CAPÍTULO 36: Síntesis, procesamiento y modificación del RNA

La síntesis de una molécula de RNA a partir de DNA es un proceso complejo que incluye una enzima del grupo de las RNA polimerasas, y diversas proteínas relacionadas. Los pasos generales requeridos para sintetizar la transcripción primaria son inicio, alargamiento y terminación; se conoce más acerca del inicio. Han sido identificadas varias regiones de DNA (por lo general localizadas torrente arriba desde el sitio de inicio) y factores proteínicos que se unen a estas secuencias para regular el comienzo de la transcripción. Ciertos RNA (en especial el RNA mensajero (mRNA)) tienen lapsos de vida muy diferentes en una célula. Las moléculas de RNA que se sintetizan en células de mamífero se sintetizan como moléculas precursoras que tienen que procesarse hacia RNA maduro, activo. Es importante entender los principios básicos de la síntesis y el metabolismo del mRNA (RNA mensajero), porque la modulación de este proceso da por resultado índices alterados de síntesis de proteína y, así, diversos cambios tanto metabólicos como fenotípicos. De este modo, todos los organismos se adaptan a cambios del ambiente. También de esta manera se establecen y mantienen las estructuras y funciones celulares diferenciadas. Los errores o cambios de la síntesis, el procesamiento, el empalme, estabilidad o función de las transcripciones de mRNA producen enfermedades.

Todas las células eucariontes tienen dos clases principales de RNA (cuadro 36-1), los RNA codificantes de proteína, o RNA mensajeros (mRNA), y dos formas de RNA no codificantes de proteína, abundantes, delineados con base en el tamaño: los RNA ribosomales (rRNA) grandes, y RNA no codificantes largos (lncRNA) y RNA no codificantes pequeños RNA de transferencia (tRNA), los RNA nucleares pequeños (SNRNA), y los microRNA y RNA silenciadores (miRNA y siRNA). Los mRNA, rRNA y tRNA están directamente involucrados en la síntesis de proteína, mientras que los otros RNA participan en el empalme de mRNA (SnRNA) o la modulación de la expresión de gen al alterar la función (mi/SiRNA) y/o expresión (lncRNA) del mRNA. Estos RNA difieren en su diversidad, estabilidad y abundancia en las células.

Los procesos de síntesis de DNA y RNA son similares por cuanto comprenden: 1) los pasos generales del inicio, alargamiento y terminación con polaridad 5′ a 3′; 2) complejos de inicio de múltiples componentes, grandes, y 3) apego a las reglas de formación de pares de bases identificadas por Watson y Crick. Sin embargo, la síntesis de DNA y RNA difiere en varios aspectos importantes, entre ellos: 1) en la síntesis de RNA se usan ribonucleótidos en lugar de desoxirribonucleótidos; 2) la U reemplaza a la T como la base complementaria para A en el RNA; 3) la síntesis de RNA no incluye un iniciador, dado que las RNA polimerasas tienen la capacidad para iniciar la síntesis de novo; 4) sólo porciones del genoma se transcriben o copian de modo vigoroso hacia el RNA, mientras que todo el genoma debe copiarse, una vez y sólo una vez, durante la replicación del DNA, y 5) no hay una función de corrección de pruebas eficiente, muy activa, en el transcurso de la transcripción del RNA.

El proceso de la síntesis de RNA a partir de una plantilla de DNA se ha caracterizado mejor en procariotas. Aun cuando en células de mamífero la regulación de la síntesis de RNA y el procesamiento postranscripcional de RNA son diferentes de los que ocurren en procariotas, el proceso de síntesis de RNA en sí es bastante similar en estas dos clases de organismos. En consecuencia, la descripción de las síntesis de RNA en procariotas, en los cuales se entiende mejor, es aplicable a eucariotas aun cuando las enzimas comprendidas y las señales reguladoras, aunque vinculadas, son diferentes.

La cadena plantilla de DNA se transcribe

La secuencia de ribonucleótidos en una molécula de RNA es complementaria a la secuencia de desoxirribonucleótidos en una cadena de la molécula de DNA bicatenaria (figura 34-8). La cadena que se transcribe o copia hacia una molécula de RNA se denomina la cadena plantilla del DNA: la otra cadena del DNA, la cadena no plantilla, suele llamarse la cadena codificadora de ese gen. Se denomina así porque, con la excepción de cambios de T por U, corresponde con precisión a la secuencia de la transcripción primaria de RNA mensajero, que codifica para el producto (proteína) del gen. En el caso de una molécula de DNA bicatenaria que contiene muchos genes, la cadena plantilla para cada gen no será necesariamente la misma cadena de la doble hélice de DNA (figura 36-1). De esta manera, una cadena dada de una molécula de DNA bicatenario servirá como la cadena plantilla para algunos genes y como la cadena codificadora para otros genes. Nótese que la secuencia de nucleótidos de una transcripción de RNA será la misma (excepto por U que reemplaza a T) que la de la cadena codificadora. La información en la cadena plantilla se lee en la dirección 3′ a 5′. Aun cuando no se muestra en la figura 36-1, hay casos de genes embebidos dentro de otros genes.

La RNA polimerasa dependiente de DNA inicia la transcripción de un sitio distinto, el promotor

La RNA polimerasa dependiente de DNA es la enzima que se encarga de la polimerización de ribonucleótidos hacia una secuencia complementaria a la cadena plantilla del gen (figuras 36-2 y 36-3). La enzima se fija a un sitio específico (el promotor) sobre la cadena plantilla. Esto va seguido por comienzo de la síntesis de RNA en el punto de inicio y el proceso continúa en tanto no se llega a una secuencia de terminación (figura 36-3). Una unidad de transcripción se define como la región del DNA que incluye las señales para el inicio, el alargamiento y la terminación de la transcripción. El producto RNA, que se sintetiza en la dirección 5′ a 3′, es el transcrito primario. La transcripción varía de un gen a otro, pero puede ser bastante alta. En la figura 36-4 se presenta una micrografía electrónica de transcripción en acción. En procariotas, esto puede representar el producto de varios genes contiguos; en células de mamífero, regularmente representa el producto de un gen único. Los términos 5′ de la transcripción de RNA primaria y el RNA citoplásmico maduro son idénticos. De este modo, el punto inicial de transcripción (TSS) corresponde al nucleótido 5′ del mRNA; esto se designa posición + 1, al igual que el nucleótido correspondiente en el DNA. Los números aumentan conforme la secuencia procede torrente abajo desde el sitio de inicio. Esta convención facilita localizar regiones particulares, como límites de intrón y exón. El nucleótido en el promotor adyacente al sitio de inicio de la transcripción en la dirección torrente arriba se designa −1, y estos números negativos se incrementan a medida que la secuencia procede torrente arriba, alejándose del TSS. El sistema numérico +/− proporciona una manera convencional de definir la ubicación de elementos reguladores en un gen.

Los transcritos primarios generados por la RNA polimerasa II (una de las tres RNA polimerasas dependientes de DNA nucleares distintas en eucariotas) quedan cubiertas con el capuchón de 7-metilguanosina trifosfato (figura 34-10), que persisten y a la postre aparecen sobre el extremo 5′ de mRNA citoplásmico maduro. Estas cubiertas se requieren para el procesamiento subsiguiente de la transcripción primaria hacia mRNA, para la traducción del mRNA, y para la protección de mRNA contra ataque nucleolítico po 5′ exonucleasas.

