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La ecuación de Michaelis-Menten
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La ecuación de Michaelis-Menten (29) ilustra en términos matemáticos la relación entre la velocidad de reacción inicial vi y la concentración de sustrato [S], que se muestra de manera gráfica en la figura 8-4:
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La constante Km de Michaelis es la concentración de sustrato a la cual vi es la mitad de la velocidad máxima (Vmáx/2) alcanzable a una concentración particular de enzima. De este modo, Km tiene las dimensiones de la concentración de sustrato. La dependencia de la velocidad de reacción inicial de [S] y Km puede ilustrarse al evaluar la ecuación de Michaelis-Menten en tres condiciones.
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Cuando [S] es mucho menor que Km (punto A en las figuras 8-4 y 8-5), el término Km + [S] es en esencia igual a la Km. El reemplazo de Km + [S] con Km reduce la ecuación (29) a
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donde ≈ significa “aproximadamente igual a”. Dado que tanto Vmáx como Km son constantes, su proporción es una constante. En otras palabras, cuando [S] está muy por debajo de Km, vi es proporcional a k[S]. Por ende, la velocidad de reacción inicial es directamente proporcional a [S].
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Cuando [S] es mucho mayor que Km (punto C en las figuras 8-4 y 8-5), el término Km + [S] es en esencia igual a [S]. Reemplazar Km + [S] por [S] reduce la ecuación (29) a
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Cuando [S] = Km (punto B en las figuras 8-4 y 8-5):
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Una forma lineal de la ecuación de Michaelis-Menten se usa para determinar Km y Vmáx
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La medición directa del valor numérico de Vmáx y, por consiguiente, el cálculo de Km, a menudo requiere concentraciones altas poco prácticas de sustrato para alcanzar condiciones de saturación. Una forma lineal de la ecuación de Michaelis-Menten evita esta dificultad y permite extrapolar Vmáx y Km desde de datos de velocidad inicial obtenidos a concentraciones de sustrato menores que las que producen saturación. Se empieza con la ecuación (29),
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La ecuación (35) es la ecuación para una línea recta y = ax + b, donde y = 1/vi y x = 1/[S]. Un gráfico de 1/vi en el eje y, expresado como una función de 1/[S] en el eje x, da una línea recta cuya intersección en el eje y se define como 1/Vmáx y la pendiente se define como Km/Vmáx. Ese gráfico se conoce como gráfico del doble recíproco o de Lineweaver-Burk (figura 8-6). Establecer el término y de la ecuación (36) igual a cero y resolver para x, revela que la intersección x es –1/Km.
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La Km puede calcularse a partir de la pendiente y la intersección y, pero quizá se calcula más fácilmente a partir de la intersección x negativa.
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La principal virtud del gráfico de Lineweaver-Burk reside en la facilidad con la cual puede usarse para determinar el mecanismo cinético de un inhibidor de enzima (véase más adelante). Sin embargo, al usar un gráfico doble recíproco para determinar constantes cinéticas es importante evitar la introducción de sesgo por la agrupación de datos a valores bajos de 1/[S]. Este sesgo puede evitarse con facilidad en el laboratorio como sigue: se prepara una solución de sustrato cuya dilución hacia una valoración producirá la concentración deseada máxima del sustrato. Ahora se preparan diluciones de la solución madre por factores de 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, etc. Los datos generados usando volúmenes iguales de estas diluciones caerán entonces en el eje 1/[S] a intervalos igualmente espaciados de 1, 2, 3, 4, 5, etc. También puede usarse un gráfico del recíproco único como el gráfico de Eadie-Hofstee (vi vs. vi/[S]) o el de Hanes-Woolf ([S]/vi vs. [S]) para minimizar la agrupación de datos.
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La constante catalítica, kcat
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Es factible usar varios parámetros para comparar la actividad relativa de diferentes enzimas o de distintas preparaciones de la misma enzima. La actividad de preparaciones de enzima impuras por lo general se expresa como actividad específica (Vmáx dividida por la concentración de proteína). Para una enzima homogénea es posible calcular su número de recambio (Vmáx dividida por los mol de enzima presentes). Sin embargo, si se conoce el número de sitios activos presentes, la actividad catalítica de una enzima homogénea se expresa mejor como su constante catalítica, kcat (Vmáx dividida por el número de sitios activos, St).
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Dado que las unidades de concentración se anulan, las unidades de kcat son tiempo recíproco.
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Eficiencia catalítica, kcat/Km
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¿Mediante qué medida se deben cuantificar y comparar la eficiencia de enzimas diferentes, sustratos diferentes para una enzima dada, y la eficiencia con la cual una enzima cataliza una reacción en las direcciones hacia adelante y hacia atrás? Si bien la capacidad máxima de una enzima dada para convertir sustrato en producto es importante, los beneficios de una kcat alta sólo pueden obtenerse si la Km es suficientemente baja. De este modo, la eficiencia catalítica de enzimas se expresa mejor en términos de la proporción de estas dos constantes cinéticas, kcat/Km.
