CAPÍTULO 38: Regulación de la expresión de gen

Los organismos alteran la expresión de genes en respuesta indicios o programas vinculados con el desarrollo genéticos, exposiciones ambientales, o enfermedad, al modular la cantidad de expresión de gen, y/o los patrones espaciales o temporales de la misma. Los mecanismos que controlan dicha expresión se han estudiado con detalle y a menudo comprenden modulación de la transcripción de gen. El control de la transcripción finalmente depende de cambios del modo de interacción de moléculas reguladoras específicas, por lo general proteínas, con diversas regiones de DNA en el gen controlado; esas interacciones pueden tener un efecto positivo o negativo sobre la transcripción. El control de la transcripción puede dar lugar a expresión de gen específica para tejido, y la regulación de gen está influida por hormonas, metales pesados y sustancias químicas. Además de controles en el ámbito de transcripción, la expresión de gen también puede ser modulada mediante ampliación de gen, reordenamiento de gen, modificaciones postranscripcionales, estabilización de RNA, control traduccional, modificación de proteína y estabilización de proteína. Muchos de los mecanismos que controlan la expresión génica se usan para responder a indicios vinculados con el desarrollo, factores de crecimiento, hormonas, agentes ambientales y fármacos terapéuticos. La disregulación de la expresión génica puede llevar a enfermedad en seres humanos. De este modo, un entendimiento molecular de estos procesos llevará a la creación de agentes que alteren mecanismos fisiopatológicos o inhiban la función o suspendan el crecimiento de organismos patogénicos.

La información genética presente en cada célula somática normal de un organismo metazoo es prácticamente idéntica. Las excepciones programadas, genéticamente reproducibles, se encuentran en las pocas células que han amplificado genes o los han reordenado para desempeñar funciones celulares especializadas. Por supuesto, en diversos estados morbosos, la integridad de los cromosomas está alterada (esto es, cáncer; figura 56-11) a veces incluso en el ámbito de cromosoma entero (p. ej., trisomía 21, que causa síndrome de Down). La expresión de la información genética debe regularse durante la ontogenia y la diferenciación del organismo y sus componentes celulares. Además, para que el organismo se adapte a su ambiente y conserve energía y nutrientes, la expresión de la información genética debe ser influida por señales extrínsecas y sólo mostrar respuesta cuando es necesario. A medida que los organismos han evolucionado, también han aparecido mecanismos reguladores más complejos que proporcionan al organismo y sus células la capacidad de respuesta necesaria para sobrevivir en un ambiente complejo. Las células de mamífero poseen alrededor de 1 000 veces más información genética que la bacteria Escherichia coli. Gran parte de esta información genética adicional probablemente está involucrada en la regulación de la expresión de gen durante la diferenciación de tejidos y procesos biológicos en el organismo multicelular, y en el aseguramiento de que el organismo pueda responder a desafíos ambientales complejos.

En términos simples, sólo hay dos tipos de regulación de gen: positiva y negativa (cuadro 38-1). Cuando un elemento regulador específico aumenta de manera cuantitativa la expresión de la información genética, se dice que la regulación es positiva; cuando la presencia de un elemento regulador específico disminuye la expresión de la información genética, se considera que la regulación es negativa. El elemento o la molécula que media la regulación negativa se llama regulador negativo, silenciador o represor; y el que media regulación positiva es un regulador positivo o activador; sin embargo, un doble negativo tiene el efecto de actuar como un positivo. Así, un efector que inhibe la función de un regulador negativo parecerá desencadenar una regulación positiva. Muchos sistemas regulados que parecen ser inducidos, en realidad son desreprimidos en el ámbito molecular. (Estos términos se explican en el capítulo 9.)

La figura 38-1 describe la extensión o cantidad de expresión de gen en tres tipos de respuesta temporal a una señal inductora. Una respuesta tipo A se caracteriza por expresión aumentada de gen, que depende de la presencia continua de la señal inductora. Cuando dicha señal se elimina, la expresión de gen disminuye hasta sus cifras basales, pero aumenta repetidas veces en respuesta a la reaparición de la señal específica. Este tipo de respuesta por lo general se observa en procariotas tras cambios repentinos de la concentración intracelular de un nutriente. También se ve en muchos organismos superiores después de exposición a inductores, como hormonas, nutrientes o factores de crecimiento (capítulo 42).

Una respuesta tipo B muestra expresión aumentada de gen que es transitoria incluso en presencia continua de la señal reguladora. Después de que esta última señal ha terminado, y se ha permitido a la célula que se recupere, quizá se observe una segunda respuesta transitoria a una señal reguladora subsiguiente. Este fenómeno de recuperación respuesta-desensibilización caracteriza a la acción de muchos agentes farmacológicos, pero también es una característica de diversos procesos naturales. Este tipo de respuesta por lo general ocurre durante el desarrollo de un organismo, cuando sólo se requiere la aparición transitoria de un producto de gen específico aunque la señal persista.

