CAPÍTULO 35: Organización, replicación y reparación del DNA

La información genética en el DNA de un cromosoma puede transmitirse por medio de replicación precisa, o se puede intercambiar mediante diversos procesos, entre ellos entrecruzamiento, recombinación, transposición y conversión. Éstos proporcionan un medio para asegurar la adaptabilidad y diversidad para el organismo pero, cuando estos procesos salen mal, también pueden dar por resultado enfermedad. Varios sistemas enzimáticos participan en la replicación, alteración y reparación del DNA. Las mutaciones se deben a un cambio de la secuencia de bases de DNA, y en ocasiones dependen de defectos de la replicación, el movimiento o la reparación del DNA, y ocurren con una frecuencia de alrededor de una en cada 10⁶ divisiones celulares. A veces, las anormalidades en productos de gen (sea en el RNA, la función de proteína, o la cantidad) son el resultado de mutaciones que suceden en DNA codificador o de región reguladora. Una mutación en una célula germinal se transmite hacia la descendencia (la denominada transmisión vertical de enfermedad hereditaria). Diversos factores, entre ellos virus, sustancias químicas, luz ultravioleta y radiación ionizante, aumentan el índice de mutación. Las mutaciones suelen afectar células somáticas y, así, se transmiten hacia generaciones sucesivas de células, pero sólo dentro de un organismo (es decir, de modo horizontal). Cada vez es más claro que varias enfermedades (y tal vez casi todos los cánceres) se deben a los efectos combinados de la transmisión vertical de mutaciones, así como a la transmisión horizontal de mutaciones inducidas.

La cromatina consta de moléculas de DNA bicatenario muy largas (dsDNA), y una masa casi igual de proteínas básicas más bien pequeñas llamadas histonas, así como una cantidad menor de proteínas no histona (la mayor parte de las cuales son ácidas y de mayor tamaño que las histonas), y una pequeña cantidad de RNA. Las proteínas no histona incluyen enzimas involucradas en la replicación y reparación del DNA, y las proteínas participantes en la síntesis, el procesamiento y el transporte hacia el citoplasma, del RNA. La hélice del dsDNA en cada cromosoma tiene una longitud que es miles de veces el diámetro del núcleo de la célula. Un propósito de las moléculas que comprenden la cromatina, en especial las histonas, es condensar el DNA. Sin embargo, es importante notar que las histonas también tienen una participación fundamental en la regulación de gen (capítulos 36, 38 y 42), en efecto, las histonas contribuyen de manera importante a todas las transacciones moleculares dirigidas a DNA. En estudios de microscopia electrónica de cromatina se han demostrado partículas esféricas densas denominadas nucleosomas, que tienen alrededor de 10 nm de diámetro y están conectadas por medio de filamentos de DNA (figura 35-1). Los nucleosomas están compuestos de DNA envuelto alrededor de un conjunto de moléculas de histona.

Las histonas son las proteínas de cromatina más abundantes

Las histonas son una familia pequeña de proteínas básicas estrechamente relacionadas. Las histonas H1 son las que están menos estrechamente unidas a la cromatina (figuras 35-1, 35-2 y 35-3) y, en consecuencia, se eliminan con facilidad con una solución salina, tras lo cual la cromatina se hace más soluble. La unidad organizacional de esta cromatina soluble es el nucleosoma. Los nucleosomas contienen cuatro tipos de histonas: H2A, H2B, H3 y H4 (las llamadas histonas centrales que forman el nucleosoma) cuya estructura se ha conservado mucho entre las especies, aunque existen variantes de las histonas y se han usado para propósitos especializados. Esta conservación extrema indica que la función de las histonas es idéntica en todos los eucariotas y que toda la molécula participa de manera bastante específica en esta función. Los dos tercios carboxilo terminal de las moléculas de histona son hidrofóbicos, mientras que sus tercios amino terminal son en particular ricos en aminoácidos básicos. Estas cuatro histonas centrales están sujetas a por lo menos seis tipos de modificación covalente de modificaciones postraduccionales (PTM): acetilación, metilación, fosforilación, ADP-ribosilación, monoubiquitilación y sumoilación. Estas modificaciones de histonas tienen importancia en la estructura y la función de la cromatina (cuadro 35-1).

Las histonas interactúan entre sí de modos muy específicos. H3 y H4 forman un tetrámero que contiene dos moléculas de cada una (H3-H4)₂, mientras que H2A y H2B forman dímeros (H2A-H2B). En condiciones fisiológicas, estos oligómeros de histona se asocian para formar el octámero de histonas de la composición (H3-H4)₂-(H2A-H2B)₂.

El nucleosoma contiene histona y DNA

Cuando el octámero de histonas se mezcla con dsDNA en condiciones iónicas apropiadas, se forma el mismo modelo de difracción de rayos X que el que se observa en cromatina recién aislada. Estudios de bioquímica y microscopia electrónica confirman la existencia de nucleosomas reconstituidos. Además, la reconstitución de nucleosomas a partir del DNA e histonas H2A, H2B, H3 y H4 es independiente del origen de organismo o celular de los diversos componentes. Ni la histona H1 ni las proteínas no histona se requieren para la reconstitución del centro del nucleosoma.

En el nucleosoma, el DNA está superenrollado en una hélice siniestra sobre la superficie del octámero de histonas en forma de disco (figura 35-2). Casi todas las proteínas histona centrales interactúan con el DNA en el interior de la superhélice sin sobresalir, aun cuando las colas amino terminal de todas las histonas probablemente se extienden fuera de esta estructura y están disponibles para modificaciones covalentes reguladoras (cuadro 35-1).

El tetrámero (H3-H4)₂ en sí puede conferir propiedades parecidas a nucleosoma sobre el DNA y, de esta manera, tiene una función fundamental en la formación del nucleosoma. La adición de dos dímeros H2A-H2B estabiliza la partícula primaria y une firmemente dos medias vueltas adicionales de DNA previamente unidas sólo de modo laxo al (H3-H4)₂. De esta manera, 1.75 giros de superhélice de DNA están envueltos alrededor de la superficie del octámero de histonas, lo que protege 145-150 pares de bases de DNA y forma la partícula central del nucleosoma (figura 35-2). En la cromatina, las partículas centrales están separadas por una región de DNA de alrededor de 30 bp denominada “enlazador”. La mayor parte del DNA está en una serie repetitiva de estas estructuras, lo que da el llamado aspecto en “cuentas sobre un hilo” en la microscopia electrónica (figura 35-1).

El montaje in vivo de nucleosomas está mediado por uno de varios factores de montaje de cromatina nucleares facilitados por chaperones de histona, un grupo de proteínas que muestran unión de alta afinidad a histona. Conforme el nucleosoma se monta, las histonas se liberan de los chaperones de histona. Los nucleosomas muestran preferencia por ciertas regiones sobre moléculas de DNA específicas, pero la base de esta distribución no al azar, denominada ajuste de fase, aún no se entiende por completo. El ajuste de fase probablemente se relaciona con la flexibilidad física relativa de ciertas secuencias de nucleótido que tienen la capacidad para dar cabida a las regiones de acodamiento dentro de la superhélice, así como con la presencia de otros factores unidos a DNA que limitan los sitios de depósito de nucleosoma.

La microscopia electrónica de la cromatina revela dos órdenes de estructura superiores —la fibrilla de 10 nm y la fibra de cromatina de 30 nm— más allá que la del nucleosoma mismo. La estructura del nucleosoma parecida a disco tiene 10 nm de diámetro y 5 nm de altura. La fibrilla de 10 nm consta de nucleosomas dispuestos con sus bordes separados por una distancia pequeña (30 bp de DNA) con sus caras planas paralelas al eje de la fibrilla (figura 35-3). La fibrilla de 10 nm probablemente está más superenrollada con 6 o 7 nucleosomas por cada vuelta, para formar la fibra de cromatina de 30 nm (figura 35-3). Cada giro de la superhélice es relativamente plano y las caras de los nucleosomas de vueltas sucesivas serían casi paralelas entre sí. Las histonas H1 parecen estabilizar la fibra de 30 nm, pero no están claras su posición ni la del DNA espaciador de longitud variable. Es probable que los nucleosomas puedan formar diversas estructuras aglomeradas. Para formar un cromosoma mitótico, la fibra de 30 nm debe compactarse en longitud otras 100 veces (véase más adelante).

En los cromosomas en interfase, las fibras de cromatina parecen estar organizadas hacia asas o dominios de 30 000 a 100 000 bp anclados en andamiaje (o matriz de sostén) dentro del núcleo, la llamada matriz nuclear. Dentro de estos dominios, algunas secuencias de DNA pueden estar ubicadas de modo no al azar. Se ha sugerido que cada dominio de cromatina en asa corresponde a una o más funciones genéticas separadas, que contienen regiones tanto codificadoras como no codificadoras del gen o los genes cognados. Esta estructura nuclear probablemente es dinámica y tiene importantes efectos sobre la regulación de gen. Datos recientes sugieren que ciertos genes o regiones de gen son móviles dentro del núcleo y que se mueven en forma obligatoria hacia loci separados dentro del núcleo en el momento de la activación. Investigación adicional determinará si éste es un fenómeno general, y de cuáles mecanismos moleculares depende.

