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Las características estructurales generales de los ribosomas y su proceso de automontaje se comentan en el capítulo 34. Estas entidades particuladas sirven como la maquinaria en la cual la secuencia de nucleótido del mRNA se traduce hacia la secuencia de aminoácidos de la proteína especificada. La traducción del mRNA comienza cerca de su terminal 5′, con la formación del amino terminal correspondiente de la molécula de proteína. El mensaje se lee de 5′ a 3′, y concluye con la formación del carboxilo terminal de la proteína. De nuevo, el concepto de polaridad queda de manifiesto. La transcripción de un gen hacia el mRNA correspondiente o su precursor forma primero la terminal 5′ de la molécula de RNA (capítulo 36). En procariotas, esto permite el inicio de la traducción del mRNA antes de que se complete la transcripción del gen. En organismos eucarióticos, el proceso de transcripción es nuclear; en tanto la traducción del mRNA ocurra en el citoplasma, evitará la transcripción y traducción simultáneas en organismos eucarióticos y hará posible el procesamiento necesario para generar mRNA maduro a partir de la transcripción primaria.
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El inicio comprende varios complejos de proteína-RNA
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El inicio de la síntesis de proteína requiere que un ribosoma seleccione una molécula de mRNA para traducción (figura 37-6). Una vez que el mRNA se une al ribosoma, este último encuentra el codón de inicio y establece el cuadro de lectura correcto en el mRNA, y la traducción empieza. Este proceso comprende tRNA, rRNA, mRNA, y al menos 10 factores de inicio eucarióticos (eIF), algunos de los cuales tienen múltiples subunidades (3 a 8). También participan GTP, ATP y aminoácidos. El inicio puede dividirse en cuatro pasos: 1) disociación del ribosoma hacia las subunidades 40S y 60S; 2) unión de un complejo ternario que consta del iniciador met-RNA (met-tRNAi), GTP, y eIF-2 al ribosoma 40S para formar el complejo de preinicio 43S; 3) unión de mRNA al complejo de preinicio 40S para formar el complejo de inicio 48S, y 4) combinación del complejo de inicio 48S con la subunidad ribosómica 60S para formar el complejo de inicio 80S.
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Disociación ribosómica
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Dos factores de inicio, eIF-3 y eIF-1A, se unen a la subunidad ribosómica 40S recién disociada. Esto retrasa su reasociación con la unidad 60S, y permite que otros factores de inicio de la traducción se asocien con la subunidad 40S.
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Formación del complejo de preinicio 43S
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El primer paso en este proceso comprende la unión de GTP por eIF-2. Este complejo binario a continuación se une a tRNAi met, un tRNA que participa de manera específica en la unión al codón de inicio AUG. (Es importante notar que hay dos tRNA para metionina. Uno especifica metionina para el codón iniciador y el otro para metioninas internas. Cada uno tiene una secuencia de nucleótido singular; ambos son aminoacilados por la misma metionil tRNA sintetasa.) El complejo ternario GTP-eIF2-tRNAi se une a la subunidad ribosómica 40S para formar el complejo de preinicio 43S, que se estabiliza mediante asociación con eIF-3 y eIF-1A.
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El eIF-2 es uno de los dos puntos de control para el inicio de síntesis de proteína en células eucarióticas. El eIF-2 consta de subunidades α, β y γ. El eIF-2 α es fosforilado (en la serina 51) por al menos cuatro proteínas cinasa diferentes (HCR, PKR, PERK y GCN2) que se activan cuando una célula está bajo estrés, y cuando el gasto de energía requerido para la síntesis de proteína sería perjudicial. Esas condiciones incluyen carencia acentuada de aminoácido y glucosa, infección por virus, presencia intracelular de cantidades grandes de proteínas plegadas de manera errónea, privación de suero, hiperosmolalidad y choque por calor. La PKR es en particular interesante a este respecto. Esta cinasa es activada por virus, y proporciona un mecanismo de defensa del huésped que disminuye la síntesis de proteína, incluso la síntesis de proteína viral, lo que inhibe la replicación de virus. El eIF-2α fosforilado se une de manera estrecha a la proteína reciclante de GTP-GDP eIF-2b, y la inactiva, lo que evita la formación del complejo de preinicio 43S y bloquea la síntesis de proteína.