El modelo de respuesta tipo C muestra una expresión de gen aumentada en respuesta a la señal reguladora que persiste por tiempo indefinido incluso después de la terminación de la señal. La señal actúa como un desencadenante en este modelo. Una vez que la expresión del gen se inicia en la célula, no puede terminarse incluso en las células hijas; por ende, es una alteración irreversible y hereditaria. Este tipo de respuesta típicamente ocurre durante el desarrollo de la función diferenciada de un tejido u órgano.

Organismos unicelulares y multicelulares sencillos sirven como modelos valiosos para el estudio de la expresión de gen en células de mamífero

El análisis de la regulación de la expresión génica en células procariontes ayudó a establecer el principio de que la información fluye desde el gen hacia un RNA mensajero, y hacia una molécula de proteína específica. Estos estudios fueron auxiliados por los análisis genéticos avanzados que pudieron efectuarse en organismos procariontes y en organismos eucariontes inferiores, como la levadura de panadero, Saccharomyces cerevisiae, y la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, entre otros. Durante los últimos años, los principios establecidos en estos estudios, junto con diversas técnicas de biología molecular, han llevado a notorio progreso en el análisis de la regulación de gen en organismos eucarióticos superiores, incluso mamíferos. En este capítulo, la exposición inicial se centra en sistemas procarióticos. No se describen aquí los impresionantes estudios genéticos, pero sí se ofrecen comentarios sobre las características fisiológicas de la expresión de gen. Sin embargo, casi todas las conclusiones acerca de estas características fisiológicas se han derivado de estudios genéticos y confirmado mediante experimentos de genética molecular y bioquímicos.

Algunas características de la expresión de gen procariótico son singulares

Antes de que puedan explicarse las características fisiológicas de la expresión de gen, es necesario definir algunos términos genéticos y reguladores especializados para sistemas procarióticos. En procariotas, los genes que participan en una vía metabólica a menudo están presentes en una disposición lineal llamada un operón, por ejemplo, el operón lac. Un operón puede estar regulado por un promotor o región reguladora únicos. El cistrón es la unidad de menor tamaño de expresión genética. Un mRNA único que codifica para más de una proteína traducida por separado se denomina un mRNA policistrónico. Por ejemplo, el mRNA operón lac policistrónico se traduce hacia tres proteínas separadas (véase más adelante). Los operones y los mRNA policistrónicos son comunes en bacterias, no así en eucariotas.

Un gen inducible es aquel cuya expresión aumenta en respuesta a un inductor o activador, una señal reguladora positiva específica. En general, los genes inducibles tienen índices de transcripción basales relativamente bajos. En contraste, los genes que tienen índices de transcripción basales altos a menudo quedan sujetos a regulación descendente por represores.

La expresión de algunos genes es constitutiva, lo que significa que se expresan a un índice razonablemente constante y no se sabe que estén sujetos a regulación. A menudo reciben el nombre de genes “de administración de la casa”. Como resultado de mutación, algunos productos de gen inducibles se expresan de manera constitutiva. Una mutación que da por resultado una expresión constitutiva de lo que anteriormente era un gen regulado se denomina una mutación constitutiva.

El análisis del metabolismo de la lactosa en E. coli llevó a la hipótesis del operón

En 1961, Jacob y Monod describieron su modelo de operón en un artículo clásico. Su hipótesis se basó en gran parte en observaciones sobre la regulación del metabolismo de la lactosa en la bacteria intestinal E. coli. Los mecanismos moleculares de los cuales depende la regulación de los genes comprendidos en el metabolismo de la lactosa ahora figuran entre los mejor entendidos en cualquier organismo. La β-galactosidasa hidroliza a la β-galactósido lactosa hacia lactosa y glucosa. El gen estructural que codifica para β-galactosidasa (lacZ) está agrupado con los genes que se encargan de la permeación de la lactosa hacia la célula (lacY) y para tiogalactósido transacetilasa (lacA). Los genes estructurales para estas tres enzimas, junto con el promotor lac y el operador lac (una región reguladora), están físicamente asociados para constituir el operón lac (figura 38-2). Este ordenamiento genético de los genes estructurales y sus genes reguladores permite la expresión coordinada de las tres enzimas que se relacionan con el metabolismo de la lactosa. Cada uno de estos genes enlazados se transcribe hacia una molécula de mRNA policistrónico grande que contiene múltiples codones de inicio (AUG) y de parada (UAA) de la traducción independientes para cada uno de estos tres cistrones. Así, cada proteína se traduce por separado y no se procesan a partir de una proteína precursora grande única.