La RNA polimerasa dependiente de DNA bacteriano es una enzima de múltiples subunidades

La RNA polimerasa dependiente de DNA básica (RNAP) de la bacteria Escherichia coli existe como un complejo central de alrededor de 400 kDa, que consta de dos subunidades α idénticas, similares a las subunidades β y β′, y una subunidad ω. La subunidad β se une a iones de Mg²⁺ y compone la subunidad catalítica (figura 36-2). El complejo central de la RNA polimerasa, ββ’α₂ω, a menudo llamada E, se asocia con un factor proteínico específico (el factor sigma [σ]) para formar la holoenzima, ββ’α₂ωσ, o Eσ. La subunidad σ ayuda a la enzima central a reconocer y unirse a la región promotora (figura 36-5) para formar el complejo de preinicio (PIC). En todas las especies bacterianas hay múltiples genes distintos que codifican para el factor σ. Los factores σ tienen una función doble en el proceso de reconocimiento de promotor; la asociación σ con la RNA polimerasa central disminuye su afinidad por el DNA en sitios no promotores, mientras que al mismo tiempo aumenta la afinidad de la holoenzima por el promotor en el DNA. Los múltiples factores σ compiten para interactuar con RNA polimerasa central limitante (E). Cada uno de estos factores σ actúa como una proteína reguladora que modifica la especificidad de reconocimiento del promotor de la holoenzima RNA polimerasa única resultante (es decir, Eσ₁, Eσ₂,…). La aparición de diferentes factores σ y su relación con el complejo central de la RNA polimerasa para formar nuevas formas de holoenzima Eσ₁, Eσ₂,…, puede correlacionarse temporalmente con diversos programas de expresión de gen en sistemas procarióticos, como esporulación, crecimiento en diversas fuentes con poco contenido de nutriente, y la respuesta a choque térmico.

Las células de mamífero poseen tres RNA polimerasas dependientes de DNA nuclear separadas

En el cuadro 36-2 se describen algunas de las propiedades distintivas de las polimerasas nucleares de mamífero. Cada una de estas RNA polimerasas dependientes de DNA se encarga de la transcripción de diferentes grupos de genes. Los tamaños de las RNA polimerasas varían desde MW de 500 hasta 600 kDa. Estas enzimas muestran perfiles de subunidad más complejos que las RNA polimerasas de procariontes. Todas tienen dos subunidades grandes, que notoriamente tienen fuertes similitudes de secuencia y estructurales con las subunidades β y β′ procariontes, y varias subunidades más pequeñas (hasta 14 en el caso de la RNA pol III). Aún no se entienden por completo las funciones de cada una de las subunidades. Una toxina peptídica del hongo Amanita phalloides, α-amanitina, es un inhibidor diferencial específico de las RNA polimerasas dependientes de DNA nucleares eucarióticas y, como tal, ha resultado ser un potente instrumento de investigación (cuadro 36-2). La α-amanitina bloquea la translocación de la RNA polimerasa durante la formación de enlace fosfodiéster.

El proceso de síntesis de RNA en bacterias (figura 36-3) es cíclico y comprende múltiples pasos. Primero la holoenzima RNA polimerasa (Eσ) debe unirse al DNA y localizar un promotor (P; figura 36-3). Una vez que el promotor es localizado, el complejo de Eσ-DNA promotor pasa por un cambio conformacional dependiente de la temperatura, y desenrolla o funde el DNA que está en el sitio de inicio de la transcripción y alrededor del mismo (en +1). Dicho complejo se llama el complejo de preinicio, o PIC; este desenrollamiento permite que el sitio activo del Eσ tenga acceso a la cadena plantilla, que por supuesto dicta la secuencia de ribonucleótidos que va a polimerizarse hacia RNA. A continuación, el primer nucleótido (típicamente una purina, aunque no siempre) se asocia con el sitio de unión a nucleótido en la subunidad β de la enzima, y en presencia del siguiente nucleótido apropiado unido a la polimerasa, la RNAP cataliza la formación del primer enlace fosfodiéster, y la cadena naciente ahora está fija al sitio de polimerización en la subunidad β de la RNAP; esta reacción se llama inicio. Debe notarse la analogía con los sitios A y P en el ribosoma (figura 37-9, abajo). El dinucleótido naciente retiene el 5′-trifosfato del nucleótido iniciador (figura 36-3, ATP).

La RNA polimerasa sigue incorporando nucleótidos 3 a ∽110, punto en el cual la polimerasa pasa por otro cambio conformacional y se aleja del promotor; esta reacción se llama eliminación de promotor. A continuación empieza la fase de alargamiento, en la cual la molécula de RNA naciente crece 5′–3′ de forma consecutiva a la incorporación continua de NTP de manera cíclica, antiparalela a su plantilla. La enzima polimeriza los ribonucleótidos en la secuencia específica dictada por la cadena plantilla, e interpretada mediante las reglas de formación de pares de bases de Watson-Crick. Se libera pirofosfato después de cada ciclo de polimerización. Al igual que para la síntesis de DNA, este pirofosfato (PP_i) es degradado con rapidez a 2 mol de fosfato inorgánico (P_i) por medio de pirofosfatasas ahí presentes, lo que proporciona irreversibilidad a la reacción sintética general. La decisión: permanecer en el promotor en un estado equilibrado o detenido, o transición hacia alargamiento, parece ser un paso regulador importante en la transcripción de gen que codifica para mRNA tanto procarionte como eucarionte.

Conforme el complejo de alargamiento que contiene a la RNA polimerasa avanza a lo largo de la molécula de DNA, debe ocurrir desenrollamiento de DNA con el fin de proporcionar acceso para la formación de par de bases apropiada para los nucleótidos de la cadena codificadora. La extensión de esta burbuja de transcripción (esto es, desenrollamiento de DNA) es constante de principio a fin de la transcripción, y se ha estimado que es de aproximadamente 20 pares de bases por cada molécula de polimerasa (figura 36-2). Así, parece ser que el tamaño de la región de DNA desenrollado está dictado por la polimerasa y es independiente de la secuencia de DNA en el complejo. La RNA polimerasa tiene una actividad intrínseca de “desenrollasa” que abre la hélice de DNA (véase la formación de PIC arriba). El hecho de que la doble hélice de DNA deba desenrollarse, y las cadenas separarse al menos de manera transitoria para la transcripción, implica alguna alteración de la estructura del nucleosoma de células eucarióticas. La topoisomerasa precede y sigue a la RNAP que está progresando, a fin de evitar la formación de tensiones de superhélice que servirían para incrementar la energía necesaria para desenrollar el DNA plantilla adelante de la RNAP.

La terminación de la síntesis de la molécula de RNA en bacterias es señalada por una secuencia en la cadena plantilla de la molécula de DNA (una señal que es reconocida por una proteína de terminación, el factor rho [ρ]). Rho es una helicasa estimulada por RNA, dependiente de ATP, que altera el complejo de alargamiento de la transcripción ternario compuesto por RNA polimerasa-RNA naciente y DNA. En algunos genes, la RNA polimerasa bacteriana puede reconocer directamente señales de terminación codificadas por DNA (figura 36-3; T) sin la ayuda del factor rho. Después de que termina la síntesis del RNA, la enzima se separa de la plantilla de DNA, y se disocia a enzima central libre (E) y factor ρ libre. Con la ayuda de otro factor σ, la holoenzima Eσ reformada, a continuación reconoce otro promotor con lo cual comienza la síntesis de una nueva molécula de RNA. En células eucarióticas no se ha conseguido una comprensión plena de la terminación, pero las proteínas que catalizan el procesamiento, terminación y poliadenilación de RNA parecen cargarse sobre la RNAP (RNA polimerasa) II poco después del inicio (véase más adelante). Más de una molécula de RNA polimerasa puede transcribir de manera simultánea la misma cadena plantilla de un gen, pero el proceso está modulado por fases y espaciado de modo que en cualquier momento cada una está transcribiendo una parte diferente de la secuencia de DNA (figuras 36-1 y 36-4).

El análisis de la secuencia de DNA de genes específicos ha permitido el reconocimiento de varias secuencias importantes en la transcripción de gen. A partir del gran número de genes bacterianos estudiados, es posible construir modelos de consenso de señales de inicio y terminación de transcripción.