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Formación del complejo de inicio 48S
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Las terminaciones 5′ de las moléculas de mRNA en células eucariontes tienen “cubierta” (capítulo 36). La cubierta 7meG facilita la unión de mRNA al complejo de preinicio 43S. Un complejo de proteína de unión a cubierta, eIF-4F (4F), que consta de eIF-4E (4E) y el complejo eIF-4G (4G)-eIF4A (4A), se une a la cubierta por medio de la proteína 4E. A continuación, eIF-4B (4B) se une a, y reduce, la estructura secundaria compleja del extremo 5′ del mRNA por medio de su actividad helicasa dependiente de ATP. La asociación del mRNA con el complejo de preinicio 43S para formar el complejo de inicio 48S requiere hidrólisis de ATP. El eIF-3 es una proteína clave porque se une con alta afinidad al componente 4G de 4F, y enlaza este complejo a la subunidad ribosómica 40S. Después de la asociación del complejo de preinicio 43S con la cubierta de mRNA, y reducción (“fusión”) de la estructura secundaria cerca del extremo 5′ del mRNA por medio de la acción de la helicasa 4B y ATP, el complejo transloca 5′ → 3′ y escanea el mRNA para buscar un codón de inicio idóneo. Por lo general éste es el AUG más 5′, pero el codón de inicio preciso está determinado por las llamadas secuencias de consenso Kozak que rodean al codón de inicio AUG:
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Se prefiere más la presencia de una purina (Pu) en las posiciones −3 y G en la posición +4.
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Función de la cola poli(A) en el inicio
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Experimentos bioquímicos y genéticos en levaduras han revelado que la cola 3′ poli(A) y la proteína de unión poly A, PAB1, se requieren para el inicio eficiente de la síntesis de proteína. Estudios adicionales mostraron que la cola poli(A) estimula el reclutamiento de la subunidad ribosómica 40S al mRNA por medio de una serie compleja de interacciones. La PAB (figura 37-7), unida a la cola poli(A), interactúa con eIF-4G, y la subunidad 4E de eIF-4F que está unido a la cubierta para formar una estructura circular que ayuda a dirigir la subunidad ribosómica 40S al extremo 5′ del mRNA y probablemente también estabiliza a los mRNA contra degradación exonucleolítica. Esto ayuda a explicar por qué las estructuras de cubierta y cola poli(A) tienen un efecto sinérgico sobre la síntesis de proteína. De hecho, interacciones proteína-proteína diferenciales entre represores de la traducción del mRNA generales y específicos, y el eIF-4 dan por resultado control de la traducción dependiente de m7GCap (figura 37-8).
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Formación del complejo de inicio 80S
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La unión de la subunidad ribosómica 60S al complejo de inicio 48S comprende hidrólisis del GTP unido al eIF-2 por eIF-5. Esta reacción origina la liberación de los factores de inicio unidos al complejo de inicio 48S (estos factores a continuación se reciclan), y la asociación rápida de las subunidades 40S y 60S para formar el ribosoma 80S. En este punto, el met-tRNAi está sobre el sitio P del ribosoma, listo para que comience el ciclo de alargamiento.
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La regulación de eIF-4E controla el índice de inicio
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El complejo 4F es en particular importante en el control del índice de traducción de proteína. Como se describió, 4F es un complejo que consta de 4E, que se une a la estructura de cubierta m7G en el extremo 5′ del mRNA, y 4G, que sirve como una proteína de andamiaje. Además de unirse a 4E, 4G se une a eIF-3, que enlaza el complejo a la subunidad ribosómica 40S. También se une a 4A y 4B, el complejo de ATPasa-helicasa que ayuda a desenrollar el RNA (figura 37-8).
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4E se encarga del reconocimiento de la estructura de cubierta del mRNA, un paso limitante en la traducción. Este proceso se regula más por medio de fosforilación. La insulina y factores de crecimiento mitogénicos dan por resultado la fosforilación de 4E sobre Ser 209 (o Tre 210). 4E fosforilado se une a la cubierta con mucho más avidez que la forma no fosforilada, lo que aumenta el índice de inicio. Componentes de la vía de la MAP cinasa, las cinasas PI3K, mTOR, RAS y S6 (figura 42-8), parecen participar en estas reacciones de fosforilación.