Ahora es convencional considerar que un gen incluye secuencias reguladoras, así como la región que codifica para la transcripción primaria. Aunque hay muchas excepciones históricas, el nombre de un gen por lo general se escribe en letras cursivas minúsculas, y la proteína codificada, cuando se abrevia, se escribe con letra tipo romano con la primera letra en mayúsculas; por ejemplo, el gen lacI codifica para la proteína represora LacI. Cuando E. coli es presentada con lactosa o con algunos análogos de lactosa específicos en condiciones no represoras apropiadas (p. ej., concentraciones altas de lactosa, medio sin glucosa o con muy poca glucosa; véase más adelante), la expresión de las actividades de la β-galactosidasa, galactósido permeasa, y tiogalactósido transacetilasa aumenta 100 a 1 000 veces; se trata de una respuesta tipo A (figura 38-1). La cinética de la inducción puede ser bastante rápida; los mRNA específicos para lac están por completo inducidos en el transcurso de 5 a 6 minutos después de la adición de lactosa a un cultivo; la concentración de proteína β-galactosidasa es máxima en el transcurso de 10 minutos. En condiciones por completo inducidas, puede haber hasta 5 000 moléculas de β-galactosidasa por cada célula, una cantidad unas 1 000 veces mayor que la concentración basal, no inducida. En el momento de la eliminación de la señal, esto es, el inductor, la síntesis de estas tres enzimas declina.

Cuando E. coli queda expuesta tanto a lactosa como a glucosa como fuentes de carbono, los organismos metabolizan primero la glucosa y después dejan de crecer temporalmente hasta que los genes del operón lac quedan inducidos para proporcionar la capacidad de metabolizar lactosa como una fuente de energía utilizable. Aunque la lactosa está presente desde el comienzo de la fase de crecimiento bacteriano, la célula no induce las enzimas necesarias para el catabolismo de la lactosa sino hasta que la glucosa se ha agotado. Primero se creyó que este fenómeno era atribuible a la represión del operón lac por algún catabolito de la glucosa; por ende, se denominó represión por catabolito. Ahora se sabe que la represión por catabolito en realidad está mediada por una proteína activadora de gen que codifica para catabolito (CAP) de manera conjunta con cAMP (figura 17-5). Esta proteína también se denomina la proteína reguladora de cAMP (CRP). La expresión de muchos sistemas enzimáticos inducibles u operones en E. coli y otros procariotas es sensible a la represión por catabolito, como se considera más adelante.

Las características fisiológicas de la inducción del operón lac se entienden bien en el ámbito molecular (figura 38-3). La expresión del gen lacI normal del operón lac es constitutiva; se expresa a un índice constante, y da por resultado la formación de las subunidades del represor lac. Cuatro subunidades idénticas con masa molecular relativa (peso molecular) de 38 000 se montan para formar una molécula represora Lac tetramérica. La molécula de proteína represora LacI, el producto de lacI, tiene afinidad alta (constante de disociación, K_d de alrededor de 10^–13 mol/L) para el locus operador, una región de DNA bicatenario con una simetría rotacional de dos pliegues y un palíndromo invertido (indicado por flechas alrededor del eje punteado) en una región que tiene 21 pares de bases de largo, como se muestra a continuación:

En cualquier momento, sólo 2 de las 4 subunidades del represor parecen unirse al operador, y dentro de la región de 21 pares de bases casi cada base de cada par de bases participa en el reconocimiento de LacI y la unión al mismo. Casi toda la unión ocurre en el surco mayor sin interrumpir la naturaleza de doble hélice, con pares de base, del DNA operador. El locus operador está entre el sitio promotor, en el cual la RNA polimerasa dependiente de DNA se fija para comenzar la transcripción, y el sitio de inicio de la transcripción del gen lacZ, el gen estructural que codifica para la β-galactosidasa (figura 38-2). Cuando está fija al locus operador, la molécula represora LacI evita la transcripción de los genes estructurales distales, lacZ, lacY y lacA al interferir con la unión de RNA polimerasa al promotor; la RNA polimerasa y el represor LacI no pueden unirse con eficacia al operón lac al mismo tiempo. De este modo, la molécula represora LacI es un regulador negativo; en su presencia (y en ausencia del inductor; véase más adelante), la expresión de los genes lacZ, lacY y lacA es muy, muy baja. Normalmente hay 20 a 40 moléculas tetrámero represoras en la célula, una concentración (20-40 10^–9 mol/L) de tetrámero suficiente para que en cualquier momento dado hacer que haya > 95% de ocupación del elemento operador lac en una bacteria, lo que asegura transcripción de gen operón lac basal baja (pero no de cero) en ausencia de señales inductoras.

