CAPÍTULO 8: Enzimas: cinética

A fin de mantener la homeostasis se requiere un conjunto completo y equilibrado de actividades de enzimas. La cinética enzimática, la medición cuantitativa de las tasas de reacciones catalizadas por enzima, y el estudio sistemático de factores que afectan estas tasas, constituye una herramienta fundamental para el análisis, diagnóstico y tratamiento de los desequilibrios enzimáticos que subyacen muchas enfermedades humanas. Por ejemplo, el análisis de la cinética puede revelar el número y el orden de los pasos individuales mediante los cuales las enzimas transforman sustratos en productos, y conjuntamente con mutagénesis dirigida hacia sitio, los análisis cinéticos pueden revelar detalles del mecanismo catalítico de una enzima dada. La aparición de enzimas particulares en la sangre, o un aumento repentino de las concentraciones de las mismas, sirve como un indicador clínico para enfermedades como infarto de miocardio, cáncer de próstata y daño hepático. La participación de las enzimas en casi todos los procesos fisiológicos hace de ellas los mejores blancos para fármacos que curan enfermedad humana o la aminoran. La cinética enzimática aplicada representa la principal herramienta mediante la cual los científicos identifican y caracterizan agentes terapéuticos que inhiben de manera selectiva las tasas de procesos catalizados por enzima específicos. De este modo, la cinética enzimática desempeña un papel fundamental y crucial en el descubrimiento de fármacos, en la farmacodinámica comparativa, y en la elucidación del modo de acción de fármacos.

Una ecuación química balanceada lista las especies químicas iniciales (sustratos) presentes, y las nuevas especies químicas (productos) formadas para una reacción química particular, todas en sus proporciones o estequiometría correctas. Por ejemplo, en la ecuación balanceada (1) que aparece a continuación se describe la reacción de una molécula, cada una, de sustratos A y B, para formar una molécula, cada una, de productos P y Q:

Las dobles flechas indican reversibilidad, propiedad intrínseca de todas las reacciones químicas. De este modo, para la reacción (1), si A y B pueden formar P y Q, estos últimos también pueden formar A y B. Por ende, la designación de un reactivo particular como “sustrato” o “producto” es un poco arbitraria porque los productos para una reacción descrita en una dirección son los sustratos para la reacción inversa. Sin embargo, el término “producto” a menudo se usa para designar los reactivos cuya formación es favorecida desde el punto de vista termodinámico. Las reacciones para las cuales los factores termodinámicos favorecen de manera significativa la formación de los productos hacia los cuales apunta la flecha, a menudo se representan con una flecha única como si fueran “irreversibles”:

También se usan flechas unidireccionales para describir reacciones en células vivas en las cuales los productos de la reacción (2) son consumidos de inmediato por una reacción subsiguiente catalizada por enzima o escapan rápidamente de la célula, por ejemplo, el CO₂. Por ende, la eliminación rápida del producto P o Q impide de manera efectiva la reacción inversa, lo que hace a la ecuación (2) irreversible desde el punto de vista funcional en condiciones fisiológicas.

El cambio de energía libre de Gibbs ΔG (también llamado la energía libre o energía de Gibbs) describe tanto la dirección en la cual tenderá a proceder una reacción química, como las concentraciones de reactivos y productos que estarán presentes en equilibrio. La ΔG para una reacción química es igual a la suma de las energías libres de la formación de los productos de la reacción ΔG_P menos la suma de las energías libres de formación de los sustratos ΔG_S. ΔG⁰ denota el cambio de energía libre que acompaña a la transición desde el estado estándar, concentraciones uno molar de sustratos y productos, hasta el equilibrio. Un término bioquímico más útil es ΔG^0’, que define el ΔG⁰ a un estado estándar de 10^–7 M protones, pH de 7.0. Si la energía libre de formación de los productos es más baja que la de los sustratos, los signos de ΔG⁰ y ΔG^0’ serán negativos, lo que indica que la reacción como está escrita se favorece en la dirección de izquierda a derecha; esas reacciones se denominan espontáneas. El signo y la magnitud del cambio de energía libre determinan qué tan lejos procederá la reacción. En la ecuación (3) se ilustra la relación entre la constante de equilibrio K_eq y ΔG⁰:

donde R es la constante gaseosa (1.98 cal/mol°K u 8.31 J/mol°K) y T es la temperatura absoluta en grados Kelvin. K_eq es igual al producto de las concentraciones de los productos de la reacción, cada uno elevado a la potencia de su estequiometría, dividido por el producto de los sustratos, cada uno elevado a la potencia de su estequiometría.

Para la reacción A + B ⇆ P + Q

y para la reacción (5)

ΔG⁰ puede calcularse a partir de la ecuación (3) si se conocen las concentraciones molares de sustratos y productos presentes en equilibrio. Si ΔG⁰ es un número negativo, K_eq será mayor que la unidad, y la concentración de productos en equilibrio excederá la de los sustratos. Si ΔG⁰ es positiva, K_eq será menor que la unidad y se favorecerá la formación de sustratos.

Note que, dado que ΔG⁰ está en función exclusivamente de los estados inicial y final de las especies que están reaccionando, sólo puede proporcionar información acerca de la dirección y el estado de equilibrio de la reacción. ΔG⁰ es independiente del mecanismo de la reacción y, por ende, no proporciona información acerca de índices de reacciones. En consecuencia —y como se explica más adelante—, aunque una reacción puede tener una ΔG⁰ o ΔG^0’ negativa grande, puede, sin embargo, tener lugar a un índice insignificante.

Las reacciones proceden por estados de transición

El concepto de estado de transición es fundamental para entender las bases química y termodinámica de la catálisis. En la ecuación (7) se describe una reacción de transferencia de grupo en la cual un grupo E que está entrando desplaza a un grupo L que está saliendo, en un inicio fijo a R:

El resultado neto de este proceso es transferir el grupo R desde L hacia E. A la mitad del desplazamiento, el enlace entre R y L se ha debilitado pero todavía no se ha roto por completo, y el nuevo enlace entre E y R hasta ahora está formado de manera incompleta. Dicho intermediario transitorio —en el cual no existe sustrato ni producto libre— se denomina el estado de transición, E···R···L. Las líneas punteadas representan los enlaces “parciales” que están pasando por formación y rotura. En la figura 8-1 se proporciona una ilustración más detallada del estado de transición intermedio formado durante la transferencia de un grupo fosforilo.

