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La proteína altamente purificada es esencial para el examen detallado de sus propiedades físicas y funcionales. Las células contienen miles de proteínas distintas, cada una en cantidades ampliamente variables. Así, el aislamiento de una proteína específica en cantidades suficientes para analizar sus propiedades plantea un formidable desafío que puede requerir la aplicación sucesiva de múltiples técnicas de purificación. La precipitación selectiva explota diferencias de la solubilidad relativa de proteínas individuales en función del pH (precipitación isoeléctrica), la polaridad (precipitación con etanol o con acetona), o la concentración de sal (separación de sustancias disueltas al añadir sulfato de amonio a la solución). Las técnicas cromatográficas separan una proteína de otra con base en la diferencia de su tamaño (cromatografía de exclusión de tamaño), la carga (cromatografía de intercambio iónico), hidrofobicidad (cromatografía de interacción hidrofóbica), o capacidad para unirse a un ligando específico (cromatografía de afinidad).
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Cromatografía de columna
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En la cromatografía de columna la matriz de fase estacionaria consta de cuentas pequeñas cargadas en un recipiente cilíndrico de vidrio, plástico o acero llamado una columna. Fritas permeables a líquido confinan las cuentas dentro de este espacio mientras que permiten que el líquido de fase móvil fluya o se filtre a través de la columna. Por medio de procedimientos químicos se pueden preparar derivados de las cuentas de fase estacionaria para cubrir su superficie con los grupos ácido, básico, hidrofóbico o tipo ligando requeridos para cromatografía de intercambio iónico, de interacción hidrofóbica, o de afinidad. A medida que el líquido de fase móvil sale de la columna, es recolectado de manera automática en una serie de porciones pequeñas llamadas fracciones. En la figura 4-2 se describe la disposición básica de un sistema de cromatografía sencillo para mesa de trabajo.
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HPLC, cromatografía líquida de alta presión
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Para la cromatografía en columna de primera generación las matrices constaban de polímeros de oligosacárido entrelazados, largos, conformados hacia cuentas esféricas de aproximadamente una décima de milímetro de diámetro. Por desgracia, su tamaño relativamente grande perturbaba el flujo de fase móvil y limitaba el área de superficie disponible. La reducción del tamaño de las partículas ofreció el potencial de aumentar mucho la resolución. Sin embargo, la resistencia creada por la matriz más estrechamente empacada requirió el uso de presiones muy altas que aplastarían las cuentas de polisacárido blandas y esponjosas y materiales similares, por ejemplo, polisacáridos y acrilamida. Finalmente, se crearon métodos para manufacturar partículas de silicón del tamaño y la forma necesarios para preparar derivados de su superficie con diversos grupos funcionales, y para empacarlas en columnas de acero inoxidable capaces de soportar presiones de varios miles de libras por pulgada (psi). Debido a su mayor poder de resolución, los sistemas de cromatografía líquida de alta presión han desplazado en su mayor parte las columnas de vidrio alguna vez familiares en el laboratorio de purificación de proteína.
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Cromatografía de exclusión de tamaño
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En la cromatografía de exclusión de tamaño —o filtración en gel— se separan las proteínas con base en su radio de Stokes, el radio de la esfera que ocupan a medida que entran en solución. El radio de Stokes es una función de la masa y la forma moleculares. Una proteína alargada que cae ocupa un mayor volumen que una proteína esférica de la misma masa. En la cromatografía de exclusión de tamaño se emplean cuentas porosas (figura 4-3). Los poros son análogos a irregularidades en una ribera de río. A medida que los objetos se mueven torrente abajo, los que entran en una irregularidad se retrasan hasta que regresan a la corriente principal. De modo similar, las proteínas con radios de Stokes demasiado grandes como para entrar en los poros (proteínas excluidas) permanecen en la fase móvil que está fluyendo y salen antes que las que pueden entrar en los poros (proteínas incluidas). Así, las proteínas surgen a partir de una columna de filtración en gel en orden descendente de sus radios de Stokes.
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Cromatografía de intercambio iónico
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En la cromatografía de intercambio iónico, las proteínas interactúan con la fase estacionaria mediante interacciones de carga-carga. Las proteínas con una carga positiva neta a un pH dado se adherirán estrechamente a cuentas con grupos funcionales que tienen carga negativa, como carboxilatos o sulfatos (intercambiadores catiónicos). De modo similar, las proteínas con una carga negativa neta se adhieren a cuentas que tienen grupos funcionales con carga positiva, típicamente aminas terciarias o cuaternarias (intercambiadores aniónicos). Las proteínas no adherentes fluyen a través de la matriz y se eliminan por medio de lavado. A continuación, las proteínas unidas son desplazadas de manera selectiva al aumentar gradualmente la fuerza iónica de la fase móvil, lo que debilita interacciones entre una carga y otra. Hay elusión de proteínas en orden inverso de la fuerza de sus interacciones con la fase estacionaria.
