CAPÍTULO 13: La cadena respiratoria y fosforilación oxidativa

Los organismos aerobios pueden captar una proporción mucho mayor de la energía libre disponible de los sustratos respiratorios que los organismos anaerobios. La mayor parte de este proceso tiene lugar dentro de las mitocondrias, que se han denominado las “centrales de energía” de la célula. La respiración está acoplada a la generación del intermediario de alta energía, ATP (capítulo 11), por medio de fosforilación oxidativa. Diversos fármacos (p. ej., amobarbital) y venenos (p. ej., cianuro, monóxido de carbono) inhiben la fosforilación oxidativa, por lo general con consecuencias mortales. Se han señalado varios defectos hereditarios de las mitocondrias, que afectan componentes de la cadena respiratoria y la fosforilación oxidativa. Los pacientes muestran miopatía y encefalopatía, y suelen tener acidosis láctica.

La matriz mitocondrial está encerrada por una doble membrana. La membrana externa es permeable a casi todos los metabolitos, y la membrana interna es selectivamente permeable (figura 13-1). La membrana externa se caracteriza por la presencia de diversas enzimas, entre ellas la acil-CoA sintetasa y glicerolfosfato aciltransferasa. Otras enzimas, incluyendo la adenilil cinasa y la creatina cinasa se encuentran en el espacio intermembrana. El fosfolípido cardiolipina está concentrado en la membrana interna, junto con las enzimas de la cadena respiratoria, ATP sintasa y diversos transportadores de membrana.

Casi toda la energía que se libera durante la oxidación de carbohidratos, ácidos grasos y aminoácidos queda disponible dentro de las mitocondrias como equivalentes reductores (—H o electrones) (figura 13-2). Las enzimas del ciclo del ácido cítrico y la β-oxidación (capítulos 22 y 16), los complejos de la cadena respiratoria, y la maquinaria para la fosforilación oxidativa, se encuentran en las mitocondrias. La cadena respiratoria reúne y transporta equivalentes reductores, y los dirige hacia su reacción final con oxígeno para formar agua; la fosforilación oxidativa es el proceso mediante el cual la energía libre liberada se atrapa como fosfato de alta energía.

Los componentes de la cadena respiratoria están contenidos en cuatro complejos proteínicos grandes insertos en la membrana mitocondrial interna

Los electrones fluyen por la cadena respiratoria a través de un intervalo redox de 1.1 V desde NAD⁺/NADH hacia O₂/2H₂O (cuadro 12-1), y pasan por tres complejos proteínicos grandes: NADH-Q oxidorreductasa (complejo I), donde se transfieren electrones desde NADH hacia la coenzima Q (Q) (también llamada ubiquinona) (figura 13-6); Q-citocromo c oxidorreductasa (complejo III), que pasa los electrones hacia el citocromo c, y citocromo c oxidasa (complejo IV), que completa la cadena, pasa los electrones hacia O₂ y hace que se reduzca a H₂O (figura 13-3). Algunas sustancias con potenciales redox más positivos que NAD⁺/NADH (p. ej., succinato) pasan electrones hacia Q por medio de un cuarto complejo, la succinato-Q reductasa (complejo II), en lugar de mediante el complejo I. Los cuatro complejos están embebidos en la membrana mitocondrial interna, pero Q y citocromo c son móviles. Q se difunde con rapidez dentro de la membrana, mientras que el citocromo c es una proteína soluble. El flujo de electrones a través de los complejos I, III y IV da por resultado el bombeo de protones desde la matriz a través de la membrana mitocondrial interna hacia el espacio intermembrana (figura 13-7).