La pregunta “¿de qué manera la RNAP encuentra el sitio correcto para iniciar la transcripción?” no es trivial cuando se considera la complejidad del genoma. E. coli tiene 4 × 10³ sitios de inicio de transcripción (es decir, promotores de gen) en 4.2 × 10⁶ pares de base (bp) de genoma. La situación es aún más compleja en humanos, en los cuales hasta 150 000 sitios de inicio de transcripción están distribuidos en 3 × 10⁹ bp de DNA. La RNAP puede unirse, con baja afinidad, a muchas regiones de DNA, pero escanea la secuencia de DNA (a un índice de ≥ 10³ bp/s) en tanto no reconoce ciertas regiones específicas del DNA a las cuales se une con mayor afinidad. Estas regiones se denominan promotores, y es la asociación de RNAP con promotores lo que asegura el inicio exacto de la transcripción. El proceso de reconocimiento-utilización del promotor es el blanco para la regulación tanto en bacterias como en humanos.

Los promotores bacterianos son relativamente simples

Los promotores bacterianos tienen alrededor de 40 nucleótidos (40 bp o cuatro vueltas de la doble hélice de DNA) de largo, una región suficientemente pequeña como para que sea cubierta por una molécula de RNA holopolimerasa de E. coli. En un promotor de consenso hay dos elementos de secuencia cortos, conservados. Aproximadamente 35 bp torrente arriba del sitio de inicio de la transcripción hay una secuencia de consenso de ocho pares de nucleótidos (consenso: 5′-TGTTGACA-3′) a los cuales el RNAP se une para formar el llamado complejo cerrado. Más proximal al sitio de inicio de la transcripción (alrededor de 10 nucleótidos torrente arriba) hay una secuencia rica en A + T de seis pares de nucleótidos (consenso: 5′-TATAAT-3′). Juntos, estos elementos de secuencia conservados comprenden el promotor, y se muestran de modo esquemático en la figura 36-5. Esta última secuencia tiene una temperatura de fusión baja debido a su carencia de pares de nucleótido GC. De esta manera, se cree que la denominada secuencia (o “caja”) TATA facilita la disociación de las dos cadenas de DNA de modo que la RNA polimerasa unida a la región promotora puede tener acceso a la secuencia de nucleótidos de su cadena plantilla inmediatamente torrente abajo. Una vez que sucede este proceso, la combinación de RNA polimerasa más promotor se llama el complejo abierto. Otras bacterias tienen secuencias de consenso un poco diferentes en sus promotores, pero en general todas tienen dos componentes para el promotor; éstos tienden a estar en la misma posición respecto al TSS y en todos los casos las secuencias entre los dos elementos promotores no tienen similitud pero todavía proporcionan funciones de espaciamiento cruciales que facilitan el reconocimiento de secuencias –35 y – 10 por la holoenzima RNA polimerasa. Dentro de una célula bacteriana, diferentes grupos de genes suelen estar regulados de manera coordinada. Un modo importante en que se logra esto es por medio del hecho de que estos genes corregulados comparten secuencias promotoras −35 y −10 particulares. Estos promotores singulares son reconocidos por diferentes factores σ unidos a RNA polimerasa central (esto es, Eσ₁, Eσ₂,…).

Las señales de terminación de transcripción dependientes de rho en E. coli también parecen tener una secuencia de consenso separada (figura 36-6). Puede observarse que la secuencia de consenso conservada, que cuenta con unos 40 pares de nucleótidos de longitud, contiene una repetición invertida dividida en secciones o interrumpida, seguida por una serie de pares de bases AT. A medida que la transcripción procede por dicha repetición, la transcripción que se genera puede formar la estructura de la horquilla intramolecular que también se describe en la figura 36-6. La transcripción continúa hacia la región AT, y con la ayuda de la proteína de terminación ρ la RNA polimerasa se detiene, se disocia de la plantilla de DNA, y libera el transcrito naciente.

Tal como se considera con detalle en el capítulo 38, la transcripción de gen bacteriana está controlada por medio de la acción de proteínas represoras y activadoras. Estas proteínas típicamente se unen a secuencias de DNA singulares y específicas que se encuentran adyacentes a promotores. Estos represores y activadores afectan la capacidad de la RNA polimerasa para unirse al promotor en el DNA, o formar complejos abiertos, o ambos. El efecto neto es estimular la formación de PIC y el inicio de la transcripción, o inhibirlos (lo cual bloquea o aumenta en consecuencia la síntesis de RNA específico).

Los promotores eucarióticos son más complejos

Está claro que las señales en el DNA que controlan la transcripción en células eucarióticas son de varios tipos. Dos tipos de elementos de secuencia son proximales al promotor. Uno de éstos define dónde va a comenzar la transcripción a lo largo del DNA, y el otro contribuye a los mecanismos que controlan la frecuencia con la cual va a ocurrir este evento. Por ejemplo, en el gen que codifica para la timidina cinasa del virus del herpes simple, que utiliza factores de transcripción de su huésped mamífero para su programa de expresión de gen temprano, hay un solo sitio de TSS y la transcripción de inicio adecuada a partir de este sitio depende de una secuencia de nucleótido localizada de unos 25 nucleótidos torrente arriba desde el sitio de inicio (es decir, en −25) (figura 36-7). Esta región tiene la secuencia de TATAAAAG y tiene notoria similitud con la secuencia TATA vinculada desde el punto de vista funcional que está localizada alrededor de 10 bp torrente arriba desde el TSS de mRNA procariótico (figura 36-5). La mutación o desactivación de la secuencia TATA reduce de manera notoria la transcripción de éste y de muchos otros genes que contienen este elemento cis-activo de consenso (figuras 36-7 y 36-8). La secuencia TATA generalmente está localizada 25 a 30 bp torrente arriba desde el sitio de inicio de la transcripción en genes de mamífero que la contienen. La secuencia de consenso para una secuencia TATA es TATAAA, aunque se han caracterizado muchas variaciones. La secuencia TATA humana es unida por la proteína de unión a TATA (TBP) de 34 kDa, una subunidad en por lo menos dos complejos de múltiples subunidades, TFIID y SAGA/P-CAF. Las subunidades no TBP de TFIID son proteínas denominadas factores relacionados con TBP (TAF). Este complejo de TBP y TAF se llama TFIID. Se cree que la unión del complejo TFIID de TBP-TAF a la secuencia de caja TATA representa un primer paso en la formación del complejo de transcripción sobre el promotor.

Un considerable número de genes eucarióticos que codifican para mRNA carecen de una secuencia consenso TATA. En esas circunstancias, elementos cis adicionales, una secuencia iniciadora (Inr), o el denominado elemento promotor torrente abajo (DPE), o todos o una combinación de los anteriores, dirigen la maquinaria de transcripción de la RNA polimerasa II hacia el promotor, y al hacerlo proporcionan transcripción basal que empieza desde el sitio correcto. El elemento Inr abarca el sitio de inicio (desde −3 hasta + 5) y consta de la secuencia consenso general TCA₊₁ G/T T T/C (A₊₁ indica el primer nucleótido transcrito, es decir, TSS). Las proteínas que se unen a Inr para dirigir la unión de pol II incluyen el TFIID. Los promotores que tienen tanto una secuencia TATA como una Inr pueden ser más fuertes o transcribirse de modo más vigoroso que los que únicamente tienen uno de estos elementos. El DPE tiene la secuencia consenso A/GGA/T CGTG, y está localizado aproximadamente 25 bp torrente abajo del +1 TSS. Al igual que la Inr, las secuencias de DPE también son unidas por las subunidades TAF de TFIID. En un estudio de miles de genes eucarióticos codificadores para proteína, a grandes rasgos 30% contuvo una secuencia TATA e Inr, 25% contuvo Inr y DPE, 15% contuvo los tres elementos, mientras que ∽ 30% sólo contuvo la Inr.

