CAPÍTULO 5: Proteínas: órdenes de estructura superiores

En la Naturaleza, la forma sigue a la función. Para que un polipéptido recién sintetizado madure hacia una proteína que sea funcional desde el punto de vista biológico, capaz de catalizar una reacción metabólica, impulsar el movimiento celular, o formar las varillas y los cables macromoleculares que proporcionan integridad estructural a pelo, huesos, tendones y dientes, debe plegarse hacia una disposición tridimensional específica, conocida como conformación. Además, durante la maduración, las modificaciones postraduccionales pueden añadir nuevos grupos químicos o eliminar segmentos peptídicos transitoriamente necesarios. Las deficiencias genéticas o nutricionales que obstaculizan la maduración de proteínas son nocivas para la salud. Algunos ejemplos de las primeras comprenden enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, encefalopatía espongiforme ovina (scrapie) y bovina (“enfermedad de las vacas locas”) y enfermedad de Alzheimer. Algunos ejemplos de ello incluyen al escorbuto (ácido ascórbico) y el síndrome de Menkes (Cu). La nueva generación de agentes terapéuticos para hepatitis C y otras enfermedades virales busca bloquear la maduración de las proteínas codificadas viralmente mediante inhibir la actividad de las ciclofilinas —una familia de isomerasas peptidilproteínas cis-trans—.

A menudo, los términos “configuración” y “conformación” son confundidos entre sí. Configuración alude a la relación geométrica entre un grupo dado de átomos, por ejemplo, los que distinguen entre L-aminoácidos y D-aminoácidos. La interconversión de alternativas configuracionales requiere el rompimiento (y reformación) de enlaces covalentes. Por otra parte, conformación se refiere a la relación espacial de cada átomo en una molécula. La interconversión entre conformadores ocurre sin rotura de enlace covalente, con retención de la configuración y, de manera típica, por medio de rotación alrededor de enlaces únicos.

En su primer enfoque, los científicos abordaron las relaciones entre estructura y función en proteínas mediante separarlas en clases con base en propiedades como solubilidad, forma o la presencia de grupos no proteínicos. Así, por ejemplo, las proteínas que pueden ser extraídas de las células usando soluciones acuosas a pH fisiológico y fuerza iónica son clasificadas como solubles. La extracción de proteínas de membrana integrales requiere disolución de la membrana con detergentes. Las proteínas globulares son moléculas compactas, de forma más o menos esférica, con proporciones axiales (la proporción entre sus dimensiones más corta y más larga) de no más de 3. Casi todas las enzimas son proteínas globulares. En contraste, muchas proteínas estructurales adoptan conformaciones muy extendidas; tales proteínas fibrosas poseen proporciones axiales de 10 o más.

Las lipoproteínas y glucoproteínas contienen lípidos y carbohidrato unido de manera covalente, respectivamente. La mioglobina, la hemoglobina, los citocromos y muchas otras metaloproteínas contienen iones metálicos estrechamente asociados. Si bien han surgido métodos de clasificación más precisos con base en la similitud, u homología, en la secuencia y la estructura tridimensional de aminoácidos, aún se usan muchos términos de clasificación antiguos.

Las proteínas desempeñan complejas funciones físicas y catalíticas al colocar grupos químicos específicos en una disposición tridimensional precisa. El andamio polipeptídico que contiene estos grupos debe adoptar una conformación tanto eficiente desde el punto de vista funcional como fuerte en el aspecto físico. A primera vista, la biosíntesis de polipéptidos comprendidos en decenas de miles de átomos individuales parecería en extremo desafiante. Cuando se considera que un polipéptido típico puede adoptar ≥ 10⁵⁰ conformaciones distintas, el plegado hacia la conformación apropiada para su función biológica parecería ser aún más difícil. Como se explica en los capítulos 3 y 4, en la síntesis de los esqueletos polipeptídicos de proteínas se emplea un pequeño grupo de bloques de construcción comunes o módulos, los aminoácidos, unidos por una conexión común, el enlace peptídico. De manera similar, una vía modular por pasos simplifica el plegado y el procesamiento de polipéptidos recién sintetizados hacia proteínas maduras.

La naturaleza modular de la síntesis y el plegado de proteína están incorporados en el concepto de órdenes de estructura de proteína: estructura primaria, la secuencia de los aminoácidos en una cadena polipeptídica; estructura secundaria, el plegado de segmentos de polipéptido cortos (3 a 30 residuos) y contiguos, hacia unidades ordenadas de manera geométrica; estructura terciaria, el montaje de unidades estructurales secundarias hacia unidades funcionales de mayor tamaño como el polipéptido maduro y los dominios que lo componen y, por último, estructura cuaternaria, el número y los tipos de unidades polipeptídicas de proteínas oligoméricas y su disposición espacial.

Los enlaces peptídicos restringen conformaciones secundarias posibles

La rotación libre sólo es posible alrededor de dos de los tres enlaces covalentes del esqueleto polipeptídico: el carbono α (Cα) al carbono carbonilo (Co), y el Cα al enlace de nitrógeno (figura 3-9). El carácter de doble enlace parcial del enlace peptídico que une el Co al nitrógeno α requiere que el carbono carbonilo, el oxígeno carbonilo y el nitrógeno α permanezcan coplanares, lo que evita la rotación. El ángulo alrededor del enlace de Cα—N recibe el nombre de ángulo fi (Ф), mientras que aquel ubicado alrededor del enlace de Co—Cα es el ángulo psi (ψ). En péptidos, para aminoácidos que no son glicina, casi ninguna combinación de ángulos fi y psi se permite debido a obstáculo estérico (figura 5-1). Las conformaciones de prolina son aún más restringidas debido a la ausencia de rotación libre del enlace N—Cα.