Las flavoproteínas y las proteínas hierro-azufre (Fe-S) son componentes de los complejos de la cadena respiratoria

Las flavoproteínas (capítulo 12) son componentes de importancia de los complejos I y II. El nucleótido flavina oxidado (FMN o FAD) puede reducirse en reacciones que involucran la transferencia de dos electrones (para formar FMNH₂ o FADH₂), pero también pueden aceptar un electrón para formar la semiquinona (figura 12-2). Las proteínas hierro-azufre (proteínas hierro no hem, Fe-S) se encuentran en los complejos I, II y III, los cuales pueden contener uno, dos o cuatro átomos de Fe enlazados a átomos de azufre inorgánico, o por medio de grupos de cisteína-SH a la proteína, o ambos (figura 13-4). Las Fe-S participan en reacciones de transferencia de un solo electrón en las cuales un átomo de Fe pasa por oxidorreducción entre Fe²⁺ y Fe³⁺.

Q acepta electrones mediante los complejos I y II

La NADH-Q oxidorreductasa o complejo I es una proteína grande, en forma de L, de múltiples subunidades, que cataliza la transferencia de electrones desde NADH hacia Q, junto con la transferencia de cuatro H⁺ a través de la membrana:

En un inicio los electrones se transfieren desde NADH hacia FMN, después hacia una serie de centros Fe-S y, por último, hacia Q (figura 13-5). En el complejo II (succinato-Q reductasa), se forma FADH₂ durante la conversión de succinato en fumarato en el ciclo del ácido cítrico (figura 16-3) y a continuación los electrones se pasan por medio de varios centros Fe-S hacia Q (figura 13-5). El glicerol-3-fosfato (generado en la desintegración de triacilgliceroles o a partir de la glucólisis, figura 17-2) y la acil-CoA también pasan electrones hacia Q mediante vías diferentes en que participan flavoproteínas (figura 13-5).

El ciclo Q acopla la transferencia de electrones al transporte de protones en el complejo III

Los electrones se pasan desde QH₂ hacia el citocromo c por medio del complejo III (Q-citocromo c oxidorreductasa):

Se cree que el proceso incluye citocromos c₁, b_L y b_H, y un Fe-S Rieske (un Fe-S poco común en el cual uno de los átomos de Fe está enlazado a dos residuos de histidina más que a dos residuos de cisteína) (figura 13-5), y se conoce como el ciclo Q (figura 13-6). Q puede existir en tres formas, la quinona oxidada, el quinol reducido o la semiquinona (figura 13-6). Esta última se forma de modo transitorio durante el ciclo, una vuelta del cual origina la oxidación de 2QH₂ a Q, lo que libera 4H⁺ hacia el espacio intermembrana, y la reducción de una Q a QH₂, lo que hace que 2H⁺ sean captados desde la matriz (figura 13-6). Note que aun cuando Q acarrea dos electrones, los citocromos acarrean sólo uno; de esta manera, la oxidación de un QH₂ está acoplada a la reducción de dos moléculas de citocromo c mediante el ciclo Q.

El oxígeno molecular se reduce hacia agua por medio del complejo IV

El complejo IV (citocromo c oxidasa) oxida el citocromo c reducido, con la reducción concomitante de O₂ hacia dos moléculas de agua:

Esta transferencia de cuatro electrones desde el citocromo c hacia O₂ comprende dos grupos hem, a y a₃, y Cu (figura 13-5). Los electrones se pasan inicialmente a un centro de Cu (Cu_A), que contiene átomos 2Cu enlazados a dos grupos proteína cisteína-SH (que semejan una Fe-S), luego en secuencia hacia hem a, hem a₃, un segundo centro de Cu, Cu_B, que está enlazado a hem a₃, y por último a O₂. De los ocho H⁺ eliminados de la matriz, cuatro se usan para formar dos moléculas de agua, y cuatro se bombean hacia el espacio intermembrana. De este modo, por cada par de electrones que pasa por la cadena desde NADH o FADH₂, el complejo IV bombea 2H⁺ a través de la membrana. El O₂ permanece estrechamente unido al complejo IV hasta que se reduce por completo, y esto minimiza la liberación de intermediarios en potencia perjudiciales, como aniones superóxido, o peróxido, que se forman cuando el O₂ acepta uno o dos electrones, respectivamente (capítulo 12).

