CAPÍTULO 7: Enzimas: mecanismo de acción

Las enzimas, que catalizan las reacciones químicas que hacen posible la vida sobre la Tierra, participan en la desintegración de nutrientes para proporcionar energía y bloques de construcción químicos; el montaje de esos bloques de construcción hacia proteínas, DNA, membranas, células y tejidos, así como la utilización de energía para impulsar la motilidad celular, la función neural y la contracción muscular. Casi todas las enzimas son proteínas. Las excepciones notables son los RNA ribosomales y un puñado de moléculas de RNA con actividad de endonucleasa o de nucleótido ligasa conocidas en conjunto como ribozimas. La capacidad para detectar y cuantificar la actividad de enzimas específicas en la sangre, otros líquidos tisulares, o extractos de células proporciona información que complementa la capacidad del médico para diagnosticar muchas enfermedades y predecir su pronóstico. Otras aplicaciones médicas comprenden cambios de la cantidad o de la actividad catalítica de enzimas clave que puede ser el resultado de defectos genéticos, déficits nutricionales, daño de tejido, toxinas o infección por virus o bacterias patógenos (p. ej., Vibrio cholerae). Los científicos médicos abordan desequilibrios de la actividad enzimática al usar fármacos para inhibir enzimas específicas y están investigando la terapia génica como un medio para remediar déficit de la concentración de enzimas o la función de las mismas.

Además de servir como los catalizadores para todos los procesos metabólicos, su impresionante actividad catalítica, especificidad para sustrato y estereoespecificidad permiten a las enzimas desempeñar funciones clave en otros procesos relacionados con la salud y el bienestar de las personas. Las proteasas y amilasas aumentan la capacidad de los detergentes para eliminar suciedad y colorantes, las enzimas tienen importancia en la producción de productos alimenticios o el aumento del valor nutriente de los mismos tanto para humanos como para animales. Por ejemplo, la proteasa quimosina (renina) se utiliza en la producción de quesos, mientras que la lactasa es empleada para eliminar lactosa de la leche y beneficiar a quienes sufren intolerancia a la lactosa por deficiencia de esta enzima hidrolítica. Finalmente, los catalíticos enzima estereoespecíficos pueden ser en particular valiosos en la biosíntesis de fármacos o antibióticos complejos.

Las enzimas que catalizan la conversión de uno o más compuestos (sustratos) hacia uno o más compuestos diferentes (productos) aumentan los índices de la reacción no catalizada correspondiente por factores de al menos 10⁶. Al igual que todos los catalizadores, las enzimas no se consumen ni se alteran de manera permanente como consecuencia de su participación en una reacción. Además de ser muy eficientes, las enzimas también son catalizadores en extremo selectivos. Al contrario de casi todos los catalizadores usados en química sintética, las enzimas son específicas tanto para el tipo de reacción catalizada como para un sustrato único o un pequeño conjunto de sustratos estrechamente relacionados. Las enzimas también son catalizadores estereoespecíficos y de manera típica catalizan reacciones de sólo un estereoisómero de un compuesto dado (p. ej., azúcares D, mas no L; aminoácidos de L pero no D). Dado que se unen a sustratos por medio de al menos “tres puntos de fijación”, las enzimas incluso pueden convertir sustratos no quirales en productos quirales. En la figura 7-1 se ilustra por qué la reducción catalizada por enzima del sustrato no quiral piruvato produce sólo l-lactato (en lugar de una mezcla racémica de d- y l-lactato). La especificidad extrema de los catalíticos enzima confiere a las células vivas la capacidad para conducir de manera simultánea y controlar de modo independiente una amplia gama de procesos químicos.

Aún se usan algunos de los nombres para enzimas descritos por vez primera durante los días más tempranos de la bioquímica, por ejemplo pepsina, tripsina y amilasa. Sin embargo, en la mayor parte de los casos los primeros bioquímicos designaron a las enzimas recién descubiertas al añadir primero el sufijo -asa a un descriptor para el tipo de reacción catalizada. Por ejemplo, las enzimas que eliminan átomos de hidrógeno por lo general se denominan deshidrogenasas, las enzimas que hidrolizan proteínas, proteasas, en tanto que las enzimas que catalizan reordenamientos de la configuración, isomerasas. El proceso se completó al agregar a estos descriptores generales términos que indican el sustrato sobre el cual actúa la enzima (xantina oxidasa), su fuente (ribonucleasa pancreática), su modo de regulación (lipasa sensible a hormona), o un dato característico de su mecanismo de acción (cisteína proteasa). Cuando es necesario, se añaden letras o números para identificar múltiples formas de una enzima (p. ej., RNA polimerasa III; proteína cinasa Cβ).

Si bien es simple y sencillo, a medida que se descubrieron más enzimas estas convenciones tempranas para asignar nombres dieron lugar cada vez más a la aparición de múltiples nombres para la misma enzima y duplicación en la asignación de nombre a enzimas que mostraban capacidades catalíticas similares.

A fin de resolver estas dificultades, la International Union of Biochemists (IUB) creó un sistema de nomenclatura de enzimas sin ambigüedad en el cual cada enzima tiene un nombre y número de código singular que identifican el tipo de reacción catalizada y los sustratos comprendidos; así, las enzimas se agrupan en seis clases:

1. Oxidorreductasas: catalizan oxidaciones y reducciones.

2. Transferasas: catalizan la transferencia de porciones, como grupos glucosilo, metilo o fosforilo.

3. Hidrolasas: catalizan la división hidrolítica de C—C, C—O, C—N y otros enlaces.

4. Liasas: catalizan la división de C—C, C—O, C—N y otros enlaces covalentes mediante eliminación de átomo, dejando dobles enlaces.

