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Queda claro que la función primaria de la replicación del DNA es el suministro de progenie con la información genética poseída por el progenitor. De este modo, la replicación del DNA debe ser completa y efectuarse de tal manera que mantenga estabilidad genética dentro del organismo y la especie. El proceso de replicación del DNA es complejo y comprende muchas funciones celulares y varios procedimientos de verificación para asegurar fidelidad en la replicación. Alrededor de 30 proteínas participan en la replicación del cromosoma de Escherichia coli, y este proceso es más complejo en organismos eucarióticos. Arthur Kornberg hizo las primeras observaciones enzimológicas acerca de replicación de DNA; describió en E. coli la existencia de una enzima ahora denominada DNA polimerasa I. Esta enzima tiene múltiples actividades catalíticas, una estructura compleja, y un requerimiento de los trifosfatos de los cuatro desoxirribonucleósidos de adenina, guanina, citocina y timina. La reacción de polimerización catalizada por la DNA polimerasa I de E. coli ha servido como prototipo para todas las DNA polimerasas tanto de procariotas como de eucariotas, aun cuando ahora se reconoce que la principal función de esta polimerasa es la corrección de pruebas y la reparación.
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En todas las células, la replicación únicamente puede ocurrir a partir de una plantilla de DNA monocatenario (ssDNA). En consecuencia, debe haber mecanismos para dirigir el sitio de inicio de la replicación y para desenrollar el DNA bicatenario (dsDNA) en esa región. A continuación debe formarse el complejo de replicación. Luego de que se completa la replicación en un área, las cadenas madre e hija tienen que volver a formar dsDNA. En células eucarióticas se requiere un paso adicional. El dsDNA debe volver a formar la estructura de cromatina, incluso nucleosomas, que existió antes del inicio de la replicación. Aunque todo este proceso no se entiende por completo en células eucarióticas, la replicación se ha descrito con bastante exactitud en células procarióticas, y los principios generales son los mismos en ambas. Los principales pasos se listan en el cuadro 35-4, se ilustran en la figura 35-13, y se comentan, en secuencia, a continuación. Este proceso involucra varias proteínas, casi todas con acción enzimática específica (cuadro 35-5).
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El origen de la replicación
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En el origen de replicación (ori), hay una asociación de proteínas de unión a dsDNA específicas para secuencia, con una serie de secuencias de DNA repetidas directas. En el bacteriófago λ, el oriλ es unido por la proteína O codificada por λ a cuatro sitios adyacentes. En E. coli, el oriC es unido por la proteína dnaA. En ambos casos, se forma un complejo que consta de 150 a 250 bp de DNA y multímeros de la proteína de unión a DNA. Esto da pie a la desnaturalización y el desenrollado locales de una región de DNA rica en A+T. En células de levadura se han identificado secuencias de replicación autónoma (ARS) o replicadores, similares en el aspecto funcional. Las ARS contienen una secuencia de 11 bp un poco degenerada llamada el elemento de replicación de origen (ORE). El ORE se une a un grupo de proteínas, análogas a la proteína dnaA de E. coli; el grupo de proteínas se denomina en conjunto el complejo de reconocimiento de origen (ORC). Se han encontrado homólogos de ORC en todos los eucariotas examinados. El ORE está ubicado adyacente a una secuencia rica en A+T de unos 80 bp que es fácil de desenrollar, la cual recibe el nombre de elemento de desenrollado de DNA (DUE). El DUE es el origen de la replicación en levaduras, y es unido por el complejo de proteínas MCM.
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En células de mamífero no se ha logrado un consenso en la definición precisa de secuencias similares en estructura a ori o ARS, aun cuando se han identificado varias de las proteínas que participan en el reconocimiento y la función de ori, y parecen bastante similares a sus homólogos en levaduras tanto en secuencia de aminoácidos como en función.