En general, cada célula de un organismo metazoario individual contiene la misma información genética. Así, las diferencias entre los tipos de célula dentro de un organismo deben explicarse por expresión diferencial de la información genética común. Se ha mostrado que la cromatina que contiene genes activos (esto es, cromatina activa desde el punto de vista transcripcional, o en potencia activa desde dicho punto de vista) difiere en varios aspectos de la de regiones inactivas. La estructura de nucleosoma de la cromatina activa parece estar alterada, a veces de manera bastante extensa, en regiones muy activas. El DNA en cromatina activa contiene regiones grandes (de alrededor de 100 000 bases de largo) que son relativamente más sensibles a la digestión por una nucleasa como la DNasa I; esta última hace cortes de cadena única en casi cualquier segmento del DNA (es decir, especificidad baja de secuencia). Digerirá DNA que no está protegido, o unido a proteína, hacia los desoxinucleótidos que lo componen. La sensibilidad a DNasa I de regiones de cromatina activas refleja sólo un potencial para transcripción más que transcripción en sí y en varios sistemas puede correlacionarse con una falta relativa de la 5-metildesoxicitidina (meC) en el DNA y modificaciones covalentes de la histona particular o PTM (fosforilación, acetilación, etc.; cuadro 35-1).

Dentro de las regiones grandes de cromatina activa hay tramos más cortos, de 100 a 300 nucleótidos, que muestran una sensibilidad aún mayor (otras 10 veces) a la de DNasa I. Estos sitios hipersensibles probablemente se producen por una conformación estructural que favorece el acceso de la nucleasa al DNA; dichas regiones a menudo están localizadas justo torrente arriba del gen activo, y son la ubicación de estructura nucleosómica interrumpida por la unión de proteínas factor de transcripción reguladoras no histona (proteínas que aumentan la unión del activador transcripcional; capítulos 36 y 38). En muchos casos, parece ser que si un gen tiene la capacidad de ser transcrito, muy a menudo tiene uno o varios sitios hipersensibles a DNasa en la cromatina justo torrente arriba. Como se mencionó, las proteínas reguladoras no histona involucradas en el control de la transcripción y las comprendidas en mantener acceso a la cadena plantilla conducen a la formación de sitios hipersensibles. Esos sitios a menudo proporcionan el primer indicio respecto a la presencia y ubicación de un elemento de control de transcripción.

En contraste, la cromatina inactiva en el aspecto transcripcional está densamente aglomerada durante la interfaz, como se observa mediante estudios con microscopia electrónica, y se denomina heterocromatina; la cromatina activa desde el punto de vista transcripcional se colorea menos densamente, y se llama eucromatina. En general, la eucromatina se replica antes que la heterocromatina en el ciclo de células de mamífero (véase más adelante). La cromatina en estas regiones de inactividad suele tener contenido alto de meC, y las histonas allí contienen relativamente niveles menores de ciertas modificaciones covalentes “activadoras” y altos niveles de PTM histona “represores”.

Hay dos tipos de heterocromatina: constitutiva y facultativa. La heterocromatina constitutiva siempre está condensada y, de este modo, es en esencia inactiva. Se encuentra en las regiones cercanas al centrómero cromosómico y en terminaciones cromosómicas (telómeros). La heterocromatina facultativa en ocasiones está condensada, pero en otras ocasiones se transcribe de manera activa y, así, está no condensada y aparece como eucromatina. De los dos miembros del par de cromosomas X en hembras de mamífero, un cromosoma X es casi por completo inactivo en el aspecto transcripcional, y es heterocromático. Empero, el cromosoma X heterocromático se descondensa en el transcurso de la gametogénesis y se torna activo desde el punto de vista transcripcional durante la embriogénesis temprana; de este modo, es heterocromatina facultativa.

Ciertas células de insectos, por ejemplo, Chironomus y Drosophila, contienen cromosomas gigantes que se han replicado durante múltiples ciclos sin separación de cromátides hijas. Estas copias de DNA se alinean lado a lado en el registro exacto, y producen un cromosoma con bandas que contiene regiones de cromatina condensada y bandas más claras de cromatina más extendida. Las regiones activas en el aspecto transcripcional de estos cromosomas politeno se descondensan en especial hacia “abultamientos” (“puffs”) que puede mostrarse que contienen las enzimas de las cuales depende la transcripción, y que son los sitios de síntesis de RNA (figura 35-4). Al usar sondas de hibridación marcadas con fluorescencia, muy sensibles, es posible “mapear” secuencias de gen específicas, o “pintarlas”, dentro de los núcleos de células de humano, incluso sin formación del cromosoma politeno, usando técnicas de FISH (hibridación in situ fluorescente; capítulo 39).

En el transcurso de la metafase, los cromosomas de mamífero poseen una simetría doble, con las cromátides hermanas duplicadas idénticas conectadas en un centrómero, cuya posición relativa es característica para un cromosoma dado (figura 35-5). El centrómero es una región rica en adenina-timina (A2T) que contiene secuencias de DNA repetidas que varían en tamaño desde 10² (levadura de cerveza) hasta 10⁶ (mamíferos) pares de bases (bp). Los centrómeros de metazoario están unidos por nucleosomas que contienen la proteína variante histona H3 CENP-A y otras proteínas de unión a centrómero específicas. Este complejo, denominado el cinetócoro, proporciona la fijación para el huso mitótico. De esta manera, es una estructura esencial para la segregación cromosómica durante la mitosis.

Los extremos de cada cromosoma contienen estructuras llamadas telómeros, que constan de repeticiones ricas en TG cortas. En humanos, los telómeros tienen un número variable de repeticiones de la secuencia 5′-TTAGGG-3′, que puede extenderse por varias kilobases. La telomerasa, un complejo que contiene plantillas de RNA de múltiples subunidades vinculado con DNA polimerasas dependientes de RNA virales (transcriptasas inversas), es la enzima que se encarga de la síntesis de telómero y, de este modo, de mantener la longitud del mismo. Dado que el acortamiento de telómero se ha relacionado tanto con transformación maligna como con envejecimiento (figura 54-7), la enzima telomerasa se ha convertido en un blanco atractivo para la quimioterapia de cáncer y el desarrollo de fármacos (figura 55-17). Cada cromátide hermana contiene una molécula de dsDNA (DNA bicatenario). Durante la interfase, la aglomeración de la molécula de DNA es menos densa que en el cromosoma condensado durante la metafase. Los cromosomas en metafase son casi por completo inactivos desde el punto de vista transcripcional.

El genoma haploide de humanos consta de alrededor de 3 × 10⁹ bp, y alrededor de 1.7 × 10⁷ nucleosomas. Así, cada una de las 23 cromátides en el genoma haploide humano contendría en promedio 1.3 × 10⁸ nucleótidos en una molécula de dsDNA; por ende, la longitud de cada molécula de DNA debe comprimirse alrededor de 8 000 veces para generar la estructura de un cromosoma en metafase condensado. En cromosomas en metafase, las fibras de cromatina de 30 nm también están plegadas hacia una serie de dominios en bucle, las porciones proximales de los cuales están ancladas a la matriz nuclear, probablemente por medio de interacciones con proteínas llamadas láminas que constituyen componentes integrales de la membrana nuclear interna dentro del núcleo (figuras 35-3 y 49-4).

El cuadro 35-2 resume las proporciones de aglomeración de cada uno de los órdenes de estructura del DNA. La aglomeración de nucleoproteínas dentro de cromátides no es al azar, según queda de manifiesto por los modelos típicos observados cuando los cromosomas se tiñen con colorantes específicos, como tinción de quinacrina o Giemsa (figura 35-6).

De un individuo a otro dentro de una especie única, el modelo de tinción (bandeo) de la totalidad del cromosoma es muy reproducible; con todo, difiere de manera significativa entre las especies, incluso las que están muy relacionadas. De este modo, la aglomeración de nucleoproteínas en cromosomas de eucariotas superiores debe depender de alguna manera de características específicas para especie de las moléculas de DNA.

Una combinación de técnicas de coloración especializada y microscopia de alta resolución ha permitido a los citogenetistas “mapear” de modo bastante preciso muchos genes a regiones específicas de cromosomas de ratón y humano. Con la elucidación reciente de las secuencias del genoma de humano y de ratón (entre otras), ha quedado claro que muchos de estos métodos de mapeo visual son bastante exactos.