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Para ciertas enzimas, una vez que el sustrato se une al sitio activo, se convierte en producto y se libera con tanta rapidez como para hacer a estos eventos efectivamente instantáneos. Para estos catalíticos excepcionalmente eficientes, el paso limitante es la formación del complejo ES. Se dice que esas enzimas están limitadas por difusión, o que son perfectas desde el punto de vista catalítico, puesto que el índice de catálisis más rápido posible está determinado por el índice al cual las moléculas se mueven o difunden a través de la solución. Los ejemplos de enzimas para las cuales kcat/Km se aproxima al límite de difusión de 108–109 M–1s–1 incluyen la triosafosfato isomerasa, anhidrasa carbónica, acetilcolinesterasa y adenosina desaminasa.
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En células vivas, el montaje de enzimas que catalizan reacciones sucesivas hacia complejos multiméricos puede evitar las limitaciones impuestas por la difusión. Las relaciones geométricas de las enzimas en estos complejos son tales que los sustratos y productos no se difunden hacia la solución de volumen sino hasta que se completa el último paso de la secuencia de pasos catalíticos. La ácido graso sintetasa extiende este concepto un paso más allá al fijar de manera covalente la cadena de ácido graso sustrato en crecimiento a una cadena de biotina que rota de un sitio activo a otro dentro del complejo hasta que se completa la síntesis de una molécula de ácido palmítico (capítulo 23).
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La Km puede aproximar una constante de unión
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La afinidad de una enzima por su sustrato es la inversa de la constante de disociación Kd para la disociación del complejo de enzima-sustrato ES.
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Dicho de otra manera, mientras menor es la tendencia a disociarse de la enzima y su sustrato, mayor es la afinidad de la enzima por su sustrato. Si bien la constante de Michaelis Km a menudo aproxima la constante de disociación Kd, esto de ningún modo siempre es así. Para una reacción catalizada por enzima típica,
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el valor de [S] que da vi = Vmáx/2 es
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Cuando k−1 >> k2, entonces
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Por ende, 1/Km sólo aproxima 1/Kd en condiciones en las cuales la asociación y disociación del complejo ES son rápidas en comparación con la catálisis. Para las muchas reacciones catalizadas por enzima para las cuales k−1 + k2 no es aproximadamente igual a k−1, 1/Km subestimará 1/Kd.
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La ecuación de Hill describe la conducta de enzimas que muestran unión cooperativa de sustrato
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Si bien casi todas las enzimas despliegan la cinética de saturación simple descrita en la figura 8-4, y se describen de manera adecuada mediante la expresión de Michaelis-Menten, algunas se unen a sus sustratos de una manera cooperativa, análoga a la unión de oxígeno por la hemoglobina (capítulo 6). La conducta cooperativa es una propiedad exclusiva de enzimas multiméricas que unen sustrato en múltiples sitios.
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Para enzimas que despliegan cooperación positiva en la unión de sustrato, la forma de la curva que relaciona los cambios en vi con los cambios en [S] es sigmoidea (figura 8-7). Ni la expresión de Michaelis-Menten ni sus gráficos derivados pueden usarse para evaluar cinética cooperativa. Por ende, los enzimólogos emplean una representación gráfica de la ecuación de Hill que en su origen fue obtenida para describir la unión cooperativa de O2 por la hemoglobina. La ecuación (44) representa la ecuación de Hill dispuesta en una forma que predice una línea recta, donde k’ es una constante compleja:
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La ecuación (44) declara que cuando [S] es bajo en comparación con k’, la velocidad de reacción inicial aumenta como la enésima potencia de [S].
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Un gráfico de log vi/(Vmáx − vi) contra log[S] da una línea recta (figura 8-8), donde la pendiente de la línea n es el coeficiente de Hill, y un parámetro empírico cuyo valor está en función del número, la clase y la fuerza de las interacciones de los sitios de unión a sustrato múltiples sobre la enzima. Cuando n = 1, todos los sitios de unión se comportan de manera independiente, y se observa conducta cinética de Michaelis-Menten simple. Si n es de más de 1, se dice que la enzima muestra cooperación positiva. La unión de sustrato a un sitio aumenta entonces la afinidad de los sitios restantes para unión a sulfato adicional. Mientras mayor es el valor para n, más alto es el grado de cooperación, y más sigmoideo será el gráfico de vi contra [S]. Una perpendicular trazada desde el punto donde el término y log vi/(Vmáx − vi) es cero interseca el eje x en una concentración de sustrato llamada S50, la concentración de sustrato que da por resultado la mitad de la velocidad máxima. De este modo, S50 es análoga a la P50 para la unión de oxígeno a hemoglobina (capítulo 6).
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