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La interacción de proteínas con ori define el sitio de inicio de la replicación, y proporciona una región corta de ssDNA esencial para el inicio de la síntesis de la cadena de DNA naciente; este proceso necesita la formación de varias interacciones entre una proteína y otra, y entre proteína y DNA. Una DNA helicasa que permite el desenrollado procesivo de DNA proporciona un paso crítico. En E. coli no infectada, un complejo de dnaB helicasa y la proteína dnaC provee esta función. Proteínas de unión a DNA monocatenario (SSB) estabilizan este complejo. En E. coli infectada por λ fago, la proteína P del fago se une a dnaλ, y el complejo de P/dnaB se une a oriλ al interactuar con la proteína O. La dnaB no es una helicasa activa cuando está en el complejo de P/dnaB/O. Tres proteínas de choque por calor de E. coli (dnaK, dnaJ y GrpE) cooperan para eliminar la proteína P y activar la dnaB helicasa. En cooperación con SSB, esto lleva al desenrollado y replicación activa del DNA. Así, la replicación del fago λ se logra a expensas de la replicación de la célula de E. coli huésped.
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Formación de la horquilla de replicación
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Una horquilla de replicación consta de cuatro componentes que se forman en la secuencia que sigue: 1) la DNA helicasa desenrolla un segmento corto del DNA dúplex madre; 2) una primasa inicia la síntesis de una molécula de RNA que es esencial para preparar la síntesis de DNA; 3) la DNA polimerasa inicia la síntesis de la cadena hija, naciente, y 4) las SSB se unen al ssDNA y evitan el retemplado prematuro de ssDNA hacia dsDNA. Dichas reacciones se ilustran en la figura 35-13.
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La enzima DNA polimerasa III (el producto del gen dnaE en E. coli) se une a DNA plantilla como parte de un complejo de múltiples proteínas que consta de varios factores accesorios de polimerasa (β, γ, δ, δ′ y τ). Las DNA polimerasas sólo sintetizan DNA en la dirección 5′ a 3′, y únicamente uno de los varios tipos diferentes de polimerasas participa en la horquilla de replicación. Puesto que las cadenas de DNA son antiparalelas (capítulo 34), la polimerasa funciona de modo asimétrico. En la cadena adelantada (hacia adelante, también denominada cadena líder, guía o conductora), el DNA se sintetiza de manera continua. En la cadena retrasada (retrógrada, también llamada cadena rezagada o retardada), el DNA se sintetiza en fragmentos cortos (1 a 5 kb; figura 35-16), los denominados fragmentos de Okazaki, llamada así en honor al científico que las descubrió. Varios fragmentos Okazaki (hasta 1 000) deben sintetizarse de modo secuencial para cada horquilla de replicación. Con el fin de asegurar que esto suceda, la helicasa actúa sobre la cadena retrasada para desenrollar dsDNA en una dirección 5′ a 3′. La helicasa se asocia con la primasa para permitir a esta última acceso apropiado a la plantilla; lo anterior permite que sea formado el preparador de RNA y, a su vez, que la polimerasa empiece a replicar el DNA. Se trata de una secuencia de reacción importante dado que las DNA polimerasas no pueden iniciar la síntesis de DNA de novo. El complejo móvil entre helicasa y primasa se ha llamado un primosoma. Conforme se completa la síntesis de un fragmento de Okazaki y se libera la polimerasa, se ha sintetizado un nuevo preparador. La misma molécula de polimerasa permanece asociada con la horquilla de replicación, y procede a sintetizar el siguiente fragmento de Okazaki.