Las regiones codificadoras a menudo están interrumpidas por secuencias interpuestas

Las regiones codificadoras de proteína del DNA, cuyas transcripciones aparecen en el citoplasma como moléculas de mRNA únicas, por lo general están interrumpidas en el genoma eucariótico por secuencias interpuestas grandes de DNA que no codifica para proteína. Por consiguiente, las transcripciones primarias del DNA, los precursores de mRNA (en un inicio denominados hnRNA porque esta especie de RNA fue bastante heterogénea en tamaño [longitud] y en su mayor parte estaba restringida al núcleo), contienen secuencias de RNA interpuestas no codificadoras que deben eliminarse en un proceso que también junta los segmentos codificadores apropiados para formar el mRNA maduro. Casi todas las secuencias codificadoras para un mRNA único están interrumpidas en el genoma (y, de esta manera, en la transcripción primaria) por al menos una (y en algunos casos hasta 50) secuencia interpuesta no codificadora (intrones). Casi siempre, los intrones son mucho más largos que las regiones codificadoras (exones). El procesamiento de la transcripción primaria, que comprende eliminación precisa de intrones y empalme de los exones adyacentes, se describe con detalle en el capítulo 36.

La función de las secuencias interpuestas, o intrones, no está totalmente clara. Sin embargo, moléculas precursoras de mRNA pueden empalmarse de manera diferencial, lo que aumenta el número de proteínas separadas (pero relacionadas) producidas por un gen único y su transcrito de gen que codifica para mRNA primario correspondiente. La función de las secuencias interpuestas, o intrones, no está por completo clara; tal vez sirvan para separar dominios funcionales (exones) de información codificadora en una forma que permite que el reordenamiento genético por medio de recombinación suceda con mayor rapidez que si todas las regiones codificadoras para una función genética dada fueran contiguas. Ese índice incrementado de reordenamiento genético de dominios funcionales podría permitir una evolución más rápida de la función biológica. En algunos casos otras proteínas o RNA no codificadores están ubicados dentro del DNA intrónico de ciertos genes (capítulo 34). En la figura 35-7 se ilustran las vínculos entre DNA cromosómico, agrupaciones de gen en el cromosoma, la estructura de exón-intrón de genes y el producto mRNA final.

El genoma haploide de cada célula de humano consta de 3 × 10⁹ pares de bases (bp) de DNA subdivididos en 23 cromosomas. El genoma haploide completo contiene suficiente DNA para codificar para cerca de 1.5 millones de genes de tamaño promedio. Aun así, estudios de índices de mutación y de las complejidades de los genomas de organismos superiores sugieren fuertemente que los seres humanos tienen mucho menos de 100 000 proteínas codificadas por ~1% del genoma humano que está compuesto de DNA exónico. De hecho, estimados actuales sugieren que hay 25 000 o menos genes codificadores de proteína en los humanos. Esto implica que casi todo el DNA es no codificador de proteína; es decir, su información nunca se traduce hacia una secuencia de aminoácidos de una molécula de proteína. Es cierto que algunas de las secuencias de DNA excesivas sirven para regular la expresión de genes en el transcurso del desarrollo, la diferenciación y la adaptación al ambiente, ya sea al servir como sitios de unión para proteínas reguladoras o al codificar para ncRNA. Está claro que algo del exceso constituye las secuencias interpuestas o intrones que dividen las regiones de genes codificadoras, y otra porción del exceso parece estar compuesta de muchas familias de secuencias repetidas para las cuales todavía no se han definido funciones claras, aunque algunos RNA pequeños transcritos a partir de estas repeticiones pueden modular la transcripción, sea de manera directa al interactuar con la maquinaria de transcripción, o indirecta al afectar la actividad de la plantilla de cromatina. Despierta interés que el ENCODE Project Consortium (capítulos 10 y 39) ha mostrado que la mayor parte de la secuencia genómica de hecho se transcribió aunque a un nivel bajo, una fracción grande de esta transcripción parece generar los lncRNA (capítulo 34). Investigación adicional elucidará el (los) papel(es) desempeñado(s) por esos transcritos.

El DNA en un genoma eucariótico puede ser dividido en diferentes “clases de secuencia”, a saber, DNA de secuencia única, o DNA no repetitivo y DNA de secuencia repetitiva. En el genoma haploide, el DNA de secuencia única por lo regular incluye los genes de copia única que codifican para proteínas. El DNA repetitivo en el genoma haploide comprende secuencias cuyo número de copias varía desde 2 hasta 10⁷ por célula.

Más de la mitad del DNA en los organismos eucarióticos está en secuencias únicas o no repetitivas

Tal estimación (y la distribución del DNA de secuencias repetitivas) se basa en diversas técnicas de hibridación de DNA-RNA y, en fecha más reciente, en la secuenciación directa de DNA. Se usan técnicas similares para estimar el número de genes activos en una población de DNA de secuencia única. En la levadura de cerveza (Saccharomyces cerevisiae, un eucariota inferior), alrededor de dos tercios de sus 6 200 genes se expresan, pero sólo ~1/5 se necesita para la viabilidad en condiciones de crecimiento en el laboratorio. En los tejidos típicos en un eucariota superior (p. ej., hígado y riñón de mamífero), entre 10 000 y 15 000 genes se expresan de modo activo. Diferentes combinaciones de genes se expresan en cada tejido, por supuesto, y cómo se logra esto es una de las principales preguntas sin respuesta en biología.

En el DNA de humanos, al menos 30% del genoma consta de secuencias repetitivas

El DNA de secuencia repetitiva se clasifica en términos generales como moderadamente repetitivo o como muy repetitivo. Las secuencias muy repetitivas constan de tramos de 5 a 500 pares de bases repetidos muchas veces en tándem. Estas secuencias suelen estar agrupadas en centrómeros y telómeros del cromosoma, y algunas están presentes en alrededor de 1 a 10 millones de copias por cada genoma haploide. Casi todas estas secuencias son inactivas en el aspecto transcripcional, y algunas tienen una función estructural en el cromosoma (figura 35-5; capítulo 39).

Las secuencias moderadamente repetitivas, que se definen como estar presentes en números de menos de 10⁶ copias por cada genoma haploide, no están agrupadas sino que están entremezcladas con secuencias únicas. En muchos casos, estas repeticiones entremezcladas largas son transcritas por la RNA polimerasa II, y contienen cubiertas indistinguibles de las que se encuentran en el mRNA.

Según su longitud, las secuencias moderadamente repetitivas se clasifican como secuencias repetidas entremezcladas largas (LINE) o secuencias repetidas entremezcladas cortas (SINE). Ambos tipos parecen ser retroposones, es decir, surgieron por movimiento desde una ubicación hacia otra (transposición) a través de un RNA intermediario mediante la acción de la transcriptasa inversa que transcribe una plantilla de RNA hacia DNA. Los genomas de mamífero contienen 20 000 a 50 000 copias de las LINE de 6 a 7 kbp, las cuales representan familias de elementos repetidos específicas para especie. Las SINE son más cortas (70 a 300 bp) y llegan hasta más de 100 000 copias por cada genoma. De las SINE en el genoma humano, una familia, la familia Alu, está presente en alrededor de 500 000 copias por cada genoma haploide y explica ~ 10% del genoma humano. Los miembros de la familia Alu humana y sus análogos estrechamente relacionados en otros animales se transcriben como componentes integrales de precursores de mRNA o moléculas de RNA separadas, incluso los bien estudiados RNA 4.5S y RNA 7S. Estos miembros de la familia particulares están muy conservados dentro de una especie, así como entre especies de mamíferos. Los componentes de las repeticiones entremezcladas cortas, incluso los miembros de la familia Alu, pueden ser elementos móviles, capaces de saltar hacia adentro y hacia afuera de diversos sitios dentro del genoma (véase más adelante). Estos eventos de transposición llegan a tener resultados desastrosos, como se ejemplifica por la inserción de secuencias Alu hacia un gen que, cuando queda así mutado, origina neurofibromatosis. Además, se ha mostrado que los RNA SINE (elemento intercalado corto) Alu, B1 y B2 regulan la producción de mRNA en los ámbitos de transcripción y de empalme de mRNA.

Secuencias repetidas de microsatélite

Una categoría de secuencias repetidas existe como disposiciones en tándem tanto dispersas como agrupadas. Las secuencias constan de 2 a 6 bp repetidas hasta 50 veces. Estas secuencias de microsatélite se encuentran con mayor frecuencia como repeticiones de dinucleótido de AC en una cadena, y TG en la cadena opuesta, pero se encuentran varias otras formas, entre ellas CG, AT y CA. Las secuencias repetidas AC ocurren en 50 000 a 100 000 ubicaciones en el genoma. En cualquier locus, el número de estas repeticiones puede variar en los dos cromosomas, lo que proporciona heterocigosidad del número de copias de un número de microsatélite particular en un individuo. Se trata de un rasgo hereditario, y debido a su número y a la facilidad para detectarlas usando la reacción en cadena de polimerasa (PCR) (capítulo 39), esas repeticiones son útiles para construir mapas de enlace genético. Casi todos los genes muestran vínculo con uno o más marcadores microsatélite, de manera que es posible evaluar la posición relativa de genes en cromosomas, al igual que la relación de un gen con una enfermedad. Usando PCR, un gran número de miembros de la familia se puede investigar con rapidez para un cierto polimorfismo de microsatélite. La asociación de un polimorfismo específico con un gen en miembros de una familia afectados (y la ausencia de este vínculo en miembros no afectados) puede ser el primer indicio en cuanto a la base genética de una enfermedad.