Las regiones de estructura secundaria ordenada surgen cuando una serie de residuos aminoacilo adoptan ángulos fi y psi similares. Los segmentos extendidos (p. ej., asas) de polipéptidos llegan a poseer diversos ángulos de ese tipo. Los ángulos que definen los dos tipos más frecuentes de estructura secundaria, la hélice α y la hoja β, caen dentro de los cuadrantes inferior y superior izquierdos de un gráfico de Ramachandran, respectivamente (figura 5-1).

Hélice α

El esqueleto polipeptídico de una hélice α está torcido una cantidad igual alrededor de cada carbono α con un ángulo fi de aproximadamente −57° y un ángulo psi de alrededor de −47°. Un giro completo de la hélice contiene un promedio de 3.6 residuos aminoacilo y la distancia que sube por cada giro (su pendiente) es de 0.54 nm (figura 5-2). Los grupos R de cada residuo aminoacilo en una hélice α miran hacia afuera (figura 5-3). Las proteínas sólo contienen L-aminoácidos, para los cuales una hélice α diestra es con mucho la más estable, y en las proteínas sólo hay hélices α diestras. En los diagramas esquemáticos de proteínas se representa a las hélices α como espirales o cilindros.

La estabilidad de una hélice α proviene sobre todo de enlaces (puentes) de hidrógeno formados entre el oxígeno del enlace peptídico del grupo carbonilo y el átomo de hidrógeno del grupo amino (que contiene nitrógeno) del enlace peptídico del cuarto residuo en dirección descendente por la cadena de polipéptido (figura 5-4). La capacidad para formar el número máximo de enlaces de hidrógeno, complementada por interacciones de Van der Waals en el centro de esta estructura estrechamente apretada, brinda la fuerza impulsora termodinámica para la formación de una hélice α. Dado que el nitrógeno del enlace peptídico de prolina carece de un átomo de hidrógeno, es incapaz de formar un enlace de hidrógeno con un oxígeno carbonilo. Así, la prolina sólo puede adaptarse de manera estable dentro del primer giro de una hélice α. Cuando está presente en otro sitio, la prolina altera la conformación de la hélice y produce una flexión. Debido a que posee un pequeño grupo R, la glicina a menudo también induce flexiones en hélices α.

En muchas hélices α tienen grupos predominantemente R hidrofóbicos proyectados desde un lado del eje de la hélice y grupos predominantemente R hidrofílicos proyectados desde el otro lado. Estas hélices anfipáticas están bien adaptadas a la formación de interfases entre regiones polares y no polares como el interior hidrofóbico de una proteína y su ambiente acuoso. Las agrupaciones de hélices anfipáticas pueden crear un canal, o poro, que permite que moléculas polares específicas pasen a través de membranas celulares hidrofóbicas.

Hoja β

Es la segunda (de ahí su denominación “β”) estructura secundaria regular reconocible en las proteínas. Los residuos aminoácidos de una hoja β, cuando se observan de canto, forman un modelo en zigzag o plisado en el cual los grupos R de residuos adyacentes apuntan en direcciones opuestas. A diferencia del esqueleto compacto de la hélice α, el esqueleto peptídico de la hoja β está muy extendido; sin embargo, al igual que la hélice α, gran parte de la estabilidad de las hojas β se deriva de enlaces de hidrógeno entre los oxígenos carbonilo y los hidrógenos amida de enlaces peptídicos. En contraste con la hélice α, estos enlaces se forman con segmentos adyacentes de hoja β (figura 5-5).

Las hojas β que interactúan pueden disponerse para formar una hoja β paralela, en la cual los segmentos adyacentes de la cadena polipeptídica proceden en la misma dirección amino hacia carbonilo, o una hoja antiparalela, en la cual proceden en direcciones opuestas (figura 5-5). Una u otra configuración permite el número máximo de enlaces de hidrógeno entre segmentos, o hebras de la hoja. Casi ninguna hoja β es perfectamente plana, sino que tiende a mostrar una torsión hacia la derecha. Las agrupaciones de hebras torcidas de hoja β forman el centro de muchas proteínas globulares (figura 5-6). En diagramas esquemáticos se representa a las hojas β como flechas que apuntan en la dirección amino hacia carboxilo terminal.

Asas y flexiones

A grandes rasgos, la mitad de los residuos en una proteína globular “típica” reside en hélices α u hojas β, y la otra mitad en asas, giros, flexiones y otras características conformacionales extendidas. “Giros y flexiones” alude a segmentos cortos de aminoácidos que unen dos unidades de estructura secundaria, como dos hebras adyacentes de una hoja β antiparalela. Un giro β comprende cuatro residuos aminoacilo, en los cuales el primer residuo está enlazado con hidrógeno al cuarto, lo que da por resultado una vuelta de 180° cerrada (figura 5-7). La prolina y la glicina a menudo están presentes en giros β.

Las asas son regiones que contienen residuos más allá del número mínimo necesario para conectar regiones adyacentes de estructura secundaria; sin embargo, las asas, que tienen conformación irregular, desempeñan funciones biológicas clave. Para muchas enzimas, las asas que forman puentes entre dominios encargados de la unión de sustratos a menudo contienen residuos aminoacilo que participan en catálisis. Los motivos de hélice-asa-hélice proporcionan la porción de unión a oligonucleótido de muchas proteínas de unión a DNA como represores y factores de transcripción. Los motivos estructurales, como el motivo de hélice-asa-hélice que son intermedios entre estructuras secundarias y terciarias, a menudo se denominan estructuras supersecundarias. Dado que muchas asas y flexiones residen sobre la superficie de proteínas y, así, quedan expuestas a solvente, constituyen sitios fácilmente accesibles, o epítopos, para reconocimiento y unión de anticuerpos.