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El complejo de DNA polimerasa
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Varias moléculas de DNA polimerasa diferentes se encargan de la replicación de DNA y comparten tres propiedades importantes: 1) alargamiento de cadena, 2) procesividad y 3) corrección de pruebas. El alargamiento de cadena explica el índice (en nucleótidos por segundo, nt/s) al cual ocurre la polimerización. La procesividad es una expresión del número de nucleótidos añadidos a la cadena naciente antes de que la polimerasa se separe de la plantilla. La función de corrección de pruebas identifica errores de copiado y los corrige. En E. coli, la DNA polimerasa III (pol III) funciona en la horquilla de replicación. De todas las polimerasas, cataliza el índice más alto de alargamiento de cadena, y es la más procesiva. Tiene la capacidad de polimerizar 0.5 Mb de DNA durante un ciclo en la cadena adelantada. La Pol III es un complejo proteínico de múltiples subunidades, grande (> 1 MDa), en E. coli. La DNA pol III se asocia con las dos subunidades b idénticas de la “abrazadera” de deslizamiento de DNA; esta asociación aumenta de manera notoria la estabilidad del complejo de pol III-DNA, la procesividad (100 ntd a > 50 000 ntd) y el índice de alargamiento de cadena (20 a 50 ntd/s), lo que genera el alto grado de procesividad que demuestra la enzima.
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Las polimerasas I (pol I) y II (pol II) participan en su mayor parte en la corrección de pruebas y la reparación de DNA. Las células eucarióticas tienen homólogos para cada una de estas enzimas, más un número grande de DNA polimerasas adicionales que participan de modo primario en la reparación del DNA. El cuadro 35-6 muestra una comparación.
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En células de mamífero, la polimerasa tiene la capacidad de polimerizar a un índice que es un poco más lento que el índice de polimerización de desoxinucleótidos por el complejo de DNA polimerasa bacteriano. Este índice disminuido quizá depende de interferencia por nucleosomas.
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Inicio y alargamiento de la síntesis de DNA
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El inicio de la síntesis de DNA (figura 35-14) requiere preparación por un tramo corto de RNA, de alrededor de 10 a 200 nucleótidos de largo. En E. coli esto es catalizado por la dnaG (primasa); en eucariotas la DNA Pol α sintetiza estos preparadores de RNA. El proceso de preparación incluye ataque nucleofílico por el grupo 3′-hidroxilo del preparador de RNA sobre el fosfato del desoxinucleósido trifosfato que entra primero (N en la figura 35-14) con separación de pirofosfato; esta transición hacia síntesis de DNA es catalizada por las DNA polimerasas apropiadas (DNA pol III en E. coli; DNA pol δ y ε en eucariotas). El grupo 3′-hidroxilo del desoxirribonucleósido monofosfato recientemente fijado queda libre entonces para llevar a cabo un ataque nucleofílico sobre el siguiente desoxirribonucleósido trifosfato que entre (N + 1 en la figura 35-14), de nuevo en su porción fosfato α, con la separación de pirofosfato. Por supuesto, la selección del desoxirribonucleótido apropiado cuyo grupo 3′-hidroxilo terminal va a ser atacado depende de la formación apropiada de pares de bases con la otra cadena de la molécula de DNA de acuerdo con las reglas de pareo de bases de Watson y Crick (figura 35-15). Cuando una porción adenina desoxirribonucleósido monofosforilo está en la posición de plantilla, una timidina trifosfato entrará, y el grupo 3′-hidroxilo del desoxirribonucleósido monofosforilo añadido más recientemente al polímero atacará su fosfato α. Por medio de este proceso por pasos, la plantilla dicta cuál desoxirribonucleósido trifosfato es complementario, y mediante enlaces de hidrógeno lo sostiene en su sitio mientras el grupo 3′-hidroxilo de la cadena en crecimiento ataca e incorpora el nuevo nucleótido hacia el polímero. Estos segmentos de DNA fijos a un componente iniciador de RNA son los fragmentos de Okazaki (figura 35-16). En mamíferos, después de que se generan muchos de estos fragmentos, el complejo de replicación empieza a eliminar los preparadores de RNA, a llenar las brechas dejadas por su eliminación con el desoxinucleótido pareado con base apropiado, y luego a sellar los fragmentos de DNA recién sintetizado, por medio de enzimas denominadas DNA ligasas.