Un análogo de la lactosa que tiene la capacidad de inducir el operón lac, si bien no sirve por sí mismo como un sustrato para la β-galactosidasa, es un ejemplo de un inductor gratuito. Un ejemplo es el isopropiltiogalactósido (IPTG). La adición de lactosa o de un inductor gratuito como IPTG a bacterias que están creciendo en una fuente de carbono poco utilizada (como succinato) da por resultado la inducción expedita de las enzimas del operón lac. Pequeñas cantidades del inductor gratuito o de lactosa tienen la capacidad de entrar en la célula incluso en ausencia de permeasa. Las moléculas represoras LacI (tanto las que están fijas a los loci operadores como las que están libres en el citosol) tienen afinidad alta por el inductor. La unión de este último a molécula represora induce un cambio de conformación en la estructura del represor, y hace que se disocie del DNA operador porque su afinidad por el operador ahora es 10⁴ veces más baja (K_d de alrededor de 10^–9 mol/L) que la de LacI en ausencia de IPTG. La RNA polimerasa dependiente de DNA ahora puede unirse al sitio promotor (figuras 36-3 y 36-8), y la transcripción empezará, aunque este proceso es relativamente ineficiente (véase más adelante). De tal manera, un inductor “desreprime” el operón lac, y permite la transcripción de los genes estructurales que codifican para β-galactosidasa, galactósido permeasa y tiogalactósido transacetilasa. La traducción del mRNA policistrónico puede ocurrir incluso antes de que se complete la transcripción. La desrepresión del operón lac permite que la célula sintetice las enzimas necesarias para catabolizar lactosa como una fuente de energía. Con base en las características fisiológicas descritas, la expresión, inducida por IPTG, de plásmidos que fueron objeto de transfección, y que portan el operador-promotor lac ligado a construcciones apropiadas obtenidas mediante procesos de bioingeniería, suele usarse para expresar proteínas recombinantes de mamífero en E. coli.

Para que la RNA polimerasa forme un PIC en el sitio promotor con mayor eficiencia, también debe estar presente la CAP a la cual el cAMP está unido. Por medio de un mecanismo independiente, la bacteria acumula cAMP sólo cuando está privada de una fuente de carbono. En presencia de glucosa (o de glicerol en concentraciones suficientes para crecer) las bacterias carecerán de suficiente cAMP para unirse a CAP porque la glucosa inhibe a la adenililciclasa, la enzima que convierte ATP en cAMP (capítulo 41). De esta manera, en presencia de glucosa o glicerol, no hay CAP saturada con cAMP, de modo que la RNA polimerasa dependiente de DNA no puede iniciar la transcripción del operón lac al índice máximo. Sin embargo, en presencia del complejo de CAP-cAMP, que se une al DNA justo torrente arriba del sitio promotor, la transcripción ocurre a niveles máximos (figura 38-3). Los estudios indican que una región de CAP entra en contacto con la subunidad α de la RNA polimerasa y estas interacciones proteína-proteína facilitan la unión de RNAP al promotor. Así, el regulador CAP-cAMP está actuando como un regulador positivo porque se requiere su presencia para la expresión óptima de gen. Por ende, el operón lac está controlado por dos factores trans de unión a DNA modulados por ligando, distintos; uno que actúa de manera positiva (complejo de cAMP-CRP) para facilitar la unión productiva de RNA polimerasa al promotor, y uno que actúa de manera negativa (represor LacI) que antagoniza la unión del promotor RNA polimerasa. La actividad máxima del operón lac ocurre cuando las concentraciones de glucosa son bajas (cAMP alto con activación de CAP) y hay lactosa (se evita que LacI se una al operador).

Cuando el gen lacI se ha mutado de modo que su producto, LacI, es incapaz de unirse al DNA operador, el organismo mostrará expresión constitutiva del operón lac. De una manera contraria, un organismo con una mutación del gen lacI que produce una proteína LacI que evita la unión de un inductor al represor, permanecerá reprimido incluso en presencia de la molécula inductora, porque el inductor no puede unirse al represor en el locus operador para desreprimir al operón. De modo similar, las bacterias que albergan mutaciones en su locus operador lac de modo que la secuencia operadora no se unirá a una molécula represora normal, expresan de manera constitutiva los genes que codifican para el operón lac. En células eucarióticas se han observado mecanismos de regulación positiva y negativa comparables a los aquí descritos para el sistema lac (véase más adelante).

El cambio genético del bacteriófago lambda (λ) proporciona otro paradigma para las interacciones entre proteína y DNA y regulación transcripcional en células eucarióticas

Al igual que algunos virus eucarióticos (p. ej., virus del herpes simple, HIV), algunos virus bacterianos pueden residir en un estado latente dentro de los cromosomas del huésped, o replicarse dentro del huésped bacteriano y finalmente llevar a lisis y muerte del mismo. Algunas E. coli albergan un virus “plantilla” de ese tipo, el bacteriófago lambda (λ). Cuando este último infecta a un organismo de esa especie, inyecta hacia la célula su genoma de DNA lineal, bicatenario, de 45 000 bp (figura 38-4). Según el estado nutricional de la célula, el DNA del bacteriófago lambda se integrará en el genoma del huésped (vía lisogénica) y permanecerá latente hasta que se active (véase más adelante), o empezará a replicarse hasta que ha hecho alrededor de 100 copias de virus completo, lleno de proteína, momento en el cual causa lisis de su huésped (vía lítica). Las partículas de virus recién generadas a continuación pueden infectar a otros huéspedes susceptibles. Las condiciones de crecimiento inadecuadas favorecen la lisogenia, mientras que las condiciones de crecimiento buenas promueven la vía lítica de crecimiento del bacteriófago lambda.