El flujo de electrones por la cadena respiratoria genera ATP por medio del proceso de fosforilación oxidativa. La teoría quimiosmótica, propuesta por Peter Mitchell en 1961, postula que los dos procesos están acoplados mediante un gradiente de protón a través de la membrana mitocondrial interna, de manera que la fuerza motriz de protón causada por la diferencia de potencial electroquímico (negativa en el lado de la matriz) impulsa el mecanismo de síntesis de ATP. Como se mencionó, los complejos I, III y IV actúan como bombas de protones. Dado que la membrana mitocondrial interna es impermeable a iones en general, y en especial a protones, éstos se acumulan en el espacio intermembrana, lo que crea la fuerza motriz de protón predicha por la teoría quimiosmótica.

Una ATP sintasa ubicada en la membrana funciona como un motor rotatorio para formar ATP

La fuerza motriz de protón impulsa una ATP sintasa ubicada en la membrana que en presencia de P_i + ADP forma ATP. La ATP sintasa está embebida en la membrana interna, junto con los complejos de la cadena respiratoria (figura 13-7). Varias subunidades de la proteína forman una estructura parecida a bola alrededor de un eje conocido como F₁, que se proyecta hacia la matriz y contiene el mecanismo de fosforilación (figura 13-8). F₁ está fijo a un complejo de proteína de membrana conocido como F₀, que también consta de varias subunidades proteínicas. F₀ abarca la membrana y forma un canal de protones. El flujo de estos últimos a través de F₀ hace que rote, lo que impulsa la producción de ATP en el complejo F₁ (figuras 13-7 y 13-8). Se cree que esto ocurre por medio de un mecanismo de cambio de unión en el cual, a medida que el eje rota, la conformación de las subunidades β en F₁ cambia desde una que se une con firmeza al ATP hacia una que libera ATP y se une a ADP y P_i, de modo que puede formarse el siguiente ATP. Los estimados sugieren que por cada NADH oxidado, los complejos I y III translocan cuatro protones cada uno, y el complejo IV transloca dos.

El ADP captura, en forma de fosfato de alta energía, una proporción importante de la energía libre derivada de los procesos catabólicos. El ATP resultante se ha denominado la “moneda” de energía de la célula porque pasa esta energía libre para impulsar los procesos que requieren energía (figura 11-6).

Hay una captación directa neta de dos grupos fosfato de alta energía en las reacciones glucolíticas (cuadro 17-1). En el ciclo del ácido cítrico se captan dos fosfatos de alta energía más por mol de glucosa durante la conversión de succinil CoA en succinato (capítulo 16). Todas estas fosforilaciones sobrevienen en el ámbito de sustrato. Por cada mol de sustrato oxidado mediante los complejos I, III y IV en la cadena respiratoria (es decir, por medio de NADH), se forman 2.5 mol de ATP por cada 0.5 mol de O₂ consumido; esto es, la proporción P:O = 2.5 (figura 13-7). Por otra parte, cuando un mol de sustrato (p. ej., succinato o 3-fosfoglicerato) se oxida por medio de los complejos II, III y IV, sólo se forma 1.5 mol de ATP; es decir, P:O = 1.5. Estas reacciones se conocen como fosforilación oxidativa en el ámbito de la cadena respiratoria. Al tomar en cuenta estos valores, se estima que cerca de 90% de los fosfatos de alta energía producidos a partir de la oxidación completa de 1 mol de glucosa se obtiene mediante fosforilación oxidativa acoplada a la cadena respiratoria (cuadro 17-1).