Cabe considerar que la reacción (7) consta de dos “reacciones parciales”; la primera corresponde a la formación (F) y la segunda a la descomposición (D) subsiguiente del intermediario de estado de transición. Al igual que para todas las reacciones, los cambios característicos de la energía libre, ΔG_F y ΔG_D se relacionan con cada reacción parcial:

Para la reacción general (10), ΔG es la suma de ΔG_F y ΔG_D. Al igual que para cualquier ecuación de dos términos, es imposible inferir a partir de ΔG el signo o la magnitud de ΔG_F o ΔG_D.

Muchas reacciones comprenden múltiples estados de transición, cada uno con un cambio relacionado de energía libre. Para estas reacciones, la ΔG general representa la suma de todos los cambios de energía libre relacionados con la formación y la descomposición de todos los estados de transición. Por ende, a partir de la ΔG general es imposible inferir el número o el tipo de estados de transición a través de los cuales procede la reacción. Dicho de otra manera, la termodinámica general no dice nada acerca de la cinética.

La ΔG_F define la energía de activación

Al margen del signo o la magnitud de ΔG, la ΔG_F para la mayoría de reacciones químicas tiene un signo positivo, de modo que la formación de intermediarios de estado de transición requiere superar barreras de energía. Por esta razón, la ΔG_F para llegar a un estado de transición a menudo se denomina la energía de activación, E_act. La facilidad —y, por ende, la frecuencia— con la cual esta barrera se supera se relaciona de manera inversa con E_act. De este modo, los parámetros termodinámicos que determinan la rapidez con la cual procede una reacción, son los valores ΔG_F para la formación de los estados de transición a través de los cuales procede la reacción. Para una reacción simple, donde α significa “proporcional a”,

La energía de activación para la reacción que está procediendo en la dirección opuesta a la trazada es igual a –ΔG_D.

La teoría cinética —también llamada la teoría de la coalición— de cinética química declara que para que dos moléculas reaccionen, deben: 1) aproximarse dentro de la distancia formadora de enlace de la otra, o “chocar”, y 2) poseer suficiente energía cinética para vencer la barrera de energía para alcanzar el estado de transición. Por ende, resulta que cualquier cosa que aumente la frecuencia o energía de colisión entre sustratos aumentará el índice de la reacción en la cual participan.

Temperatura

Aumentar la temperatura incrementa la energía cinética de las moléculas. Como lo muestra la figura 8-2, el número total de moléculas cuya energía cinética excede la barrera de energía E_act (barra vertical) para la formación de productos aumenta desde temperaturas bajas (A), pasando por intermedias (B) hasta altas (C). El aumento de la energía cinética de moléculas también aumenta su rapidez de movimiento y, por ende, la frecuencia con la cual chocan. Esta combinación de choques más frecuentes y más energéticos y, por ende, productivos, aumenta el índice de reacción.

Concentración de reactivo

La frecuencia con la cual las moléculas chocan es directamente proporcional a sus concentraciones. Para dos moléculas diferentes, A y B, la frecuencia con la cual chocan se duplicará si se duplica la concentración de A o de B. Si las concentraciones tanto de A como de B se duplican, la probabilidad de choque aumentará cuatro veces.

Para una reacción química que procede a temperatura constante, y que comprende una molécula, cada una, de A y B,

la fracción de las moléculas que poseen una energía cinética dada será una constante. El número de moléculas que poseen energía cinética suficiente para superar la barrera de energía de activación será una constante. Por ende, el número de choques con suficiente energía para producir el producto P será directamente proporcional al número de choques entre A y B y, así, y a sus concentraciones molares, denotadas por corchetes.

De modo similar, para la reacción representada por

que también puede escribirse como

El índice de expresión correspondiente es

o

Para el caso general, cuando n moléculas de A reaccionan con m moléculas de B,

el índice de expresión es

Reemplazar el signo de proporcionalidad con signos de igual al introducir una constante de índice, k, característica de la reacción en estudio de las ecuaciones (20) y (21), en las cuales los números 1 y –1 se refieren a las reacciones hacia adelante e inversa, respectivamente.

La suma de las proporciones molares de los reactivos define el orden cinético de la reacción. Considere la reacción (5). El coeficiente estequiométrico para el reactivo único, A, es 2; por ende, el índice de producción de P es proporcional al cuadrado de [A], y se dice que la reacción es de segundo orden respecto al reactivo A. En este caso, la reacción general también es de segundo orden. Por ende, k₁ se denomina una constante de índice de segundo orden.

En la reacción (12) se describe una reacción de segundo orden simple entre dos reactivos diferentes, A y B. El coeficiente estequiométrico para cada reactivo es 1. Por ende, aunque la reacción es de segundo orden, se dice que es de primer orden respecto de A, y de primer orden respecto de B.

En el laboratorio, el orden cinético de una reacción respecto a un reactivo particular, al cual se hace referencia como el reactivo variable o sustrato, puede determinarse al mantener la concentración de los otros reactivos a una concentración constante, o fija, en un gran exceso sobre el reactivo variable. En estas condiciones de seudoprimer orden, la concentración del o los reactivos “fijos” permanece casi constante. De este modo, el índice de reacción depende de manera exclusiva de la concentración del reactivo variable, a veces también llamado el reactivo limitante. Los conceptos de orden de reacción y condiciones de seudoprimer orden no sólo se aplican a reacciones químicas simples, sino también a reacciones catalizadas por enzimas.

K_eq es una proporción de constantes de índice

Si bien todas las reacciones químicas son hasta cierto grado reversibles, en condiciones de equilibrio las concentraciones generales de reactivos y productos permanecen constantes. Por ende, en equilibrio, el índice de conversión de sustratos en productos, es igual al índice al cual los productos se convierten en sustratos:

Por ende,

y

La proporción de k₁ a k_–1 se denomina la constante de equilibrio K_eq. Es necesario tener en mente las propiedades importantes que siguen de un sistema en equilibrio:

1. La constante de equilibrio es una proporción de las constantes de índice de reacción (no los índices de reacción).

2. En equilibrio, los índices de reacción (no las constantes de índice) de las reacciones hacia adelante y hacia atrás son iguales.

3. El valor numérico de la constante de equilibrio K_eq puede calcularse a partir de las concentraciones de sustratos y productos a equilibrio, o a partir de la proporción k₁/k₋₁.