Las secuencias por lo general justo torrente arriba del sitio de inicio determinan la frecuencia con la cual sucede un evento de transcripción. Las mutaciones en estas regiones aminoran 10 a 20 veces la frecuencia de inicios transcripcionales. Las secuencias GC y CAAT, así llamadas debido a las secuencias de DNA comprendidas, son típicas de estos elementos de DNA. Cada una de estas secuencias se une a una proteína específica, Sp1 en el caso de la secuencia GC, y CTF por la secuencia CAAT; ambas se unen mediante sus dominios de unión a DNA (DBD) separados (figura 36-7). La frecuencia de inicio de transcripción es una consecuencia de estas interacciones entre proteína y DNA, y de interacciones complejas entre dominios particulares de los factores de transcripción (distintos de los dominios DBD, denominados los dominios de activación; AD) de estas proteínas y el resto de la maquinaria de transcripción (RNA polimerasa II, los factores basales o generales, GTF, TFIIA, B, D, E, F, H y otros factores correguladores como Mediador, remodeladores de cromatina y factores modificadores de cromatina). (Véase más adelante y las figuras 36-9 y 36-10.) La interacción entre proteína y DNA en la secuencia TATA que incluye RNA polimerasa II y otros componentes de la maquinaria de transcripción basal asegura la fidelidad del inicio.

Juntos, los elementos torrente arriba del promotor y cis-activo proximal al promotor confieren fidelidad y frecuencia de inicio en un gen, respectivamente. La secuencia TATA tiene un requerimiento en especial rígido tanto de posición como de orientación. Como en el caso de los promotores bacterianos, los cambios de una sola base en cualquiera de estos elementos cis pueden tener efectos notorios sobre la función al reducir la afinidad de unión de los factores trans alterados (TFIID/TBP o Sp1, CTF y factores similares). También es crucial el espaciado de la secuencia TATA, Inr y elementos promotores DPE.

Una tercera clase de elementos de secuencia puede aumentar o disminuir el índice de inicio de transcripción de genes eucarióticos. Estos elementos se llaman aumentadores o represores (o silenciadores), dependiendo de cómo afectan la síntesis de RNA. Se han encontrado en diversas ubicaciones tanto torrente arriba como torrente abajo del sitio de inicio de la transcripción, e incluso dentro de las porciones codificadoras de proteína transcritas de algunos genes. Los aumentadores y silenciadores pueden ejercer sus efectos cuando están ubicados a miles o incluso decenas de miles de bases de unidades de transcripción localizadas en el mismo cromosoma. Sorprende que los aumentadores y silenciadores pueden funcionar de una manera independiente de la orientación. Se han descrito literalmente cientos de estos elementos. En algunos casos, los requisitos de secuencia para unión están rígidamente restringidos; en otros, se permite considerable variación de secuencia. Algunas secuencias únicamente se unen a una proteína única, pero casi todas se unen a varias proteínas diferentes. Juntos, estos transfactores que se unen a elementos promotores cis distales proximales regulan la transcripción en respuesta a una vasta gama de señales biológicas. Esos eventos reguladores de la transcripción contribuyen de modo importante al control de la expresión de gen.

Señales específicas regulan la terminación de la transcripción

Las señales para la terminación de la transcripción por RNA polimerasa II eucariótica sólo se entienden poco. Parece ser que las señales de terminación existen torrente muy abajo de la secuencia de codificación de genes eucarióticos. Por ejemplo, la señal de terminación de transcripción para la globina β de ratón ocurre en varias posiciones 1 000 a 2 000 bases más allá del sitio en el cual finalmente se añadirá la cola poli(A) de mRNA. Se sabe menos en cuanto al proceso de terminación o si participan factores de terminación específicos similares al factor ρ bacteriano. Con todo, se conoce que la formación del 3′ terminal del mRNA, que se genera después de la transcripción, está acoplada de alguna manera a eventos o estructuras formados en el momento y el sitio de inicio. Además, la formación de mRNA, y en este caso la formación del extremo 3′ depende de una estructura especial presente en el extremo C terminal de la subunidad mayor de RNA polimerasa II, el dominio C terminal o CTD (véase más adelante), y este proceso parece comprender al menos dos pasos, como sigue. Luego de que una RNA polimerasa II ha atravesado la región de la unidad de transcripción que codifica para el extremo 3′ de la transcripción, las RNA endonucleasas dividen la transcripción primaria en una posición alrededor de 15 bases 3′ de la secuencia de consenso AAUAAA que en transcripciones eucarióticas sirve como una señal de división y poliadenilación. Finalmente, esta terminal 3′ recién formada se poliadenila en el nucleoplasma, como se describe más adelante.

Un aparato complejo que consta de hasta 50 proteínas únicas proporciona transcripción precisa y regulable de genes eucarióticos. Las enzimas RNA polimerasa (pol I, pol II y pol III) transcriben información contenida en la cadena plantilla de DNA hacia RNA. Estas polimerasas deben reconocer un sitio específico en el promotor para iniciar la transcripción en el nucleótido apropiado. Aun así, en contraste con la situación en procariontes, las RNA polimerasas eucariontes in vitro solas son incapaces de distinguir entre secuencias promotoras y otras regiones no promotoras del DNA en la prueba in vitro. Todas las formas de RNA polimerasa eucarionte requieren otras proteínas, conocidas como factores de transcripción generales o GTF. La RNA polimerasa II requiere TFIIA, B, D (o TBP), E, F y H tanto para facilitar la unión de la enzima específica para el promotor, como para la formación del PIC. Las RNA polimerasas I y III requieren sus propios GTF específicos para polimerasa. Más aún, la RNA polimerasa II y los GTF no muestran respuesta a proteínas activadoras, y sólo pueden catalizar la transcripción basal o (no)-desregulada in vitro. Otro grupo de proteínas (los coactivadores o correguladores) funcionan conjuntamente con proteínas transactivadoras de unión a DNA, o se comunican con Pol II/GTF para regular la tasa de transcripción (véase más adelante).

Formación del complejo de transcripción pol II

En bacterias, un complejo de factor σ-holoenzima polimerasa, Eσ, se une de manera selectiva al promotor en el DNA para formar el PIC. La situación es mucho más compleja en genes eucarióticos. Los genes codificadores de mRNA, que son transcritos por pol II, se describen como un ejemplo. En el caso de genes transcritos por pol II, la función de los factores σ es asumida por diversas proteínas. La formación del PIC necesita, además de pol II, varios de los denominados factores de transcripción general (GTF) llamados TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF y TFIIH. Estos GTF sirven para promover la transcripción de RNA polimerasa II esencialmente en todos los genes. Algunos de estos GTF están compuestos de múltiples subunidades. El TFIID, que se une al elemento promotor secuencia TATA mediante su subunidad TBP, es el único de estos factores que independientemente es capaz de unión específica, de alta afinidad al promotor en el DNA. El TFIID consta de 15 subunidades, TBP y 14 factores asociados con TBP (TAF).

El TBP se une a la secuencia TATA en el surco menor del DNA (casi todos los factores de transcripción se unen en el surco mayor) y origina una flexión o acodamiento de aproximadamente 100 grados de la hélice de DNA. Se cree que esta flexión facilita la interacción de TAF con otros componentes del complejo de inicio de transcripción, el promotor eucariótico de múltiples componentes, y posiblemente con factores unidos a elementos torrente arriba. Aunque al principio definido como un componente sólo requerido para transcripción de promotores de gen pol II, el TBP, en virtud de su asociación con distintos grupos de TAF específicos para polimerasa, separados, también es un componente importante de los complejos de inicio de transcripción pol I y pol III, incluso si no contienen secuencias TATA.

La unión de TFIID marca un promotor específico para la transcripción. De varios pasos in vitro subsiguientes, el primero es la unión de TFIIA, y después de TFIIB, al complejo de TFIID-promotor. Esto da por resultado un complejo ternario estable que luego se ubica con mayor exactitud y más estrechamente unido en el sitio de inicio de la transcripción; este complejo a continuación atrae y une el complejo de pol II-TFIIF al promotor. La adición de TFIIE y la de TFIIH son los pasos finales en el montaje del PIC. El TFIIE parece unirse al complejo con pol II–TFIIF, y a continuación se recluta TFIIH. Cada uno de estos eventos de unión extiende el tamaño del complejo, de modo que finalmente quedan cubiertas alrededor de 60 bp (desde −30 hasta +30 respecto a +1 TSS) (figura 36-9). El PIC ahora está completo y tiene capacidad de transcripción basal iniciada a partir del nucleótido correcto. En genes que carecen de una secuencia TATA, se requieren los mismos factores. En esos casos, la Inr o el DPE sirve para (figura 36-8) colocar al complejo en la posición adecuada para inicio preciso de la transcripción.