Si bien las asas carecen de regularidad estructural manifiesta, muchas adoptan una conformación específica estabilizada por medio de formación de enlaces de hidrógeno, puentes salinos, e interacciones hidrofóbicas con otras porciones de la proteína; sin embargo, no todas las porciones de proteínas están necesariamente ordenadas. Las proteínas pueden contener regiones “desordenadas”, a menudo en el extremo amino o carboxilo terminal, caracterizadas por una alta flexibilidad conformacional. En muchos casos, estas regiones desordenadas adoptan una conformación ordenada en el momento de unión de un ligando. Tal flexibilidad estructural permite que dichas regiones actúen como conmutadores controlados por ligando que afectan la estructura y la función de proteínas.

Estructura terciaria y cuaternaria

El término “estructura terciaria” se refiere a toda la conformación tridimensional de un polipéptido. Indica, en espacio tridimensional, de qué modo las características estructurales secundarias —hélices, hojas, flexiones, giros y asas— se montan para formar dominios, y cómo estos últimos se relacionan desde el punto de vista espacial entre sí. Un dominio es una sección de estructura proteínica suficiente para desempeñar una tarea química o física particular, como la unión de un sustrato u otro ligando. Casi todos los dominios son de naturaleza modular, contiguos tanto en secuencia primaria como en espacio tridimensional (figura 5-8). Las proteínas simples, en particular las que interactúan con un sustrato único, como lisozima o triosa fosfato isomerasa (figura 5-6), y la proteína de almacenamiento de oxígeno mioglobina (capítulo 6), a menudo constan de un dominio único. En contraste, la lactato deshidrogenasa comprende dos dominios, un dominio de unión a NAD⁺ N terminal, y un dominio de unión a C terminal para el segundo sustrato, piruvato (figura 5-8). La lactato deshidrogenasa es una de la familia de oxidorreductasas que comparten un dominio de unión a NAD(P)⁺ N terminal, conocido como el pliegue de Rossmann. Al fusionar el módulo del pliegue de Rossmann a diversos dominios C terminal, ha evolucionado una gran familia de oxidorreductasas que utilizan NAD(P)⁺/NAD(P)H para la oxidación y reducción de una amplia gama de metabolitos. Los ejemplos son alcohol deshidrogenasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, malato deshidrogenasa, quinona oxidorreductasa, 6-fosfogluconato deshidrogenasa, D-glicerato deshidrogenasa, formato deshidrogenasa y 3α, 20β-hidroxiesteroide deshidrogenasa.

No todos los dominios unen sustratos. Los dominios de membrana hidrofóbicos fijan proteínas a membranas o les permiten abarcar membranas. Las secuencias de localización dirigen proteínas hacia ubicaciones subcelulares o extracelulares específicas, como el núcleo, las mitocondrias, vesículas secretoras, etc. Los dominios reguladores desencadenan cambios de la función de proteína en respuesta a la unión de efectores alostéricos o modificaciones covalentes (capítulo 9). Combinar el código del material genético de los módulos de dominio individuales proporciona una ruta fácil para generar proteínas de gran complejidad estructural y funcional (figura 5-9).

Las proteínas que contienen múltiples dominios también pueden montarse por medio de la asociación de múltiples polipéptidos o protómeros. La estructura cuaternaria define la composición polipeptídica de una proteína y, para una proteína oligomérica, las relaciones espaciales entre sus protómeros o subunidades. Las proteínas monoméricas constan de una cadena polipeptídica única; las proteínas diméricas contienen dos cadenas polipeptídicas. Los homodímeros contienen dos copias de la misma cadena polipeptídica, mientras que en un heterodímero los polipéptidos difieren. Se usan letras griegas (α, β, γ, etc.) para distinguir diferentes subunidades de una proteína heterooligomérica, en tanto que los números en subíndice indican el número de cada tipo de subunidad. Por ejemplo, α₄ designa una proteína homotetramérica, y α₂b₂γ una proteína con cinco subunidades de tres tipos diferentes.

Dado que incluso las proteínas pequeñas contienen muchos miles de átomos, las representaciones de la estructura de proteínas que indican la posición de cada átomo por lo general son demasiado complejas como para interpretarlas con facilidad. De este modo, se usan diagramas esquemáticos simplificados para representar características clave de las estructuras terciaria y cuaternaria de una proteína. Los diagramas de cinta (figuras 5-6 y 5-8) trazan la conformación del esqueleto polipeptídico; cilindros y flechas indican regiones de una hélice α y una hoja β, respectivamente. En una representación aún más simple, segmentos de línea que enlazan los carbonos α de cada residuo de aminoácido indican la trayectoria del esqueleto polipeptídico. Tales diagramas esquemáticos a menudo incluyen las cadenas laterales de aminoácidos seleccionados que recalcan relaciones específicas entre estructura y función.

Los órdenes superiores de la estructura de proteínas se estabilizan de manera primordial —y a menudo de forma exclusiva— por medio de interacciones no covalentes. Entre éstas, las principales son interacciones hidrofóbicas que impulsan casi todas las cadenas laterales de aminoácidos hidrofóbicas hacia el interior de la proteína y las protegen contra el agua. Otros contribuidores importantes comprenden enlaces de hidrógeno y puentes salinos entre los carboxilatos de ácidos aspártico y glutámico, y las cadenas laterales con carga opuesta de residuos lisilo, arginilo e histidilo protonados. Tales interacciones son individualmente débiles, 1 a 5 kcal/mol, en comparación con un enlace covalente típico de 80 a 120 kcal/mol; sin embargo, del mismo modo que en un cierre de Velcro se aprovecha la fuerza acumulativa de múltiples asas y ganchos de plástico, en conjunto estas muchas interacciones débiles individualmente confieren un alto grado de estabilidad a la conformación funcional desde el punto de vista biológico de una proteína.

Algunas proteínas contienen enlaces disulfuro covalentes (S—S) que enlazan los grupos sulfhidrilo de residuos cisteinilo. La formación de enlaces disulfuro comprende oxidación de los grupos cisteinilo sulfhidrilo y requiere oxígeno. Los enlaces disulfuro intrapolipeptídicos aumentan más la estabilidad de la conformación plegada de un péptido, mientras que los enlaces disulfuro interpolipeptídicos estabilizan la estructura cuaternaria de ciertas proteínas oligoméricas.