Las secuencias de trinucleótido que aumentan de número (inestabilidad de microsatélite) pueden causar enfermedad. La secuencia de repetición p(CGG)_n inestable se relaciona con el síndrome de X frágil. Otras repeticiones de trinucleótido que pasan por mutación dinámica (por lo general un incremento) muestran vínculo con corea de Huntington (CAG), distrofia miotónica (CTG), atrofia muscular espinobulbar (CAG) y enfermedad de Kennedy (CAG).

Casi todos los péptidos en mitocondrias (alrededor de 54 de 67) están codificados por genes nucleares, en tanto que el resto está codificado por genes que se encuentran en DNA mitocondrial (mt). En el humano, las mitocondrias contienen 2 a 10 copias de una pequeña ~ 16 kbp molécula de dsDNA circular que constituye alrededor de 1% del DNA celular total. Este mtDNA codifica para RNA ribosómico y de transferencia específicos para mt, y para 13 proteínas que desempeñan funciones clave en la cadena respiratoria (capítulo 13). La figura 35-8 muestra el mapa estructural linealizado de los genes mitocondriales de ser humano. El cuadro 35-3 lista algunas de las características del mtDNA.

Una característica importante del mtDNA mitocondrial de humano es que (puesto que el huevo contribuye con todas las mitocondrias durante la formación del cigoto) se transmite por herencia no mendeliana materna. De este modo, en enfermedades que se producen por mutaciones del mtDNA, una madre afectada en teoría transmitiría la enfermedad a todos sus hijos, pero sólo sus hijas transmitirían el rasgo. Comoquiera que sea, en algunos casos, las deleciones en el mtDNA suceden durante la oogénesis y, de esta manera, no se heredan desde la madre; de manera reciente ha quedado demostrado que varias enfermedades se deben a mutaciones del mtDNA; entre ellas están diversas miopatías, trastornos neurológicos y algunos casos de diabetes mellitus.

Una alteración de la secuencia de bases purina y pirimidina en un gen debido a un cambio (una eliminación o una inserción) de una o más bases puede suscitar un producto de gen alterado o la alteración de la expresión génica si DNA codificado no proteínico está implicado. Tal alteración en el material genético produce una mutación cuyas consecuencias se comentan con detalle en el capítulo 37.

La recombinación cromosómica es un modo de reordenar el material genético

La información genética puede intercambiarse entre cromosomas similares u homólogos. El intercambio, o evento de recombinación, se produce principalmente en el transcurso de la meiosis en células de mamífero, y requiere alineamiento de cromosomas en metafase homólogos, un alineamiento que casi siempre sucede con gran exactitud. Ocurre un proceso de entrecruzamiento (figura 35-9). Esto por lo general ocasiona un intercambio igual o recíproco de información genética entre cromosomas homólogos. Si los cromosomas homólogos poseen diferentes alelos de los mismos genes, el entrecruzamiento llega a producir diferencias de enlace genético notables y hereditarias. En el raro caso en el cual el alineamiento de cromosomas homólogos es impreciso, el evento de entrecruzamiento o recombinación puede traducirse en un intercambio desigual de información. Un cromosoma quizá reciba menos material genético y, así, una deleción, mientras que el otro miembro del par de cromosomas recibe más material genético y, de esta manera, una inserción o duplicación (figura 35-9). El entrecruzamiento desigual ocurre en humanos, según se demuestra por la existencia de hemoglobinas designadas Lepore y anti-Lepore (figura 35-10). Mientras más separadas están dos secuencias en un cromosoma individual, mayor es la probabilidad de un evento de recombinación por entrecruzamiento. Tal es la base de los métodos de mapeo genético. El entrecruzamiento desigual afecta disposiciones en tándem de DNA repetidos independientemente de si son genes que codifican para globina relacionados (figura 35-10) o DNA repetitivo más abundante. El entrecruzamiento desigual por deslizamiento en la formación de pares puede dar por resultado expansión o contracción del número de copias de la familia repetida, y contribuir a la expansión y fijación de miembros variantes en toda la disposición de repetición.

Ocurre integración cromosómica con algunos virus

Algunos virus bacterianos (bacteriófagos) tienen la capacidad de recombinarse con el DNA de un huésped bacteriano de tal modo que la información genética del bacteriófago se incorpora de una manera lineal hacia la del huésped. Esta integración, que es una forma de recombinación, sucede por medio del mecanismo que se ilustra en la figura 35-11. El esqueleto del genoma de bacteriófago circular se rompe, al igual que el de la molécula de DNA del huésped; los extremos apropiados se vuelven a sellar con la polaridad apropiada. El DNA del bacteriófago se endereza (“lineariza”) de modo figurativo, a medida que se integra en la molécula de DNA bacteriano, a menudo también un círculo cerrado. El sitio en el cual el genoma del bacteriófago se integra o se recombina con el genoma bacteriano se elige mediante uno de dos mecanismos. Si el bacteriófago contiene una secuencia de DNA homóloga a una secuencia en la molécula de DNA huésped, puede producirse un evento de recombinación análogo al que ocurre entre cromosomas homólogos. De cualquier manera, algunos bacteriófagos sintetizan proteínas que unen sitios específicos en cromosomas bacterianos a un sitio no homólogo característico de la molécula de DNA del bacteriófago. La integración sucede en el sitio y se dice que es “específica para sitio”.

Muchos virus de animales, en especial los virus oncogénicos (sea de modo directo o, en el caso de virus RNA como el HIV que origina del SIDA, sus transcripciones de DNA generadas por medio de la acción de la DNA polimerasa dependiente de RNA viral, o transcriptasa inversa) pueden integrarse hacia cromosomas de la célula de mamífero. La integración del DNA del virus de animal hacia el genoma del animal por lo general no es “específica para sitio” sino que despliega preferencias por sitio.

La transposición puede producir genes procesados

En células eucarióticas, elementos de DNA pequeños que claramente no son virus tienen la capacidad de transponerse ellos mismos hacia adentro y hacia afuera del genoma del huésped de maneras que afectan la función de secuencias de DNA vecinas. Estos elementos móviles, a veces llamados “DNA saltador”, o genes saltadores, pueden portar regiones flanqueantes de DNA y, por tanto, afectar de manera profunda la evolución. Como se mencionó, la familia Alu de secuencias de DNA moderadamente repetidas tiene características estructurales similares a los términos de retrovirus, lo que explicaría la capacidad de estos últimos para entrar y salir del genoma de mamífero.

El descubrimiento de “genes procesados” para moléculas de inmunoglobulina, moléculas de α-globulina, y varias otras, ha proporcionado evidencia directa de la transposición de otros elementos de DNA pequeños hacia el genoma humano. Dichos genes procesados constan de secuencias de DNA idénticas o casi idénticas a las del RNA mensajero para el producto de gen apropiado. Así que la región 5′-no traducida, la región codificadora sin representación de intrón, y la cola 3′ poli(A) están presentes de modo contiguo. Este ordenamiento de secuencia de DNA particular debe haberse producido por la transcripción inversa de una molécula RNA mensajero procesada de modo apropiado, de la cual las regiones intrón se habían eliminado y a la cual la cola poli(A) se había añadido. El único mecanismo reconocido que esta transcripción inversa podría haber usado para integrarse en el genoma habría sido un evento de transposición. De hecho, estos “genes procesados” tienen repeticiones terminales cortas en cada extremo, al igual que las secuencias transpuestas conocidas en organismos inferiores. En ausencia de su transcripción y, de esta manera, de selección genética para función, muchos de los genes procesados se han alterado al azar mediante evolución, de modo que ahora contienen codones sin sentido que eliminan su capacidad para codificar para una proteína funcional intacta (capítulo 37) incluso si pueden ser transcritos; se les denomina “seudogenes”.

La conversión de gen produce reordenamientos

Además de entrecruzamiento desigual y transposición, un tercer mecanismo puede producir cambios rápidos en el material genético. Secuencias similares en cromosomas homólogos o no homólogos en ocasiones pueden parearse y eliminar cualquier secuencia desproporcionada entre ellas. Esto puede llevar a la fijación accidental de una variante u otra en toda una familia de secuencias repetidas y, de esta manera, homogeneizar las secuencias de los miembros de las familias de DNA repetitivo. Este último proceso se llama conversión de gen.