La accesibilidad del promotor y, por ende, la formación del PIC a menudo están moduladas por nucleosomas

En ciertos genes eucarióticos la maquinaria de transcripción (pol II, etc.) no puede tener acceso a las secuencias promotoras (es decir, TATA-INR-DPE) porque estos elementos promotores esenciales están envueltos en nucleosomas (figuras 35-2, 35-3 y 36-10). Los nucleosomas represores sólo se eliminan después de que los factores de transcripción se unen al DNA potenciador torrente arriba del promotor, y reclutan factores remodeladores de cromatina y correguladores modificadores, como los factores Swi/Snf, SRC-1, p300/CBP (capítulo 42) P/CAF u otros factores (figura 36-10). Una vez que el promotor está “abierto” luego de la disociación del nucleosoma, GTF y RNA polimerasa II pueden unirse e iniciar la transcripción del gen de mRNA. Note que la unión de transactivadores y correguladores puede ser sensible a, o controlar de manera directa, o ambas, el estado de modificación covalente de las histonas dentro de los nucleosomas en y alrededor del promotor y potenciador y, así, aumentar o disminuir la capacidad de todos los otros componentes requeridos para la formación de PIC para interactuar con un gen particular. Este denominado código epigenético de modificaciones de histonas y proteína puede contribuir de modo importante al control de la transcripción del gen. En realidad, las mutaciones en proteínas que catalizan (escritoras de código), eliminan (borradoras de código) o que se unen de manera diferencial (lectoras de código) a histonas modificadas pueden llevar a enfermedad en humanos.

La fosforilación activa a la pol II

La pol II eucariótica consta de 12 subunidades. Como ya se mencionó, las dos subunidades de mayor tamaño (MW 220 y 150 kDa) son homólogas a las subunidades β y β′ bacterianas. Además del número incrementado de subunidades, la pol II eucariótica difiere de su homóloga procariótica por cuanto tiene una serie de siete repeticiones con secuencia de consenso Tir-Ser-Pro-Tre-Ser-Pro-Ser en el carboxilo terminal de la subunidad pol II de mayor tamaño. Este dominio de repetición carboxilo terminal (CTD) tiene 26 unidades repetidas en la levadura de cerveza y 52 unidades en células de mamífero. El CTD es un sustrato para varias enzimas (cinasas, fosfatasas, prolil isomerasas, glucosilasas); la fosforilación del CTD fue la primera modificación postraduccional (PTM) de CTD descubierta. La subunidad cinasa de TFIIH entre otras proteínas puede modificar el CTD. El CTD modificado de manera covalente es el sitio de unión para una amplia gama de proteínas, y se ha mostrado que interactúa con muchas enzimas modificadoras de mRNA y procesadoras del mismo, y proteínas de transporte nuclear. De este modo, la asociación de estos factores con el CTD de la RNA polimerasa II (y otros componentes de la maquinaria basal) sirve para acoplar el inicio de la transcripción con el empalme de mRNA, la formación del extremo 3′, y el transporte hacia el citoplasma (véase más adelante). La pol II se activa cuando se fosforila en los residuos Ser y Tre, y despliega menor actividad cuando el CTD se desfosforila. La fosforilación/desfosforilación de CTD es crucial para la eliminación del promotor, el alargamiento, la terminación, e incluso el procesamiento apropiado del mRNA. La pol II que carecen de la cola CTD es incapaz de activar la transcripción, y las células que expresan pol II que carece de CTD son inviables. Esos resultados subrayan la importancia de este dominio para la biogénesis de mRNA.

La pol II puede asociarse con otras proteínas llamadas proteínas Mediadoras o Med para formar un complejo que a veces se denomina holoenzima pol II; este complejo puede formarse en el promotor o antes de la formación del PIC (véase más adelante). Las proteínas Med son esenciales para la regulación apropiada de la transcripción de pol II al desempeñar muchísimas funciones, que tanto activan como reprimen la transcripción. De esta manera, el Mediador, al igual que TFIID, es un corregulador transcripcional (figura 36-11).

La función de activadores y correguladores de la transcripción

Originalmente se consideró que el TFIID era una proteína única, la TBP. Aun así, algunas evidencias llevaron al importante descubrimiento de que el TFIID de hecho es un complejo que consta de TBP y las 14 TAF. La primera evidencia de que el TFIID era más complejo que las moléculas de la TBP provino de la observación de que la TBP se une a un segmento de DNA de 10 bp, inmediatamente sobre la secuencia TATA del gen, mientras que el holo-TFIID natural cubre una región de 35 bp o de mayor tamaño (figura 36-9). En segundo lugar, la TBP tiene una masa molecular de 20 a 40 kDa (dependiendo de la especie), mientras que el complejo nativo de TFIID tiene una masa de aproximadamente 1 000 kDa. Finalmente, y quizá lo que tiene mayor importancia, la TBP apoya la transcripción basal, no así la transcripción aumentada proporcionada por ciertos activadores, por ejemplo. Sp1 unido a la secuencia GC. Por otra parte, el TFIID apoya la transcripción tanto basal como aumentada por Sp1, Oct1, AP1, CTF, ATF, etcétera (cuadro 36-3). Los TAF son esenciales para esta transcripción aumentada por activador. Probablemente hay varias formas de TFIID que difieren un poco en su complemento de TAF. Así, diferentes combinaciones de TAF con TBP (o uno de varios factores parecidos a TBP recién descubiertos (TLF)) se unen a diferentes promotores, e informes recientes sugieren que esto puede explicar la activación selectiva de genes para diversos promotores en células tejidos, y las diferentes potencias de ciertos promotores. Los TAF, puesto que se necesitan para la acción de los activadores, suelen llamarse coactivadores o correguladores. De este modo, hay tres clases de factores de transcripción involucrados en la regulación de los genes pol II: pol II y GTF, correguladores, y activadores-represores de unión a DNA (cuadro 36-4). La manera en que estas clases de proteínas interactúan para regir tanto el sitio como la frecuencia de transcripción es una interrogante de importancia fundamental e investigación activa. Se cree que los correguladores actúan como un puente entre los transactivadores de unión a DNA y pol II/GTF, y que modifican la cromatina.

Dos modelos pueden explicar el montaje del complejo de preinicio

La formación del PIC antes descrito se basa en la adición secuencial de componentes purificados según se observa por medio de experimentos in vitro. Una característica esencial de este modelo es que el montaje de PIC tiene lugar sobre una plantilla de DNA donde todas las proteínas de transcripción tienen fácil acceso al DNA. Por consiguiente, se cree que los activadores de la transcripción, que tienen dominios de unión y de activación de DNA autónomos (capítulo 38), funcionan al estimular la formación de PIC. Aquí el TAF o los complejos mediadores se consideran factores que forman puentes que comunican entre los activadores unidos torrente arriba, y los GTF y pol II. Esta opinión asume que hay montaje por pasos del PIC, promovido por diversas interacciones entre activadores, coactivadores y componentes del PIC (figura 36-11, panel A). Este modelo recibió apoyo por observaciones de que muchas de estas proteínas en realidad pueden unirse entre sí in vitro.