Cristalografía con rayos X

Después de que en 1960 John Kendrew solucionó la estructura tridimensional de la mioglobina, la cristalografía con rayos X reveló las estructuras de miles de macromoléculas biológicas que van desde proteínas hasta oligonucleótidos y virus. En la solución de esta estructura por medio de cristalografía con rayos X, una proteína se precipita primero en condiciones que forman cristales bien ordenados. Para establecer condiciones apropiadas, en estudios de cristalización se usan algunos microlitros de solución de proteína, y una matriz de variables (temperatura, pH, presencia de sales o solutos orgánicos como polietilén glicol) a fin de establecer condiciones óptimas para la formación de cristales. El primer paso es radiar cristales montados en capilares de cuarzo con rayos X monocromáticos de longitud de onda aproximada de 0.15 nm para confirmar que son proteína, no sal. A continuación los cristales de proteína se pueden congelar en nitrógeno líquido para recolección subsiguiente de un grupo de datos de alta resolución. Los modelos formados mediante los rayos X que son difractados por los átomos en su trayectoria se registran sobre una placa fotográfica o su equivalente en computadoras como un modelo circular de puntos de intensidad variable. A continuación los patrones son grabados electrónicamente utilizando un detector de área y se analizan los datos inherentes en estas manchas usando un método matemático llamado una síntesis de Fourier, que suma las funciones de onda. Las amplitudes de onda se relacionan con la intensidad de la mancha, pero dado que las ondas no están secuenciadas, es necesario determinar la relación entre sus fases a fin de extrapolar las posiciones de los átomos que han alcanzado el patrón de difracción.

En el método tradicional para la solución del “problema de fase” se emplea desplazamiento isomorfo. Antes de la radiación, un átomo, con una “firma” de rayos X distintiva, se introduce en un cristal en posiciones conocidas en la estructura primaria de la proteína. En el desplazamiento isomorfo de átomo pesado por lo general se usa mercurio o uranio, que se une a residuos cisteína. En un método alternativo se utiliza la expresión de proteínas recombinantes codificadas por plásmido, en las cuales el selenio reemplaza al azufre de la metionina. En la expresión se usa un huésped bacteriano auxotrófico para la biosíntesis de metionina y un medio definido en el cual la selenometionina reemplaza a la metionina. De manera alternativa, si la estructura desconocida es similar a una que ya se ha resuelto, el reemplazo molecular en un modelo existente proporciona una manera atractiva de secuenciar los datos sin el uso de átomos pesados. Por último, los resultados de las secuencias y las sumas de Fourier proporcionan un perfil de densidad de electrones o mapa tridimensional de cómo los átomos se conectan o relacionan entre sí.

La capacidad de algunas enzimas cristalizadas para catalizar reacciones químicas sugiere de manera firme que las estructuras determinadas mediante cristalografía son, de hecho, representativas de las estructuras presentes en solución libre.

Espectroscopia con resonancia magnética nuclear (NMR)

Es un importante complemento para la cristalografía con rayos X y mide la absorbancia de energía electromagnética de radiofrecuencia por ciertos núcleos atómicos. Los isótopos “activos en NMR” de elementos importantes desde el punto de vista biológico comprenden ¹H, ¹³C, ¹⁵N y ³¹P. La frecuencia, o desviación química, a la cual un núcleo particular absorbe energía está en función tanto del grupo funcional dentro del cual reside, como de la proximidad de otros núcleos activos en la NMR. Alguna vez limitados a metabolitos y macromoléculas relativamente pequeñas, ≤ 30 kDa, en la actualidad es posible analizar proteínas y complejos proteínicos de > 100 kDa mediante NMR. La espectroscopia con NMR bidimensional permite construir una representación tridimensional de una proteína al determinar la proximidad de estos núcleos a otro. En la espectroscopia con NMR se analizan proteínas en una solución acuosa, lo cual no sólo obvia la necesidad de formar cristales (una ventaja particular cuando se trata con proteínas de membrana difíciles de cristalizar), sino que también hace posible la observación en tiempo real de los cambios de conformación que acompañan a la unión a ligando o catálisis. También ofrece la posibilidad de que algún día logre observarse la estructura y la dinámica de proteínas (y metabolitos) dentro de células vivas.

Microscopia por crioelectrones

El desarrollo del microscopio en la década de 1600-1610 por Van Leeuwenhoek desencadenó una revolución en la Biología. Por primera vez los científicos pudieron obtener imágenes bidimensionales que revelaron la verdadera naturaleza celular del tejido vivo y la existencia de organismos microbianos. Sin embargo, la resolución de los análisis microscópicos estaba limitada por la relativamente larga longitud de onda de las fuentes de radiación electromagnética disponibles, por lo general la luz visible (4−7 × 10⁻⁷ m). Mediante cubrir la dispersión de los materiales en una unicapa con acetato de uranilo u otros compuestos que contienen metales pesados, el microscopio electrónico (EM) logró generar una proyección de imágenes bidimensional a una resolución de unos cuantos Angstroms mediante utilizar electrones de alta energía con longitudes de onda de 1 − 10 × 10⁻¹² m.

Aunque la visualización que se obtiene con un EM es lo bastante alta como para permitir apreciar virus y complejos macromoleculares, la exposición a descargas de electrones de alta energía destruye con rapidez los materiales orgánicos, como proteínas y polinucleótidos. El microscopio por crioelectrones (crio-EM) extiende la resolución de EM a materiales biológicos mediante emplear agentes criogénicos —como nitrógeno líquido y helio líquido— para proteger de la destrucción a los materiales orgánicos. Aunque aún no alcanza la resolución a nivel atómico de la cristalografía con rayos X y la espectroscopia NMR, la capacidad de la crio-EM para visualizar macromoléculas individuales permite una buena definición y análisis de sus complejos y estados conformacionales. Más aún, su resolución macromolecular permite que la crio-EM sea empleada en el análisis de los componentes individuales de muestras heterogéneas, en tanto que la cristalografía y la NMR requieren muestras muy grandes y altamente purificadas.