4. El equilibrio es un estado dinámico. Si bien no hay un cambio neto de la concentración de sustratos o productos, moléculas de sustrato y de producto individuales continuamente se están interconvirtiendo. La interconvertibilidad puede probarse al añadir a un sistema en equilibrio una cantidad traza de producto radioisotópico, que entonces puede mostrarse que da por resultado la aparición de sustrato radiomarcado.

Las enzimas disminuyen la barrera de energía de activación para una reacción

Todas las enzimas aceleran las tasas de reacción al disminuir la ΔG_F para la formación de estados de transición. Sin embargo, pueden diferir en la manera en que esto se logra. Si bien la secuencia de pasos químicos en el sitio activo corre pareja con los que ocurren cuando los sustratos reaccionan en ausencia de un catalítico, el ambiente del sitio activo disminuye la ΔG_F al estabilizar los intermediarios del estado de transición. En otras palabras, la enzima puede imaginarse como unida al intermediario de estado de transición (figura 8-1) de manera más estrecha que a sustratos o productos. Como se explica en el capítulo 7, la estabilización puede comprender: 1) grupos acidobásicos colocados de manera idónea para transferir protones hacia o desde el intermediario de estado de transición, 2) grupos cargados o iones metálicos colocados de manera idónea, que estabilizan cargas que se están formando, o 3) la imposición de tensión estérica sobre sustratos de modo que su forma se aproxima a la del estado de transición. La proteasa del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) (figura 7-6) ilustra la catálisis por una enzima que disminuye la barrera de activación al estabilizar un intermediario de estado de transición.

La catálisis por enzimas que procede por medio de un mecanismo de reacción singular típicamente ocurre cuando el intermediario de estado de transición forma un enlace covalente con la enzima (catálisis covalente). El mecanismo catalítico de la serina proteasa quimotripsina (figura 7-7) ilustra la manera en la cual una enzima utiliza catálisis covalente para proporcionar una vía de reacción única que posee un más favorable E_act.

Si bien las enzimas pueden pasar por modificaciones transitorias durante el proceso de catálisis, siempre salen sin cambios cuando se completa la reacción. Por ende, la presencia de una enzima no tiene efecto sobre la ΔG⁰ para la reacción general, que está en función sólo de los estados inicial y final de los reactivos. En la ecuación 25 se muestra la relación entre la constante de equilibrio para una reacción y el cambio de energía libre estándar para esa reacción:

Este principio quizá se ilustra con mayor facilidad al incluir la presencia de la enzima (Enz) en el cálculo de la constante de equilibrio para una reacción catalizada por enzima:

Dado que la enzima a ambos lados de las dobles flechas está presente en igual cantidad y forma idéntica, la expresión para la constante de equilibrio,

reduce a una idéntica a la que procede para la reacción en ausencia de la enzima:

Por ende, las enzimas carecen de efecto sobre K_eq.

Temperatura

El aumento de la temperatura incrementa el índice de reacciones tanto no catalizadas como catalizadas por enzima al aumentar la energía cinética y la frecuencia de choque de las moléculas que están reaccionando. Sin embargo, la energía calorífica también aumenta la flexibilidad conformacional de la enzima hasta un punto que excede la barrera de energía para alterar las interacciones no covalentes que mantienen su estructura tridimensional. La cadena polipeptídica empieza entonces a desdoblarse, o desnaturalizarse, con una pérdida acompañante de la actividad catalítica. El rango de temperatura en el cual una enzima mantiene una conformación estable, competente desde el punto de vista catalítico, depende de —y, por lo general, excede de manera moderada— la temperatura normal de las células en las cuales reside. Las enzimas de humanos por lo general muestran estabilidad a temperaturas de hasta 40 a 55 °C. En contraste, las enzimas de los microorganismos termofílicos que residen en manantiales calientes volcánicos u orificios hidrotérmicos submarinos, pueden ser estables hasta 100 °C o incluso más.

El coeficiente de temperatura (Q₁₀) es el factor por el cual el índice de un proceso biológico aumenta para un incremento de 10 °C de temperatura. Para las temperaturas en las cuales las enzimas son estables, los índices de casi todos los procesos biológicos típicamente se duplican para un aumento de temperatura de 10 °C (Q₁₀ = 2). Los cambios de los índices de reacciones catalizadas por enzima que acompañan a un aumento o disminución de la temperatura corporal constituyen una característica de supervivencia prominente para formas de vida “de sangre fría” como lagartos o peces, cuya temperatura corporal está dictada por el ambiente externo. Sin embargo, para mamíferos y otros organismos homeotérmicos, los cambios de los índices de reacción de enzimas con la temperatura sólo asumen importancia fisiológica en circunstancias como fiebre o hipotermia.

Concentración de ion hidrógeno

El índice de casi todas las reacciones catalizadas por enzima muestra una dependencia importante de la concentración de ion hidrógeno. Casi todas las enzimas intracelulares muestran actividad óptima a valores de pH entre 5 y 9. La relación entre actividad y concentración de ion hidrógeno (figura 8-3) refleja el equilibrio entre la desnaturalización de enzima a pH alto o bajo, y los efectos sobre el estado cargado de la enzima, los sustratos o ambos. Para enzimas cuyo mecanismo comprende catálisis acidobásica, los residuos comprendidos deben estar en el estado de protonación apropiado para que la reacción proceda. La unión y el reconocimiento de moléculas de sustrato con grupos disociables típicamente también comprenden la formación de puentes salinos con la enzima. Los grupos cargados más frecuentes son grupos carboxilato (negativos) y aminas protonadas (positivos). La ganancia o pérdida de grupos cargados cruciales afecta de manera adversa la unión a sustrato y, así, retrasará o suprimirá la catálisis.

En casi todas las mediciones de los índices de reacciones catalizadas por enzima se emplean periodos hasta cierto punto breves, condiciones que se aproximan a las condiciones de índice inicial. En estas condiciones, sólo se acumulan trazas de producto, lo que hace insignificante al índice de la reacción inversa. De este modo, la velocidad inicial (v_i) de la reacción es en esencia la del índice de reacción hacia adelante. En las valoraciones de actividad enzimática casi siempre se emplea un exceso molar grande (10³ a 10⁶) de sustrato sobre enzima. En estas condiciones, v_i es proporcional a la concentración de enzima, es decir, de seudoprimer orden con respecto a la enzima. Por ende, la medición de la velocidad inicial permite estimar la cantidad de enzima presente en una muestra biológica.

LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO AFECTA EL ÍNDICE DE REACCIÓN

En el texto que sigue, las reacciones enzimáticas se tratan como si sólo tuvieran un sustrato único y un producto único. Para enzimas con múltiples sustratos, los principios que se comentan a continuación se aplican con igual validez. Más aún, al emplear condiciones de seudoprimer orden (véase antes), los científicos pueden estudiar la dependencia del índice de reacción en un reactivo individual por medio de la selección apropiada de sustratos fijos y variables. En otras palabras, en condiciones de seudoprimer orden, la conducta de una enzima con múltiples sustratos imitará a la de una que cuenta sólo con un solo sustrato. Sin embargo, en estas circunstancias, la constante de índice observada estará en función de la constante de índice de k₁ para la reacción, así como la concentración del (o los) sustrato(s) fijo(s).

Para una enzima típica, a medida que la concentración de sustrato aumenta, v_i se incrementa hasta que alcanza un valor máximo V_máx (figura 8-4). Cuando los aumentos adicionales de la concentración de sustrato no aumentan más la v_i, se dice que la enzima está “saturada” con sustrato. Note que la forma de la curva que relaciona la actividad con la concentración de sustrato (figura 8-4) es hiperbólica. A cualquier constante dada, sólo las moléculas de sustrato que se combinan con la enzima como un complejo de enzima-sustrato (ES) pueden transformarse en producto. Ya que la constante de equilibrio para la formación del complejo de enzima-sustrato no es infinitamente grande, sólo una fracción de la enzima puede estar presente como un complejo ES, aun cuando el sustrato está presente en exceso (puntos A y B de la figura 8-5); por tanto, de los puntos A o B, aumentar o disminuir [S] aumentará o disminuirá el número de complejos ES con un cambio correspondiente de v_i. En el punto C (figura 8-5), en esencia toda la enzima está presente como el complejo ES. Dado que no queda enzima libre disponible para formar ES, los aumentos adicionales de [S] no pueden aumentar el índice de la reacción. En estas condiciones de saturación, la v_i depende sólo de —y, de este modo, está limitada por— la rapidez con la cual el producto se disocia de la enzima de modo que logre combinarse con más sustrato.

La ecuación de Michaelis-Menten

La ecuación de Michaelis-Menten (29) ilustra en términos matemáticos la relación entre la velocidad de reacción inicial v_i y la concentración de sustrato [S], que se muestra de manera gráfica en la figura 8-4:

La constante K_m de Michaelis es la concentración de sustrato a la cual v_i es la mitad de la velocidad máxima (V_máx/2) alcanzable a una concentración particular de enzima. De este modo, K_m tiene las dimensiones de la concentración de sustrato. La dependencia de la velocidad de reacción inicial de [S] y K_m puede ilustrarse al evaluar la ecuación de Michaelis-Menten en tres condiciones.

1. Cuando [S] es mucho menor que K_m (punto A en las figuras 8-4 y 8-5), el término K_m + [S] es en esencia igual a la K_m. El reemplazo de K_m + [S] con K_m reduce la ecuación (29) a

• donde ≈ significa “aproximadamente igual a”. Dado que tanto V_máx como K_m son constantes, su proporción es una constante. En otras palabras, cuando [S] está muy por debajo de K_m, v_i es proporcional a k[S]. Por ende, la velocidad de reacción inicial es directamente proporcional a [S].

1. Cuando [S] es mucho mayor que K_m (punto C en las figuras 8-4 y 8-5), el término K_m + [S] es en esencia igual a [S]. Reemplazar K_m + [S] por [S] reduce la ecuación (29) a

• De este modo, cuando [S] excede con mucho a K_m, la velocidad de reacción es máxima (V_máx) y no está afectada por aumentos adicionales de la concentración de sustrato.

1. Cuando [S] = K_m (punto B en las figuras 8-4 y 8-5):

• La ecuación (32) declara que cuando [S] es igual a K_m, la velocidad inicial es de la mitad del máximo. La ecuación (32) también revela que K_m es —y puede determinarse la manera experimental a partir de— la concentración de sustrato a la cual la velocidad inicial es de la mitad del máximo.

Una forma lineal de la ecuación de Michaelis-Menten se usa para determinar K_m y V_máx

La medición directa del valor numérico de V_máx y, por consiguiente, el cálculo de K_m, a menudo requiere concentraciones altas poco prácticas de sustrato para alcanzar condiciones de saturación. Una forma lineal de la ecuación de Michaelis-Menten evita esta dificultad y permite extrapolar V_máx y K_m desde de datos de velocidad inicial obtenidos a concentraciones de sustrato menores que las que producen saturación. Se empieza con la ecuación (29),

se invierte

se factoriza

y se simplifica

La ecuación (35) es la ecuación para una línea recta y = ax + b, donde y = 1/v_i y x = 1/[S]. Un gráfico de 1/v_i en el eje y, expresado como una función de 1/[S] en el eje x, da una línea recta cuya intersección en el eje y se define como 1/V_máx y la pendiente se define como K_m/V_máx. Ese gráfico se conoce como gráfico del doble recíproco o de Lineweaver-Burk (figura 8-6). Establecer el término y de la ecuación (36) igual a cero y resolver para x, revela que la intersección x es –1/K_m.

La K_m puede calcularse a partir de la pendiente y la intersección y, pero quizá se calcula más fácilmente a partir de la intersección x negativa.

La principal virtud del gráfico de Lineweaver-Burk reside en la facilidad con la cual puede usarse para determinar el mecanismo cinético de un inhibidor de enzima (véase más adelante). Sin embargo, al usar un gráfico doble recíproco para determinar constantes cinéticas es importante evitar la introducción de sesgo por la agrupación de datos a valores bajos de 1/[S]. Este sesgo puede evitarse con facilidad en el laboratorio como sigue: se prepara una solución de sustrato cuya dilución hacia una valoración producirá la concentración deseada máxima del sustrato. Ahora se preparan diluciones de la solución madre por factores de 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, etc. Los datos generados usando volúmenes iguales de estas diluciones caerán entonces en el eje 1/[S] a intervalos igualmente espaciados de 1, 2, 3, 4, 5, etc. También puede usarse un gráfico del recíproco único como el gráfico de Eadie-Hofstee (v_i vs. v_i/[S]) o el de Hanes-Woolf ([S]/v_i vs. [S]) para minimizar la agrupación de datos.