Cuando se integra en el genoma del huésped en su estado latente, el bacteriófago lambda permanecerá en ese estado en tanto no se active por exposición de su huésped bacteriano a agentes que dañan el DNA. En respuesta a ese estímulo nocivo, el bacteriófago latente queda “inducido” y empieza a transcribir y después a traducir los genes de su propio genoma que son necesarios para su escisión desde el cromosoma huésped, su replicación de DNA, y la síntesis de su cubierta proteínica y sus enzimas líticas. Este evento actúa como una respuesta desencadenante o tipo C (figura 38-1); esto es, una vez que el bacteriófago lambda latente se ha comprometido a sí mismo a inducción, no hay regreso hasta que la célula se lisa y el bacteriófago replicado se libera. Este cambio desde un estado latente o de profago hacia una infección lítica se entiende bien en los ámbitos genético y molecular, y se describirá con detalle aquí; aunque se comprende menos bien en el ámbito molecular, el HIV y el virus del herpes pueden comportarse de manera similar, haciendo una transición de la forma latente a activa de la infección. El evento de cambio genético lítico/lisogénico en el bacteriófago lambda se centra alrededor de una región de 80 bp en su genoma de DNA bicatenario, denominada el “operador derecho” (O_R) (figura 38-5A). El operador derecho está flanqueado en su lado izquierdo por el gen estructural de la proteína represora lambda, cI, y en su lado derecho por el gen estructural que codifica para otra proteína reguladora llamada cro. Cuando el bacteriófago lambda se encuentra en su estado de profago (esto es, integrado en el genoma del huésped), el gen represor cI es el único gen del mismo que se expresa. Cuando el bacteriófago lambda está pasando por crecimiento lítico, el gen represor cI no se expresa, pero sí se expresan el gen cro (así como muchos otros genes en lambda). Es decir, cuando el gen represor está activado, el gen cro está desactivado, y cuando el gen cro está activado, el gen represor cI está desactivado. Como se verá, estos dos genes regulan la expresión uno del otro y, así, finalmente, la decisión entre crecimiento lítico y lisogénico del bacteriófago lambda. Esta decisión entre transcripción de gen represor y transcripción de gen cro es un ejemplo paradigmático de un cambio transcripcional molecular.

El operador derecho lambda de 80 bp, O_R, puede subdividirse en tres elementos de DNA cis-activos de 17 bp, espaciados de manera uniforme, separados, que representan los sitios de unión de una u otra de dos proteínas reguladoras de bacteriófago lambda. Es importante que las secuencias de nucleótido de estos tres sitios dispuestos en tándem son similares, mas no idénticas (figura 38-5B). Los tres elementos cis relacionados, llamados operadores O_R1, O_R2 y O_R3, pueden ser unidos por proteínas cI o Cro. Sin embargo, las afinidades relativas de cI y Cro por cada uno de los sitios varían, y esta afinidad de unión diferencial es fundamental para la operación apropiada del “cambio molecular” lítico o lisogénico del fago lambda. La región de DNA entre los genes cro y represor también contiene dos secuencias promotoras que dirigen la unión de RNA polimerasa en una orientación especificada, donde comienza a transcribir genes adyacentes. Un promotor dirige a la RNA polimerasa para que transcriba hacia la derecha y, así, para que transcriba cro y otros genes distales, mientras que el otro promotor dirige la transcripción del gen represor cI hacia la izquierda (figura 38-5B).

El producto del gen represor cI, la proteína represora λ cI de 136 aminoácidos es una molécula de dos dominios con dominio de unión a DNA amino terminal y dominio de dimerización carboxilo terminal. La asociación de una proteína represora con otra forma un dímero. Los dímeros represores cI se unen al DNA operador de manera mucho más estrecha que los monómeros (figura 38-6A a 38-6C).

El producto del gen cro, la proteína Cro de 9 kDa y 66 aminoácidos, tiene un dominio único pero también se une al DNA operador de manera más estrecha que un dímero (figura 38-6D). El dominio único de la proteína Cro media tanto la unión a operador como la dimerización.

En una bacteria lisogénica (esto es, una bacteria que contiene un profago lambda latente integrado), el dímero represor de lambda se une de preferencia a O_R1, pero al hacerlo, mediante una interacción cooperativa, aumenta la unión (por un factor de 10) de otro dímero represor a O_R2 (figura 38-7). La afinidad del represor por O_R3 es la menor de las tres subregiones operadoras. La unión del represor a O_R1 tiene dos efectos importantes. La ocupación de O_R1 por represor bloquea la unión de la RNA polimerasa al promotor hacia la derecha, y de esa manera evita la expresión de cro. En segundo lugar, como se mencionó, el dímero represor unido a O_R1 aumenta la unión del dímero represor a O_R2. La unión del represor a O_R2 tiene el importante efecto adicional de aumentar la unión de la RNA polimerasa al promotor hacia la izquierda que superpone O_R3 y, así, aumenta la transcripción y la expresión subsiguiente del gen represor. Este aumento de la transcripción está mediado por interacciones directas entre una proteína y otra, entre RNA polimerasa unida a promotor y represor unido a O_R2, de una manera muy similar a la antes descrita para la proteína CAP y la RNA polimerasa en el operón lac. De este modo, el represor λ cI es tanto un regulador negativo, al evitar la transcripción de cro, como un regulador positivo, al aumentar la transcripción de su propio gen, cI. Este efecto doble del represor es la causa del estado estable del bacteriófago lambda latente; el represor no sólo evita la expresión de los genes necesarios para lisis, sino que también promueve la expresión de sí mismo para estabilizar este estado de diferenciación. Si la concentración intracelular de proteína represora se hace demasiado alta, este represor excesivo se unirá a O_R3, y al hacerlo disminuye la transcripción del gen represor desde el promotor hacia la izquierda bloqueando la unión de RNAP al promotor cl, hasta que la concentración de represor decrece y el represor se disocia por sí mismo de O_R3. Despierta interés que en eucariotas se han observado ejemplos similares de proteínas represoras que también tienen la capacidad de activar la transcripción.