Modelado molecular

Un adjunto cada vez más útil para la determinación empírica de la estructura tridimensional de proteínas es el uso de tecnología de computadora para modelado molecular. Cuando se conoce la estructura tridimensional, es factible utilizar programas de dinámica molecular para simular la dinámica conformacional de una proteína, y la manera en la cual factores como temperatura, pH, fuerza iónica o sustituciones de aminoácidos influyen sobre estos movimientos. Los programas de acoplamiento molecular simulan las interacciones que tienen lugar cuando una proteína se encuentra con un sustrato, inhibidor u otro ligando. La investigación virtual para moléculas que tienen probabilidades de interactuar con sitios clave sobre una proteína de interés biomédico se usa de manera extensa con el fin de facilitar el descubrimiento de nuevos fármacos.

El modelado molecular también se emplea para inferir la estructura de proteínas para las cuales aún no se dispone de estructuras cristalográficas con rayos X o NMR. Los algoritmos de estructuras secundarias sopesan la propensión de residuos específicos a quedar incorporados hacia hélices α u hojas β en proteínas ya estudiadas para predecir la estructura secundaria de otros polipéptidos. En el modelado de homología, la estructura tridimensional conocida de una proteína se usa como una plantilla sobre la cual erigir un modelo de la estructura probable de una proteína relacionada. Los científicos están trabajando para idear programas de computadora que predecirán de manera fiable la conformación tridimensional de una proteína de manera directa a partir de su secuencia primaria, lo que permitirá determinar las estructuras de muchas de las proteínas desconocidas para las cuales en la actualidad se carece de plantillas.

Las proteínas son moléculas dinámicas desde el punto de vista conformacional que pueden plegarse hacia su conformación competente desde el punto de vista funcional en un marco de tiempo de milisegundos. Más aún, a menudo pueden volver a plegarse si su conformación queda alterada, un proceso conocido como renaturalización. ¿De qué modo se logra este notorio proceso de plegado? En la Naturleza, el plegado hacia el estado natural ocurre demasiado rápido como para ser producto de una búsqueda desordenada de todas las estructuras posibles. Las proteínas desnaturalizadas no son sólo espirales al azar; los contactos naturales son favorecidos y regiones de la estructura natural prevalecen incluso en el estado desnaturalizado. A continuación se comentan los factores que facilitan el plegado y la recuperación del mismo en las proteínas, así como los conceptos actuales relacionados.

La conformación natural de una proteína es favorecida desde el punto de vista termodinámico

El número de combinaciones distintas de ángulos fi y psi que especifican conformaciones potenciales de incluso un polipéptido hasta cierto punto pequeño —15 kDa— es asombrosamente vasto. Las proteínas se guían a través de este vasto laberinto de posibilidades mediante la termodinámica. Dado que la conformación relevante desde el punto de vista biológico —o natural— de una proteína por lo general es la que resulta más favorecida desde el punto de vista energético, el conocimiento de la conformación natural está especificado en la secuencia primaria. No obstante, si se esperara que un polipéptido encontrara su conformación natural mediante exploración al azar de todas las conformaciones posibles, el proceso requeriría miles de millones de años para completarse; queda claro que en la Naturaleza el plegado de proteína en células tiene lugar de una manera más ordenada y guiada.

El plegado es modular

El plegado de proteínas por lo general ocurre mediante un proceso por pasos. En la primera etapa, a medida que el polipéptido recién sintetizado surge a partir del ribosoma, segmentos cortos se pliegan hacia unidades estructurales secundarias que proporcionan regiones locales de estructura organizada; el plegado ahora se reduce a la selección de una disposición apropiada de este número relativamente pequeño de elementos estructurales secundarios. En la segunda etapa, las regiones hidrofóbicas se segregan hacia el interior de la proteína, lejos del solvente, lo que forma un “glóbulo fundido”, un polipéptido parcialmente plegado en el cual los módulos de estructura secundaria se reordenan hasta que se logra la conformación madura de la proteína. Este proceso es ordenado, mas no rígido; hay considerable flexibilidad en las formas y el orden en el cual los elementos de estructura secundaria pueden reordenarse. En general, cada elemento de estructura secundaria o supersecundaria facilita el plegado apropiado al dirigir el proceso de plegado hacia la conformación natural y lo aleja de las alternativas no productivas. En el caso de proteínas oligoméricas, los protómeros individuales tienden a plegarse antes de que se asocien con otras subunidades.

Proteínas auxiliares ayudan al plegado

En condiciones de laboratorio apropiadas, muchas proteínas volverán a plegarse de manera espontánea después de ser desnaturalizadas (esto es, desdobladas) mediante tratamiento con ácido o base, agentes caotrópicos o detergentes. Sin embargo, la restitución del plegado en estas circunstancias es lenta —de minutos a horas—. Más aún, algunas proteínas no vuelven a plegarse de manera espontánea in vitro y a menudo forman agregados insolubles, complejos desordenados de polipéptidos desdoblados o parcialmente plegados que se sostienen juntos principalmente mediante interacciones hidrofóbicas. Los agregados representan callejones sin salida no productivos en el proceso de plegado. Las células emplean proteínas auxiliares para acelerar el proceso de plegado y guiarlo hacia una conclusión productiva.