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La replicación muestra polaridad
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Como se mencionó, las moléculas de DNA son bicatenarias, y las dos cadenas son antiparalelas. La replicación de DNA en procariotas y eucariotas sucede en ambas cadenas a la vez; sin embargo, una enzima que tiene la capacidad de polimerizar DNA en la dirección 3′ a 5′ no existe en organismo alguno, de manera que las dos cadenas de DNA recién replicadas no pueden crecer en la misma dirección de modo simultáneo. Sin embargo, en bacterias la misma enzima replica ambas cadenas al mismo tiempo (en eucariontes Pol ε y Pol δ catalizan la síntesis de las cadenas adelantada y retrasada; cuadro 35-6. La enzima única replica una cadena (“cadena adelantada”) de una manera continua en la dirección 5′ a 3′, con la misma dirección anterógrada general. Replica la otra cadena (“cadena retrasada”) de modo discontinuo mientras polimeriza los nucleótidos en sucesiones cortas de 150 a 250 nucleótidos, de nuevo en la dirección 5′ a 3′, pero al mismo tiempo mira hacia el extremo posterior del preparador de RNA precedente en lugar de hacia la porción no replicada. Este proceso de síntesis de DNA semidiscontinua se muestra en un diagrama en las figuras 35-13 y 35-16.
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Formación de burbujas de replicación
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La replicación del cromosoma bacteriano circular, compuesto de aproximadamente 5 × 106 bp de DNA procede desde un ori único. Este proceso se completa en alrededor de 30 minutos, un índice de replicación de 3 × 105 bp/min. El genoma de mamífero completo se replica en aproximadamente 9 horas, el periodo promedio requerido para la formación de un genoma tetraploide a partir de un genoma diploide en una célula en replicación. Si un genoma de mamífero (3 × 109 bp) se replica al mismo índice que en las bacterias (es decir, 3 × 105 bp/min) a partir de un ori único, la replicación tardaría ¡más de 150 horas! Los organismos metazoarios sortean este problema usando dos estrategias. En primer lugar, la replicación es bidireccional. En segundo lugar, la replicación procede desde orígenes múltiples en cada cromosoma (un total de hasta 100 en seres humanos). De esta manera, la replicación se produce en ambas direcciones a lo largo de todos los cromosomas, y ambas cadenas se replican a la vez. Este proceso de replicación genera “burbujas de replicación” (figura 35-17).
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Los múltiples sitios que sirven como orígenes para la replicación de DNA en eucariotas están poco definidos, excepto en algunos virus de animales, y en levaduras. Con todo, está claro que el inicio está regulado en los aspectos tanto espacial como temporal, puesto que agrupaciones de sitios adyacentes inician la replicación de modo sincrónico. La activación de la replicación, o el inicio de la replicación de DNA en un replicador/ori, está influida por varias propiedades bien determinadas de la estructura de cromatina, que apenas están empezando a entenderse. Aun así, está claro que hay más replicadores y ORC excesivo que los necesarios para replicar el genoma de mamíferos dentro del tiempo de una fase S típica; por ende, debe haber mecanismos para controlar el exceso de replicadores unidos a ORC. El entendimiento del control de la formación de complejos de replicación y la activación de los mismos es uno de los principales desafíos en este campo.