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La actividad de 4E está regulada en una segunda vía, y ésta también comprende fosforilación. Una serie de proteínas recién descubiertas se unen a 4E y lo desactivan; estas proteínas comprenden 4EBP1 (BP1, también conocida como PHAS-1) y las proteínas estrechamente relacionadas 4E-BP2 y 4E-BP3. BP1 se une con alta afinidad a 4E. La asociación [4E]•[BP1] evita que 4E se una a 4G (para formar 4F). Dado que esta interacción es esencial para la unión de 4F a la subunidad ribosómica 40S, y para colocar de manera correcta esto sobre el mRNA cubierto, BP-1 inhibe con eficacia el inicio de la traducción.
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La insulina y otros factores de crecimiento dan por resultado la fosforilación de BP-1 en siete sitios únicos. La fosforilación de BP-1 da por resultado su disociación de 4E, y no puede volver a unirse sino hasta que se desfosforilan sitios cruciales. Estos efectos sobre la activación de 4E explican en parte de qué modo la insulina causa un notorio aumento postranscripcional de la síntesis de proteína en el hígado, el tejido adiposo y el músculo.
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El alargamiento también es un proceso de múltiples pasos, facilitado por factor accesorio
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El alargamiento, es un proceso cíclico en el ribosoma, en el cual un aminoácido a la vez se añade a la cadena peptídica naciente (figura 37-9). La secuencia peptídica está determinada por el orden de los codones en el mRNA. El alargamiento comprende varios pasos catalizados por proteínas llamadas factores de alargamiento (EF). Estos pasos son: 1) unión de aminoacil-tRNA al sitio A, 2) formación de enlace peptídico, 3) translocación del ribosoma sobre el mRNA, y 4) expulsión del tRNA desacilado de los sitios P- y E-.
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Unión de aminoacil-tRNA al sitio A
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En el ribosoma 80S completo que se forma durante el proceso de inicio, tanto el sitio A (sitio aminoacilo o aceptor) como el E (sitio de salida del tRNA desacilado) están libres. La unión del aminoacil-tRNA apropiado en el sitio A requiere reconocimiento de codón apropiado. El factor de alargamiento 1A (EF1A) forma un complejo ternario con GTP y el aminoacil-tRNA que está entrando (figura 37-9). A continuación, este complejo permite que el aminoacil-tRNA correcto entre al sitio A con la liberación de EF1A•GDP y fosfato. La hidrólisis de GTP es catalizada por un sitio activo en el ribosoma; la hidrólisis induce un cambio conformacional en el ribosoma, lo que aumenta de manera concomitante la afinidad por el tRNA. Como se muestra en la figura 37-9, 1 EF1A-GDP se recicla entonces hacia EF1A-GTP, con la ayuda de otros factores proteínicos solubles y GTP.
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Formación de enlace peptídico
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El grupo α-amino del nuevo aminoacil-tRNA en el sitio aún lleva a cabo un ataque nucleofílico sobre el grupo carboxilo esterificado del peptidil-tRNA que ocupa el sitio P (sitio peptidilo o polipéptido). En el momento del inicio, este sitio está ocupado por el iniciador met-tRNAi. Esta reacción es catalizada por una peptidiltransferasa, un componente del RNA 28S de la subunidad ribosómica 60S. Éste es otro ejemplo de actividad de ribozima, e indica una función directa importante (y previamente no sospechada) para el RNA en la síntesis de proteína (cuadro 37-3). Dado que el aminoácido en el aminoacil-tRNA ya está “activado”, no se requiere una fuente de energía adicional para esta reacción. La reacción da por resultado la fijación de la cadena peptídica en crecimiento al tRNA en el sitio A.
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El tRNA ahora desacilado se fija mediante su anticodón al sitio P en un extremo y mediante la cola CCA abierta a un sitio de salida (exit) (E) en la subunidad ribosómica grande (figura 37-9, en medio). En este punto, el factor de alargamiento 2 (EF2) se une al peptidil-tRNA y lo desplaza del sitio A al sitio P. A su vez, el tRNA desacilado está en el sitio E, desde el cual abandona el ribosoma. El complejo EF2-GTP se hidroliza hacia EF2-GDP, lo que mueve con eficacia el mRNA hacia delante un codón, y deja el sitio A abierto para ocupación por otro complejo ternario de tRNA aminoácido-EF1AGTP y otro sitio de alargamiento.