El control respiratorio asegura un aporte constante de ATP

La disponibilidad de ADP puede controlar el índice de respiración de las mitocondrias, lo cual se debe a que la oxidación y fosforilación están firmemente acopladas; esto es, la oxidación no puede proceder por la cadena respiratoria sin fosforilación concomitante de ADP. En el cuadro 13-1 se muestran las cinco condiciones que controlan el índice de respiración en las mitocondrias. Casi todas las células en el estado en reposo se encuentran en estado 4, y la disponibilidad de ADP controla la respiración. Cuando se realiza trabajo, el ATP se convierte en ADP, lo que permite que ocurra más respiración que, a su vez, reabastece las reservas de ATP. En ciertas condiciones, la concentración de fosfato inorgánico también puede afectar el índice de funcionamiento de la cadena respiratoria. A medida que se incrementa la respiración (como durante ejercicio), la célula se aproxima al estado 3 o el estado 5 cuando la capacidad de la cadena respiratoria queda saturada o la PO₂ disminuye por debajo de la K_m para el hem a₃. También existe la posibilidad de que el transportador de ADP/ATP, que facilita la entrada de ADP citosólico a la mitocondria, y la salida de ATP desde esta última, se conviertan en el limitante de la velocidad.

De este modo, la manera en la cual los procesos oxidativos biológicos permiten que la energía libre resultante de la oxidación de alimento quede disponible para ser captada es por pasos, eficiente y controlada, en lugar de explosiva, ineficiente e incontrolada, como en muchos procesos biológicos. La energía libre restante que no se capta como fosfato de alta energía se libera como calor. Esto no necesita considerarse “desperdicio”, porque asegura que el sistema respiratorio en conjunto sea lo bastante exergónico como para que se saque de equilibrio, lo que permite el flujo unidireccional continuo y suministro constante de ATP. También contribuye al mantenimiento de la temperatura corporal.

Gran parte de la información acerca de la cadena respiratoria se ha obtenido por medio del uso de inhibidores y, a la inversa, esto ha proporcionado conocimiento respecto al mecanismo de acción de varios venenos (figura 13-9), mismos que se clasifican como inhibidores de la cadena respiratoria, inhibidores de la fosforilación oxidativa y desacopladores de esta última.

Los barbitúricos, como el amobarbital, inhiben el transporte de electrones mediante el complejo I al bloquear la transferencia desde Fe-S hacia Q. En dosificación suficiente, son mortales in vivo. La antimicina A y el dimercaprol inhiben la cadena respiratoria en el complejo III. Los venenos clásicos H₂S, monóxido de carbono y cianuro inhiben el complejo IV y, en consecuencia, pueden suspender por completo la respiración. El malonato es un inhibidor competitivo del complejo II.

El atractilósido inhibe la fosforilación oxidativa mediante la inhibición del transportador de ADP hacia dentro de la mitocondria, y de ATP hacia afuera de ella (figura 13-10). El antibiótico oligomicina bloquea por completo la oxidación y fosforilación al bloquear el flujo de protones por medio de la ATP sintasa (figura 13-9).

Los desacopladores disocian la oxidación en la cadena respiratoria, de la fosforilación (figura 13-7). Estos compuestos son tóxicos in vivo, lo que hace que la respiración se torne incontrolada, puesto que el índice ya no queda limitado por la concentración de ADP o P_i. El desacoplador que se ha usado con mayor frecuencia es el 2,4-dinitrofenol, pero otros compuestos actúan de manera similar. La termogenina (o la proteína desacopladora) es un desacoplador fisiológico que se encuentra en el tejido adiposo pardo que funciona para generar calor corporal, en particular para el recién nacido y durante la hibernación en animales (capítulo 25).

La diferencia de potencial electroquímico a través de la membrana, una vez establecida como resultado de translocación de protón, inhibe el transporte adicional de equivalentes reductores por la cadena respiratoria, a menos que se descargue por translocación retrógrada de protones a través de la membrana mediante la ATP sintasa. Esto, a su vez, depende de la disponibilidad de ADP y P_i.

Los desacopladores (p. ej., dinitrofenol) son anfipáticos (capítulo 21) y aumentan la permeabilidad de la membrana mitocondrial interna lipoide a protones, lo que reduce el potencial electroquímico y suscita cortocircuito de la ATP sintasa (figura 13-7). De este modo, la oxidación puede proceder sin fosforilación.