Chaperones

Las proteínas chaperón participan en el plegado de más de la mitad de las proteínas de mamíferos. La familia de chaperones hsp70 (proteína de choque por calor de 70 kDa) se une a secuencias cortas de aminoácidos hidrofóbicos que emergen mientras un nuevo polipéptido está siendo sintetizado, lo que los protege contra solvente. Los chaperones evitan la agregación; de este modo, proporcionan una oportunidad para la formación de elementos estructurales secundarios apropiados y su coalescencia subsiguiente hacia un glóbulo fundido. La familia de chaperones hsp60, a veces llamada chaperoninas, difiere en secuencia y estructura de hsp70 y sus homólogos; así, hsp60 actúa más tarde en el proceso de plegado, a menudo junto con un chaperón hsp70. La cavidad central del chaperón hsp60 en forma de rosquilla, proporciona un ambiente protegido en el cual un polipéptido puede plegarse hasta que todas las regiones hidrofóbicas están sepultadas en su interior, lo que previene cualquier tendencia hacia la agregación.

Proteína disulfuro isomerasa

Los enlaces disulfuro entre polipéptidos y dentro de los mismos estabilizan las estructuras terciaria y cuaternaria. El proceso se inicia por la enzima proteín-sulfhidril-oxidasa, el cual cataliza la oxidación de los residuos de cisteína para formar enlaces disulfuro. Sin embargo, la formación de enlace disulfuro es inespecífica, una cisteína dada puede formar un enlace disulfuro con cualquier residuo cisteinilo accesible. Al catalizar el intercambio de disulfuro, la rotura de un enlace S—S y su reformación con una diferente cisteína compañera, la disulfuro isomerasa de proteína, facilita la formación de enlaces disulfuro y estabiliza la conformación natural de una proteína. Dado que varias oxidasas eucarióticas sulfhidrilo son dependientes de flavina, la deficiencia de riboflavina en la dieta a menudo es acompañada de un incremento en la incidencia de un mal plegado de las proteínas que contienen disulfuro.

Prolina-cis, trans-isomerasa

Todos los enlaces peptídicos X-Pro —donde X representa cualquier residuo— se sintetizan en la configuración trans. Sin embargo, de los enlaces X-Pro de proteínas maduras, alrededor de 6% es cis. La configuración cis es en particular frecuente en giros β. La isomerización desde trans hacia cis es catalizada por la enzima prolina-cis, trans-isomerasa, una familia de enzimas también conocidas como ciclofilinas (figura 5-10). Además de promover la maduración de las proteínas naturales, las ciclofilinas también participan en el plegamiento de las proteínas expresadas por invasores virales. En consecuencia, las ciclofilinas son un objetivo en el desarrollo de fármacos como la ciclosporina y Alisporivir para el tratamiento del HIV, la hepatitis C y otras enfermedades transmitidas por virus.

El plegado es un proceso dinámico

Las proteínas son moléculas dinámicas desde el punto de vista conformacional, mismas que se pueden plegar y desdoblar cientos o miles de veces durante su lapso de vida. ¿De qué modo las proteínas, una vez desdobladas, se vuelven a plegar y restituyen su conformación funcional? En primer lugar, el desdoblamiento rara vez lleva a la aleatorización completa de la cadena polipeptídica dentro de la célula. Las proteínas desdobladas por lo general retienen varios contactos y regiones de estructura secundaria que facilitan el proceso de reaparición del plegado. En segundo lugar, las proteínas chaperón pueden “rescatar” proteínas desdobladas que han quedado atrapadas en el aspecto termodinámico en un callejón sin salida con plegado erróneo, al desdoblar regiones hidrofóbicas y proporcionar una segunda oportunidad para que se plieguen de manera productiva. El glutatión puede reducir enlaces disulfuro inapropiados que quizá se formen al momento de la exposición a agentes oxidantes, como O₂, peróxido de hidrógeno o superóxido (capítulo 54).

Priones

Las encefalopatías espongiformes transmisibles, o enfermedades por prión, son enfermedades neurodegenerativas mortales caracterizadas por cambios espongiformes, gliomas astrocíticos y pérdida neuronal originada por el depósito de agregados proteínicos insolubles en células neurales. Comprenden la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob en humanos, encefalopatía espongiforme en ovejas y encefalopatía espongiforme en el ganado vacuno (enfermedad de las vacas locas). Una forma variante de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, la vCJD, misma que afecta a pacientes más jóvenes, se relaciona con trastornos psiquiátricos y conductuales de inicio temprano. Las enfermedades por prión llegan a manifestarse como trastornos infecciosos, genéticos o esporádicos. Dado que es imposible identificar un gen viral o bacteriano que codifica la proteína prión patológica, la fuente y el mecanismo de transmisión de la enfermedad por prión permanecieron sin determinarse durante mucho tiempo.

Hoy es reconocido que las enfermedades por prión son trastornos de conformación de proteína que se transmiten al alterar la conformación y, por ende, las propiedades físicas, de proteínas endógenas para el huésped. La proteína relacionada con prión, PrP, de seres humanos, una glucoproteína codificada en el brazo corto del cromosoma 20, en circunstancias normales es monomérica y rica en hélice α. Las proteínas prión patológicas sirven como las plantillas para la transformación conformacional de la PrP normal, conocida como PrPc (celular), hacia PrPsc (“scrapie”); esta última es rica en hojas β con muchas cadenas laterales aminoacilo hidrofóbicas expuestas a solvente. A medida que se forma cada nueva molécula de PrPsc, desencadena la producción de aún más variantes patológicas en una reacción en cadena conformacional. Dado que las moléculas de PrPsc se relacionan con fuerza entre sí por medio de sus regiones hidrofóbicas expuestas, las unidades de PrPsc que se están acumulando muestran coalescencia y forman agregados resistentes a proteasa insolubles. Puesto que un prión o una proteína relacionada con prión patológico pueden servir como la plantilla para la transformación conformacional de muchas veces su número de moléculas de PrPc, las enfermedades por prión pueden transmitirse mediante la proteína sola sin afección del DNA o el RNA.