La constante catalítica, k_cat

Es factible usar varios parámetros para comparar la actividad relativa de diferentes enzimas o de distintas preparaciones de la misma enzima. La actividad de preparaciones de enzima impuras por lo general se expresa como actividad específica (V_máx dividida por la concentración de proteína). Para una enzima homogénea es posible calcular su número de recambio (V_máx dividida por los mol de enzima presentes). Sin embargo, si se conoce el número de sitios activos presentes, la actividad catalítica de una enzima homogénea se expresa mejor como su constante catalítica, k_cat (V_máx dividida por el número de sitios activos, S_t).

Dado que las unidades de concentración se anulan, las unidades de k_cat son tiempo recíproco.

Eficiencia catalítica, k_cat/K_m

¿Mediante qué medida se deben cuantificar y comparar la eficiencia de enzimas diferentes, sustratos diferentes para una enzima dada, y la eficiencia con la cual una enzima cataliza una reacción en las direcciones hacia adelante y hacia atrás? Si bien la capacidad máxima de una enzima dada para convertir sustrato en producto es importante, los beneficios de una k_cat alta sólo pueden obtenerse si la K_m es suficientemente baja. De este modo, la eficiencia catalítica de enzimas se expresa mejor en términos de la proporción de estas dos constantes cinéticas, k_cat/K_m.

Para ciertas enzimas, una vez que el sustrato se une al sitio activo, se convierte en producto y se libera con tanta rapidez como para hacer a estos eventos efectivamente instantáneos. Para estos catalíticos excepcionalmente eficientes, el paso limitante es la formación del complejo ES. Se dice que esas enzimas están limitadas por difusión, o que son perfectas desde el punto de vista catalítico, puesto que el índice de catálisis más rápido posible está determinado por el índice al cual las moléculas se mueven o difunden a través de la solución. Los ejemplos de enzimas para las cuales k_cat/K_m se aproxima al límite de difusión de 10⁸–10⁹ M^–1s^–1 incluyen la triosafosfato isomerasa, anhidrasa carbónica, acetilcolinesterasa y adenosina desaminasa.

En células vivas, el montaje de enzimas que catalizan reacciones sucesivas hacia complejos multiméricos puede evitar las limitaciones impuestas por la difusión. Las relaciones geométricas de las enzimas en estos complejos son tales que los sustratos y productos no se difunden hacia la solución de volumen sino hasta que se completa el último paso de la secuencia de pasos catalíticos. La ácido graso sintetasa extiende este concepto un paso más allá al fijar de manera covalente la cadena de ácido graso sustrato en crecimiento a una cadena de biotina que rota de un sitio activo a otro dentro del complejo hasta que se completa la síntesis de una molécula de ácido palmítico (capítulo 23).

La K_m puede aproximar una constante de unión

La afinidad de una enzima por su sustrato es la inversa de la constante de disociación K_d para la disociación del complejo de enzima-sustrato ES.

Dicho de otra manera, mientras menor es la tendencia a disociarse de la enzima y su sustrato, mayor es la afinidad de la enzima por su sustrato. Si bien la constante de Michaelis K_m a menudo aproxima la constante de disociación K_d, esto de ningún modo siempre es así. Para una reacción catalizada por enzima típica,

el valor de [S] que da v_i = V_máx/2 es

Cuando k₋₁ >> k₂, entonces

y

Por ende, 1/K_m sólo aproxima 1/K_d en condiciones en las cuales la asociación y disociación del complejo ES son rápidas en comparación con la catálisis. Para las muchas reacciones catalizadas por enzima para las cuales k₋₁ + k₂ no es aproximadamente igual a k₋₁, 1/K_m subestimará 1/K_d.

La ecuación de Hill describe la conducta de enzimas que muestran unión cooperativa de sustrato

Si bien casi todas las enzimas despliegan la cinética de saturación simple descrita en la figura 8-4, y se describen de manera adecuada mediante la expresión de Michaelis-Menten, algunas se unen a sus sustratos de una manera cooperativa, análoga a la unión de oxígeno por la hemoglobina (capítulo 6). La conducta cooperativa es una propiedad exclusiva de enzimas multiméricas que unen sustrato en múltiples sitios.

Para enzimas que despliegan cooperación positiva en la unión de sustrato, la forma de la curva que relaciona los cambios en v_i con los cambios en [S] es sigmoidea (figura 8-7). Ni la expresión de Michaelis-Menten ni sus gráficos derivados pueden usarse para evaluar cinética cooperativa. Por ende, los enzimólogos emplean una representación gráfica de la ecuación de Hill que en su origen fue obtenida para describir la unión cooperativa de O₂ por la hemoglobina. La ecuación (44) representa la ecuación de Hill dispuesta en una forma que predice una línea recta, donde k’ es una constante compleja:

La ecuación (44) declara que cuando [S] es bajo en comparación con k’, la velocidad de reacción inicial aumenta como la enésima potencia de [S].

Un gráfico de log v_i/(V_máx − v_i) contra log[S] da una línea recta (figura 8-8), donde la pendiente de la línea n es el coeficiente de Hill, y un parámetro empírico cuyo valor está en función del número, la clase y la fuerza de las interacciones de los sitios de unión a sustrato múltiples sobre la enzima. Cuando n = 1, todos los sitios de unión se comportan de manera independiente, y se observa conducta cinética de Michaelis-Menten simple. Si n es de más de 1, se dice que la enzima muestra cooperación positiva. La unión de sustrato a un sitio aumenta entonces la afinidad de los sitios restantes para unión a sulfato adicional. Mientras mayor es el valor para n, más alto es el grado de cooperación, y más sigmoideo será el gráfico de v_i contra [S]. Una perpendicular trazada desde el punto donde el término y log v_i/(V_máx − v_i) es cero interseca el eje x en una concentración de sustrato llamada S₅₀, la concentración de sustrato que da por resultado la mitad de la velocidad máxima. De este modo, S₅₀ es análoga a la P₅₀ para la unión de oxígeno a hemoglobina (capítulo 6).

Los inhibidores de las actividades catalíticas de enzimas proporcionan tanto agentes farmacológicos como recursos de investigación para estudiar el mecanismo de acción de las enzimas. La fuerza de la interacción entre un inhibidor y una enzima depende de las fuerzas importantes en la estructura de proteína y la unión de ligando (enlaces de hidrógeno, interacciones electrostáticas, interacciones hidrofóbicas y fuerzas de Van der Waals; capítulo 5). Los inhibidores pueden clasificarse con base en su sitio de acción en la enzima, en si producen modificación química de la enzima o en los parámetros de cinética sobre los cuales influyen. Los compuestos que imitan el estado de transición de una reacción catalizada por enzima (análogos de estado de transición) o que aprovechan la maquinaria catalítica de una enzima (inhibidores basados en mecanismo) pueden ser inhibidores en particular potentes. Desde el punto de vista cinético, se distinguen dos clases de inhibidores con base en si el aumento de la concentración de sustrato supera o no la inhibición.

