biológica típica. Las valoraciones de la concentración de proteína, por ejemplo, mediante el método de Lowry o de Bradford, y tinciones como azul Coomassie, si bien son universales, no proporcionan información respecto a la identidad de un polipéptido dado.

En la proteómica de primera generación se empleaba SDS-PAGE o electroforesis bidimensional para resolver una proteína de otra en una muestra biológica, lo cual iba seguido por determinación de la secuencia de aminoácidos de su amino terminal mediante el método de Edman. Las identidades se determinaban al buscar secuencias de polipéptidos disponibles, para proteínas que contenían una secuencia N-terminal que coincidía, y se predecía que poseían un M_r y, para geles 2D, pI, similares.

Estos esfuerzos tempranos quedaron restringidos por el número limitado de secuencias de polipéptidos disponible y las dificultades para aislar polipéptidos en cantidades suficientes para el análisis de Edman a partir de los geles. Los intentos por aumentar el poder de resolución y el rendimiento de muestra al aumentar el tamaño de los geles sólo fueron marginalmente exitosos. Finalmente, el desarrollo de técnicas de espectrometría de masa proporcionó un medio para la determinación de la secuencia de proteínas, cuya sensibilidad fue comparable a la de los métodos de separación electroforética.

El conocimiento de la secuencia del genoma del organismo en cuestión facilitó mucho la identificación al proporcionar un conjunto integral de secuencias de polipéptidos codificadas por DNA. También proporcionó datos sobre la secuencia de nucleótidos a partir de la cual construir arreglos de genes, a veces llamados chips de DNA, que contienen cientos de sondas de oligonucleótido distintas. Estos chips podían usarse entonces para detectar la presencia de mRNA que contenían secuencias de nucleótidos complementarias. Si bien los cambios en la expresión del mRNA que codifica para una proteína no necesariamente reflejan cambios comparables de la concentración de la proteína correspondiente, los chips de genes fueron tanto menos demandantes desde el punto de vista técnico como más sensibles que los métodos proteómicos de primera generación, en particular respecto a proteínas poco abundantes.

La proteómica de segunda generación acopló técnicas cromatográficas de nanoescala recién desarrolladas con la espectrometría de masa. Las proteínas en una muestra biológica primero se tratan con una proteasa para hidrolizarlas hacia péptidos más pequeños que a continuación quedan sujetos a cromatografía de fase revertida, de intercambio iónico, o de exclusión de tamaño, para distribuir el vasto número de péptidos hacia subgrupos más pequeños que se prestan más a análisis. Estos subgrupos se analizaron al inyectar el efluente de la columna directamente en un cuadripolo doble o espectrómetro de masa de tiempo de vuelo. En la tecnología de identificación de proteína multidimensional (MudPIT) se emplean rondas de cromatografía para resolver los péptidos producidos a partir de la digestión de una muestra biológica compleja hacia varias fracciones más simples que pueden analizarse por separado mediante MS.

En la actualidad, la suspensión de mezclas de péptidos complejas dentro del espectrómetro de masa en sí, y la exportación subsiguiente de subgrupos pequeños para el análisis final con el uso de trampas de iones a menudo permite que incluso mezclas complejas se analicen directamente por medio de MS sin fraccionamiento cromatográfico previo. También continúan los esfuerzos por refinar los métodos para el análisis de la expresión de mRNA y de proteína en células individuales.

La bioinformática ayuda a la identificación de funciones de proteínas

En la actualidad se desconocen las funciones de una proporción grande de las proteínas codificadas por el genoma humano. Continúan los esfuerzos por desarrollar arreglos o chips de proteína para probar directamente las funciones potenciales de proteínas en una escala en masa. Sin embargo, si bien las funciones de algunas proteínas son relativamente fáciles de valorar, como la actividad de proteasa o de esterasa, otras son mucho menos manejables. La recolección de datos por medio de bioinformática permite a los investigadores comparar secuencias de aminoácidos de proteínas desconocidas con las de aquellas cuyas funciones se han determinado. Esto proporciona un medio de descubrir indicios respecto a sus propiedades, funciones fisiológicas y mecanismos de acción de proteínas, potenciales. Los algoritmos explotan la tendencia de la Naturaleza a emplear variaciones de un tema estructural para desempeñar funciones similares en varias proteínas (p. ej., el plegamiento de unión a nucleótidos, de Grossman, para unir NAD[P]H; secuencias de direccionamiento nuclear, y manos EF para unir Ca2+). Estos dominios por lo general se detectan en la estructura primaria por conservación de aminoácidos particulares en posiciones clave. De este modo, la información acerca de las propiedades y la función fisiológica de una proteína recién descubierta pueden inferirse al comparar su estructura primaria con la de proteínas conocidas.

• Los polímeros largos de aminoácidos, o polipéptidos, constituyen la unidad estructural básica de las proteínas, y la estructura de una proteína proporciona información acerca de cómo desempeña sus funciones.

• Las proteínas pasan por alteraciones postraduccionales durante su vida, que influyen sobre su función y determinan su destino.

• Al generar un nuevo amino terminal, el reactivo de Edman permitió la determinación de segmentos largos de secuencia de aminoácidos.

• Los geles de poliacrilamida proporcionan una matriz porosa para separar proteínas con base en su movilidad en un campo eléctrico de corriente continua aplicada.

• La proporción casi constante a la cual el detergente aniónico SDS se une a proteínas permite que la SDS-PAGE separe polipéptidos de manera predominante con base en el tamaño relativo.

• Dado que la masa es una propiedad universal de todas las biomoléculas y sus derivados, la MS ha surgido como una técnica versátil aplicable a la determinación de la estructura primaria, la identificación de modificaciones postraduccionales, y la detección de anormalidades metabólicas.

• La clonación de DNA, junto con la química de proteína, proporcionó un método híbrido que aumentó mucho la rapidez y la eficiencia para la determinación de estructuras primarias de proteínas.

• La genómica, la determinación de secuencias de polinucleótidos enteras, proporciona a los investigadores un esbozo de todas las macromoléculas codificadas genéticamente.

• En el análisis proteómico se utilizan datos genómicos para identificar la totalidad de proteínas en una muestra biológica a partir de datos parciales de secuencia de aminoácidos obtenidos al acoplar métodos de separación de proteínas y péptidos con secuenciación mediante MS.

• Un objetivo importante de la proteómica es la identificación de proteínas y de sus modificaciones postraduccionales, cuya aparición o desaparición se correlaciona con fenómenos fisiológicos, el envejecimiento, o enfermedades específicas.

• Bioinformática se refiere al desarrollo de algoritmos de computadora diseñados para inferir las propiedades funcionales de macromoléculas por medio de la comparación de secuencias de proteínas nuevas, con otras cuyas propiedades se conocen.