5. Isomerasas: catalizan cambios geométricos o estructurales dentro de una molécula.

6. Ligasas: catalizan la unión de dos moléculas en reacciones acopladas a la hidrólisis de ATP.

El nombre de la hexocinasa según la IUB es ATP:D-hexosa 6-fosfotransferasa. E.C. 2.7.1.1; dicho nombre identifica a la hexocinasa como un miembro de la clase 2 (transferasas), subclase 7 (transferencia de un grupo fosforilo), subsubclase 1 (el alcohol es el aceptor de fosforilo), y “hexosa-6” indica que el alcohol fosforilado está en el carbón 6 de una hexosa. A pesar de su claridad, los nombres establecidos por la IUB son largos y hasta cierto punto engorrosos, de modo que en general se sigue haciendo referencia a la hexocinasa y muchas otras enzimas por sus nombres tradicionales, aunque a veces ambiguos. Por otro lado, los números E.C. son en particular útiles para diferenciar enzimas que tienen funciones o actividades catalíticas similares, según se ilustra por su utilización en los capítulos de la sección VI.

Muchas enzimas contienen pequeñas moléculas no proteínicas y iones metálicos que participan de manera directa en la unión de sustrato o en la catálisis. Denominados grupos prostéticos, cofactores y coenzimas, éstos extienden el repertorio de capacidades catalíticas más allá de las proporcionadas por el número limitado de grupos funcionales presentes en las cadenas laterales aminoacilo de péptidos.

Los grupos prostéticos están estrechamente integrados en la estructura de una enzima

Los grupos prostéticos se distinguen por su incorporación estrecha y estable hacia la estructura de una proteína mediante fuerzas covalentes o no covalentes. Los ejemplos son fosfato de piridoxal, flavina mononucleótido (FMN), flavina adenina dinucleótido (FAD), pirofosfato de tiamina y biotina. Los iones metálicos son el grupo prostético más común; cerca de un tercio de todas las enzimas que contienen iones metálicos unidos Fe, Co, Cu, Mg, Mn y Znreciben el nombre de metaloenzimas. Los iones metálicos que participan en reacciones redox por lo general forman complejos con grupos prostéticos como el hem (capítulos 6 y 31) o agrupaciones de hierro-azufre (capítulo 12). Los metales también pueden facilitar la unión y orientación de sustratos, la formación de enlaces covalentes con intermediarios de reacción (Co²⁺ en la coenzima B₁₂, capítulo 44), o al actuar como ácidos de Lewis o bases para hacer los sustratos más electrofílicos (con pocos electrones) o nucleofílicos (ricos en electrones) y, por tanto, más reactivos.

Los cofactores se asocian de manera reversible con enzimas o sustratos

Los cofactores pueden asociarse de manera directa con la enzima o en forma de un complejo de cofactor-sustrato. Si bien los cofactores desempeñan funciones similares a las de los grupos prostéticos, se unen de una manera transitoria, disociable. Por ende, al contrario de los grupos prostéticos asociados, para que ocurra catálisis debe haber cofactores en el medio que rodea a la enzima. Los cofactores más comunes también son iones metálicos. Las enzimas que requieren un cofactor ion metálico se llaman enzimas activadas por metal para distinguirlas de las metaloenzimas para las cuales los iones metálicos sirven como grupos prostéticos.

Muchas coenzimas, cofactores y grupos prostéticos son derivados de vitaminas B

Las vitaminas B hidrosolubles proporcionan componentes importantes de muchas coenzimas. La nicotinamida es un componente de las coenzimas redox NAD y NADP (figura 7-2), mientras que la riboflavina es un componente de las coenzimas redox FMN y FAD. El ácido pantoténico es un componente del acarreador de grupo acilo, coenzima A. Como su pirofosfato, la tiamina participa en la descarboxilación de α-cetoácidos, y las coenzimas ácido fólico y cobamida funcionan en el metabolismo de un carbono. Además, varias coenzimas contienen las porciones adenina, ribosa y fosforilo del AMP o el ADP (figura 7-2).

Las coenzimas sirven como transbordadores de sustrato

Las coenzimas sirven como transbordadores reciclables que transportan muchos sustratos de un punto a otro dentro de la célula. Estos transbordadores tienen doble función: en primer lugar, estabilizan especies, como átomos de hidrógeno (FADH) o iones híbridos (NADH) que son demasiado reactivos como para persistir durante cualquier tiempo importante en presencia del agua o las moléculas orgánicas que permean células. En segundo lugar, sirven como un adaptador o mango que facilita el reconocimiento y la unión de grupos químicos pequeños, como el acetato (coenzima A) o la glucosa (UDP), por sus enzimas blanco. Otras porciones químicas transportadas por coenzimas son grupos metilo (folatos) y oligosacáridos (dolicol).

Una importante información de principios del siglo xx acerca de la catálisis enzimática provino de la observación de que la presencia de sustratos hace a las enzimas más resistentes a los efectos desnaturalizantes de las temperaturas altas. Dicha observación llevó a Emil Fischer a proponer que las enzimas y sus sustratos interactúan para formar un complejo de enzima-sustrato (ES) cuya estabilidad térmica fue mayor que la de la enzima en sí. Este conocimiento impactó de manera profunda sobre la comprensión tanto de la naturaleza química como de la conducta cinética de la catálisis enzimática.

Fischer razonó que la especificidad en extremo alta con la cual las enzimas distinguen sus sustratos cuando están formando un complejo de ES era análoga a la manera en la cual una cerradura mecánica distingue la llave apropiada. La analogía para las enzimas es que la “cerradura” está formada por una hendidura o una bolsa en la superficie de la proteína que forma parte de una región llamada el sitio activo (figuras 5-6 y 5-8). Como lo indica el adjetivo “activo”, el sitio activo es mucho más que simplemente un sitio de reconocimiento para la unión de sustratos, pues provee el entorno necesario en el que la transformación química tiene lugar. Dentro del sitio activo, los sustratos son acercados estrechamente uno a otro en la alineación óptima con los cofactores, grupos prostéticos y cadenas laterales de aminoácidos que se encargan de catalizar su transformación química en productos (figura 7-3). La catálisis es aumentada más por la capacidad del sitio activo para proteger sustratos contra agua y generar un ambiente cuya polaridad, hidrofobicidad, acidez o alcalinidad puede diferir de manera notoria de la que hay en el citoplasma circundante.