Enfermedad de Alzheimer

La reaparición del plegado o el plegado erróneo de otra proteína endógena al tejido cerebral de humanos, el amiloide β, es una característica notoria de la enfermedad de Alzheimer. Si bien la causa principal de dicha enfermedad aún no se ha dilucidado, las placas seniles y los heces neurofibrilares característicos contienen agregados de la proteína amiloide β, polipéptido de 4.3 kDa producido por división proteolítica de una proteína de mayor tamaño conocida como proteína precursora amiloide. En pacientes con enfermedad de Alzheimer, las cifras de amiloide β aumentan, y esta proteína pasa por una transformación conformacional desde un estado rico en hélice α soluble hacia un estado abundante en hoja β y propenso a la autoagregación. La apolipoproteína E ha quedado comprendida como un mediador potencial de esta transformación conformacional.

Talasemias β

Las talasemias se producen por defectos genéticos que alteran la síntesis de una de las subunidades polipeptídicas de la hemoglobina (capítulo 6). En el transcurso del brote de síntesis de hemoglobina que ocurre durante el desarrollo de eritrocitos, un chaperón específico llamado proteína estabilizadora de hemoglobina α (o proteína estabilizante de cadena alfa) (AHSP) se une a subunidades α de hemoglobina libres en espera de incorporación hacia el multímero de hemoglobina. En ausencia de este chaperón, las subunidades de hemoglobina α libres se agregan y el precipitado resultante tiene efectos tóxicos sobre el eritrocito en desarrollo. Investigaciones en ratones modificados desde el punto de vista genético sugieren una participación para la AHSP en la modulación de la gravedad de la talasemia β en humanos.

La maduración de proteína a menudo comprende la formación y la rotura de enlaces covalentes

La maduración de proteínas hacia su estado estructural final a menudo comprende la división o formación (o ambas) de enlaces covalentes, un proceso de modificación postraduccional. Muchos polipéptidos en un inicio se sintetizan como precursores de mayor tamaño llamados proproteínas. Los segmentos polipeptídicos “extra” en estas proteínas a menudo sirven como secuencias líder que dirigen un polipéptido hacia un organelo particular o facilitan su paso a través de una membrana. Otros segmentos aseguran que la actividad en potencia perjudicial de una proteína —como las proteasas tripsina y quimotripsina—, permanezca inhibida en tanto estas proteínas lleguen a su destino final. Sin embargo, una vez que se satisfacen esos requerimientos transitorios, las regiones peptídicas ahora superfluas se eliminan mediante proteólisis selectiva. Quizá tengan lugar otras modificaciones covalentes que añaden nuevas funcionalidades químicas a una proteína. La maduración del colágeno ilustra ambos procesos.

El colágeno es una proteína fibrosa

El colágeno es la más abundante de las proteínas fibrosas y constituye más de 25% de la masa proteínica en el organismo humano; otras proteínas fibrosas importantes son la queratina y la miosina. Dichas proteínas fibrosas representan una fuente primaria de fuerza estructural para las células (esto es, el citoesqueleto) y los tejidos. La flexibilidad y la fuerza de la piel dependen de una red entrelazada de fibras de colágeno y queratina, mientras que los huesos y los dientes son apuntalados por una red subyacente de fibras de colágeno análogas a los filamentos de acero en el concreto reforzado. El colágeno también está presente en tejidos conjuntivos, como ligamentos y tendones. El alto grado de resistencia a la tracción necesario para satisfacer estas funciones estructurales requiere proteínas alargadas, las cuales se caracterizan por secuencias de aminoácidos repetitivas y una estructura secundaria regular.

El colágeno forma una triple hélice singular

El tropocolágeno, la unidad de repetición de una fibra de colágeno madura, consta de tres polipéptidos de colágeno, cada uno de los cuales contiene alrededor de 1 000 aminoácidos, agrupados en una conformación singular, la triple hélice de colágeno (figura 5-11). Una fibra de colágeno madura forma una varilla alargada con una proporción axial de alrededor de 200. Tres hebras polipeptídicas entrelazadas, que se tuercen hacia la izquierda, se envuelven entre sí en dirección hacia la derecha para formar la triple hélice de colágeno. La lateralidad opuesta de esta superhélice y sus polipéptidos componentes hacen que la triple hélice de colágeno sea muy resistente al desdoblamiento —el mismo principio usado en cables de acero de puentes colgantes—. Una triple hélice de colágeno tiene 3.3 residuos por giro y una elevación por cada residuo de cerca de dos veces la de una hélice α. Los grupos R de cada hebra polipeptídica de la triple hélice se aprietan de manera tan estrecha que, para que se ajusten, uno debe ser H, de modo que cada tercer residuo aminoácido en el colágeno es un residuo glicina. El escalonamiento de las tres hebras proporciona una colocación apropiada de las glicinas requisito en toda la hélice. El colágeno también tiene alto contenido de prolina e hidroxiprolina, lo que da un modelo Gli-X-Y repetitivo (figura 5-11), en el cual la Y por lo general es prolina o hidroxiprolina.

Las triples hélices de colágeno se estabilizan mediante enlaces de hidrógeno entre residuos en diferentes cadenas polipeptídicas, proceso auxiliado por los grupos hidroxilo de residuos hidroxiprolilo. Enlaces covalentes formados entre residuos lisilo modificados tanto dentro de cadenas polipeptídicas como entre las mismas, proporcionan estabilidad adicional.

El colágeno se sintetiza como un precursor de mayor tamaño

El colágeno en un inicio se sintetiza como un polipéptido precursor de mayor tamaño, el procolágeno. Muchos residuos prolilo y lisilo de procolágeno se hidroxilan mediante la prolilo hidroxilasa y la lisilo hidroxilasa, enzimas que requieren ácido ascórbico (vitamina C; capítulos 27 y 44). Los residuos hidroxiprolilo e hidroxilisilo proporcionan capacidad adicional de formación de enlaces de hidrógeno que estabiliza la proteína madura. Además, las glucosilo y galactosilo transferasas fijan residuos glucosilo o galactosilo a los grupos hidroxilo de residuos hidroxilisilo específicos.