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Durante la replicación de DNA, debe haber una separación de las dos cadenas para permitir que cada una sirva como una plantilla al unir con hidrógeno sus bases nucleótido al desoxinucleótido trifosfato que está entrando. La separación de las cadenas de DNA es promovida por SSB en E. coli, una proteína llamada proteína de replicación A (RPA) en eucariotas; estas moléculas estabilizan la estructura monocatenaria a medida que progresa la horquilla de replicación. Las proteínas estabilizantes se unen de manera cooperadora y estequiométrica a las cadenas únicas sin interferir con las capacidades de los nucleótidos para servir como plantillas (figura 35-13). Además de separar las dos cadenas de la doble hélice, debe haber un desenrollado de la molécula (1 vez cada 10 pares de nucleótidos) para permitir la separación de cadena. El complejo proteínico de DNA β hexamérico desenrolla DNA en E. coli, mientras que el complejo de MCM hexamérico desenrolla el DNA eucariótico. Este desenrollado ocurre en segmentos adyacentes a la burbuja de replicación; para contrarrestarlo hay múltiples “uniones giratorias” entremezcladas en las moléculas de DNA de todos los organismos. La función de giro es proporcionada por enzimas específicas que introducen “muescas” en una cadena de la doble hélice que se está desenrollando, lo que permite que proceda el proceso de desenrollado. Las muescas se vuelven a sellar con rapidez y sin requerir ingreso de energía, debido a la formación de un enlace covalente de alta energía entre el esqueleto de fosfodiéster que tiene la muesca y la enzima de resellado de muescas; este último tipo de enzima recibe el nombre de DNA topoisomerasas. Dicho proceso se describe en un diagrama en la figura 35-18, y ahí se compara con el resellado dependiente de ATP llevado a cabo por las DNA ligasas. Las topoisomerasas también tienen la capacidad de desenrollar DNA superenrollado; éste es una estructura de orden superior que se encuentra en moléculas de DNA circulares envueltas alrededor de un centro (figuras 35-2 y 35-19).
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En una especie de virus de animales (retrovirus) hay una clase de enzimas capaz de sintetizar una molécula de DNA monocatenaria y después una bicatenaria a partir de una plantilla de RNA monocatenario. Esta polimerasa, la DNA polimerasa dependiente de RNA, o “transcriptasa inversa”, sintetiza primero una molécula híbrida de DNA-RNA utilizando el genoma de RNA como una plantilla. Una nucleasa codificada por virus específica, la RNasa H, degrada a la cadena de RNA plantilla hibridada y la cadena de DNA restante, a su vez, sirve como una plantilla para formar una molécula de dsDNA que contiene la información originalmente presente en el genoma RNA del virus de animal.
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Reconstitución de la estructura de cromatina
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Hay evidencia de que la organización nuclear y la estructura de cromatina están involucradas en la determinación de la regulación y el inicio de la síntesis de DNA. Como se comentó, el índice de polimerización en células eucarióticas, que tienen cromatina y nucleosomas, es más lento que el que se observa en células procariotas, que carecen de cromosomas canónicos. También está claro que la estructura de cromatina debe volver a formarse luego de la replicación. El DNA recién replicado se monta con rapidez hacia nucleosomas, y los octámeros de histonas preexistentes y recién montados se distribuyen al azar hacia cada brazo de la horquilla de replicación. Estas reacciones se facilitan mediante las acciones de proteínas chaperón de histona que trabajan conjuntamente con complejos remodeladores de cromatina.
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El DNA se sintetiza durante la fase S del ciclo celular
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En células de animales, incluso células de humanos, el genoma de DNA sólo se replica en un momento especificado en el transcurso del lapso de vida de las células. Este periodo se llama la fase sintética o S. Esto por lo general está separado temporalmente de la fase mitótica o fase M, por periodos no sintéticos denominados fases gap 1 (G1) y gap 2 (G2), que ocurren antes y después de la fase S, respectivamente (figura 35-20). Entre otras cosas, la célula se prepara para la síntesis de DNA durante G1, y para la mitosis durante G2. La célula regula el proceso de síntesis de DNA al permitir que únicamente suceda una vez por ciclo celular y sólo en momentos específicos y en su mayor parte en células que se están preparando para dividirse por medio de un proceso mitótico.
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Todas las células eucarióticas tienen productos de gen que rigen la transición desde una fase del ciclo celular hacia la otra. Las ciclinas son una familia de proteínas cuya concentración se incrementa y disminuye en momentos específicos, esto es, en el “ciclo” durante el ciclo celular (de ahí su nombre). Las ciclinas activan, en el momento apropiado, diferentes proteína cinasas dependientes de ciclina (CDK) que fosforilan sustratos esenciales para la progresión por el ciclo celular (figura 35-21). Por ejemplo, Las cifras de ciclina D aumentan al final de la fase G1 y permiten la progresión más allá del punto de inicio (levadura) o de restricción (mamíferos), donde las células proceden de modo irrevocable hacia la fase S o de síntesis de DNA.