Evidencia reciente sugiere que hay otro posible mecanismo de formación de PIC y, de este modo, de la regulación de la transcripción. En primer lugar, se encuentran complejos premontados grandes de GTF y pol II en extractos celulares, y estos complejos pueden relacionarse con el promotor en un paso único; en segundo lugar, el índice de transcripción que se logra cuando se añaden activadores a concentraciones limitantes de holoenzima pol II puede igualarse al incrementar la concentración de esta última en ausencia de activadores. Así, por lo menos in vitro, pueden establecerse condiciones en las cuales los activadores no son por sí mismos absolutamente esenciales para la formación de PIC; tales observaciones condujeron a la hipótesis del “reclutamiento”, que ahora se ha probado de manera experimental. Expresado en términos simples, la función de activadores y de algunos coactivadores tal vez solamente sea reclutar un complejo de holoenzima-GTF preformado hacia el promotor. El requerimiento de un dominio de activación se evita cuando un componente del TFIID o la holoenzima pol II se fija de manera artificial, usando técnicas de DNA recombinante, al dominio de unión a DNA (DBD) de un activador. Esta fijación, mediante el componente DBD de la molécula activadora, da pie a una estructura competente en el aspecto transcripcional, y no hay requerimiento adicional del dominio de activación del activador. En esta perspectiva, la función de los dominios de activación es dirigir complejos de holoenzima-GTF preformados hacia el promotor; no ayudan en el montaje del PIC (figura 36-11, panel B). En este modelo, la eficiencia del proceso de reclutamiento determina de modo directo el índice de transcripción en un promotor dado.

En organismos procarióticos, los transcritos primarios de genes que codifican para mRNA empiezan a servir como plantillas de traducción incluso antes de que se haya completado su transcripción. Esto puede suceder porque el sitio de transcripción no está compartamentalizado hacia un núcleo como lo está en organismos eucarióticos. De esta manera, la transcripción y traducción están acopladas en células procarióticas; por tanto, los mRNA procarióticos están sujetos a poco procesamiento antes de llevar a cabo su función prevista en la síntesis de proteína. De hecho, la regulación apropiada de algunos genes (p. ej., el operón Trp) depende de este acoplamiento de la transcripción y la traducción. Las moléculas de rRNA y tRNA procarióticas se transcriben en unidades de tamaño considerablemente mayor que la molécula final. En realidad, muchas de las unidades de transcripción de tRNA codifican para más de una molécula de tRNA. De este modo, en procariotas el procesamiento de estas moléculas precursoras de rRNA y tRNA se requiere para la generación de las moléculas funcionales maduras.

Casi todos los transcritos primarios de RNA eucariótico pasan por procesamiento extenso entre el momento en que se sintetizan y el momento en el cual desempeñan su función final, sea como mRNA, miRNA, o como un componente de la maquinaria de traducción, como rRNA, o tRNA. El procesamiento ocurre principalmente dentro del núcleo. Los procesos de transcripción, procesamiento de RNA, e incluso transporte de RNA desde el núcleo están muy coordinados. De hecho, se cree que un coactivador transcripcional denominado SAGA en levaduras y P/CAF en células de ser humano, enlaza la activación de la transcripción al procesamiento del RNA al reclutar un segundo complejo llamado TREX para alargamiento, empalme y exportación nuclear de la transcripción. El TREX (exportación de transcripción) representa un probable enlace molecular entre complejos de alargamiento de transcripción, la maquinaria de empalme del RNA, y exportación nuclear (figura 36-12). Este acoplamiento probablemente aumenta de manera notoria tanto la fidelidad como el índice de procesamiento y movimiento del mRNA hacia el citoplasma para la traducción.

Las porciones codificadoras (exones) de casi todos los genes eucariontes están interrumpidas por intrones

Las secuencias de RNA que aparecen en RNA maduros se denominan exones. En genes que codifican para mRNA, los exones a menudo están interrumpidos por secuencias largas de DNA que no aparecen en mRNA maduro ni contribuyen a la información genética finalmente traducida hacia la secuencia de aminoácidos de una molécula de proteína (capítulo 35). De hecho, estas secuencias a menudo interrumpen la región codificadora de genes estructurales. Estas secuencias interpuestas, o intrones, existen dentro de casi todos los genes que codifican para mRNA de eucariontes superiores, pero no en todos. En genes que codifican para mRNA de ser humano, los exones promedian ∽ 150 nt, mientras que los intrones son mucho más heterogéneos; varían desde 10 a 100 nt hasta 30 000 nucleótidos de largo. Las secuencias de RNA intrón se eliminan de la transcripción, y los exones de la transcripción se empalman de modo apropiado entre sí en el núcleo antes de que la molécula de mRNA resultante aparezca en el citoplasma para la traducción (figuras 36-13 y 36-14).

Los intrones se eliminan y los exones se empalman entre sí

Se han descrito diferentes mecanismos de reacción de empalme para eliminación de intrón. A continuación se describe el que se usa con mayor frecuencia en células eucarióticas. Aun cuando las secuencias de nucleótidos en los intrones de las diversas transcripciones eucarióticas (e incluso las que están dentro de una transcripción única) son bastante heterogéneas, hay secuencias razonablemente conservadas en cada una de las dos uniones de exón-intrón (empalme) y en el sitio de ramificación, que está localizado 20 a 40 nucleótidos torrente arriba desde el sitio de empalme 3′ (véase secuencias de consenso en la figura 36-14). Un complejo de múltiples componentes especial, el empalmosoma, participa en la conversión del transcrito primario hacia mRNA. Los empalmosomas constan del transcrito primario, cinco snRNA (U1, U2, U4, U5 y U6) y más de 60 proteínas, muchas de las cuales contienen proteínas motivo RRM (reconocimiento de RNA) y SR (serina-arganina). En conjunto, las cinco proteínas que contienen SnRNA y RRM/SR forman una pequeña ribonucleoproteína nuclear denominada complejo snRNA. Es probable que este empalmosoma penta-snRNP se forme antes de la interacción con precursores de mRNA. Se cree que los snRNP colocan los segmentos de exón e intrón de RNA para las reacciones de empalme necesarias. La reacción de empalme empieza con un corte en la unión del exón 5′ (donador o izquierdo) y el intrón (figura 36-13). Esto se logra por medio de ataque nucleofílico por un residuo adenililo en la secuencia de punto de ramificación localizada justo torrente arriba desde el extremo 3′ de este intrón. La terminal 5′ libre forma entonces una estructura en asa o lazo que es unida por un enlace fosfodiéster 5′ – 2′ poco común a la A reactiva en la secuencia de sitio de ramificación PyNPyPyPuAPy (figura 36-14). Este residuo adenililo típicamente está localizado 20 a 30 nucleótidos torrente arriba desde el extremo 3′ desde el intrón que se está eliminando. El sitio de ramificación identifica el sitio de empalme 3′. Se hace un segundo corte en la unión del intrón con el exón 3′ (donador a la derecha). En esta segunda reacción de transesterificación, el hidroxilo 3′ del exón torrente arriba ataca al fosfato 5′ en el límite entre exón e intrón torrente abajo, y la estructura en lazo que contiene el intrón se libera y se hidroliza. Los exones 5′ y 3′ se ligan para formar una secuencia continua.

Los snRNA y las proteínas asociadas se necesitan para la formación de las diversas estructuras e intermediarios. U1 dentro del complejo snRNP se une primero mediante formación de par de bases al límite entre exón e intrón 5′. A continuación, U2 dentro del complejo snRNP se une por medio de formación de par de bases al sitio de ramificación, y esto expone el residuo A nucleofílico. U4/U5/U6 dentro del complejo snRNP media un desenrollamiento mediado por proteína, dependiente de ATP, que suscita alteración del complejo U42U6 formado con par de base, con la liberación de U4. A continuación U6 puede interactuar primero con U2, y después con U1. Estas interacciones sirven para aproximar el sitio de empalme 5′, el punto de ramificación con su A reactiva, y el sitio de empalme 3′. U5 incrementa esta alineación; este proceso también produce la formación de la estructura en asa o lazo. Los dos extremos se dividen, probablemente por medio del U22U6 dentro del complejo snRNP. U6 sin duda es esencial, dado que las levaduras con deficiencia de este snRNA no son viables. Tiene importancia notar que el RNA sirve como agente catalítico. Esta secuencia de eventos a continuación se repite en genes que contienen múltiples intrones. En esos casos, se sigue un modelo definido para cada gen, aunque los intrones no necesariamente se eliminan en secuencia, 1, después 2, después 3, etc.