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La carga de la molécula de tRNA con la porción aminoacilo requiere la hidrólisis de un ATP hacia un AMP, equivalente a la hidrólisis de dos ATP hacia dos ADP y fosfatos. La entrada del aminoacil-tRNA al sitio A da por resultado la hidrólisis de un GTP hacia GDP. La translocación del peptidil-tRNA recién formado en el sitio A hacia el sitio P por EF2 origina de manera similar hidrólisis de GTP hacia GDP y fosfato. De este modo, los requerimientos de energía para la formación de un enlace peptídico incluyen el equivalente de la hidrólisis de dos moléculas de ATP hacia ADP, y de dos moléculas de GTP hacia GDP, o la hidrólisis de cuatro enlaces de fosfato de alta energía. Un ribosoma eucariótico puede incorporar hasta seis aminoácidos por segundo; los ribosomas procarióticos incorporan hasta 18 por segundo. De este modo, el proceso de síntesis de péptido que requiere energía ocurre con gran rapidez y exactitud en tanto no se llega a un codón de terminación.
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La terminación ocurre cuando se reconoce un codón de parada
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En comparación con el inicio y el alargamiento, la terminación es un proceso relativamente simple (figura 37-10). Después de que múltiples ciclos de alargamiento culminan en polimerización de aminoácidos específicos hacia una molécula de proteína, aparece en el sitio A el codón de parada o de terminación del mRNA (UUA, UAG, UGA). En circunstancias normales, no hay tRNA con un anticodón capaz de reconocer esa señal de terminación. El factor liberador RF1 reconoce que un codón de parada reside en el sitio A (figura 37-10). RF1 es unido por un complejo que consta del factor de liberación RF3 con GTP unido; este complejo, con la peptidil transferasa, promueve la hidrólisis del enlace entre el péptido y el tRNA que ocupa el sitio P. De este modo, se añade una molécula de agua en lugar de un aminoácido. Esta hidrólisis libera la proteína y el tRNA del sitio P. En el momento de la hidrólisis y liberación, el ribosoma 80S se disocia hacia sus subunidades 40S y 60S, que entonces se reciclan (figura 37-7). Por ende, los factores de liberación son proteínas que hidrolizan el enlace peptidil-tRNA cuando un codón de parada ocupa el sitio A. A continuación, el mRNA se libera del ribosoma, que se disocia hacia las subunidades 40S y 60S que lo componen, y puede repetirse otro ciclo.
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Los polisomas son montajes de ribosomas
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Muchos ribosomas pueden traducir la misma molécula de mRNA de manera simultánea. Debido a su tamaño relativamente grande, las partículas de ribosoma no se pueden fijar a un mRNA con menos de 35 nucleótidos de separación. Múltiples ribosomas en la misma molécula de mRNA forman un polirribosoma, o “polisoma” (figura 37-7). En un sistema no restringido, el número de ribosomas fijos a un mRNA (y, así, el tamaño de los polirribosomas) tiene correlación positiva con la longitud de la molécula de mRNA.
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Los polirribosomas que están sintetizando de manera activa proteínas pueden existir como partículas libres en el citoplasma celular, o estar fijos a hojas de material citoplásmico membranoso denominadas retículo endoplásmico. El aspecto “rugoso” que se observa en la microscopia electrónica depende de la fijación de los ribosomas articulados al retículo endoplásmico. Las proteínas sintetizadas por los ribosomas fijos se sacan hacia el espacio de la cisterna entre las hojas del retículo endoplásmico rugoso, y se exportan desde ahí. El aparato de Golgi aglomera algunos de los productos proteínicos del retículo endoplásmico rugoso para exportación final (capítulo 46). Las partículas polirribosómicas libres en el citosol se encargan de la síntesis de proteínas requeridas para las funciones intracelulares.
