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Un aparato complejo que consta de hasta 50 proteínas únicas proporciona transcripción precisa y regulable de genes eucarióticos. Las enzimas RNA polimerasa (pol I, pol II y pol III) transcriben información contenida en la cadena plantilla de DNA hacia RNA. Estas polimerasas deben reconocer un sitio específico en el promotor para iniciar la transcripción en el nucleótido apropiado. Aun así, en contraste con la situación en procariontes, las RNA polimerasas eucariontes in vitro solas son incapaces de distinguir entre secuencias promotoras y otras regiones no promotoras del DNA en la prueba in vitro. Todas las formas de RNA polimerasa eucarionte requieren otras proteínas, conocidas como factores de transcripción generales o GTF. La RNA polimerasa II requiere TFIIA, B, D (o TBP), E, F y H tanto para facilitar la unión de la enzima específica para el promotor, como para la formación del PIC. Las RNA polimerasas I y III requieren sus propios GTF específicos para polimerasa. Más aún, la RNA polimerasa II y los GTF no muestran respuesta a proteínas activadoras, y sólo pueden catalizar la transcripción basal o (no)-desregulada in vitro. Otro grupo de proteínas (los coactivadores o correguladores) funcionan conjuntamente con proteínas transactivadoras de unión a DNA, o se comunican con Pol II/GTF para regular la tasa de transcripción (véase más adelante).
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Formación del complejo de transcripción pol II
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En bacterias, un complejo de factor σ-holoenzima polimerasa, Eσ, se une de manera selectiva al promotor en el DNA para formar el PIC. La situación es mucho más compleja en genes eucarióticos. Los genes codificadores de mRNA, que son transcritos por pol II, se describen como un ejemplo. En el caso de genes transcritos por pol II, la función de los factores σ es asumida por diversas proteínas. La formación del PIC necesita, además de pol II, varios de los denominados factores de transcripción general (GTF) llamados TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF y TFIIH. Estos GTF sirven para promover la transcripción de RNA polimerasa II esencialmente en todos los genes. Algunos de estos GTF están compuestos de múltiples subunidades. El TFIID, que se une al elemento promotor secuencia TATA mediante su subunidad TBP, es el único de estos factores que independientemente es capaz de unión específica, de alta afinidad al promotor en el DNA. El TFIID consta de 15 subunidades, TBP y 14 factores asociados con TBP (TAF).
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El TBP se une a la secuencia TATA en el surco menor del DNA (casi todos los factores de transcripción se unen en el surco mayor) y origina una flexión o acodamiento de aproximadamente 100 grados de la hélice de DNA. Se cree que esta flexión facilita la interacción de TAF con otros componentes del complejo de inicio de transcripción, el promotor eucariótico de múltiples componentes, y posiblemente con factores unidos a elementos torrente arriba. Aunque al principio definido como un componente sólo requerido para transcripción de promotores de gen pol II, el TBP, en virtud de su asociación con distintos grupos de TAF específicos para polimerasa, separados, también es un componente importante de los complejos de inicio de transcripción pol I y pol III, incluso si no contienen secuencias TATA.
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La unión de TFIID marca un promotor específico para la transcripción. De varios pasos in vitro subsiguientes, el primero es la unión de TFIIA, y después de TFIIB, al complejo de TFIID-promotor. Esto da por resultado un complejo ternario estable que luego se ubica con mayor exactitud y más estrechamente unido en el sitio de inicio de la transcripción; este complejo a continuación atrae y une el complejo de pol II-TFIIF al promotor. La adición de TFIIE y la de TFIIH son los pasos finales en el montaje del PIC. El TFIIE parece unirse al complejo con pol II–TFIIF, y a continuación se recluta TFIIH. Cada uno de estos eventos de unión extiende el tamaño del complejo, de modo que finalmente quedan cubiertas alrededor de 60 bp (desde −30 hasta +30 respecto a +1 TSS) (figura 36-9). El PIC ahora está completo y tiene capacidad de transcripción basal iniciada a partir del nucleótido correcto. En genes que carecen de una secuencia TATA, se requieren los mismos factores. En esos casos, la Inr o el DPE sirve para (figura 36-8) colocar al complejo en la posición adecuada para inicio preciso de la transcripción.