Cromátides hermanas se intercambian

En organismos eucarióticos diploides, como los humanos, después de que las células progresan por la fase S, tienen un contenido tetraploide de DNA, que se encuentra en la forma de cromátides hermanas de pares de cromosomas (figura 35-6). Cada una de estas cromátides hermanas contiene información genética idéntica dado que cada una es un producto de la replicación semiconservadora de la molécula de DNA madre original de ese cromosoma. Puede haber entrecruzamiento entre estas cromátides hermanas idénticas desde el punto de vista genético. Por supuesto, estos intercambios de cromátides hermanas (figura 35-12) carecen de consecuencias genéticas en tanto el intercambio sea el resultado de un entrecruzamiento igual.

Los genes que codifican para inmunoglobulina se reordenan

En células de mamífero, algunos reordenamientos de gen interesantes ocurren normalmente durante el desarrollo y la diferenciación. Por ejemplo, los genes V_L y C_L, que codifican para las porciones variable (V_L) y conservada (C_L) de la cadena ligera de inmunoglobulina G (IgG) en una molécula de IgG única (capítulo 38), están ampliamente separados en el DNA de la línea germinal. En el DNA de una célula productora de inmunoglobulina (plasmática) diferenciada, los mismos genes V_L y C_L se han movido físicamente para acercarse en el genoma y hacia la misma unidad de transcripción. No obstante, incluso entonces, este reordenamiento de DNA en el transcurso de la diferenciación no produce contigüidad de los genes V_L y C_L en el DNA. En lugar de eso, el DNA contiene una secuencia entremezclada o de interrupción de alrededor de 1 200 bp en la unión de las regiones V y C o cerca de la misma. La secuencia entremezclada se transcribe hacia RNA junto con los genes V_L y C_L, y la información entremezclada de secuencia no IgG se elimina del RNA durante su procesamiento nuclear (capítulos 36 y 38).

Queda claro que la función primaria de la replicación del DNA es el suministro de progenie con la información genética poseída por el progenitor. De este modo, la replicación del DNA debe ser completa y efectuarse de tal manera que mantenga estabilidad genética dentro del organismo y la especie. El proceso de replicación del DNA es complejo y comprende muchas funciones celulares y varios procedimientos de verificación para asegurar fidelidad en la replicación. Alrededor de 30 proteínas participan en la replicación del cromosoma de Escherichia coli, y este proceso es más complejo en organismos eucarióticos. Arthur Kornberg hizo las primeras observaciones enzimológicas acerca de replicación de DNA; describió en E. coli la existencia de una enzima ahora denominada DNA polimerasa I. Esta enzima tiene múltiples actividades catalíticas, una estructura compleja, y un requerimiento de los trifosfatos de los cuatro desoxirribonucleósidos de adenina, guanina, citocina y timina. La reacción de polimerización catalizada por la DNA polimerasa I de E. coli ha servido como prototipo para todas las DNA polimerasas tanto de procariotas como de eucariotas, aun cuando ahora se reconoce que la principal función de esta polimerasa es la corrección de pruebas y la reparación.

En todas las células, la replicación únicamente puede ocurrir a partir de una plantilla de DNA monocatenario (ssDNA). En consecuencia, debe haber mecanismos para dirigir el sitio de inicio de la replicación y para desenrollar el DNA bicatenario (dsDNA) en esa región. A continuación debe formarse el complejo de replicación. Luego de que se completa la replicación en un área, las cadenas madre e hija tienen que volver a formar dsDNA. En células eucarióticas se requiere un paso adicional. El dsDNA debe volver a formar la estructura de cromatina, incluso nucleosomas, que existió antes del inicio de la replicación. Aunque todo este proceso no se entiende por completo en células eucarióticas, la replicación se ha descrito con bastante exactitud en células procarióticas, y los principios generales son los mismos en ambas. Los principales pasos se listan en el cuadro 35-4, se ilustran en la figura 35-13, y se comentan, en secuencia, a continuación. Este proceso involucra varias proteínas, casi todas con acción enzimática específica (cuadro 35-5).

El origen de la replicación

En el origen de replicación (ori), hay una asociación de proteínas de unión a dsDNA específicas para secuencia, con una serie de secuencias de DNA repetidas directas. En el bacteriófago λ, el oriλ es unido por la proteína O codificada por λ a cuatro sitios adyacentes. En E. coli, el oriC es unido por la proteína dnaA. En ambos casos, se forma un complejo que consta de 150 a 250 bp de DNA y multímeros de la proteína de unión a DNA. Esto da pie a la desnaturalización y el desenrollado locales de una región de DNA rica en A+T. En células de levadura se han identificado secuencias de replicación autónoma (ARS) o replicadores, similares en el aspecto funcional. Las ARS contienen una secuencia de 11 bp un poco degenerada llamada el elemento de replicación de origen (ORE). El ORE se une a un grupo de proteínas, análogas a la proteína dnaA de E. coli; el grupo de proteínas se denomina en conjunto el complejo de reconocimiento de origen (ORC). Se han encontrado homólogos de ORC en todos los eucariotas examinados. El ORE está ubicado adyacente a una secuencia rica en A+T de unos 80 bp que es fácil de desenrollar, la cual recibe el nombre de elemento de desenrollado de DNA (DUE). El DUE es el origen de la replicación en levaduras, y es unido por el complejo de proteínas MCM.

En células de mamífero no se ha logrado un consenso en la definición precisa de secuencias similares en estructura a ori o ARS, aun cuando se han identificado varias de las proteínas que participan en el reconocimiento y la función de ori, y parecen bastante similares a sus homólogos en levaduras tanto en secuencia de aminoácidos como en función.

Desenrollado del DNA

La interacción de proteínas con ori define el sitio de inicio de la replicación, y proporciona una región corta de ssDNA esencial para el inicio de la síntesis de la cadena de DNA naciente; este proceso necesita la formación de varias interacciones entre una proteína y otra, y entre proteína y DNA. Una DNA helicasa que permite el desenrollado procesivo de DNA proporciona un paso crítico. En E. coli no infectada, un complejo de dnaB helicasa y la proteína dnaC provee esta función. Proteínas de unión a DNA monocatenario (SSB) estabilizan este complejo. En E. coli infectada por λ fago, la proteína P del fago se une a dnaλ, y el complejo de P/dnaB se une a oriλ al interactuar con la proteína O. La dnaB no es una helicasa activa cuando está en el complejo de P/dnaB/O. Tres proteínas de choque por calor de E. coli (dnaK, dnaJ y GrpE) cooperan para eliminar la proteína P y activar la dnaB helicasa. En cooperación con SSB, esto lleva al desenrollado y replicación activa del DNA. Así, la replicación del fago λ se logra a expensas de la replicación de la célula de E. coli huésped.

Formación de la horquilla de replicación

Una horquilla de replicación consta de cuatro componentes que se forman en la secuencia que sigue: 1) la DNA helicasa desenrolla un segmento corto del DNA dúplex madre; 2) una primasa inicia la síntesis de una molécula de RNA que es esencial para preparar la síntesis de DNA; 3) la DNA polimerasa inicia la síntesis de la cadena hija, naciente, y 4) las SSB se unen al ssDNA y evitan el retemplado prematuro de ssDNA hacia dsDNA. Dichas reacciones se ilustran en la figura 35-13.

La enzima DNA polimerasa III (el producto del gen dnaE en E. coli) se une a DNA plantilla como parte de un complejo de múltiples proteínas que consta de varios factores accesorios de polimerasa (β, γ, δ, δ′ y τ). Las DNA polimerasas sólo sintetizan DNA en la dirección 5′ a 3′, y únicamente uno de los varios tipos diferentes de polimerasas participa en la horquilla de replicación. Puesto que las cadenas de DNA son antiparalelas (capítulo 34), la polimerasa funciona de modo asimétrico. En la cadena adelantada (hacia adelante, también denominada cadena líder, guía o conductora), el DNA se sintetiza de manera continua. En la cadena retrasada (retrógrada, también llamada cadena rezagada o retardada), el DNA se sintetiza en fragmentos cortos (1 a 5 kb; figura 35-16), los denominados fragmentos de Okazaki, llamada así en honor al científico que las descubrió. Varios fragmentos Okazaki (hasta 1 000) deben sintetizarse de modo secuencial para cada horquilla de replicación. Con el fin de asegurar que esto suceda, la helicasa actúa sobre la cadena retrasada para desenrollar dsDNA en una dirección 5′ a 3′. La helicasa se asocia con la primasa para permitir a esta última acceso apropiado a la plantilla; lo anterior permite que sea formado el preparador de RNA y, a su vez, que la polimerasa empiece a replicar el DNA. Se trata de una secuencia de reacción importante dado que las DNA polimerasas no pueden iniciar la síntesis de DNA de novo. El complejo móvil entre helicasa y primasa se ha llamado un primosoma. Conforme se completa la síntesis de un fragmento de Okazaki y se libera la polimerasa, se ha sintetizado un nuevo preparador. La misma molécula de polimerasa permanece asociada con la horquilla de replicación, y procede a sintetizar el siguiente fragmento de Okazaki.