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Los mRNA que no se están traduciendo pueden formar partículas de ribonucleoproteína que se acumulan en organelos citoplásmicos llamados cuerpos P
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Los mRNA, unidos por proteínas aglomeradoras específicas, y exportados desde el núcleo como partículas de ribonucleoproteínas (RNP), a veces no se asocian de inmediato con ribosomas para ser traducidos. En lugar de eso, mRNA específicos pueden asociarse con los constituyentes proteínicos que forman los cuerpos P, pequeños compartimientos densos que incorporan mRNA como mRNP (figura 37-11); estos organelos citoplásmicos se relacionan con gránulos que contienen mRNA pequeños similares que se encuentran en neuronas y ciertas células maternas. Los cuerpos P son sitios de represión de la traducción y de descomposición del mRNA. Se ha sugerido que más de 35 proteínas distintas residen de manera exclusiva o extensa dentro de los cuerpos P. Estas proteínas varían desde enzimas que descubren el mRNA, RNA helicasas y RNA exonucleasas (5′ a 3′ y 3′ a 5′), hasta componentes involucrados en la función del miRNA y en el control de calidad del mRNA. Sin embargo, la incorporación de una mRNP no es una “sentencia de muerte” inequívoca del mRNA. De hecho, aunque todavía no se entienden por completo los mecanismos, ciertos mRNA parecen almacenarse temporalmente en los cuerpos P y después recuperarse y utilizarse para la traducción de proteína. Esto sugiere que hay un equilibrio donde las funciones citoplásmicas del mRNA (traducción y degradación) son controladas por la interacción dinámica del mRNA con polisomas y cuerpos P.
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La maquinaria de la síntesis de proteína puede mostrar respuesta a amenazas ambientales
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La ferritina, una proteína de unión a hierro, evita que el hierro ionizado (Fe2+) alcance concentraciones tóxicas dentro de las células. El hierro elemental estimula la síntesis de ferritina al causar la liberación de una proteína citoplásmica que se une a una región específica en la región 5′ no traducida del mRNA de ferritina. La alteración de esta interacción entre proteína y mRNA activa al mRNA de ferritina, y da por resultado su traducción; este mecanismo proporciona control rápido de la síntesis de una proteína que secuestra Fe2+, una molécula en potencia tóxica (figura 52-8). De modo similar, el estrés ambiental y la privación de nutrientes inhiben los papeles positivos de mTOR (figura 37-8; figura 42-8) sobre la promoción de la activación de la formación de complejo eIF4F y 48S.
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Muchos virus se apropian de la maquinaria de síntesis de proteína de la célula huésped
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La maquinaria de síntesis de proteína también puede modificarse de maneras perjudiciales. Los virus se replican usando los procesos de la célula huésped, incluso los involucrados en la síntesis de proteína. Algunos mRNA virales se traducen con mucho mayor eficiencia que los de la célula huésped (p. ej., virus de la encefalomiocarditis). Otros, como los reovirus y el virus de la estomatitis vesicular, se replican con eficiencia y así, sus abundantes mRNA tienen una ventaja competitiva sobre los mRNA de la célula huésped para factores de traducción limitados. Otros virus inhiben la síntesis de proteína por la célula huésped al evitar la asociación de mRNA con el ribosoma 40S.
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El poliovirus y otros picornavirus adquieren una ventaja selectiva al alterar la función del complejo 4F. Los mRNA de estos virus carecen de una estructura de cubierta para dirigir la unión de la subunidad ribosómica 40S (véase antes). En lugar de eso, dicha subunidad entra en contacto con un sitio de entrada ribosómico interno (IRES) en una reacción que requiere 4G pero no 4E. El virus adquiere una ventaja selectiva al tener una proteasa que ataca a G4 y elimina el sitio de unión a 4E amino terminal. Ahora, es imposible que se forme el complejo 4E-4G (4F), de modo que la subunidad ribosómica 40S no puede dirigirse hacia huéspedes mRNA cubiertos, con lo que se suprime la síntesis de la célula huésped. El fragmento 4G puede dirigir la unión de la subunidad ribosómica 40S a mRNA que contienen IRES, de modo que la traducción del mRNA viral es muy eficiente (figura 37-12). Estos virus también promueven la desfosforilación de BP1 (PHAS-1), lo que disminuye la traducción dependiente de cubierta (4E) (figura 37-8).
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