Las enzimas usan diversas combinaciones de cuatro mecanismos generales para lograr notorio aumento catalítico de los índices de reacciones químicas.

Catálisis por proximidad

Para que las moléculas reaccionen, deben acercarse hasta ubicarse dentro de la distancia formadora de enlace de otra. Mientras más alta sea su concentración, con mayor frecuencia se encontrarán una con otra y mayor será el índice de su reacción.

Cuando una enzima se une a moléculas de sustrato en su sitio activo, crea una región de concentración local alta de sustrato en la cual las moléculas de sustrato están orientadas en una posición ideal para que interactúen químicamente. Esto se traduce en aumentos de al menos 1 000 veces de la tasa en comparación con la misma reacción no catalizada por enzima.

Catálisis acidobásica

Además de contribuir a la capacidad del sitio activo para unirse a sustratos, los grupos funcionales ionizables de cadenas laterales aminoacilo, y cuando están presentes, de grupos prostéticos, pueden contribuir a la catálisis al actuar como ácidos o bases. Se distinguen dos tipos de catálisis acidobásica. Catálisis específica para ácido o base se refiere a reacciones para las cuales el único ácido o base participante son protones o iones hidróxido. El índice de reacción es sensible a cambios de la concentración de protones, pero independiente de las concentraciones de otros ácidos (donadores de protón) o bases (aceptores de protón) presentes en solución o en el sitio activo. Se dice que las reacciones cuyos índices muestran capacidad de respuesta a todos los ácidos o bases presentes, están sujetas a catálisis por ácido general o por base general.

Catálisis por tensión

Las enzimas que catalizan reacciones líticas, transformaciones químicas que comprenden el rompimiento de un enlace covalente, típicamente se unen a sus sustratos en una conformación que es un poco desfavorable para el enlace que sufrirá la división. Tal conformación tensa imita la del intermediario de estado de transición, especie transitoria que representa la transición o el punto medio en la transformación de sustratos en productos. La tensión resultante estira o deforma el enlace al cual se dirige; esto lo debilita y lo hace más vulnerable a división. Linus Pauling, laureado con el premio Nobel, fue el primero en sugerir una función para la estabilización de estado de transición como un mecanismo general mediante el cual las enzimas aceleran los índices de reacciones químicas. Los químicos a menudo aprovechan el conocimiento del estado de transición de una reacción catalizada por enzima para diseñar y crear inhibidores de enzima más eficaces, llamados análogos de estado de transición, como farmacóforos potenciales.

Catálisis covalente

El proceso de catálisis covalente comprende la formación de un enlace covalente entre la enzima y uno o más sustratos. La enzima modificada después se convierte en un reactivo. La catálisis covalente introduce una nueva vía de reacción cuya energía de activación es más baja —y, por ende, es más rápida— que la vía de reacción en solución homogénea. Sin embargo, el estado químico modificado de la enzima es transitorio; en el momento en que se completa la reacción, la enzima vuelve a su estado no modificado original. De este modo, su función permanece catalítica. La catálisis covalente se observa con particular frecuencia entre enzimas que catalizan reacciones de transferencia de grupo. Los residuos sobre la enzima que participa en la catálisis covalente por lo general son cisteína o serina y, en ocasiones, histidina. La catálisis covalente a menudo sigue un mecanismo de “ping-pong”: uno en donde el primer sustrato es unido y su producto se libera antes de la unión del segundo sustrato (figura 7-4).

Si bien el “modelo de cerradura y llave” de Fischer permitió comprender la especificidad extrema de interacciones entre enzima y sustrato, la rigidez implícita del sitio activo de la enzima no explicó los cambios dinámicos que acompañan a la unión de sustrato y la catálisis. Esta desventaja fue abordada por el modelo de adaptación inducida de Daniel Koshland, que declara que cuando los sustratos se aproximan y se unen a una enzima, inducen un cambio conformacional, una modificación análoga a colocar una mano (sustrato) dentro de un guante (enzima) (figura 7-5). Un corolario es que la enzima induce cambios recíprocos en sus sustratos y aprovecha la energía de unión para facilitar la transformación de sustratos en productos. El modelo de adaptación inducida se ha confirmado de manera amplia por medio de estudios biofísicos de movimiento de enzimas durante unión a sustrato.

Las enzimas de la familia de la proteasa aspártica, que incluye la enzima digestiva pepsina, las catepsinas lisosómicas y la proteasa producida por el virus de inmunodeficiencia humana (HIV), comparten un mecanismo catalítico común que emplea dos residuos aspartilo conservados, que actúan como catalíticos acidobásicos. En la primera etapa de la reacción, un aspartato que está funcionando como una base general (Asp X, figura 7-6) extrae un protón de una molécula de agua, lo que la hace más nucleofílica. El nucleófilo resultante después ataca al carbono carbonilo electrofílico del enlace peptídico establecido como objetivo para hidrólisis, lo que forma un intermediario de estado de transición tetraédrico. A continuación, un segundo aspartato (Asp Y, figura 7-6) facilita la descomposición de este intermediario tetraédrico al donar un protón al grupo amino producido por la rotura del enlace peptídico. Los dos aspartatos de sitio activo pueden actuar de manera simultánea como una base general o como un ácido general porque su ambiente inmediato favorece la ionización de uno, no así del otro.