El complejo de DNA polimerasa

Varias moléculas de DNA polimerasa diferentes se encargan de la replicación de DNA y comparten tres propiedades importantes: 1) alargamiento de cadena, 2) procesividad y 3) corrección de pruebas. El alargamiento de cadena explica el índice (en nucleótidos por segundo, nt/s) al cual ocurre la polimerización. La procesividad es una expresión del número de nucleótidos añadidos a la cadena naciente antes de que la polimerasa se separe de la plantilla. La función de corrección de pruebas identifica errores de copiado y los corrige. En E. coli, la DNA polimerasa III (pol III) funciona en la horquilla de replicación. De todas las polimerasas, cataliza el índice más alto de alargamiento de cadena, y es la más procesiva. Tiene la capacidad de polimerizar 0.5 Mb de DNA durante un ciclo en la cadena adelantada. La Pol III es un complejo proteínico de múltiples subunidades, grande (> 1 MDa), en E. coli. La DNA pol III se asocia con las dos subunidades b idénticas de la “abrazadera” de deslizamiento de DNA; esta asociación aumenta de manera notoria la estabilidad del complejo de pol III-DNA, la procesividad (100 ntd a > 50 000 ntd) y el índice de alargamiento de cadena (20 a 50 ntd/s), lo que genera el alto grado de procesividad que demuestra la enzima.

Las polimerasas I (pol I) y II (pol II) participan en su mayor parte en la corrección de pruebas y la reparación de DNA. Las células eucarióticas tienen homólogos para cada una de estas enzimas, más un número grande de DNA polimerasas adicionales que participan de modo primario en la reparación del DNA. El cuadro 35-6 muestra una comparación.

En células de mamífero, la polimerasa tiene la capacidad de polimerizar a un índice que es un poco más lento que el índice de polimerización de desoxinucleótidos por el complejo de DNA polimerasa bacteriano. Este índice disminuido quizá depende de interferencia por nucleosomas.

Inicio y alargamiento de la síntesis de DNA

El inicio de la síntesis de DNA (figura 35-14) requiere preparación por un tramo corto de RNA, de alrededor de 10 a 200 nucleótidos de largo. En E. coli esto es catalizado por la dnaG (primasa); en eucariotas la DNA Pol α sintetiza estos preparadores de RNA. El proceso de preparación incluye ataque nucleofílico por el grupo 3′-hidroxilo del preparador de RNA sobre el fosfato del desoxinucleósido trifosfato que entra primero (N en la figura 35-14) con separación de pirofosfato; esta transición hacia síntesis de DNA es catalizada por las DNA polimerasas apropiadas (DNA pol III en E. coli; DNA pol δ y ε en eucariotas). El grupo 3′-hidroxilo del desoxirribonucleósido monofosfato recientemente fijado queda libre entonces para llevar a cabo un ataque nucleofílico sobre el siguiente desoxirribonucleósido trifosfato que entre (N + 1 en la figura 35-14), de nuevo en su porción fosfato α, con la separación de pirofosfato. Por supuesto, la selección del desoxirribonucleótido apropiado cuyo grupo 3′-hidroxilo terminal va a ser atacado depende de la formación apropiada de pares de bases con la otra cadena de la molécula de DNA de acuerdo con las reglas de pareo de bases de Watson y Crick (figura 35-15). Cuando una porción adenina desoxirribonucleósido monofosforilo está en la posición de plantilla, una timidina trifosfato entrará, y el grupo 3′-hidroxilo del desoxirribonucleósido monofosforilo añadido más recientemente al polímero atacará su fosfato α. Por medio de este proceso por pasos, la plantilla dicta cuál desoxirribonucleósido trifosfato es complementario, y mediante enlaces de hidrógeno lo sostiene en su sitio mientras el grupo 3′-hidroxilo de la cadena en crecimiento ataca e incorpora el nuevo nucleótido hacia el polímero. Estos segmentos de DNA fijos a un componente iniciador de RNA son los fragmentos de Okazaki (figura 35-16). En mamíferos, después de que se generan muchos de estos fragmentos, el complejo de replicación empieza a eliminar los preparadores de RNA, a llenar las brechas dejadas por su eliminación con el desoxinucleótido pareado con base apropiado, y luego a sellar los fragmentos de DNA recién sintetizado, por medio de enzimas denominadas DNA ligasas.

La replicación muestra polaridad

Como se mencionó, las moléculas de DNA son bicatenarias, y las dos cadenas son antiparalelas. La replicación de DNA en procariotas y eucariotas sucede en ambas cadenas a la vez; sin embargo, una enzima que tiene la capacidad de polimerizar DNA en la dirección 3′ a 5′ no existe en organismo alguno, de manera que las dos cadenas de DNA recién replicadas no pueden crecer en la misma dirección de modo simultáneo. Sin embargo, en bacterias la misma enzima replica ambas cadenas al mismo tiempo (en eucariontes Pol ε y Pol δ catalizan la síntesis de las cadenas adelantada y retrasada; cuadro 35-6. La enzima única replica una cadena (“cadena adelantada”) de una manera continua en la dirección 5′ a 3′, con la misma dirección anterógrada general. Replica la otra cadena (“cadena retrasada”) de modo discontinuo mientras polimeriza los nucleótidos en sucesiones cortas de 150 a 250 nucleótidos, de nuevo en la dirección 5′ a 3′, pero al mismo tiempo mira hacia el extremo posterior del preparador de RNA precedente en lugar de hacia la porción no replicada. Este proceso de síntesis de DNA semidiscontinua se muestra en un diagrama en las figuras 35-13 y 35-16.

Formación de burbujas de replicación

La replicación del cromosoma bacteriano circular, compuesto de aproximadamente 5 × 10⁶ bp de DNA procede desde un ori único. Este proceso se completa en alrededor de 30 minutos, un índice de replicación de 3 × 10⁵ bp/min. El genoma de mamífero completo se replica en aproximadamente 9 horas, el periodo promedio requerido para la formación de un genoma tetraploide a partir de un genoma diploide en una célula en replicación. Si un genoma de mamífero (3 × 10⁹ bp) se replica al mismo índice que en las bacterias (es decir, 3 × 10⁵ bp/min) a partir de un ori único, la replicación tardaría ¡más de 150 horas! Los organismos metazoarios sortean este problema usando dos estrategias. En primer lugar, la replicación es bidireccional. En segundo lugar, la replicación procede desde orígenes múltiples en cada cromosoma (un total de hasta 100 en seres humanos). De esta manera, la replicación se produce en ambas direcciones a lo largo de todos los cromosomas, y ambas cadenas se replican a la vez. Este proceso de replicación genera “burbujas de replicación” (figura 35-17).

Los múltiples sitios que sirven como orígenes para la replicación de DNA en eucariotas están poco definidos, excepto en algunos virus de animales, y en levaduras. Con todo, está claro que el inicio está regulado en los aspectos tanto espacial como temporal, puesto que agrupaciones de sitios adyacentes inician la replicación de modo sincrónico. La activación de la replicación, o el inicio de la replicación de DNA en un replicador/ori, está influida por varias propiedades bien determinadas de la estructura de cromatina, que apenas están empezando a entenderse. Aun así, está claro que hay más replicadores y ORC excesivo que los necesarios para replicar el genoma de mamíferos dentro del tiempo de una fase S típica; por ende, debe haber mecanismos para controlar el exceso de replicadores unidos a ORC. El entendimiento del control de la formación de complejos de replicación y la activación de los mismos es uno de los principales desafíos en este campo.

Durante la replicación de DNA, debe haber una separación de las dos cadenas para permitir que cada una sirva como una plantilla al unir con hidrógeno sus bases nucleótido al desoxinucleótido trifosfato que está entrando. La separación de las cadenas de DNA es promovida por SSB en E. coli, una proteína llamada proteína de replicación A (RPA) en eucariotas; estas moléculas estabilizan la estructura monocatenaria a medida que progresa la horquilla de replicación. Las proteínas estabilizantes se unen de manera cooperadora y estequiométrica a las cadenas únicas sin interferir con las capacidades de los nucleótidos para servir como plantillas (figura 35-13). Además de separar las dos cadenas de la doble hélice, debe haber un desenrollado de la molécula (1 vez cada 10 pares de nucleótidos) para permitir la separación de cadena. El complejo proteínico de DNA β hexamérico desenrolla DNA en E. coli, mientras que el complejo de MCM hexamérico desenrolla el DNA eucariótico. Este desenrollado ocurre en segmentos adyacentes a la burbuja de replicación; para contrarrestarlo hay múltiples “uniones giratorias” entremezcladas en las moléculas de DNA de todos los organismos. La función de giro es proporcionada por enzimas específicas que introducen “muescas” en una cadena de la doble hélice que se está desenrollando, lo que permite que proceda el proceso de desenrollado. Las muescas se vuelven a sellar con rapidez y sin requerir ingreso de energía, debido a la formación de un enlace covalente de alta energía entre el esqueleto de fosfodiéster que tiene la muesca y la enzima de resellado de muescas; este último tipo de enzima recibe el nombre de DNA topoisomerasas. Dicho proceso se describe en un diagrama en la figura 35-18, y ahí se compara con el resellado dependiente de ATP llevado a cabo por las DNA ligasas. Las topoisomerasas también tienen la capacidad de desenrollar DNA superenrollado; éste es una estructura de orden superior que se encuentra en moléculas de DNA circulares envueltas alrededor de un centro (figuras 35-2 y 35-19).