Con ese estado lisogénico, mediado por cI, represivo, estable, podría preguntarse de qué modo alguna vez se podría entrar al sitio lítico; sin embargo, este proceso ocurre con bastante eficiencia. Cuando una señal de daño del DNA, como luz ultravioleta, golpea la bacteria huésped lisogénica, se generan fragmentos de DNA monocatenario que activan una co-proteasa específica codificada por un gen bacteriano y denominada recA (figura 38-7). La proteasa recA activada hidroliza la porción de la proteína represora que conecta los dominios amino terminal y carboxilo terminal de esa molécula (figura 38-6A). Esa división de los dominios represores hace que los dímeros represores se disocien lo que, a su vez, causa disociación de las moléculas represoras desde O_R2, y finalmente desde O_R1. Los efectos de la eliminación de receptor desde O_R1 y O_R2 son predecibles. La RNA polimerasa inmediatamente tiene acceso al promotor hacia la derecha, y comienza a transcribir el gen cro y se pierde el efecto aumentador del represor en O_R2 en la transcripción hacia la izquierda (figura 38-7).

La proteína Cro recién sintetizada resultante también se une a la región del operador como un dímero, pero este orden de preferencia es opuesto al del represor (figura 38-7). Es decir, Cro se une de manera más estrecha a O_R3, pero no hay efecto cooperador de O_R3 sobre la unión de Cro a O_R2. A concentraciones cada vez más altas de Cro, la proteína se unirá a O_R2 y finalmente a O_R1.

La ocupación de O_R3 por Cro desactiva de inmediato la transcripción desde el promotor cI hacia la izquierda, y de esa manera evita cualquier expresión adicional del gen represor. De esta manera, el cambio molecular se “arroja” por completo en la dirección lítica. El gen cro ahora se expresa, y el gen represor se desactiva por completo; este evento es irreversible, y la expresión de otros genes del bacteriófago lambda empieza como parte del ciclo lítico. Cuando la concentración de represor Cro se hace bastante alta, finalmente ocupará O_R1 y al hacerlo reduce la expresión de su propio gen, proceso que es necesario para que se realicen las etapas finales del ciclo lítico.

Las estructuras tridimensionales de Cro y de la proteína represora lambda se han determinado mediante cristalografía con rayos X, y se han propuesto y probado modelos para su unión y para efectuar los eventos moleculares y genéticos antes descritos. Ambos se unen al DNA usando motivos de dominio de unión a DNA (DBD) de hélice-giro-hélice (véase más adelante). Hasta la fecha, este sistema proporciona, según se dice, la mejor comprensión de los eventos moleculares involucrados en la activación y represión de gen.

El análisis detallado del represor lambda llevó al importante concepto de que las proteínas reguladoras de la transcripción tienen varios dominios funcionales. Por ejemplo, el represor lambda se une al DNA con alta afinidad. Los monómeros represores forman dímeros, que interactúan de manera cooperativa entre sí, y el represor interactúa con la RNA polimerasa para aumentar o bloquear la unión del promotor o la formación del complejo abierto de RNAP (figura 36-3). La interfaz de proteína-DNA y las tres interfases de proteína-proteína comprenden dominios separados y distintos de la molécula represora. Como se explica más adelante (figura 38-19), ésta es una característica compartida por casi todas las moléculas (quizá todas) que regulan la transcripción.

Casi todo el DNA en células procarióticas está organizado en genes y dado que el DNA no se encuentra compactado con histonas nucleosomales, siempre tiene el potencial de ser transcritas si se activan factores trans positivos y negativos apropiados. Existe una situación muy diferente en células de mamífero, en las cuales relativamente poco del DNA total está organizado hacia genes que codifican para mRNA y sus regiones reguladoras asociadas. La función del DNA extra se está investigando de manera activa (capítulo 39; el ENCODE Project). Más importante aún, como se muestra en el capítulo 35, en células eucarióticas el DNA se encuentra extensamente plegado y aglomerado hacia el complejo de proteína-DNA llamado cromatina. Las histonas son una parte importante de este complejo, porque ambos forman estructuras conocidas como nucleosomas (capítulo 35) y son también un factor importante en los mecanismos reguladores de gen, como se explica más adelante.