Quimotripsina

Si bien la catálisis por proteasas aspárticas involucra el ataque hidrolítico directo de agua sobre un enlace peptídico, la catálisis por la serina proteasa quimotripsina comprende la formación previa de un intermediario de enzima acilo covalente. Un residuo serilo conservado, la serina 195, es activado vía las interacciones con histidina 57 y aspartato 102. Muy separados en la estructura primaria, en el sitio activo de la proteína madura estos residuos están dentro de la distancia formadora de enlace de otro. Alineados en el orden Asp 102-His 57-Ser 195, este trío conforma una “red de transmisión de carga” que funciona como un “transbordador de protón”.

La unión de sustrato inicia desviaciones de protón que, en efecto, transfieren el protón hidroxilo de Ser 195 a Asp 102 (figura 7-7). La nucleofilicidad aumentada del oxígeno serilo facilita su ataque sobre el carbono carbonilo del enlace peptídico del sustrato, lo que forma un intermediario de acilo-enzima covalente. El protón en Asp 102 a continuación se transborda a través de His 57 hacia el grupo amino que es liberado cuando el enlace peptídico se divide. La porción del péptido original con un grupo amino libre después deja el sitio activo y es reemplazada por una molécula de agua. La red de transmisión de carga ahora activa la molécula de agua al extraer un protón a través de His 57 hacia Asp 102. El ion hidróxido resultante ataca el intermediario acilo-enzima y un transbordador de protón inverso regresa un protón a Ser 195, lo que restituye su estado original. Si bien se modifica durante el proceso de catálisis, la quimotripsina surge sin cambios en el momento en que se completa la reacción. Las proteasas tripsina y elastasa emplean un mecanismo catalítico similar, pero los números de los residuos en sus transbordadores de protón Ser-His-Asp difieren.

Fructosa-2,6-bisfosfatasa

Es una enzima reguladora de la gluconeogénesis (capítulo 19) y cataliza la liberación hidrolítica del fosfato en el carbono 2 de la fructosa-2,6-bisfosfato. En la figura 7-8 se ilustran las funciones de siete residuos de sitio activo. La catálisis comprende una “tríada catalítica” de un residuo Glu y dos residuos His, y un intermediario fosfohistidilo covalente.

Los miembros de una familia de enzimas como las aspártico o serina proteasas emplean un mecanismo similar para catalizar un tipo de reacción común, pero actúan sobre diferentes sustratos. Casi todas las familias de enzimas surgieron por medio de eventos de duplicación de gen que crean una segunda copia del gen que codifica para una enzima particular. Los dos genes —y en consecuencia sus proteínas codificadas— pueden evolucionar entonces de manera independiente y formar homólogos divergentes que reconocen diferentes sustratos. El resultado se ilustra por la quimotripsina, que divide enlaces peptídicos en el lado carboxilo terminal de aminoácidos hidrofóbicos grandes, y la tripsina, que divide enlaces peptídicos en el lado carboxilo terminal de aminoácidos básicos. Se dice que las proteínas que divergieron desde un ancestro común son homólogas entre sí. La ascendencia común de enzimas puede inferirse a partir de la presencia de aminoácidos específicos en la misma posición en cada miembro de la familia; se dice que estos residuos son residuos conservados. En el cuadro 7-1 se ilustra la conservación estructural primaria de dos componentes de la red de transmisión de carga para varias serinas proteasas. Entre los residuos más conservados figuran los que participan de manera directa en la catálisis.

Los organismos superiores a menudo elaboran varias versiones de una enzima dada distintas desde el punto de vista físico, cada una de las cuales cataliza la misma reacción. Al igual que los miembros de otras familias de proteína, estos catalíticos de proteína o isozimas surgen por medio de duplicación de gen. Si bien las proteasas antes descritas tienen diferentes sustratos, las isozimas pueden poseer diferencias sutiles en propiedades como sensibilidad a factores reguladores particulares (capítulo 9) o afinidad por sustrato (p. ej., hexocinasa y glucocinasa) que las adaptan a tejidos o circunstancias específicos, más que a distintas especificidades de sustrato. Las isozimas que catalizan la reacción idéntica también pueden mejorar la supervivencia al proporcionar una copia de “respaldo” de una enzima esencial.

Las cantidades relativamente pequeñas de enzimas presentes en células complican la determinación de su presencia y concentración; sin embargo, la amplificación conferida por su capacidad para transformar con rapidez miles de moléculas de un sustrato específico en producto confiere a cada enzima la capacidad para revelar su presencia. Las valoraciones de la actividad catalítica de enzimas a menudo se usan en laboratorios de investigación y clínicos. En condiciones apropiadas (capítulo 8), el índice de la reacción catalítica que se está monitoreando es proporcional a la cantidad de enzima presente, lo cual permite inferir su concentración.

Enzimología de molécula única

La sensibilidad limitada de las valoraciones enzimáticas tradicionales exige el uso de un grupo grande —o conjunto— de moléculas de enzima para producir cantidades de producto medibles. Los datos obtenidos de este modo reflejan la actividad promedio de enzimas individuales a través de múltiples ciclos de catálisis. Avances recientes en nanotecnología han hecho posible observar —por lo general mediante microscopia de fluorescencia— eventos catalíticos que implican enzima y molécula de sustrato individuales. En consecuencia, los científicos ahora tienen la posibilidad de medir el índice de eventos catalíticos únicos y, en ocasiones, los pasos individuales en la catálisis por medio de un proceso llamado enzimología de molécula única, un ejemplo del cual se presenta en la figura 7-9.