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La accesibilidad del promotor y, por ende, la formación del PIC a menudo están moduladas por nucleosomas
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En ciertos genes eucarióticos la maquinaria de transcripción (pol II, etc.) no puede tener acceso a las secuencias promotoras (es decir, TATA-INR-DPE) porque estos elementos promotores esenciales están envueltos en nucleosomas (figuras 35-2, 35-3 y 36-10). Los nucleosomas represores sólo se eliminan después de que los factores de transcripción se unen al DNA potenciador torrente arriba del promotor, y reclutan factores remodeladores de cromatina y correguladores modificadores, como los factores Swi/Snf, SRC-1, p300/CBP (capítulo 42) P/CAF u otros factores (figura 36-10). Una vez que el promotor está “abierto” luego de la disociación del nucleosoma, GTF y RNA polimerasa II pueden unirse e iniciar la transcripción del gen de mRNA. Note que la unión de transactivadores y correguladores puede ser sensible a, o controlar de manera directa, o ambas, el estado de modificación covalente de las histonas dentro de los nucleosomas en y alrededor del promotor y potenciador y, así, aumentar o disminuir la capacidad de todos los otros componentes requeridos para la formación de PIC para interactuar con un gen particular. Este denominado código epigenético de modificaciones de histonas y proteína puede contribuir de modo importante al control de la transcripción del gen. En realidad, las mutaciones en proteínas que catalizan (escritoras de código), eliminan (borradoras de código) o que se unen de manera diferencial (lectoras de código) a histonas modificadas pueden llevar a enfermedad en humanos.
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La fosforilación activa a la pol II
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La pol II eucariótica consta de 12 subunidades. Como ya se mencionó, las dos subunidades de mayor tamaño (MW 220 y 150 kDa) son homólogas a las subunidades β y β′ bacterianas. Además del número incrementado de subunidades, la pol II eucariótica difiere de su homóloga procariótica por cuanto tiene una serie de siete repeticiones con secuencia de consenso Tir-Ser-Pro-Tre-Ser-Pro-Ser en el carboxilo terminal de la subunidad pol II de mayor tamaño. Este dominio de repetición carboxilo terminal (CTD) tiene 26 unidades repetidas en la levadura de cerveza y 52 unidades en células de mamífero. El CTD es un sustrato para varias enzimas (cinasas, fosfatasas, prolil isomerasas, glucosilasas); la fosforilación del CTD fue la primera modificación postraduccional (PTM) de CTD descubierta. La subunidad cinasa de TFIIH entre otras proteínas puede modificar el CTD. El CTD modificado de manera covalente es el sitio de unión para una amplia gama de proteínas, y se ha mostrado que interactúa con muchas enzimas modificadoras de mRNA y procesadoras del mismo, y proteínas de transporte nuclear. De este modo, la asociación de estos factores con el CTD de la RNA polimerasa II (y otros componentes de la maquinaria basal) sirve para acoplar el inicio de la transcripción con el empalme de mRNA, la formación del extremo 3′, y el transporte hacia el citoplasma (véase más adelante). La pol II se activa cuando se fosforila en los residuos Ser y Tre, y despliega menor actividad cuando el CTD se desfosforila. La fosforilación/desfosforilación de CTD es crucial para la eliminación del promotor, el alargamiento, la terminación, e incluso el procesamiento apropiado del mRNA. La pol II que carecen de la cola CTD es incapaz de activar la transcripción, y las células que expresan pol II que carece de CTD son inviables. Esos resultados subrayan la importancia de este dominio para la biogénesis de mRNA.
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La pol II puede asociarse con otras proteínas llamadas proteínas Mediadoras o Med para formar un complejo que a veces se denomina holoenzima pol II; este complejo puede formarse en el promotor o antes de la formación del PIC (véase más adelante). Las proteínas Med son esenciales para la regulación apropiada de la transcripción de pol II al desempeñar muchísimas funciones, que tanto activan como reprimen la transcripción. De esta manera, el Mediador, al igual que TFIID, es un corregulador transcripcional (figura 36-11).