En una especie de virus de animales (retrovirus) hay una clase de enzimas capaz de sintetizar una molécula de DNA monocatenaria y después una bicatenaria a partir de una plantilla de RNA monocatenario. Esta polimerasa, la DNA polimerasa dependiente de RNA, o “transcriptasa inversa”, sintetiza primero una molécula híbrida de DNA-RNA utilizando el genoma de RNA como una plantilla. Una nucleasa codificada por virus específica, la RNasa H, degrada a la cadena de RNA plantilla hibridada y la cadena de DNA restante, a su vez, sirve como una plantilla para formar una molécula de dsDNA que contiene la información originalmente presente en el genoma RNA del virus de animal.

Reconstitución de la estructura de cromatina

Hay evidencia de que la organización nuclear y la estructura de cromatina están involucradas en la determinación de la regulación y el inicio de la síntesis de DNA. Como se comentó, el índice de polimerización en células eucarióticas, que tienen cromatina y nucleosomas, es más lento que el que se observa en células procariotas, que carecen de cromosomas canónicos. También está claro que la estructura de cromatina debe volver a formarse luego de la replicación. El DNA recién replicado se monta con rapidez hacia nucleosomas, y los octámeros de histonas preexistentes y recién montados se distribuyen al azar hacia cada brazo de la horquilla de replicación. Estas reacciones se facilitan mediante las acciones de proteínas chaperón de histona que trabajan conjuntamente con complejos remodeladores de cromatina.

El DNA se sintetiza durante la fase S del ciclo celular

En células de animales, incluso células de humanos, el genoma de DNA sólo se replica en un momento especificado en el transcurso del lapso de vida de las células. Este periodo se llama la fase sintética o S. Esto por lo general está separado temporalmente de la fase mitótica o fase M, por periodos no sintéticos denominados fases gap 1 (G₁) y gap 2 (G₂), que ocurren antes y después de la fase S, respectivamente (figura 35-20). Entre otras cosas, la célula se prepara para la síntesis de DNA durante G₁, y para la mitosis durante G₂. La célula regula el proceso de síntesis de DNA al permitir que únicamente suceda una vez por ciclo celular y sólo en momentos específicos y en su mayor parte en células que se están preparando para dividirse por medio de un proceso mitótico.

Todas las células eucarióticas tienen productos de gen que rigen la transición desde una fase del ciclo celular hacia la otra. Las ciclinas son una familia de proteínas cuya concentración se incrementa y disminuye en momentos específicos, esto es, en el “ciclo” durante el ciclo celular (de ahí su nombre). Las ciclinas activan, en el momento apropiado, diferentes proteína cinasas dependientes de ciclina (CDK) que fosforilan sustratos esenciales para la progresión por el ciclo celular (figura 35-21). Por ejemplo, Las cifras de ciclina D aumentan al final de la fase G₁ y permiten la progresión más allá del punto de inicio (levadura) o de restricción (mamíferos), donde las células proceden de modo irrevocable hacia la fase S o de síntesis de DNA.

Las ciclinas D activan CDK4 y CDK6; estas dos cinasas también se sintetizan en el transcurso de G₁ en células que se están dividiendo de manera activa. Las ciclinas D y CDK4 y CDK6 son proteínas nucleares que se montan como un complejo al final de la fase G₁. El complejo ciclina-CDK es ahora una serina-treonina proteína cinasa activa. Un sustrato para esta cinasa es la proteína de retinoblastoma (Rb). La Rb es un regulador del ciclo celular porque se une α, y desactiva, un factor de transcripción (E2F) necesario para la transcripción de ciertos genes (genes que codifican para histona, proteínas de replicación de DNA, etc.) necesarios para la progresión desde la fase G₁ hacia la S. La fosforilación de Rb por CDK4 o CDK6 produce liberación de E2F desde Rb por represión de la transcripción mediada por Rb; de este modo, surge activación de gen, y tiene lugar progresión del ciclo celular.

Otras ciclinas y CDK participan en diferentes aspectos de la progresión del ciclo celular (cuadro 35-7). La ciclina E y la CDK2 forman un complejo al final de G₁. La ciclina E se degrada con rapidez, y la CDK2 liberada a continuación forma un complejo con la ciclina A. Esta secuencia es necesaria para el inicio de la síntesis de DNA durante la fase S. Un complejo entre ciclina B y CDK1 es limitante para la transición G₂/M en células eucarióticas.

Muchos de los virus que ocasionan cáncer (oncovirus) y de los genes que inducen cáncer (oncogenes) tienen la capacidad para aliviar o alterar la restricción manifiesta que normalmente controla la entrada de células de mamífero desde la fase G₁ hacia la S. Con base en lo anterior, podría haberse conjeturado que la producción excesiva de una ciclina, la pérdida de un inhibidor de CDK específico (véase más adelante), o la producción o activación de una ciclina/CDK en un momento inapropiado podría traducirse en división celular anormal o irrestricta. En este contexto cabe hacer notar que el oncogén bcl vinculado con el linfoma de células B parece ser el gen que codifica para la ciclina D1. De modo similar, las oncoproteínas (o proteínas transformadoras) producidas por varios virus DNA establecen como objetivo el represor de la transcripción Rb para desactivación, lo que induce división celular de manera inapropiada, mientras que la desactivación de Rb, que por sí mismo es un gen supresor tumoral, lleva a crecimiento celular descontrolado y formación de tumores.

En el transcurso de la fase S, las células de mamífero contienen cantidades más grandes de DNA polimerasa que durante las fases no sintéticas del ciclo celular. Más aún, también hay incremento de la actividad de las enzimas de las cuales depende la formación de los sustratos para la síntesis de DNA (es decir, desoxirribonucleósido trifosfatos) y su actividad disminuirá luego de la fase sintética en tanto no reaparezca la señal para síntesis renovada de DNA. En el transcurso de la fase S, el DNA nuclear se replica por completo una vez y sólo una vez. Una vez que la cromatina se ha replicado, se marca de manera que se impida su replicación adicional en tanto no pase otra vez por mitosis. Este proceso se denomina emisión de licencia para la replicación. Los mecanismos moleculares para este fenómeno parecen comprender disociación, o fosforilación de ciclina-CDK, o ambas, y degradación subsiguiente de varias proteínas de unión a origen que desempeñan funciones cruciales en la formación de complejo de replicación. En consecuencia, los orígenes sólo se activan una vez por cada ciclo celular.

En general, un par dado de cromosomas se replican de manera simultánea y dentro de una porción fija de la fase S en el momento de cada replicación. En un cromosoma, agrupaciones de unidades de replicación se replican de modo coordinado. Se desconoce la naturaleza de las señales que regulan la síntesis de DNA a estos niveles, pero la regulación parece ser una propiedad intrínseca de cada cromosoma individual que está mediada por los varios orígenes de replicación contenidos ahí.

Todos los organismos contienen mecanismos complejos, conservados desde el punto de vista evolutivo, para reparar DNA dañado

La reparación de DNA dañado es crucial para mantener la integridad genómica y, así, evitar la propagación de mutaciones, sea de modo horizontal, es decir, cambios de secuencia de DNA en células somáticas, o vertical, en la cual lesiones no reparadas están presentes en el DNA de espermatozoide o de ovocito y, por ende, pueden transmitirse a la progenie. El DNA queda sujeto a diario a una enorme gama de lesiones de origen químico, físico y biológico (cuadro 35-8), de ahí que el reconocimiento de lesiones del DNA y la reparación de las mismas sea esencial. En consecuencia, las células eucariontes contienen cinco vías principales de reparación del DNA, cada una de las cuales contiene múltiples proteínas a veces compartidas; estas proteínas de reparación del DNA típicamente tienen ortólogos en procariontes. Los mecanismos de reparación del DNA son las vías de reparación: reparación por escisión de nucleótido (NER); reparación de errores de emparejamiento (MMR); reparación por escisión de bases (BER); recombinación homóloga (HR) y unión de extremo no homólogo (NHEJ) (figura 35-22). La naturaleza ha efectuado el experimento de probar la importancia de muchas de estas proteínas de reparación del DNA para las características biológicas del humano —las mutaciones en un gran número de estos genes llevan a enfermedad de humanos (cuadro 35-9) (capítulo 39)—. Más aún, experimentos dirigidos a gen sistemáticos con ratones de laboratorio también han atribuido claramente a estos genes funciones cruciales de mantenimiento de la integridad del gen. En estudios de genética de ratones, se observó que de hecho las mutaciones dirigidas dentro de estos genes inducen defectos de la reparación del DNA, mientras que a menudo también aumentan de manera notoria la susceptibilidad a cáncer.