Los inhibidores competitivos típicamente semejan sustratos

Los efectos de los inhibidores competitivos pueden superarse al aumentar la concentración de sustrato. Con mayor frecuencia, la inhibición competitiva del inhibidor (I) se une a la porción de unión a sustrato del sitio activo, lo que bloquea el acceso por el sustrato. Por ende, las estructuras de casi todos los inhibidores competitivos clásicos tienden a asemejarse a las estructuras de un sustrato y, así, se llaman análogos de sustrato. La inhibición de la enzima succinato deshidrogenasa por el malonato ilustra la inhibición competitiva por un análogo de sustrato. La succinato deshidrogenasa cataliza la eliminación de un átomo de hidrógeno de cada uno de los dos carbonos metileno del succinato (figura 8-9). Tanto el succinato como su análogo estructural malonato (⁻OOC—CH₂—COO⁻) pueden unirse al sitio activo de la succinato deshidrogenasa, lo que forma un complejo ES o uno EI, respectivamente. Sin embargo, dado que el malonato sólo contiene un átomo de metileno, no puede pasar por deshidrogenación. La formación y disociación del complejo EI es un proceso dinámico descrito por

para la cual la constante de equilibrio K_i es

En efecto, un inhibidor competitivo actúa al disminuir el número de moléculas de enzima libres disponibles para unión a sustrato, esto es, para formar ES y, así, finalmente para formar producto, como se describe a continuación:

Un inhibidor competitivo y sustrato ejercen efectos recíprocos sobre la concentración de los complejos EI y ES. Dado que la formación de complejos ES elimina enzima libre disponible para combinarse con el inhibidor, el aumento de [S] disminuye la concentración del complejo EI y aumenta la velocidad de reacción. El grado al cual [S] debe aumentarse para superar por completo la inhibición depende de la concentración del inhibidor presente, su afinidad por la enzima, K_i, y la afinidad, K_m, de la enzima por su sustrato.

Los gráficos del doble recíproco facilitan la evaluación de inhibidores

Los gráficos del doble recíproco distinguen entre inhibidores competitivos y no competitivos, y simplifican la evaluación de constantes de inhibición. v_i se determina a varias concentraciones de sustrato tanto en presencia como en ausencia de inhibidor. Para la inhibición competitiva clásica, las líneas que conectan los puntos experimentales convergen en el eje y (figura 8-10). Dado que la intersección y es igual a 1/V_máx, este modelo indica que cuando 1/[S] se aproxima a 0, v_i es independiente de la presencia de inhibidor. Sin embargo, note que la intersección en el eje x no varía con la concentración del inhibidor y que puesto que −1/K’ es de menor tamaño que 1/K_m, K’_m (la “K_m aparente”), se hace más grande en presencia de concentraciones cada vez mayores del inhibidor. De este modo, un inhibidor competitivo no tiene efecto sobre V_máx pero aumenta K’_m, la K_m aparente para el sustrato. Para la inhibición competitiva simple, la intersección en el eje x es

Una vez que K_m se ha determinado en ausencia de inhibidor, K_i puede calcularse a partir de la ecuación (47). Los valores de K_i se usan para comparar diferentes inhibidores de la misma enzima. Mientras más bajo es el valor para K_i, más eficaz es el inhibidor. Por ejemplo, los fármacos estatina que actúan como inhibidores competitivos de la HMG-CoA reductasa (capítulo 26) tienen valores de K_i de varios órdenes de magnitud más bajos que la K_m para el sustrato HMG-CoA.

Los inhibidores no competitivos simples disminuyen V_máx pero no afectan K_m

En la inhibición no competitiva estricta, la unión del inhibidor no afecta la unión de sustrato; por ende, es factible la formación de complejos tanto EI como EIS. Sin embargo, si bien el complejo inhibidor de enzima aún puede unirse a sustrato, su eficiencia para transformar sustrato en producto, reflejada por V_máx, está disminuida. Los inhibidores no competitivos unen enzimas en sitios distintos del sitio de unión a sustrato y por lo general muestran poca o ninguna semejanza estructural con el sustrato.

Para la inhibición no competitiva simple, E y EI poseen afinidad idéntica por el sustrato, y el complejo EIS genera producto a un índice insignificante (figura 8-11). La inhibición no competitiva más compleja ocurre cuando la unión del inhibidor afecta la afinidad aparente de la enzima por el sustrato, lo que hace que las líneas se intersequen en el tercer o cuarto cuadrante de un gráfico del doble recíproco (que no se muestra). Si bien ciertos inhibidores muestran características de una mezcla de inhibición competitiva y no competitiva, la evaluación de estos inhibidores va más allá del objetivo de este capítulo.

Gráfico de Dixon

A veces se emplea como una alternativa para el gráfico de Lineweaver-Burk, para determinar constantes de inhibición. La velocidad inicial (v_i) se mide a varias concentraciones de inhibidor, pero a una concentración fija de sustrato (S). Para un inhibidor competitivo o no competitivo simple, un gráfico de 1/v_i contra la concentración del inhibidor [I] da una línea recta. El experimento se repite a diferentes concentraciones fijas de sustratos. El conjunto de líneas resultantes interseca a la izquierda del eje y. Para inhibición competitiva, una perpendicular trazada hacia el eje x desde el punto de intersección de las líneas da –K_i (figura 8-12, arriba). Para inhibición no competitiva la intersección del eje x es –K_i (figura 8-12, abajo). En las publicaciones farmacéuticas a menudo se emplean gráficos de Dixon para ilustrar la potencia comparativa de inhibidores competitivos.

IC₅₀

Una alternativa menos rigurosa para K_i como una medida de la potencia inhibidora es la concentración de inhibidor que produce inhibición de 50%, IC₅₀. A diferencia de la constante de disociación de equilibrio K_i, el valor numérico de IC₅₀ varía en función de las circunstancias específicas de la concentración de sustratos, etc., bajo la cual se determina.