La plantilla de cromatina contribuye de manera importante al control de la transcripción de gen eucarionte

La estructura de la cromatina proporciona un nivel de control adicional de la transcripción de gen. Regiones grandes de cromatina son inactivas desde el punto de vista transcripcional, mientras que otras son activas o potencialmente activas (capítulo 35). Con pocas excepciones, cada célula contiene el mismo conjunto de genes. El desarrollo de órganos, tejidos y células especializados, y su función en el organismo intacto, dependen de la expresión diferencial de genes.

Parte de esta expresión diferencial se logra al tener diferentes regiones de cromatina disponibles para transcripción en células de diversos tejidos. Por ejemplo, el DNA que contiene la agrupación de gen que codifica para globina β está en cromatina “activa” en el reticulocito, pero en cromatina “inactiva” en células musculares. No se han elucidado todos los factores involucrados en la determinación de cromatina activa. La presencia de nucleosomas y de complejos de histonas y DNA (capítulo 35) ciertamente proporciona una barrera contra la asociación fácil de factores de transcripción con regiones de DNA específicas. Por ende, la dinámica de la formación de la estructura de nucleosoma y de la alteración de la misma es una parte importante de la regulación de gen eucarionte.

La modificación covalente de histona, también llamada el código de histona, es un determinante importante de la actividad de gen. Las histonas están sujetas a una amplia gama de modificaciones postraduccionales específicas (cuadro 35-1); tales modificaciones son dinámicas y reversibles. La acetilación de histona y la desacetilación de la misma se entienden mejor. El sorprendente descubrimiento de que la histona acetilasa y otras actividades enzimáticas están asociadas con los correguladores involucrados en la regulación de la transcripción de gen (capítulo 42) ha proporcionado un nuevo concepto de regulación de gen. Se sabe que ocurre acetilación en residuos de lisina en las colas amino terminales de moléculas de histona, y se ha correlacionado de manera constante con transcripción, o de modo alternativo con el potencial transcripcional. La acetilación de histona reduce la carga positiva de estas colas, y probablemente contribuye a un decremento de la afinidad de unión de histona por el DNA que tiene carga negativa. Más aún, esa modificación covalente de las histonas crea nuevos sitios de unión para proteínas adicionales como complejos remodeladores de cromatina dependientes de ATP, que contienen subunidades que portan dominios estructurales que se unen de manera específica a histonas que han quedado sujetas a modificaciones postraduccionales (PTM) depositadas por correguladores. Estos complejos pueden aumentar la accesibilidad de secuencias de DNA adyacentes al eliminar histonas nucleosomales. Los correguladores (modificadores de cromatina y remodeladores de cromatina), al trabajar de manera conjunta, pueden abrir regiones promotoras y reguladoras de gen, lo que facilita la unión de otros factores trans y RNA polimerasa II y GTF (figuras 36-10 y 36-11). La desacetilación de histona catalizada por correpresores transcripcionales tendría el efecto opuesto. Diferentes proteínas con actividades de acetilasa y desacetilasa específicas están asociadas con diversos componentes del aparato de transcripción. Las proteínas que catalizan las PTM de histona a veces se denominan “redactores de código”, mientras que las proteínas que reconocen estas PTM de histona, se unen a las mismas y las interpretan se llaman “lectoras de código”, y las enzimas que eliminan PTM de histona se llaman “borradoras de código”. Entonces, en conjunto, PTM de histona representan una fuente de información reguladora en potencia rica en información, muy dinámica. Se están investigando las reglas y los mecanismos exactos que definen la especificidad de estos diversos procesos. En el capítulo 42 se ilustran algunos ejemplos específicos. Varias empresas comerciales están trabajando para desarrollar fármacos que alteren de manera específica la capacidad de las proteínas que modulan el código de histona.

En el capítulo 35 se describe la evidencia de que la metilación de residuos desoxicitidina (en la secuencia 5′-^meCpG-3′) en el DNA puede efectuar cambios en la cromatina, de modo que impide su transcripción activa. Por ejemplo, en el hígado de ratón, sólo pueden expresarse los genes ribosómicos no metilados, y hay evidencia de que muchos virus de animales no se transcriben cuando su DNA está metilado. La desmetilación aguda de residuos 5MeC en regiones específicas de genes inducibles que codifican para hormona esteroide se ha relacionado con un índice aumentado de transcripción del gen. Sin embargo, aún es imposible generalizar que el DNA metilado es inactivo desde el punto de vista transcripcional, que toda la cromatina inactiva está metilada, o que el DNA activo no está metilado.