Uno de los mecanismos de reparación de DNA estudiados de manera más intensiva es el mecanismo que se usa para reparar roturas bicatenarias de DNA (DSB); lo que se comenta con cierto detalle aquí. Las células eucariontes utilizan dos vías, HR y NHEJ, para eliminar DSB. La elección entre las dos depende de la fase del ciclo celular (figuras 35-20 y 35-21) y del tipo exacto de DSB que va a repararse (cuadro 35-8). Durante las fases G₀/G₁ del ciclo celular, las DSB son corregidas mediante la vía NHEJ, mientras que durante las fases S, y G2/M del ciclo celular, se utiliza HR. Todos los pasos de la reparación del daño del DNA son catalizados por moléculas evolutivamente conservadas, que incluyen detectores de daño de DNA, transductores y mediadores de reparación del daño. En conjunto, estas cascadas de proteínas participan en la respuesta celular al daño del DNA. Es importante que los resultados celulares finales del daño del DNA, y los intentos celulares por reparar el daño del DNA, varían desde retraso del ciclo celular para permitir que haya reparación del DNA; paro del ciclo celular, hasta apoptosis o senescencia (figura 35-23; detalles más adelante). Las moléculas involucradas en estos procesos complejos y altamente integrados varían desde modificaciones de histona específicas para daño (esto es, lisina dimetilada 20 histona H4; H4K20me2) y la incorporación de variantes de isotipo de histona, como histona H2AX (cuadro 35-1), poli ADP ribosa polimerasa, PARP, el complejo proteínico MRN (subunidades Mre11-Rad50-NBS1), hasta proteínas de reconocimiento/emisión de señales de cinasa activadas por daño de DNA (ATM [ataxia telangiectasia, mutada] y cinasa relacionada con ATM, ATR, la proteína cinasa dependiente de DNA de múltiples subunidades [DNA-PK y Ku70/80], y cinasas de punto de control 1 y 2 [CHK1, CHK2]). Estas cinasas múltiples fosforilan y, en consecuencia, modulan las actividades de docenas de proteínas, como muchas proteínas de reparación de DNA, de verificación de punto de control, y de control del ciclo celular, como CDC25A, B, C, Wee1, p21, p16 y p19 (todas reguladores de ciclina-CDK [figura 9-8 y véase más adelante]; diversas exonucleasas y endonucleasas; proteínas de unión a DNA específicas para cadena única de DNA [RPA]; PCNA y DNA polimerasas específicas [DNA pol delta, δ, y eta, η]). Varios de estos (tipos) de proteínas/enzimas se han comentado antes en el contexto de la replicación del DNA. La reparación del DNA y su relación con el control del ciclo celular son áreas de investigación muy activas dados los papeles fundamentales en la biología celular y el potencial para generar cáncer y para prevenirlo.

La integridad del DNA y de cromosomas se monitorea de principio a fin del ciclo celular

Dada la importancia de la función normal del DNA y de los cromosomas para la supervivencia, no sorprende que las células eucarióticas hayan creado mecanismos complejos para monitorear la integridad del material genético. Como se detalló, varios sistemas de enzimas de múltiples subunidades, complejos, han aparecido por evolución para reparar DNA dañado en el ámbito de secuencia de nucleótido. De modo similar, los percances de DNA en el ámbito de cromosoma también se monitorean y reparan. La integridad tanto del DNA como de los cromosomas se monitorea de manera continua durante todo el ciclo celular (figura 35-20). Los cuatro pasos específicos en los cuales ocurre este monitoreo se han llamado puntos de control. Si se detectan problemas en alguno de estos puntos, la progresión por el ciclo se interrumpe, y el tránsito por el ciclo celular se suspende en tanto no se repara el daño. Los mecanismos moleculares que fundamentan la detección del daño de DNA en el transcurso de las fases G₁ y G₂ del ciclo se entienden mejor que los que operan durante las fases S y M.

El supresor tumoral p53, una proteína de peso molecular de 53 kDa aparente en SDS-PAGE, desempeña un papel clave en la verificación del punto de control tanto de G₁ como de G₂. Normalmente una proteína muy inestable, p53 es un factor de transcripción de unión a DNA, una de una familia de proteínas relacionadas (esto es, p53, p63 y p73), que de algún modo se estabiliza en respuesta a daño de DNA, quizá por interacciones p53-DNA directas. Al igual que las histonas antes comentadas, p53 está sujeta a una panoplia de PTM reguladoras, todas las cuales probablemente modifican sus múltiples actividades biológicas. Las concentraciones incrementadas de p53 activan la transcripción de un montaje de genes que sirven en conjunto para retrasar el tránsito por el ciclo. Una de estas proteínas inducidas, p21, es un potente inhibidor de la CDK-ciclina (CKI) que tiene la capacidad para inhibir con eficiencia la acción de todas las CDK. Está claro que la inhibición de las CDK suspenderá la progresión por el ciclo celular (figuras 35-19 y 35-20). Si el daño del DNA es demasiado extenso como para que se repare, las células afectadas sufren apoptosis (muerte celular programada) de una manera dependiente de p53. En este caso, p53 induce la activación de un conjunto de genes que inducen a apoptosis. Las células que carecen de p53 funcional no pasan por apoptosis en respuesta a cifras altas de radiación o de quimioterápicos activos en el DNA. Entonces, tal vez no sorprende que p53 sea uno de los genes mutados con mayor frecuencia en cánceres de seres humanos (capítulo 56). De hecho, estudios de secuenciación genómica recientes de múltiples muestras de DNA tumoral sugieren que más de 80% de los cánceres de ser humano porta mutaciones de pérdida de función de p53. La investigación adicional sobre los mecanismos de manejo de punto de control resultará inestimable para la creación de opciones terapéuticas eficaces contra el cáncer.

• El DNA en células eucarióticas se relaciona con diversas proteínas, lo que produce una estructura denominada cromatina.

• Gran parte del DNA se asocia con proteínas histona para formar una estructura llamada el nucleosoma, que consta de un octámero de histonas alrededor del cual se envuelven alrededor de 150 bp de DNA.

• Las histonas están sujetas a una gama extensa de modificaciones covalentes dinámicas que tienen importantes consecuencias reguladoras.

• Los nucleosomas y las estructuras de orden superior formadas a partir de ellos sirven para compactar el DNA.

• El DNA en regiones activas desde el punto de vista transcripcional es relativamente más sensible al ataque por nucleasa in vitro; algunas regiones, llamadas sitios hipersensibles, son excepcionalmente sensibles y a menudo se encuentra que contienen sitios de control de transcripción.

• El DNA muy activo en el aspecto transcripcional (los genes) suele estar agrupado en regiones de cada cromosoma. Dentro de estas regiones, los genes pueden estar separados por DNA inactivo en estructuras nucleosómicas. En muchas unidades de transcripción eucariotas (es decir, la parte de un gen que es copiada por la RNA polimerasa) a menudo consta de regiones de DNA codificadoras (exones) interrumpidas por secuencias interpuestas de DNA no codificador (intrones). Esto es particularmente cierto de los genes codificadores de mRNA.

• Después de la transcripción, durante el procesamiento del RNA, los intrones se eliminan, y los exones se ligan entre sí para formar el mRNA maduro que aparece en el citoplasma; este proceso se denomina empalme del RNA.

• El DNA en cada cromosoma se replica exactamente de acuerdo con las reglas de la formación de pares de bases en el transcurso de la fase S del ciclo celular.

• Cada cadena de la doble hélice se replica de modo simultáneo pero mediante mecanismos un poco diferentes. Un complejo de proteínas, incluso la DNA polimerasa, replica la cadena adelantada de manera continua en la dirección 5′ a 3′. La cadena retrasada se replica de modo discontinuo, en fragmentos cortos de 100 a 250 nucleótidos mediante la sintetización de polimerasa de DNA en la dirección 3′ → 5′.

• La replicación de DNA es iniciada en sitios especiales llamados orígenes, u ori, y generan burbujas de replicación. Cada cromosoma contiene múltiples orígenes. Todo el proceso requiere alrededor de 9 h en una célula de ser humano típica, y sólo ocurre durante la fase S del ciclo celular.

• Diversos mecanismos en los que se emplean diferentes sistemas de enzimas reparan DNA celular dañado tras exposición de células a mutágenos químicos y físicos.

• Las células normales que contienen DNA imposible de reparar pasan por muerte celular programada.