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Las ciclinas D activan CDK4 y CDK6; estas dos cinasas también se sintetizan en el transcurso de G1 en células que se están dividiendo de manera activa. Las ciclinas D y CDK4 y CDK6 son proteínas nucleares que se montan como un complejo al final de la fase G1. El complejo ciclina-CDK es ahora una serina-treonina proteína cinasa activa. Un sustrato para esta cinasa es la proteína de retinoblastoma (Rb). La Rb es un regulador del ciclo celular porque se une α, y desactiva, un factor de transcripción (E2F) necesario para la transcripción de ciertos genes (genes que codifican para histona, proteínas de replicación de DNA, etc.) necesarios para la progresión desde la fase G1 hacia la S. La fosforilación de Rb por CDK4 o CDK6 produce liberación de E2F desde Rb por represión de la transcripción mediada por Rb; de este modo, surge activación de gen, y tiene lugar progresión del ciclo celular.
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Otras ciclinas y CDK participan en diferentes aspectos de la progresión del ciclo celular (cuadro 35-7). La ciclina E y la CDK2 forman un complejo al final de G1. La ciclina E se degrada con rapidez, y la CDK2 liberada a continuación forma un complejo con la ciclina A. Esta secuencia es necesaria para el inicio de la síntesis de DNA durante la fase S. Un complejo entre ciclina B y CDK1 es limitante para la transición G2/M en células eucarióticas.
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Muchos de los virus que ocasionan cáncer (oncovirus) y de los genes que inducen cáncer (oncogenes) tienen la capacidad para aliviar o alterar la restricción manifiesta que normalmente controla la entrada de células de mamífero desde la fase G1 hacia la S. Con base en lo anterior, podría haberse conjeturado que la producción excesiva de una ciclina, la pérdida de un inhibidor de CDK específico (véase más adelante), o la producción o activación de una ciclina/CDK en un momento inapropiado podría traducirse en división celular anormal o irrestricta. En este contexto cabe hacer notar que el oncogén bcl vinculado con el linfoma de células B parece ser el gen que codifica para la ciclina D1. De modo similar, las oncoproteínas (o proteínas transformadoras) producidas por varios virus DNA establecen como objetivo el represor de la transcripción Rb para desactivación, lo que induce división celular de manera inapropiada, mientras que la desactivación de Rb, que por sí mismo es un gen supresor tumoral, lleva a crecimiento celular descontrolado y formación de tumores.
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En el transcurso de la fase S, las células de mamífero contienen cantidades más grandes de DNA polimerasa que durante las fases no sintéticas del ciclo celular. Más aún, también hay incremento de la actividad de las enzimas de las cuales depende la formación de los sustratos para la síntesis de DNA (es decir, desoxirribonucleósido trifosfatos) y su actividad disminuirá luego de la fase sintética en tanto no reaparezca la señal para síntesis renovada de DNA. En el transcurso de la fase S, el DNA nuclear se replica por completo una vez y sólo una vez. Una vez que la cromatina se ha replicado, se marca de manera que se impida su replicación adicional en tanto no pase otra vez por mitosis. Este proceso se denomina emisión de licencia para la replicación. Los mecanismos moleculares para este fenómeno parecen comprender disociación, o fosforilación de ciclina-CDK, o ambas, y degradación subsiguiente de varias proteínas de unión a origen que desempeñan funciones cruciales en la formación de complejo de replicación. En consecuencia, los orígenes sólo se activan una vez por cada ciclo celular.