Inhibidores estrechamente unidos

Algunos inhibidores se unen a enzimas con afinidad tan alta, K_i ≤ 10⁻⁹ M, que la concentración de inhibidor requerida para medir K_i cae por debajo de la concentración de enzima típicamente presente en una valoración. En estas circunstancias, una fracción importante del inhibidor total puede estar presente como un complejo EI. De ser así, esto viola la suposición, implícita en cinética de estado estable clásica, de que la concentración de inhibidor libre es independiente de la concentración de enzima. El análisis cinético de estos inhibidores muy unidos requiere ecuaciones cinéticas especializadas que incorporan la concentración de enzima para estimar K_i o IC₅₀, y para distinguir entre inhibidores competitivos y no competitivos estrechamente unidos.

Los inhibidores irreversibles “envenenan” enzimas

En los ejemplos anteriores, los inhibidores forman un complejo disociable, dinámico, con la enzima; por ende, la enzima por completo activa puede recuperarse con tan sólo eliminar el inhibidor del medio circundante. Sin embargo, varios otros inhibidores actúan de manera irreversible al producir modificación química de la enzima. Estas modificaciones por lo general comprenden hacer o romper enlaces covalentes con residuos aminoacilo esenciales para la unión a sustrato, catálisis o mantenimiento de la conformación funcional de la enzima. Dado que estos cambios covalentes son hasta cierto punto estables, una enzima que ha sido “envenenada” por un inhibidor irreversible, como un átomo de metal pesado o un reactivo acilante, permanece inhibida incluso después de eliminar del medio circundante el inhibidor que resta.

Inhibición basada en mecanismo

Los inhibidores “basados en mecanismo” o “suicidas” son análogos de sustrato especializados que contienen un grupo químico que puede transformarse mediante la maquinaria catalítica de la enzima blanco. Después de la unión al sitio activo, la catálisis por la enzima genera un grupo muy reactivo que forma un enlace covalente con un residuo esencial desde el punto de vista catalítico, y bloquea la función del mismo. La especificidad y la persistencia de inhibidores suicidas, que son tanto específicos para enzima como no reactivos fuera de los confines del sitio activo de la enzima, los hacen promisorios para la creación de fármacos específicos para enzima. El análisis cinético de inhibidores suicidas está más allá del objetivo de este capítulo. Ni el método de Lineweaver-Burk ni el de Dixon son aplicables porque los inhibidores suicidas violan una condición limítrofe clave común a ambos métodos, a saber, que la actividad de la enzima no disminuye en el transcurso de la valoración.

Si bien muchas enzimas tienen un sustrato único, muchas otras tienen dos —y a veces más— sustratos y productos. Los principios fundamentales, ya comentados, si bien se ilustran para enzimas con un sustrato único, también aplican a enzimas con múltiples sustratos. Sin embargo, las expresiones matemáticas utilizadas para evaluar reacciones de múltiples sustratos son complejas. Aun cuando un análisis detallado del rango completo de reacciones de múltiples sustratos va más allá del objetivo de este capítulo, a continuación se consideran algunos aspectos comunes de conducta cinética para reacciones de dos sustratos y dos productos (llamadas reacciones “Bi-Bi”).

Reacciones secuenciales o de desplazamiento único

En reacciones secuenciales, ambos sustratos deben combinarse con la enzima para formar un complejo ternario antes de que pueda proceder la catálisis (figura 8-13, arriba). Las reacciones secuenciales a veces reciben el nombre de reacciones de desplazamiento único porque el grupo que se está transfiriendo por lo general pasa de manera directa, en un solo paso, desde un sustrato hacia el otro. Las reacciones Bi-Bi secuenciales pueden distinguirse más con base en si los dos sustratos se agregan en un orden al azar o en uno forzoso. Para reacciones de orden al azar, el sustrato A o el B puede combinarse primero con la enzima para formar un complejo EA o uno EB (figura 8-13, centro). En reacciones de orden forzoso, A debe combinarse primero con E antes de que B pueda combinarse con el complejo EA. Una explicación por la cual algunas enzimas emplean mecanismos de orden forzoso puede encontrarse en la hipótesis de la adaptación inducida de Koshland: la adición de A induce un cambio de conformación en la enzima que alinea residuos que reconocen B y se unen al mismo.

Reacciones de “ping-pong”

El término “ping-pong” aplica a mecanismos en los cuales uno o más productos son liberados desde la enzima antes de que se hayan añadido todos los sustratos. Las reacciones de “ping-pong” comprenden catálisis covalente y una forma transitoria, modificada, de la enzima (figura 7-4). Las reacciones Bi-Bi de “ping-pong” son reacciones de doble desplazamiento. El grupo que se transfiere primero es desplazado del sustrato A por la enzima para formar productos P y una forma modificada de la enzima (F). La transferencia de grupo subsiguiente desde F hacia el segundo sustrato B, que forma el producto Q y regenera E, constituye el segundo desplazamiento (figura 8-13, abajo).

Casi todas las reacciones Bi-Bi se conforman a la cinética de Michaelis-Menten

Casi todas las reacciones Bi-Bi se conforman a una forma un poco más compleja de cinética de Michaelis-Menten en la cual V_máx se refiere al índice de reacción que se alcanza cuando ambos sustratos están presentes a concentraciones que producen saturación. Cada sustrato tiene su propio valor K_m característico, que corresponde a la concentración que da la mitad de la velocidad máxima cuando el segundo sustrato está presente a concentraciones que producen saturación. Al igual que para las reacciones de un solo sustrato, pueden usarse gráficos del doble recíproco para determinar V_máx y K_m. v_i se mide como una función de la concentración de un sustrato (el sustrato variable), mientras que la concentración del otro sustrato (el sustrato fijo) se mantiene constante. Si las líneas obtenidas para varias concentraciones de sustrato fijo se grafican en el mismo gráfico, es posible distinguir entre un mecanismo “ping-pong”, que da líneas paralelas (figura 8-14), y un mecanismo secuencial, que da un modelo de líneas que se intersecan (no mostrado).

Los estudios de inhibición del producto se usan para complementar análisis cinéticos y distinguir entre reacciones Bi-Bi ordenadas y al azar. Por ejemplo, en una reacción Bi-Bi ordenada al azar, cada producto será un inhibidor competitivo en ausencia de sus coproductos al margen de cuál sustrato es designado como el sustrato variable. Sin embargo, para un mecanismo secuencial (figura 8-13, arriba), sólo el producto Q dará el modelo indicativo de inhibición competitiva cuando A es el sustrato variable, mientras que sólo el producto P producirá este modelo con B como el sustrato variable. Otras combinaciones de inhibidor del producto y sustrato variable producirán formas de inhibición no competitiva compleja.