Sistemas de difusión de intercambio que incluyen proteínas transportadoras que abarcan la membrana están presentes en la misma para intercambio de aniones contra iones OH^– y cationes contra iones H⁺. Esos sistemas se necesitan para captación y salida de metabolitos ionizados, mientras que preservan los equilibrios eléctrico y osmótico. La membrana mitocondrial interna es libremente permeable a moléculas pequeñas no cargadas, como oxígeno, agua, CO₂, NH₃ y ácidos monocarboxílicos, como 3-hidroxibutírico, acetoacético y acético —sobre todo en su forma soluble más lípida—. Los ácidos grasos de cadena larga se transportan hacia las mitocondrias por medio del sistema de carnitina (figura 22-1), y hay también un acarreador especial para el piruvato que comprende un simporte que utiliza el gradiente de H⁺ desde afuera hacia dentro de la mitocondria (figura 13-10). Sin embargo, los aniones dicarboxilato y tricarboxilato (p. ej., malato, citrato) y los aminoácidos requieren sistemas transportadores o acarreadores específicos para facilitar su paso a través de la membrana. El transporte de aniones dicarboxilato y tricarboxilato está estrechamente enlazado con el de fosfato inorgánico, que penetra con facilidad como el ion H₂PO₄⁻ en intercambio por OH⁻. La captación neta de malato por el transportador dicarboxilato necesita fosfato inorgánico para intercambio en la dirección opuesta. La captación neta de citrato, isocitrato o cis-aconitato por el transportador tricarboxilato requiere malato a cambio. El transporte de α-cetoglutarato también exige un intercambio con malato. El transportador de nucleótido adenina permite el intercambio de ATP y ADP, no así de AMP. Es vital para permitir que el ATP salga de las mitocondrias hacia los sitios de utilización extramitocondrial y que ocurra el regreso de ADP para la producción de ATP dentro de la mitocondria (figura 13-11). Dado que en esta translocación se eliminan de la matriz cuatro cargas negativas por cada tres introducidas, el gradiente electroquímico a través de la membrana (la fuerza motriz de protón) favorece la exportación de ATP. El Na⁺ puede intercambiarse por H⁺, impulsado por el gradiente de protón. Se cree que la captación activa de Ca²⁺ por mitocondrias ocurre con una transferencia de carga neta de 1 (uniporte de Ca⁺), posiblemente por medio de un antiporte Ca²⁺/H⁺. La liberación de calcio a partir de las mitocondrias se facilita por intercambio con Na⁺.

Los ionóforos permiten que cationes específicos penetren en las membranas

Los ionóforos son moléculas lipofílicas que forman complejos con cationes específicos y facilitan su transporte a través de membranas biológicas, por ejemplo, valinomicina (K⁺). En realidad, los desacopladores clásicos como el dinitrofenol, son ionóforos de protón.

Una transhidrogenasa translocadora de protón es una fuente de NADPH intramitocondrial

La transhidrogenasa enlazada con energía, una proteína de la membrana mitocondrial interna, acopla el paso de protones por el gradiente electroquímico desde afuera hacia dentro de la mitocondria, con la transferencia de H desde NADH intramitocondrial hacia NADPH para enzimas intramitocondriales como glutamato deshidrogenasa e hidroxilasas incluidas en la síntesis de esteroide.

La oxidación de NADH extramitocondrial está mediada por transbordadores de sustrato