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En general, un par dado de cromosomas se replican de manera simultánea y dentro de una porción fija de la fase S en el momento de cada replicación. En un cromosoma, agrupaciones de unidades de replicación se replican de modo coordinado. Se desconoce la naturaleza de las señales que regulan la síntesis de DNA a estos niveles, pero la regulación parece ser una propiedad intrínseca de cada cromosoma individual que está mediada por los varios orígenes de replicación contenidos ahí.
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Todos los organismos contienen mecanismos complejos, conservados desde el punto de vista evolutivo, para reparar DNA dañado
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La reparación de DNA dañado es crucial para mantener la integridad genómica y, así, evitar la propagación de mutaciones, sea de modo horizontal, es decir, cambios de secuencia de DNA en células somáticas, o vertical, en la cual lesiones no reparadas están presentes en el DNA de espermatozoide o de ovocito y, por ende, pueden transmitirse a la progenie. El DNA queda sujeto a diario a una enorme gama de lesiones de origen químico, físico y biológico (cuadro 35-8), de ahí que el reconocimiento de lesiones del DNA y la reparación de las mismas sea esencial. En consecuencia, las células eucariontes contienen cinco vías principales de reparación del DNA, cada una de las cuales contiene múltiples proteínas a veces compartidas; estas proteínas de reparación del DNA típicamente tienen ortólogos en procariontes. Los mecanismos de reparación del DNA son las vías de reparación: reparación por escisión de nucleótido (NER); reparación de errores de emparejamiento (MMR); reparación por escisión de bases (BER); recombinación homóloga (HR) y unión de extremo no homólogo (NHEJ) (figura 35-22). La naturaleza ha efectuado el experimento de probar la importancia de muchas de estas proteínas de reparación del DNA para las características biológicas del humano —las mutaciones en un gran número de estos genes llevan a enfermedad de humanos (cuadro 35-9) (capítulo 39)—. Más aún, experimentos dirigidos a gen sistemáticos con ratones de laboratorio también han atribuido claramente a estos genes funciones cruciales de mantenimiento de la integridad del gen. En estudios de genética de ratones, se observó que de hecho las mutaciones dirigidas dentro de estos genes inducen defectos de la reparación del DNA, mientras que a menudo también aumentan de manera notoria la susceptibilidad a cáncer.
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Uno de los mecanismos de reparación de DNA estudiados de manera más intensiva es el mecanismo que se usa para reparar roturas bicatenarias de DNA (DSB); lo que se comenta con cierto detalle aquí. Las células eucariontes utilizan dos vías, HR y NHEJ, para eliminar DSB. La elección entre las dos depende de la fase del ciclo celular (figuras 35-20 y 35-21) y del tipo exacto de DSB que va a repararse (cuadro 35-8). Durante las fases G0/G1 del ciclo celular, las DSB son corregidas mediante la vía NHEJ, mientras que durante las fases S, y G2/M del ciclo celular, se utiliza HR. Todos los pasos de la reparación del daño del DNA son catalizados por moléculas evolutivamente conservadas, que incluyen detectores de daño de DNA, transductores y mediadores de reparación del daño. En conjunto, estas cascadas de proteínas participan en la respuesta celular al daño del DNA. Es importante que los resultados celulares finales del daño del DNA, y los intentos celulares por reparar el daño del DNA, varían desde retraso del ciclo celular para permitir que haya reparación del DNA; paro del ciclo celular, hasta apoptosis o senescencia (figura 35-23; detalles más adelante). Las moléculas involucradas en estos procesos complejos y altamente integrados varían desde modificaciones de histona específicas para daño (esto es, lisina dimetilada 20 histona H4; H4K20me2) y la incorporación de variantes de isotipo de histona, como histona H2AX (cuadro 35-1), poli ADP ribosa polimerasa, PARP, el complejo proteínico MRN (subunidades Mre11-Rad50-NBS1), hasta proteínas de reconocimiento/emisión de señales de cinasa activadas por daño de DNA (ATM [ataxia telangiectasia, mutada] y cinasa relacionada con ATM, ATR, la proteína cinasa dependiente de DNA de múltiples subunidades [DNA-PK y Ku70/80], y cinasas de punto de control 1 y 2 [CHK1, CHK2]). Estas cinasas múltiples fosforilan y, en consecuencia, modulan las actividades de docenas de proteínas, como muchas proteínas de reparación de DNA, de verificación de punto de control, y de control del ciclo celular, como CDC25A, B, C, Wee1, p21, p16 y p19 (todas reguladores de ciclina-CDK [figura 9-8 y véase más adelante]; diversas exonucleasas y endonucleasas; proteínas de unión a DNA específicas para cadena única de DNA [RPA]; PCNA y DNA polimerasas específicas [DNA pol delta, δ, y eta, η]). Varios de estos (tipos) de proteínas/enzimas se han comentado antes en el contexto de la replicación del DNA. La reparación del DNA y su relación con el control del ciclo celular son áreas de investigación muy activas dados los papeles fundamentales en la biología celular y el potencial para generar cáncer y para prevenirlo.