El empalme alternativo proporciona mRNA diferentes

El procesamiento de moléculas de mRNA es un sitio para la regulación de la expresión de gen. Patrones alternativos de empalme de mRNA se producen por mecanismos de control adaptativos y vinculados con el desarrollo específicos para cada tejido. Despierta interés que estudios recientes sugieren que el empalme alternativo está controlado, al menos en parte, por marcas epigenéticas en la cromatina (cuadro 35-1). Esta forma de acoplamiento de la transcripción y el procesamiento del mRNA puede ser cinética y/o estar mediada por interacciones entre PTM de histonas específicas y factores de empalme alternativos que pueden cargarse hacia transcritos de gen que codifica para mRNA nacientes durante el proceso de transcripción (figura 36-12).

Como se mencionó, la secuencia de eventos de empalme de exón-intrón por lo general sigue un orden jerárquico para un gen dado. El hecho de que durante el empalme se forman estructuras de RNA muy complejas (y de que varios snRNA y proteínas están involucrados) proporciona muchas posibilidades para un cambio de este orden y para la generación de diferentes mRNA. De manera similar, el uso de sitios de poliadenilación de división de terminación alternativos también ocasiona variabilidad del mRNA. En la figura 36-15 se muestran algunos ejemplos esquemáticos de estos procesos, todos los cuales suceden en la Naturaleza.

El empalme fallido puede traducirse en enfermedad. Al menos una forma de β-talasemia, una enfermedad en la cual el gen que codifica para la globina β de la hemoglobina está gravemente expresado de modo insuficiente, parece ser el resultado de un cambio de nucleótido en una unión de exón e intrón, lo que impide la eliminación del intrón y, en consecuencia, lleva a síntesis reducida de la proteína de la cadena β, o a falta de la misma. Ésta es una consecuencia del hecho de que el marco de lectura de traducción normal del mRNA, se altera por un defecto del proceso fundamental de empalme del RNA, lo que subraya la exactitud que debe mantener el proceso de empalme RNA-RNA.

La utilización de promotor alternativo proporciona una forma de regulación

El empalme alternativo puede proporcionar regulación específica para tejido de la expresión de gen, como se mencionó, por medio de elementos de control en el promotor o mediante el uso de promotores alternativos. El gen que codifica para la glucocinasa (GK) consta de 10 exones interrumpidos por nueve intrones. La secuencia de exones 2 a 10 es idéntica en células del hígado, y β pancreáticas, los tejidos primarios en los cuales se expresa la proteína GK. La expresión del gen GK está regulada de manera muy diferente (por dos promotores distintos) en estos dos tejidos. El promotor hepático y el exón 1L están localizados cerca de los exones 2 a 10; el exón 1L está ligado de modo directo al exón 2. En contraste, el promotor de células β pancreáticas está localizado unos 30 kbp torrente arriba. En este caso, el límite 3′ del exón 1B está ligado al límite 5′ del exón 2. El promotor hepático y el exón 1L se excluyen y eliminan durante la reacción de empalme (figura 36-16). La existencia de múltiples promotores distintos permite que haya modelos de expresión específicos para célula y para tejido de un gen particular (mRNA). En el caso de la GK, la insulina y el cAMP (capítulo 42) controlan la transcripción de GK en el hígado, mientras que la glucosa controla la expresión de GK en células β.

Tanto los RNA ribosómicos como casi todos los RNA de transferencia se procesan a partir de precursores de mayor tamaño

En células de mamífero, las tres moléculas de rRNA (28S, 18S, 5.8S) se transcriben como parte de una molécula precursora 45S grande única. El precursor luego se procesa en el nucléolo para proporcionar estos tres componentes del RNA para las subunidades de ribosoma que se encuentran en el citoplasma. Los genes que codifican para rRNA están localizados en los nucléolos de células de mamífero. En cada célula hay cientos de copias de estos genes. Este número grande de genes se necesita para sintetizar suficientes copias de cada tipo de rRNA, para formar los 10⁷ ribosomas requeridos para cada replicación celular. Mientras que una molécula de mRNA única puede copiarse hacia 10⁵ moléculas de proteína, lo que proporciona una amplificación grande, los rRNA son productos terminales. Esta falta de amplificación requiere tanto un número grande de genes como un índice de transcripción alto, típicamente sincronizado con el índice de crecimiento celular. De manera similar, los RNA de transferencia (tRNA) a menudo se sintetizan como precursores, con secuencias extra tanto 5′ como 3′ de las secuencias que comprende el tRNA maduro. Una pequeña fracción de tRNA contiene intrones.

En esencia todos los RNA se modifican de manera covalente después de la transcripción; está claro que por lo menos algunas de estas modificaciones son reguladoras.

El RNA mensajero (mRNA) se modifica en los extremos 5′ y 3′

Como se mencionó, las moléculas de mRNA de mamífero contienen una estructura de 7-metilguanosina que hace las veces de cubierta en su 5′ terminal (figura 34-10), y casi todos tienen una cola poli(A) en la 3′ terminal. La estructura de cubierta se añade al extremo 5′ del precursor de mRNA recién transcrito en el núcleo antes de transporte de la molécula de mRNA hacia el citoplasma. La cubierta 5′ de la transcripción del RNA se requiere tanto para el inicio eficiente de la traducción como para la protección del extremo 5′ del mRNA contra ataque por exonucleasas 5′ → 3′. Las metilaciones secundarias de moléculas de mRNA, las que están en el 2′-hidroxi y el N⁷ de residuos adenililo, ocurren luego de que la molécula de mRNA ha aparecido en el citoplasma.

Las colas poli(A) se añaden al extremo 3′ de las moléculas de mRNA en un paso de procesamiento postranscripcional. El mRNA se divide primero alrededor de 20 nucleótidos torrente abajo desde una secuencia de reconocimiento AAUAA. Otra enzima, la poli(A) polimerasa, añade una cola poli(A) que después se extiende a hasta 200 residuos A. La cola poli(A) parece proteger el extremo 3′ del mRNA contra ataque por la exonucleasa 3′ → 5′ y facilitar la traducción. La presencia o ausencia de la cola poli(A) no determina si una molécula precursora en el núcleo aparece en el citoplasma, porque ninguna molécula de mRNA nuclear con cola poli(A) contribuye al mRNA citoplásmico, ni todas las moléculas de mRNA citoplásmicas contienen colas poli(A) (los mRNA histona son más notables a este respecto). Luego de transporte nuclear, las enzimas citoplásmicas en células de mamífero pueden tanto añadir como eliminar residuos adenililo de las colas poli(A); este proceso se ha vinculado con una alteración de la estabilidad y la traducibilidad del mRNA.

El tamaño de algunas moléculas de mRNA citoplásmicas, incluso después de que se elimina la cola poli(A), aún es considerablemente mayor que el tamaño requerido para codificar para la proteína específica para la cual es un templado (plantilla), a menudo por un factor de 2 o 3. Los nucleótidos extra surgen en regiones no traducidas (no codificadoras para proteína) tanto 5′ como 3′ de la región codificadora; las secuencias no traducidas más largas generalmente están en el extremo 3′. Las secuencias 5′UTR y 3′UTR han sido implicadas en el procesamiento, el transporte, el almacenamiento, la degradación y la traducción de RNA; cada una de estas reacciones contribuye en potencia con niveles adicionales de control de la expresión del gen; algunos de estos eventos postranscripcionales que incluyen mRNA ocurren en los organelos citoplásmicos llamados cuerpos P (capítulo 37).