El descubrimiento de fármacos requiere valoraciones enzimáticas idóneas para investigación de “alta capacidad de procesamiento”

Las enzimas constituyen una de las clases primarias de biomoléculas dirigidas para la creación de fármacos y otros agentes terapéuticos; por ejemplo, muchos antibióticos inhiben enzimas que son singulares para microbios patógenos. El descubrimiento de nuevos fármacos se facilita mucho cuando es posible valorar un gran número de farmacóforos potenciales de una manera rápida y automatizada, proceso denominado investigación de alta capacidad de procesamiento (HTS). En el HTS se aprovechan avances recientes en robótica, óptica, procesamiento de datos y microfluídica para efectuar y analizar muchos miles de valoraciones simultáneas de la actividad de una enzima dada. En los dispositivos de investigación de alta capacidad de procesamiento de uso más frecuente se emplean volúmenes de 100 μL en placas de plástico con 96, 384 o 1 536 pozos, y equipo por completo automatizado capaz de surtir sustratos, coenzimas, enzimas e inhibidores potenciales en una multiplicidad de combinaciones y concentraciones. La investigación de alta capacidad de procesamiento es ideal para analizar los muchos productos de química combinacional, la síntesis simultánea de grandes bibliotecas de compuestos químicos que contienen todas las combinaciones posibles de un conjunto de precursores químicos. Las valoraciones enzimáticas que producen un producto cromogénico o fluorescente son ideales, puesto que los detectores ópticos se elaboran con facilidad mediante procedimientos de ingeniería para permitir el análisis rápido de múltiples muestras, a menudo en tiempo real. Como se explica en el capítulo 8, su principal uso es el análisis de compuestos inhibitorios con potencial final para uso como fármacos.

Inmunoanálisis ligados a enzima

Es factible explotar la sensibilidad de las valoraciones enzimáticas con el fin de detectar proteínas que carecen de actividad catalítica. En el análisis inmunosorbente ligado a enzima (ELISA) se usan anticuerpos enlazados de manera covalente a una “enzima reportera” como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa de rábano picante cuyos productos se detectan con facilidad, por lo general mediante la absorbancia de luz o por medio de fluorescencia. El suero u otras muestras biológicas que serán analizadas son colocados en placas de microtitulación de plástico, donde las proteínas se adhieren a la superficie de plástico y quedan inmovilizadas. Cualquier plástico expuesto que quede es subsecuentemente “bloqueado” mediante añadir una proteína no antigénica, como albúmina de suero bovino. Entonces se añade una solución de anticuerpo enlazado de manera covalente a una enzima reportera. Los anticuerpos se adhieren al antígeno inmovilizado y quedan inmovilizados. Después se eliminan mediante lavado las moléculas de anticuerpo libres excesivas. A continuación se determinan la presencia y cantidad de anticuerpo unido al añadir el sustrato para la enzima reportera.

Las deshidrogenasas dependientes de NAD(P) son valoradas de manera espectrofotométrica

Las propiedades físico-químicas de los reactivos en una reacción catalizada por enzima dictan las opciones para la valoración de la actividad enzimática. En las valoraciones espectrofotométricas se explota la capacidad de un sustrato o producto para absorber luz. Las coenzimas reducidas NADH y NADPH, escritas como NAD(P)H, absorben luz a una longitud de onda de 340 nm, no así sus formas oxidadas NAD(P)⁺ (figura 7-10). Por ende, cuando el NAD(P)⁺ se reduce, la absorbancia a 340 nm aumenta en proporción con —y a un índice determinado por— la cantidad de NAD(P)H producida. Por el contrario, para una deshidrogenasa que cataliza la oxidación de NAD(P)H, se observa un decremento de la absorbancia a 340 nm. En cada caso, el índice de cambio de la densidad óptica a 340 nm será proporcional a la cantidad de enzima presente.

Suele ser más difícil de efectuar la valoración de enzimas cuyas reacciones no se acompañan de un cambio de la absorbancia o de la fluorescencia. En ocasiones es posible transformar el producto o el sustrato restante en un compuesto que se detecta con mayor facilidad, aunque antes de la medición el producto de la reacción quizá tenga que separarse de sustrato que no ha reaccionado. Una estrategia alternativa es crear un sustrato sintético cuyo producto absorbe luz o muestra fluorescencia. Por ejemplo, la hidrólisis del enlace fosfoéster en el p-nitrofenil fosfato (pNPP), una molécula sustrato artificial, es catalizada a una tasa medible por muchas fosfatasas, fosfodiesterasas y serina proteasas. Si bien el pNPP no absorbe la luz visible, después de su hidrólisis el anión de p-nitrofenilato resultante absorbe luz a 419 nm y, así, puede cuantificarse.

Muchas enzimas son valoradas mediante acoplamiento a una deshidrogenasa

Otro método bastante común es emplear una valoración “acoplada” (figura 7-11); por lo común una deshidrogenasa cuyo sustrato es el producto de la enzima de interés se añade en exceso catalítico. El índice de aparición o desaparición de NAD(P)H depende entonces del índice de la reacción enzimática a la cual se ha acoplado la deshidrogenasa.

El análisis de enzimas en el plasma sanguíneo ha desempeñado una función fundamental en el diagnóstico de varios procesos morbosos. Muchas enzimas son constituyentes funcionales de la sangre; entre algunos ejemplos están seudocolinesterasa, lipoproteína lipasa, así como componentes de la cascada de eventos en la coagulación de la sangre y la disolución de coágulo. Otras enzimas se liberan hacia el plasma después de muerte o lesión celular; si bien estas últimas no desempeñan una función fisiológica en el plasma, pueden servir como biomarcadores, moléculas cuya apariencia o concentración son de utilidad en el diagnóstico y el pronóstico de enfermedades y lesiones que afectan tejidos específicos. Después de lesión, la concentración plasmática de una enzima liberada puede aumentar en etapas tempranas o tardías, y declinar de manera rápida o con lentitud. Las proteínas del citoplasma tienden a aparecer con mayor rapidez que las de organelos subcelulares. La rapidez con la cual las enzimas y otras proteínas son eliminadas del plasma varía con su susceptibilidad a proteólisis y permeabilidad a través de los glomérulos renales.