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Cromatografía de interacción hidrofóbica
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Separa a proteínas con base en su tendencia a asociarse con una matriz de fase estacionaria cubierta con grupos hidrofóbicos (p. ej., fenil Sepharose, octil Sephadex). Las proteínas que tienen superficies hidrofóbicas expuestas se adhieren a la matriz por medio de interacciones hidrofóbicas que se aumentan mediante una fase móvil de fuerza iónica alta. Las proteínas no adherentes primero se eliminan mediante lavado. A continuación se disminuye la polaridad de la fase móvil al reducir de manera gradual la concentración de sal. Si la interacción entre proteína y fase estacionaria es en particular fuerte, puede añadirse etanol o glicerol a la fase móvil para disminuir su polaridad y debilitar más las interacciones hidrofóbicas.
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Cromatografía de afinidad
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La cromatografía de afinidad explota la alta selectividad de casi todas las proteínas para sus ligandos. Las enzimas pueden purificarse mediante cromatografía de afinidad usando sustratos, productos, coenzimas o inhibidores, inmovilizados. En teoría, sólo las proteínas que interactúan con el ligando inmovilizado se adhieren. A continuación hay elusión de proteínas unidas sea mediante competencia con ligando soluble libre o, de manera menos selectiva, al alterar interacciones entre proteína y ligando al usar urea, clorhidrato de guanidina, pH levemente ácido, o concentraciones altas de sal. Las matrices de fase estacionaria disponibles comercialmente contienen ligandos como análogos de NAD+ o ATP. La purificación de proteínas expresadas de manera recombinante suele facilitarse al modificar el gen clonado para añadir un nuevo dominio de fusión designado para interactuar con un ligando unido a matriz específico (capítulo 7).
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La pureza de las proteínas se evalúa mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE)
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El método más ampliamente usado para determinar la pureza de una proteína es la SDS-PAGE, electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) en presencia del detergente aniónico dodecil sulfato de sodio (SDS). La electroforesis separa biomoléculas cargadas con base en los índices a los cuales migran en un campo eléctrico aplicado; en cuanto a la SDS-PAGE, la acrilamida se polimeriza y se entrecruza para formar una matriz porosa. La SDS se une a proteínas a una proporción de una molécula de SDS por cada dos enlaces peptídicos, lo que causa que el polipéptido se desdoble o se desnaturalice. Cuando es utilizada en forma conjunta con 2-mercaptoetanol o ditiotreitol para reducir enlaces disulfuro y romperlos (figura 4-4), la SDS-PAGE separa los polipéptidos componentes de proteínas multiméricas. El gran número de moléculas de SDS aniónicas, cada una de las cuales porta una carga de −1, abruma las contribuciones de carga de los grupos funcionales aminoácidos endógenos a los polipéptidos. Dado que la proporción entre carga y masa de cada complejo de SDS-polipéptido es más o menos igual, la resistencia física que cada péptido encuentra a medida que se mueve por la matriz de acrilamida determina el índice de migración. Dado que los complejos grandes encuentran mayor resistencia, los polipéptidos se separan con base en su masa molecular relativa (Mr, también conocida como peso molecular). Es factible visualizar polipéptidos individuales atrapados en el gel de acrilamida después de removerlos del campo eléctrico, tiñéndolos con colorantes como azul de Coomassie (figura 4-5).
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Enfoque isoeléctrico (IEF)
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Se usan amortiguadores iónicos llamados anfolitos y un campo eléctrico aplicado para generar un gradiente de pH dentro de una matriz de poliacrilamida. Las proteínas aplicadas migran hasta que llegan a la región de la matriz donde el pH coincide con su punto isoeléctrico (pI), el pH al cual la carga neta de una molécula es cero. El IEF se usa de manera conjunta con SDS-PAGE para la electroforesis bidimensional, que separa polipéptidos con base en el pI en una dimensión y con base en la Mr en la segunda (figura 4-6). La electroforesis bidimensional resulta idónea para separar los componentes de mezclas de proteínas complejas.
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