Los microRNA se derivan de transcritos primarios grandes por medio de procesamiento nucleolítico específico

Casi todos los miRNA son transcritos por RNA pol II hacia transcritos primarios denominados pri-miRNA. Los pri-miRNA tienen cubierta 5′ y están poliadenilados en la posición 3′ (figura 36-17). Los pri-miRNA se sintetizan a partir de unidades de transcripción que codifican para uno o varios miRNA separados; estas unidades de transcripción están situadas de manera independiente en el genoma o dentro del DNA intrónico de otros genes. Por ende, dada esta organización, los genes que codifican para miRNA deben poseer, como mínimo, un promotor separado, la región codificante y las señales de poliadenilación/terminación. Los pri-miRNA tienen extensa estructura secundaria, y esta estructura intramolecular se mantiene después de procesamiento por la nucleasa Drosha-DGCR8; la porción que contiene la horquilla de RNA es preservada, transportada a través del poro nuclear mediante la acción de la exportina 5, y una vez en el citoplasma, procesada más por el complejo dicer nucleasa-TRBP heterodimérico a un 21 o 22-mer. Finalmente, una de las dos cadenas es seleccionada para carga hacia el complejo silenciador inducido por RNA (RISC), que está compuesto de una de cuatro proteínas argonauta (Ago 1 → 4), para formar un miRNA monocatenario de 21 a 22 nt, funcional. Los siRNA se producen de manera similar. Una vez que están en el complejo RISC, los miRNA pueden modular la función del mRNA mediante uno de tres mecanismos: a) al promover directamente la degradación de mRNA; b) al estimular degradación de cola poli A mediada por el complejo CCR4/NOT, o c) inhibición de la traducción al establecer como objetivo el factor de traducción de unión a cubierta 5′-metilo, eIF4 (figuras 37-7 y 37-8), o el ribosoma directamente. Datos recientes sugieren que los genes codificantes para miRNA reguladores pueden estar enlazados a sus genes blanco y, por ende, coevolucionar con ellos.

La edición del RNA cambia el mRNA después de la transcripción

El dogma fundamental afirma que para un gen y producto de gen dados hay una relación lineal entre la secuencia codificadora en el DNA, la secuencia en el mRNA y la secuencia de la proteína (figura 35-7). Los cambios en la secuencia del DNA se deben reflejar en un cambio en la secuencia del mRNA y, dependiendo del uso de codón, en la secuencia de proteína. Como quiera que sea, a últimas fechas se han documentado excepciones de esta regla. La información codificadora puede cambiarse en el ámbito del mRNA mediante edición del RNA. En esos casos, la secuencia codificadora del mRNA difiere de la que hay en el DNA bicatenario. Un ejemplo es el gen y mRNA que codifican para la apolipoproteína B (apoB). En el hígado, el gen apoB único se transcribe hacia un mRNA que dirige la síntesis de una proteína de 100 kDa, la apoB100. En el intestino, el mismo gen dirige la síntesis de la transcripción primaria; de cualquier modo, una citidina desaminasa convierte un codón CAA en el mRNA hacia UAA en un sitio específico único. En lugar de codificar para glutamina, este codón se convierte en una señal de terminación (cuadro 37-1) y el resultado es una proteína truncada de 48 kDa (apoB48). La ApoB100 y la apoB48 tienen funciones diferentes en los dos órganos. Un número creciente de otros ejemplos comprende un cambio de glutamina a arginina en el receptor de glutamato, y varios cambios en mRNA mitocondriales de tripanosoma, que por lo general incluyen la adición o deleción de uridina. Se desconoce la extensión precisa de la edición del RNA, pero estimados actuales sugieren que < 0.01% de los mRNA se edita de esta manera. Recientemente, se ha descrito edición de miRNA, lo que sugiere que estas dos formas de mecanismos de control postranscripcionales podrían contribuir de modo cooperativo a la regulación de gen.

El RNA de transferencia se procesa y modifica de manera extensa

Las moléculas de tRNA sirven como moléculas adaptadoras para la traducción del mRNA hacia secuencias proteínicas (capítulos 34 y 37). Los tRNA contienen muchas modificaciones de las bases estándar A, U, G y C, entre ellas metilación, reducción, desaminación y enlaces glucosídicos reordenados. La modificación postranscripcional adicional de las moléculas de tRNA comprende alquilaciones de nucleótido y la fijación de la terminal CpCpA_OH característica en el extremo 3′ de la molécula por la enzima nucleotidil transferasa. El OH 3′ en la ribosa A es el punto de fijación para el aminoácido específico que va a entrar hacia la reacción de polimerización de la síntesis de proteína. La metilación de precursores de tRNA de mamífero probablemente sucede en el núcleo, mientras que la división y fijación de CpCpA_OH son funciones citoplásmicas, puesto que las terminales se recambian con mayor rapidez que las moléculas de tRNA mismas. Las enzimas dentro del citoplasma de células de mamífero se necesitan para la fijación de aminoácidos a los residuos CpCpA_OH (capítulo 37).

Además de la acción catalítica proporcionada por los snRNA en la formación de mRNA, se han atribuido varias otras funciones enzimáticas al RNA. Las ribozimas son moléculas de RNA con actividad catalítica; por lo regular incluyen reacciones de transesterificación y casi todas muestran vínculo con el metabolismo de RNA (empalme y endorribonucleasa). A últimas fechas, se notó que un componente del RNA ribosómico hidroliza un aminoacil éster y, así, desempeña un papel central en la función de enlace peptídico (peptidil transferasas; capítulo 37). Estas observaciones, hechas usando moléculas de RNA derivadas de los organelos de vegetales, levaduras, virus y otras células eucarióticas superiores, muestran que el RNA puede actuar como una enzima, y han revolucionado el pensamiento respecto a la acción enzimática y el origen de la vida misma.

• El RNA se sintetiza a partir de una plantilla de DNA por medio de la enzima RNA polimerasa.

• En tanto que las bacterias contienen sólo una poimerasa RNA (β,β′ α₂), hay tres RNA polimerasas dependientes de DNA nucleares distintas en mamíferos: RNA polimerasas I, II y III. Estas enzimas catalizan la transcripción de genes que codifican para rRNA (Pol I), mRNA/miRNA (Pol II) y tRNA y rRNA 5S (Pol III).

• Las RNA polimerasas interactúan con regiones cis-activas singulares de genes, denominadas promotores, para formar complejos de preinicio (PIC) que tienen la capacidad de inicio. En eucariotas el proceso de la formación de PIC pol II requiere, además de polimerasa, múltiples factores de transcripción generales (GTF), TFIIA, B, D, E, F y H.

• La formación de PIC eucariótico puede ocurrir sobre promotores accesibles por pasos (mediante las interacciones ordenadas secuenciales de GTF y RNA polimerasa con promotores de DNA) o en un paso por medio del reconocimiento del promotor por un complejo de GTF-holoenzima RNA polimerasa preformado.

• La transcripción muestra tres fases: inicio, alargamiento y terminación. Todas dependen de elementos cis de DNA separados, y están moduladas por factores proteínicos de acción trans separados.

• La presencia de nucleosomas puede ocluir la unión tanto de cofactores como de la maquinaria de transcripción a sus elementos cis de DNA cognados, lo que inhibe la transcripción.

• Casi todos los RNA eucarióticos se sintetizan como precursores que contienen secuencias excesivas que se eliminan antes de la generación de RNA maduro, funcional. Estas reacciones de procesamiento proporcionan pasos potenciales adicionales para la regulación de la expresión de genes.

• La síntesis de mRNA eucarióticos origina un precursor pre-mRNA que contiene mucho RNA excesivo (intrones) que se debe eliminar con precisión mediante empalme de RNA para generar mRNA traducible, funcional, compuesto de secuencias codificadoras exónicas, y 5′ y 3′ no codificadoras.

• Todos los pasos, desde cambios en la plantilla, secuencia y accesibilidad de DNA en la cromatina, hasta estabilidad y traducibilidad de RNA, están sujetos a modulación y, por consiguiente, son los sitios de control potenciales para la regulación de gen eucariótico.