El análisis cuantitativo de la actividad de las enzimas o de otras proteínas liberadas —por lo general en plasma o suero, aunque también en orina o en diversas células— proporciona información respecto al diagnóstico, el pronóstico y la respuesta al tratamiento. En el análisis de la actividad enzimática de manera característica se emplean valoraciones cinéticas estándar de índices de reacción inicial. El cuadro 7-2 lista varias enzimas valiosas en el diagnóstico clínico; sin embargo, estas enzimas no son absolutamente específicas para la enfermedad indicada. Por ejemplo, las concentraciones sanguíneas elevadas en fosfatasa ácida prostática a menudo se relacionan con cáncer prostático, pero también con ciertos otros cánceres y enfermedades no cancerosas. En consecuencia, los datos de la valoración enzimática deben considerarse junto con otros factores recabados por medio de un examen clínico integral. Los factores por considerar en la interpretación de los datos sobre enzimas comprenden la edad del paciente, el sexo, los antecedentes personales no patológicos y patológicos, el posible consumo de fármacos o drogas, así como la sensibilidad y la especificidad diagnóstica de la prueba enzimática.

Las enzimas ayudan al diagnóstico de infarto de miocardio (MI)

Una enzima útil para enzimología diagnóstica debe ser hasta cierto punto específica para el tejido u órgano bajo estudio, aparecer en el plasma u otro líquido en un momento útil para el diagnóstico (la “ventana diagnóstica”) y prestarse a la valoración automatizada. Las enzimas que se utilizan para confirmar un MI ilustran el concepto de una “ventana diagnóstica” y proporcionan una perspectiva histórica sobre el uso de diferentes enzimas para este propósito.

La detección de una enzima debe ser posible en el transcurso de algunas horas, luego de un MI para confirmar un diagnóstico preliminar y permitir el inicio de terapia apropiada. De este modo, las enzimas que sólo aparecen en el plasma 12 horas o más después de lesión, tienen utilidad limitada. Las primeras enzimas usadas para diagnosticar MI fueron la aspartato aminotransferasa (AST), alanina aminotransferasa (ALT) y lactato deshidrogenasa (LDH). Sin embargo, la AST y la ALT resultaron no ser las idóneas, puesto que aparecen en el plasma con relativa lentitud y no son específicas para el músculo cardiaco. Si bien la lactato deshidrogenasa también se libera con relativa lentitud hacia el plasma, ofreció la ventaja de especificidad hística como una consecuencia de su estructura cuaternaria.

La LDH es una enzima tetramérica que consta de dos tipos de monómeros: H (de heart [corazón]) y M (de músculo) que se combinan para dar cinco isozimas de LDH: HHHH (I₁), HHHM (I₂), HHMM (I₃), HMMM (I₄) y MMMM (I₅). Las proporciones relativas de cada subunidad en las células de un órgano particular está determinada por patrones específicos para tejido en la expresión de los genes H y M. La isozima I₁ predomina en el tejido cardíaco, y la isozima I₅, en el hígado. De este modo, cuando la concentración de LDH aumenta en el plasma sanguíneo, la identidad del tejido lesionado puede inferirse a partir de su patrón característico de isozimas de LDH. En el laboratorio clínico, isozimas individuales se pueden separar mediante electroforesis y detectar con una valoración acoplada (figura 17-12). Si bien tiene importancia histórica, la valoración de LDH ha quedado reemplazada como un marcador para MI por proteínas que aparecen en el plasma con mayor rapidez que la LDH.

La creatina cinasa (CK) tiene tres isozimas: CK-MM (músculo estriado), CK-BB (cerebro) y CK-MB (corazón y músculo estriado). La CK-MB tiene una ventana diagnóstica útil; aparece en el transcurso de 4 a 6 horas luego de un MI, alcanza un máximo a las 24 horas, y regresa a la basal hacia las 48 a 72 horas. Al igual que para la LDH, las isozimas de CK individuales son separables mediante electroforesis, lo que facilita la detección. La medición de la concentración plasmática de CK se sigue usando para evaluar trastornos del músculo esquelético, como la distrofia muscular de Duchenne. Sin embargo, en la actualidad en casi todos los laboratorios clínicos la medición de la concentración plasmática de troponina ha reemplazado a la CK como el marcador diagnóstico preferido para MI.

Troponinas

La troponina es un complejo de tres proteínas comprendidas en la contracción muscular en los músculos estriado y cardíaco, no así en el músculo liso (capítulo 51). La medición inmunológica de las concentraciones plasmáticas de troponinas cardíacas I y T proporciona indicadores sensibles y específicos de daño del músculo cardíaco. Las concentraciones de troponina aumentan 2 a 6 horas después de un MI y permanecen elevadas durante 4 a 10 días. Además del MI, otro tipo de daño del músculo cardíaco también aumenta las concentraciones séricas de troponina. Así que las troponinas cardíacas sirven como un marcador de todo el daño del músculo cardíaco. La búsqueda de marcadores adicionales para enfermedad cardíaca —como albúmina modificada por isquemia y la evaluación simultánea de un espectro de marcadores diagnósticos por medio de proteómica— aún es un área activa de investigación clínica—.

Usos clínicos adicionales de las enzimas

También es factible emplear enzimas en el laboratorio clínico como herramientas para determinar la concentración de metabolitos críticos; por ejemplo, la glucosa oxidasa suele utilizarse para medir la concentración plasmática de glucosa. Cada vez con mayor frecuencia se emplean enzimas como recursos para el tratamiento de lesión y enfermedad. El activador del plasminógeno hístico (tPA) o la estreptocinasa se usan en el tratamiento de MI agudo, mientras que la tripsina ha sido utilizada en el tratamiento de fibrosis quística. La administración por vía intravenosa de glicosilasas producidas con métodos recombinantes se ha aprobado para el tratamiento de varias enfermedades por almacenamiento lisosomal, entre ellas la enfermedad de Gaucher (β-glucosidasa), la enfermedad de Pompe (α-glucosidasa), la enfermedad de Fabry (α-galactosidasa A) y la enfermedad de Sly (β-glucuronidasa).