El NADH no puede penetrar en la membrana mitocondrial, sino que se produce de manera continua en el citosol por la 3-fosfogliceraldehído deshidrogenasa, una enzima en la secuencia de glucólisis (figura 17-2). Empero, en condiciones aeróbicas, el NADH extramitocondrial no se acumula, y se cree que la cadena respiratoria lo oxida en las mitocondrias. La transferencia de equivalentes reductores a través de la membrana mitocondrial requiere pares de sustrato, enlazados por deshidrogenasas idóneas a cada lado de la membrana mitocondrial. En la figura 13-12 se muestra el mecanismo de transferencia usando el transbordador de glicerofosfato. Puesto que la enzima mitocondrial está enlazada a la cadena respiratoria por medio de una flavoproteína más que por NAD, por cada átomo de oxígeno consumido sólo se forman 1.5 mol de ATP en lugar de 2.5. Si bien este transbordador está presente en algunos tejidos (p. ej., cerebro, músculo blanco), en otros (p. ej., músculo cardíaco) es deficiente. Por ende, se cree que el sistema del transbordador malato (figura 13-13) es de utilidad más universal. La complejidad de este sistema se debe a la impermeabilidad de la membrana mitocondrial al oxaloacetato, que debe reaccionar con el glutamato para formar aspartato y α-cetoglutarato mediante transaminación antes de transporte a través de la membrana mitocondrial y reconstitución hacia oxaloacetato en el citosol.

El transporte de ion en las mitocondrias está enlazado con energía

Las mitocondrias mantienen o acumulan cationes como K⁺, Na⁺, Ca²⁺, y Mg²⁺ y P_i. Se supone que una bomba de protón primaria impulsa el intercambio de catión.

El transbordador de creatina fosfato facilita el transporte de fosfato de alta energía desde mitocondrias

El transbordador de creatina fosfato (figura 13-14) incrementa las funciones de la creatina fosfato como un amortiguador de energía al actuar como un sistema dinámico para la transferencia de fosfato de alta energía desde mitocondrias en tejidos activos como el corazón y el músculo estriado. Una isoenzima de la creatina cinasa (CK_m) se encuentra en el espacio intermembrana mitocondrial, catalizando la transferencia de fosfato de alta energía hacia creatina desde ATP que surge a partir del transportador de nucleótido adenina. A su vez, la creatina fosfato se transporta hacia el citosol por medio de poros de proteína en la membrana mitocondrial externa, y queda disponible para la generación de ATP extramitocondrial.

La enfermedad conocida como miopatía mitocondrial mortal infantil con disfunción renal comprende decremento grave o falta de casi todas las oxidorreductasas de la cadena respiratoria. En el síndrome MELAS (del inglés Mitochondrial Encephalopathy, Lactic Acidosis and Stroke [mitencefalopatía, acidosis láctica y apoplejía mitocondriales]) es una enfermedad hereditaria debida a deficiencia de NADH-Q oxidorreductasa (complejo I) o citocromo oxidasa (complejo IV). Se produce por una mutación del DNA mitocondrial, y se cree que está involucrada en la enfermedad de Alzheimer y la diabetes mellitus. Diversos fármacos y venenos actúan por inhibición de la fosforilación oxidativa (vea antes).

• Casi toda la energía liberada partir de la oxidación de carbohidratos, grasas y proteínas se pone a disposición en las mitocondrias como equivalentes reductores (—H o e⁻), los cuales se encauzan hacia la cadena respiratoria, donde pasan por un gradiente redox de acarreadores hacia su reacción final con oxígeno para formar agua.

• Los acarreadores redox están agrupados en cuatro complejos de cadena respiratoria en la membrana mitocondrial interna. Tres de los cuatro complejos tienen la capacidad para usar la energía liberada en el gradiente redox para bombear protones hacia el exterior de la membrana, lo que crea un potencial electroquímico entre la matriz y el espacio de la membrana interna.

• La ATP sintasa abarca la membrana y actúa como un motor rotatorio usando la energía potencial del gradiente de protón o fuerza motriz de protón para sintetizar ATP a partir de ADP y P_i. De este modo, la oxidación está estrechamente acoplada a la fosforilación para satisfacer las necesidades de energía de las células.

• Dado que la membrana mitocondrial interna es impermeable a protones y otros iones, los transportadores de intercambio especiales abarcan la membrana para permitir que iones como OH⁻, ATP⁴⁻, ADP³⁻ y metabolitos, pasen sin descargar el gradiente electroquímico a través de la membrana.

• Muchos venenos bien conocidos, como el cianuro, suspenden la respiración mediante inhibición de la cadena respiratoria.