Muchos fármacos actúan como inhibidores de enzimas

El objetivo de la farmacología es identificar agentes que pueden

1. Destruir o alterar el crecimiento, la invasividad o el desarrollo de agentes patógenos invasores.

2. Estimular mecanismos de defensa endógenos.

3. Suspender u obstaculizar procesos moleculares aberrantes desencadenados por estímulos genéticos, ambientales o biológicos, con perturbación mínima de las funciones celulares normales del huésped.

En virtud de sus diversas funciones fisiológicas y alto grado de selectividad de sustrato, las enzimas constituyen blancos naturales para la creación de fármacos que son tanto potentes como específicos. Los fármacos estatina, por ejemplo, disminuyen la producción de colesterol al inhibir la 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A reductasa (capítulo 26), mientras que la emtricitabina y el tenofovir disoproxil fumarato bloquean la replicación del HIV al inhibir una inverso transcriptasa viral (capítulo 34). La farmacoterapia de la hipertensión a menudo incluye la administración de un inhibidor de la enzima convertidora de angiotensina, lo que disminuye la concentración de angiotensina II, un vasoconstrictor (capítulo 42).

La cinética enzimática define condiciones de investigación apropiadas

La cinética enzimática tiene un papel crucial en el descubrimiento de fármacos. El conocimiento de la conducta cinética de la enzima de interés se necesita, ante todo, para seleccionar condiciones de valoración apropiadas que detectan con facilidad la presencia de un inhibidor. La concentración de sustrato, por ejemplo, debe ajustarse de modo que se genere suficiente producto para permitir la detección fácil de actividad de la enzima sin que sea tan alta que enmascare la presencia de un inhibidor. En segundo lugar, la cinética enzimática proporciona el medio para cuantificar y comparar la potencia de diferentes inhibidores y definir su modo de acción. Los inhibidores no competitivos son en particular deseables, porque —en contraste con los competitivos— sus efectos nunca pueden superarse por completo mediante incrementos de la concentración de sustrato.

Casi todos los fármacos se metabolizan in vivo

El desarrollo de fármacos a menudo comprende más que la evaluación cinética de la interacción de inhibidores con la enzima blanco. Para minimizar su dosificación efectiva y, por ende, el potencial de efectos secundarios perjudiciales, un fármaco necesita ser resistente a la degradación por enzimas presentes en el paciente o en el agente patógeno, un proceso llamado metabolismo de fármaco. Por ejemplo, la penicilina y otros antibióticos β-lactámicos bloquean la síntesis de la pared celular en bacterias al envenenar de manera irreversible la enzima alanil alanina carboxipeptidasa-transpeptidasa. Sin embargo, muchas bacterias producen β-lactamasas que hidrolizan la función beta-lactámica crucial en la penicilina y fármacos relacionados. Una estrategia para superar la resistencia a antibiótico resultante es administrar de manera simultánea un inhibidor de beta-lactamasa y un antibiótico beta-lactámico.

También se requiere a veces de transformación metabólica para convertir un precursor farmacológico inactivo, o profármaco, en su forma biológicamente activa (capítulo 47). El ácido 2’-desoxi-5-fluorouridílico, un potente inhibidor de la timidilato sintasa, un blanco común de la quimioterapia de cáncer, se produce a partir de 5- fluorouracilo por medio de una serie de transformaciones enzimáticas catalizadas por una fosforribosil transferasa y las enzimas de la vía de salvamento de desoxirribonucleósido (capítulo 33). El diseño y la administración eficaces de profármacos requieren conocimiento de la cinética y de los mecanismos de las enzimas encargadas de transformarlos en sus formas biológicamente activas.

• El estudio de la cinética enzimática —los factores que afectan los índices de reacciones catalizadas por enzima— revela los pasos individuales mediante los que las enzimas transforman sustratos en productos.

• La ΔG, el cambio general de la energía libre para una reacción, es independiente del mecanismo de reacción, y no proporciona información respecto a los índices de reacciones.

• La K_eq es una proporción de constantes de índice de reacción, se calcula a partir de las concentraciones de sustratos y productos en equilibrio, o a partir de la proporción k₁/k₋₁. Las enzimas no afectan la K_eq.

• Las reacciones proceden por medio de estados de transición en los cuales ΔG_F es la energía de activación. La temperatura, la concentración de ion hidrógeno, la concentración de enzima, la concentración de sustrato, y los inhibidores, afectan los índices de reacciones catalizadas por enzima.

• En la medición del índice de una reacción catalizada por enzima por lo general se emplean condiciones de índice iniciales, para las cuales la ausencia virtual de producto impide de forma efectiva que ocurra la reacción inversa.

• Las formas lineales de la ecuación de Michaelis-Menten simplifican la determinación de K_m y V_máx.

• Una forma lineal de la ecuación de Hill se usa para evaluar la cinética de unión a sustrato cooperativa mostrada por algunas enzimas multiméricas. La pendiente n, el coeficiente de Hill, refleja el número, la naturaleza y la fuerza de las interacciones de los sitios de unión a sustrato. Un valor de n de más de 1 indica cooperación positiva.

• Los efectos de inhibidores competitivos simples, que por lo general semejan sustratos, se superan al aumentar la concentración del sustrato. Los inhibidores no competitivos simples disminuyen la V_máx pero no afectan la K_m.

• Para inhibidores competitivos y no competitivos simples, la constante inhibitoria K_i es igual a la constante de disociación de equilibrio para el complejo de enzima-inhibidor relevante. Un término más simple y menos riguroso para evaluar la eficacia de un inhibidor es la IC₅₀, la concentración del inhibidor que produce inhibición de 50% en las circunstancias particulares del experimento.

• Los sustratos pueden añadirse en un orden al azar (cualquier sustrato puede combinarse primero con la enzima) y en un orden forzoso (el sustrato A debe unirse antes que el sustrato B).

• En reacciones de “ping-pong”, uno o más productos se liberan a partir de la enzima antes de que se hayan añadido todos los sustratos.

• La cinética enzimática aplicada facilita la identificación, caracterización y elucidación del modo de acción de fármacos que inhiben de manera selectiva enzimas específicas.

• La cinética enzimática desempeña un papel fundamental en el análisis y la optimización del metabolismo de fármacos, un determinante clave de la eficacia de estos últimos.