En muchas técnicas diagnósticas se aprovechan la especificidad y eficiencia de las enzimas que actúan sobre oligonucleótidos como el DNA. Las enzimas conocidas como endonucleasas de restricción, por ejemplo, dividen DNA bicatenario en sitios especificados por una secuencia de cuatro, seis o más pares de bases llamados sitios de restricción. La división de una muestra de DNA con una enzima de restricción produce un grupo característico de fragmentos de DNA de menor tamaño (capítulo 39). Las desviaciones del modelo de producto normal, llamadas polimorfismos de longitud de fragmento de restricción (RFLP), ocurren si una mutación hace a un sitio de restricción irreconocible para su endonucleasa de restricción cognada o, de manera alternativa, genera un nuevo sitio de reconocimiento. Los RFLP en la actualidad se utilizan para facilitar la detección prenatal de diversos trastornos hereditarios, entre ellos rasgo de células falciformes, talasemia β, fenilcetonuria en lactantes y enfermedad de Huntington.

Aplicaciones médicas de la reacción en cadena de la polimerasa

Como se describe en el capítulo 39, la reacción en cadena de polimerasa (PCR) emplea una DNA polimerasa termoestable y preparadores oligonucleótido apropiados para producir miles de copias de un segmento definido de DNA a partir de una cantidad diminuta de material inicial. La PCR permite a los científicos médicos, biológicos y forenses detectar y caracterizar DNA que en un inicio está presente a cifras demasiado bajas como para realizar una detección directa. Además de investigar mutaciones genéticas, la PCR puede usarse para detectar e identificar agentes patógenos y parásitos como Trypanosoma cruzi —el agente causal de la enfermedad de Chagas— y Neisseria meningitidis —el agente causal de la meningitis bacteriana—, por medio de la amplificación selectiva de su DNA.

La tecnología de DNA recombinante ha surgido como un recurso importante en el estudio de las enzimas; a fin de examinar la estructura y función de enzimas es necesario contar con muestras muy purificadas de las mismas. El aislamiento de una enzima individual, en particular si está presente en una concentración baja, de entre los miles de proteínas existentes en una célula, en ocasiones es una tarea en extremo difícil. Si el gen que codifica para la enzima de interés ha sido clonado, por lo general es posible producir grandes cantidades de su proteína codificada en Escherichia coli o levadura. Sin embargo, no todas las proteínas animales pueden expresarse de forma activa en células microbianas ni los microbios realizan ciertas tareas de procesamiento postraduccional. Debido a ello, un gen puede expresarse en sistemas de células animales en cultivo empleando el vector de expresión baculovirus para transformar células de insecto cultivadas. El capítulo 39 presenta más detalles respecto a las técnicas de DNA recombinante.

Las proteínas de fusión recombinantes se purifican mediante cromatografía de afinidad

La tecnología de DNA recombinante también puede usarse para crear proteínas modificadas que se purifican con facilidad mediante cromatografía de afinidad. El gen de interés se enlaza a una secuencia de oligonucleótido que codifica una extensión carboxilo o amino terminal para la proteína codificada. La proteína modificada resultante, llamada proteína de fusión, contiene un dominio hecho a la medida para interactuar con un soporte de afinidad específico. Un método popular es fijar un oligonucleótido que codifica para seis residuos histidina consecutivos. La proteína “marca de His” (o “cola de His”) que se expresa se une a soportes cromatográficos que contienen un ion metálico divalente inmovilizado como Ni²⁺o Cd²⁺. De manera alternativa, el dominio de unión a sustrato de la glutatión S-transferasa (GST) puede servir como una “marca de GST”. La figura 7-13 ilustra la purificación de una proteína de fusión GST usando un soporte de afinidad que contiene glutatión unido. La mayoría de los dominios de fusión a menudo también codifican para un sitio de división para una proteasa muy específica como la trombina en la región que enlaza las dos porciones de la proteína; esto permite la eliminación del dominio de fusión añadido después de purificación de afinidad.

La mutagénesis dirigida hacia sitio proporciona información mecanicista

Una vez que se ha establecido la capacidad para expresar una proteína a partir de su gen clonado, cabe la posibilidad de emplear mutagénesis dirigida hacia sitio para cambiar residuos aminoacilo específicos al alterar sus codones. Usado en combinación con análisis cinéticos y cristalografía con rayos X, este método facilita la identificación de las funciones específicas de residuos aminoacilo dados en la unión a sustrato y la catálisis. Por ejemplo, la inferencia de que un residuo aminoacilo particular funciona como un ácido general puede probarse mediante su reemplazo con un residuo aminoacilo incapaz de donar un protón.

Cech descubrió la primera molécula de RNA catalítica

La participación de los catalizadores enzimáticos en la maduración postraduccional de ciertas proteínas tiene analogías en el mundo del RNA. Muchas moléculas de RNA pasan por procesamiento en el cual se eliminan segmentos de oligonucleótido, y los segmentos restantes se vuelven a ligar para formar el producto maduro (capítulo 36); sin embargo, no todos estos catalíticos son proteínas. Mientras estaban examinando el procesamiento de moléculas de RNA ribosomal (rRNA) en el protozoario ciliado Tetrahymena, Thomas Cech y sus colaboradores observaron, a principios del decenio de 1980-1989, que el procesamiento del rRNA 26S procedió sin contratiempos in vitro incluso en ausencia total de proteína. La fuente de esta actividad de empalme se rastreó a un segmento catalítico de 413 bp que retuvo su actividad catalítica incluso cuando se replicó en E. coli (capítulo 39). Antes de esa época, se había creído que los polinucleótidos sólo sirven como entidades de almacenamiento de información y de transmisión de la misma, y que la catálisis estaba restringida únicamente a proteínas.