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La función de activadores y correguladores de la transcripción
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Originalmente se consideró que el TFIID era una proteína única, la TBP. Aun así, algunas evidencias llevaron al importante descubrimiento de que el TFIID de hecho es un complejo que consta de TBP y las 14 TAF. La primera evidencia de que el TFIID era más complejo que las moléculas de la TBP provino de la observación de que la TBP se une a un segmento de DNA de 10 bp, inmediatamente sobre la secuencia TATA del gen, mientras que el holo-TFIID natural cubre una región de 35 bp o de mayor tamaño (figura 36-9). En segundo lugar, la TBP tiene una masa molecular de 20 a 40 kDa (dependiendo de la especie), mientras que el complejo nativo de TFIID tiene una masa de aproximadamente 1 000 kDa. Finalmente, y quizá lo que tiene mayor importancia, la TBP apoya la transcripción basal, no así la transcripción aumentada proporcionada por ciertos activadores, por ejemplo. Sp1 unido a la secuencia GC. Por otra parte, el TFIID apoya la transcripción tanto basal como aumentada por Sp1, Oct1, AP1, CTF, ATF, etcétera (cuadro 36-3). Los TAF son esenciales para esta transcripción aumentada por activador. Probablemente hay varias formas de TFIID que difieren un poco en su complemento de TAF. Así, diferentes combinaciones de TAF con TBP (o uno de varios factores parecidos a TBP recién descubiertos (TLF)) se unen a diferentes promotores, e informes recientes sugieren que esto puede explicar la activación selectiva de genes para diversos promotores en células tejidos, y las diferentes potencias de ciertos promotores. Los TAF, puesto que se necesitan para la acción de los activadores, suelen llamarse coactivadores o correguladores. De este modo, hay tres clases de factores de transcripción involucrados en la regulación de los genes pol II: pol II y GTF, correguladores, y activadores-represores de unión a DNA (cuadro 36-4). La manera en que estas clases de proteínas interactúan para regir tanto el sitio como la frecuencia de transcripción es una interrogante de importancia fundamental e investigación activa. Se cree que los correguladores actúan como un puente entre los transactivadores de unión a DNA y pol II/GTF, y que modifican la cromatina.
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Dos modelos pueden explicar el montaje del complejo de preinicio
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La formación del PIC antes descrito se basa en la adición secuencial de componentes purificados según se observa por medio de experimentos in vitro. Una característica esencial de este modelo es que el montaje de PIC tiene lugar sobre una plantilla de DNA donde todas las proteínas de transcripción tienen fácil acceso al DNA. Por consiguiente, se cree que los activadores de la transcripción, que tienen dominios de unión y de activación de DNA autónomos (capítulo 38), funcionan al estimular la formación de PIC. Aquí el TAF o los complejos mediadores se consideran factores que forman puentes que comunican entre los activadores unidos torrente arriba, y los GTF y pol II. Esta opinión asume que hay montaje por pasos del PIC, promovido por diversas interacciones entre activadores, coactivadores y componentes del PIC (figura 36-11, panel A). Este modelo recibió apoyo por observaciones de que muchas de estas proteínas en realidad pueden unirse entre sí in vitro.
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Evidencia reciente sugiere que hay otro posible mecanismo de formación de PIC y, de este modo, de la regulación de la transcripción. En primer lugar, se encuentran complejos premontados grandes de GTF y pol II en extractos celulares, y estos complejos pueden relacionarse con el promotor en un paso único; en segundo lugar, el índice de transcripción que se logra cuando se añaden activadores a concentraciones limitantes de holoenzima pol II puede igualarse al incrementar la concentración de esta última en ausencia de activadores. Así, por lo menos in vitro, pueden establecerse condiciones en las cuales los activadores no son por sí mismos absolutamente esenciales para la formación de PIC; tales observaciones condujeron a la hipótesis del “reclutamiento”, que ahora se ha probado de manera experimental. Expresado en términos simples, la función de activadores y de algunos coactivadores tal vez solamente sea reclutar un complejo de holoenzima-GTF preformado hacia el promotor. El requerimiento de un dominio de activación se evita cuando un componente del TFIID o la holoenzima pol II se fija de manera artificial, usando técnicas de DNA recombinante, al dominio de unión a DNA (DBD) de un activador. Esta fijación, mediante el componente DBD de la molécula activadora, da pie a una estructura competente en el aspecto transcripcional, y no hay requerimiento adicional del dominio de activación del activador. En esta perspectiva, la función de los dominios de activación es dirigir complejos de holoenzima-GTF preformados hacia el promotor; no ayudan en el montaje del PIC (figura 36-11, panel B). En este modelo, la eficiencia del proceso de reclutamiento determina de modo directo el índice de transcripción en un promotor dado.