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La integridad del DNA y de cromosomas se monitorea de principio a fin del ciclo celular
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Dada la importancia de la función normal del DNA y de los cromosomas para la supervivencia, no sorprende que las células eucarióticas hayan creado mecanismos complejos para monitorear la integridad del material genético. Como se detalló, varios sistemas de enzimas de múltiples subunidades, complejos, han aparecido por evolución para reparar DNA dañado en el ámbito de secuencia de nucleótido. De modo similar, los percances de DNA en el ámbito de cromosoma también se monitorean y reparan. La integridad tanto del DNA como de los cromosomas se monitorea de manera continua durante todo el ciclo celular (figura 35-20). Los cuatro pasos específicos en los cuales ocurre este monitoreo se han llamado puntos de control. Si se detectan problemas en alguno de estos puntos, la progresión por el ciclo se interrumpe, y el tránsito por el ciclo celular se suspende en tanto no se repara el daño. Los mecanismos moleculares que fundamentan la detección del daño de DNA en el transcurso de las fases G1 y G2 del ciclo se entienden mejor que los que operan durante las fases S y M.
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El supresor tumoral p53, una proteína de peso molecular de 53 kDa aparente en SDS-PAGE, desempeña un papel clave en la verificación del punto de control tanto de G1 como de G2. Normalmente una proteína muy inestable, p53 es un factor de transcripción de unión a DNA, una de una familia de proteínas relacionadas (esto es, p53, p63 y p73), que de algún modo se estabiliza en respuesta a daño de DNA, quizá por interacciones p53-DNA directas. Al igual que las histonas antes comentadas, p53 está sujeta a una panoplia de PTM reguladoras, todas las cuales probablemente modifican sus múltiples actividades biológicas. Las concentraciones incrementadas de p53 activan la transcripción de un montaje de genes que sirven en conjunto para retrasar el tránsito por el ciclo. Una de estas proteínas inducidas, p21, es un potente inhibidor de la CDK-ciclina (CKI) que tiene la capacidad para inhibir con eficiencia la acción de todas las CDK. Está claro que la inhibición de las CDK suspenderá la progresión por el ciclo celular (figuras 35-19 y 35-20). Si el daño del DNA es demasiado extenso como para que se repare, las células afectadas sufren apoptosis (muerte celular programada) de una manera dependiente de p53. En este caso, p53 induce la activación de un conjunto de genes que inducen a apoptosis. Las células que carecen de p53 funcional no pasan por apoptosis en respuesta a cifras altas de radiación o de quimioterápicos activos en el DNA. Entonces, tal vez no sorprende que p53 sea uno de los genes mutados con mayor frecuencia en cánceres de seres humanos (capítulo 56). De hecho, estudios de secuenciación genómica recientes de múltiples muestras de DNA tumoral sugieren que más de 80% de los cánceres de ser humano porta mutaciones de pérdida de función de p53. La investigación adicional sobre los mecanismos de manejo de punto de control resultará inestimable para la creación de opciones terapéuticas eficaces contra el cáncer.