Desde entonces se han descubierto varias otras ribozimas. Casi todas catalizan reacciones de desplazamiento nucleofílicas dirigidas a los enlaces fosfodiéster del esqueleto del RNA. En RNA que se dividen por sí mismos, pequeños, como cabeza de martillo (hammerhead) o RNA del virus de la hepatitis delta, el nucleófilo atacante es agua, y el resultado es hidrólisis. Para las ribozimas intrón del grupo 1 grandes, el nucleófilo atacante es el 3’-hidroxilo de la ribosa terminal de otro segmento de RNA, y el resultado es una reacción de empalme.

El ribosoma —la ribozima final

El ribosoma fue la primera “máquina molecular” reconocida. El ribosoma, un complejo masivo formado por grandes números de subunidades de proteínas y varias moléculas de RNA ribosomal grandes, desempeña el proceso de importancia vital y muy complejo de sintetizar cadenas polipeptídicas largas siguiendo las instrucciones codificadas en moléculas de RNA mensajero (capítulo 37). Durante muchos años se supuso que los RNA ribosomales desempeñaban un papel estructural pasivo, o que tal vez ayudaban en el reconocimiento de mRNA cognados por medio de un mecanismo de formación de pares de bases. Así, fue un algo sorprendente descubrir que los RNA ribosomales eran tanto necesarios como suficientes para la catálisis.

La hipótesis del mundo del RNA

El descubrimiento de ribozimas tuvo una profunda influencia sobre la teoría evolutiva. Durante muchos años, diversos científicos habían emitido la hipótesis de que los primeros catalíticos biológicos se formaron cuando los aminoácidos contenidos en el caldo primordial mostraron coalescencia para formar las primeras proteínas simples. Cuando quedó de manifiesto que el RNA podía tanto portar información como catalizar reacciones químicas simples, surgió una nueva hipótesis del “mundo del RNA” en la cual el RNA constituyó la primera macromolécula biológica. Finalmente, el DNA surgió como un oligonucleótido con mayor estabilidad química para el almacenamiento de información a largo plazo, mientras que las proteínas, en virtud de su variedad mucho mayor de grupos funcionales químicos, dominaron la catálisis. Si se asume que se formó alguna clase de híbrido de RNA-proteína como un intermediario en la transición desde catalíticos ribonucleótido hacia polipeptídicos, sólo es necesario mirar al ribosoma para encontrar el eslabón perdido probable.

¿Por qué las proteínas no se hicieron cargo de todas las funciones catalíticas? Probablemente, en el caso del ribosoma el proceso fue demasiado complejo y demasiado esencial como para dar gran oportunidad para que posibles competidores prevalecieran. En el caso de los RNA que se dividen por sí mismos pequeños, y los intrones que se empalman por sí mismos, tal vez representen uno de los pocos casos en los cuales la autocatálisis de RNA es más eficiente que el desarrollo de un nuevo catalítico proteínico.

• Las enzimas son catalíticos eficientes cuya especificidad estricta se extiende a la clase de reacción catalizada, y típicamente a un solo sustrato.

• Los grupos prostéticos orgánicos e inorgánicos, cofactores y coenzimas desempeñan papeles importantes en la catálisis. Las coenzimas, muchas de las cuales son derivados de vitamina B, sirven como “transbordadores” para grupos de uso común, como aminas, electrones y grupos acetilo.

• Durante la catálisis, las enzimas suelen redirigir los cambios conformacionales inducidos por la unión a sustrato para efectuar cambios complementarios en el sustrato que faciliten su transformación en producto.

• Los mecanismos catalíticos empleados por las enzimas comprenden la introducción de tensión, la aproximación de reactantes, la catálisis acidobásica y la catálisis covalente. La proteasa del HIV ilustra la catálisis acidobásica; la quimotripsina y la fructosa-2,6-bifosfatasa ilustran la catálisis covalente.

• Los residuos aminoacilo que participan en la catálisis están altamente conservados entre todas las clases de una enzima dada. La mutagénesis dirigida hacia sitio, que se usa para cambiar residuos que se sospecha que son importantes en la catálisis por la unión a sustrato, proporciona información sobre los mecanismos de acción de enzimas.

• La actividad catalítica de enzimas revela su presencia, facilita su detección y proporciona la base para inmunoensayos ligados a enzima. Muchas enzimas pueden analizarse por medio de espectrofotometría al acoplarlas a una deshidrogenasa dependiente de NAD(P)⁺.

• La química combinacional genera extensas bibliotecas de activadores e inhibidores potenciales de enzimas, que pueden probarse mediante investigación de alta capacidad de procesamiento.

• El análisis de enzimas plasmáticas ayuda al diagnóstico de infarto de miocardio, pancreatitis aguda y diversos trastornos óseos y hepáticos, y a establecer el pronóstico de los mismos.

• Las endonucleasas de restricción facilitan el diagnóstico de enfermedades genéticas al revelar polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restricción, y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) amplifica el DNA inicialmente presente en cantidades demasiado pequeñas para análisis.

• La fijación de un polihistidilo, glutatión S-transferasa (GST), u otra “marca” al N o C terminal de una proteína recombinante facilita su purificación mediante cromatografía de afinidad sobre un soporte sólido que contiene un ligando inmovilizado, como un catión divalente (p. ej., Ni²⁺) o GST. A continuación, proteasas específicas pueden eliminar las “marcas” de afinidad y generar la enzima natural.

• No todas las enzimas son proteínas. Se conocen varias ribozimas que pueden cortar los enlaces fosfodiéster del RNA y volver a empalmarlos. En el ribosoma, la catálisis depende principalmente del rRNA y no de los componentes polipeptídicos.