La porción central del polipéptido precursor se asocia entonces con otras moléculas y forma la triple hélice característica; dicho proceso va acompañado de la eliminación del amino terminal globular y de extensiones carboxilo terminales del polipéptido precursor mediante proteólisis selectiva. La lisilo oxidasa, proteína que contiene cobre, que convierte grupos є-amino en aldehídos, modifica ciertos residuos lisilo. Los aldehídos pueden pasar por una condensación de aldol para formar un doble enlace C=C, o para formar una base de Schiff (eneimina) con el grupo є-amino de un residuo lisilo no modificado, que después se reduce y forma un enlace C—N único. Estos enlaces covalentes unen los polipéptidos individuales y confieren a la fibra fuerza y rigidez excepcionales.

Los trastornos nutricionales y genéticos pueden alterar la maduración del colágeno

La compleja serie de eventos en la maduración del colágeno proporciona un modelo que ilustra las consecuencias biológicas de la maduración incompleta de polipéptidos. El defecto mejor conocido de la biosíntesis de colágeno es el escorbuto, un resultado de una deficiencia en la dieta de vitamina C requerida por las prolilo y lisilo hidroxilasas. El déficit resultante del número de residuos hidroxiprolina e hidroxilisina socava la estabilidad conformacional de las fibras de colágeno, lo que lleva a encías sangrantes, hinchazón de articulaciones, cicatrización inadecuada de heridas y por último la muerte. El síndrome de Menkes, caracterizado por pelo rizado y retraso del crecimiento, refleja una deficiencia en la dieta del cobre requerido por la lisilo oxidasa, que cataliza un paso clave en la formación de enlaces covalentes que fortalecen las fibras de colágeno.

Los trastornos genéticos de la biosíntesis de colágeno comprenden varias formas de osteogénesis imperfecta, la cual se distingue por la presencia de huesos frágiles. En el síndrome de Ehlers-Danlos, un grupo de trastornos del tejido conjuntivo que comprenden alteración de la integridad de las estructuras de apoyo, defectos en los genes que codifican para el colágeno-1, procolágeno N-peptidasa o lisilo hidroxilasa, dan por resultado articulaciones móviles y anormalidades de la piel (capítulo 50).

• Las proteínas pueden clasificarse con base en su solubilidad, forma o función, o según la presencia de un grupo prostético, como hem.

• La estructura primaria codificada por gen de un polipéptido es la secuencia de sus aminoácidos. Su estructura secundaria se produce por plegado de polipéptidos hacia motivos con enlaces de hidrógeno, como la hélice α, la hoja plegada β, flexiones β y asas. Las combinaciones de estos motivos pueden formar motivos supersecundarios.

• La estructura terciaria alude a las relaciones entre dominios estructurales secundarios. La estructura cuaternaria de proteínas que tienen dos o más polipéptidos (proteínas oligoméricas) se refiere a las relaciones espaciales entre diversos tipos de polipéptidos.

• Las estructuras primarias se estabilizan por medio de enlaces peptídicos covalentes. Los órdenes de estructura superiores se estabilizan mediante fuerzas débiles —enlaces de hidrógeno múltiples, enlaces salinos (electrostáticos) y asociación de grupos R hidrofóbicos—.

• El ángulo fi (Ф) de un polipéptido es el ángulo alrededor del enlace C_α—N; el ángulo psi (ψ) es el que hay alrededor del enlace C_α—C_o. Casi todas las combinaciones de ángulos fi-psi son denegadas debido a obstaculización estérica. Los ángulos fi-psi que forman la hélice α y la hoja β caen dentro de los cuadrantes inferior y superior izquierdos de un gráfico de Ramachandran, respectivamente.

• Aún hay poca comprensión en cuanto al proceso del plegado de proteína. En términos generales, los segmentos cortos de polipéptidos recién sintetizados se pliegan hacia unidades estructurales secundarias. Las fuerzas que sepultan regiones hidrofóbicas desde el solvente después impulsan al polipéptido parcialmente plegado hacia un “glóbulo fundido” en el cual los módulos de estructura secundaria se reordenan para dar la conformación natural de la proteína.

• Las proteínas que ayudan al plegado comprenden la proteína disulfuro isomerasa, prolina-cis, trans-isomerasa y los chaperones que participan en el plegado de más de la mitad de las proteínas de mamífero. Los chaperones protegen contra solvente a los polipéptidos recién sintetizados, además de que proporcionan un ambiente para que elementos de la estructura secundaria surjan y muestren coalescencia para formar glóbulos fundidos.

• Investigadores biomédicos están trabajando para desarrollar agentes que interfieran con el plegamiento de proteínas virales y priones, como fármacos para el tratamiento de hepatitis C y una gama de trastornos neurodegenerativos.

• La cristalografía de rayos X y el NMR son técnicas clave utilizadas para estudiar órdenes superiores de la estructura proteínica.

• Aunque no tiene el nivel de resolución de la cristalografía con rayos X o la NMR, la crio-EM ha demostrado ser una poderosa herramienta para analizar las dinámicas macromoleculares de las macromoléculas biológicas en muestras heterogéneas.

• Los priones —partículas de proteína que carecen de ácido nucleico— causan encefalopatías espongiformes transmisibles y mortales, como la enfermedad de Creutzfeldt–Jakob o las encefalopatías espongiformes ovina y bovina. Las enfermedades por prión comprenden una estructura secundaria-terciaria alterada de una proteína natural, la PrPc. Cuando esta última interactúa con su isoforma patológica, PrPSc, su conformación se transforma desde una estructura predominantemente helicoidal α hacia la estructura con hoja β característica de la PrPSc.

• El colágeno ilustra el estrecho enlace entre la estructura de proteínas y la función biológica. Las enfermedades de la maduración del colágeno comprenden el síndrome de Ehlers-Danlos y el escorbuto, la enfermedad por deficiencia de vitamina C.