Por último, la unión de factores de transcripción específicos a elementos de DNA cognados puede dar por resultado alteración de la estructura nucleosómica. Muchos genes eucarióticos tienen múltiples elementos de DNA de unión a proteína. La unión seriada de factores de transcripción a estos elementos (de un modo combinacional) puede alterar de manera directa la estructura del nucleosoma, evitar que vuelva a formarse, o reclutar, por medio de interacciones entre una proteína y otra, complejos correguladores de múltiples proteínas que tienen la capacidad para modificar o remodelar de manera covalente nucleosomas. Estas reacciones dan por resultado cambios estructurales en el ámbito de cromatina, que al final aumentan la accesibilidad del DNA a otros factores y a la maquinaria de transcripción.

El DNA eucariótico, que se encuentra en una región “activa” de cromatina, se puede transcribir. Al igual que en células procarióticas, un promotor dicta dónde iniciará la transcripción la RNA polimerasa, pero el promotor en células de mamífero (capítulo 36) es más complejo. Se añade más complejidad por elementos o factores que aumentan o reprimen la transcripción, definen la expresión específica para tejido, y modulan las acciones de muchas moléculas efectoras. Por último, resultados recientes sugieren que la activación y represión de gen podría ocurrir cuando genes particulares se movilizan hacia dentro o fuera de diferentes compartimientos o ubicaciones subnucleares.

Los mecanismos epigenéticos contribuyen de manera importante al control de la transcripción de gen

Las moléculas y la biología reguladora antes descritas contribuyen de manera importante a la regulación de la transcripción. De hecho, durante los años recientes el papel de la modificación covalente de DNA y proteínas histona y no histona, y los ncRNA recién descubiertos han recibido tremenda atención en el campo de la investigación sobre la regulación de gen, en particular por medio de investigación sobre cómo esas modificaciones químicas, o moléculas, o ambas, alteran de manera estable patrones de expresión génica sin alterar la secuencia de gen de DNA subyacente. Este campo de estudio se ha llamado epigenética. Un aspecto de estos mecanismos, las PTM de histonas, se ha denominado el código de histona o el código epigenético de histona (capítulo 35). El término “epigenética” significa “por arriba de la genética” y se refiere al hecho de que estos mecanismos reguladores no cambian la secuencia de DNA regulada subyacente, sino más bien simplifican los patrones de expresión de este DNA. Los mecanismos epigenéticos desempeñan funciones clave en el establecimiento, el mantenimiento y la reversibilidad de estados transcripcionales. Una característica clave de los mecanismos epigenéticos es que los estados transcripcionales activados/desactivados controlados pueden mantenerse por medio de múltiples rondas de división celular. Esta observación indica que debe haber mecanismos robustos para mantener estos estados epigenéticos y propagarlos de manera estable.

Pueden describirse dos formas de señales epigenéticas, señales epigenéticas cis y trans; éstas se ilustran de manera esquemática en la figura 38-8. En la figura 38-8A se presenta un evento de emisión de señal trans sencillo compuesto de retroacción transcripcional positiva mediada por un transactivador difusible abundante que se divide entre las células progenitora e hija en cada división. En tanto el factor de transcripción indicado es expresado a una magnitud suficiente para permitir que todas las células hija subsiguientes hereden la señal epigenética trans (factor de transcripción), esas células tendrán el fenotipo celular o molecular dictado por los otros genes blanco de este activador transcripcional. En la figura 38-8, panel B, se presenta un ejemplo de cómo una señal epigenética cis (como una marca de metilación 5MeCpG específica) puede propagarse de manera estable a las dos células hijas después de la división celular. La marca de DNA hemimetilado (esto es, sólo una de las dos cadenas de DNA es modificada por 5MeC) generada durante la replicación de DNA dirige la metilación de la cadena recién replicada mediante la acción de DNA metilasas de mantenimiento omnipresentes. Esta metilación 5MeC da lugar a que ambas cadenas hijas de DNA tengan la marca epigenética cis completa.

Las señales epigenéticas tanto cis como trans dan por resultado estados de expresión estables y hereditarios y, por ende, representan respuestas de expresión génica tipo C (figura 38-1). Sin embargo, tiene importancia notar que ambos estados se pueden invertir si las señales epigenéticas trans o cis se eliminan, por ejemplo, al extinguir la expresión del factor de transcripción que hace que suceda esto (señal trans) o al eliminar una señal epigenética cis de DNA (por medio de desmetilación de DNA). Se han descrito enzimas que, al menos in vitro, pueden eliminar tanto PTM de proteína como modificaciones de 5MeC.

La transmisión estable de estados activados/desactivados epigenéticos puede efectuarse mediante múltiples mecanismos moleculares. En la figura 38-9 se muestran tres maneras mediante las cuales las marcas epigenéticas cis pueden propagarse por una ronda de replicación de DNA. El primer ejemplo de transmisión de marca epigenética involucra la propagación de marcas de 5MeC de DNA, y ocurre como se describe en la figura 38-8. El segundo ejemplo de transmisión de estado epigenético ilustra cómo una PTM de histona nucleosomal (en este ejemplo, la histona H3 trimetilada lisina K-27; H3K27me3) puede propagarse. En este ejemplo inmediatamente después de la replicación de DNA, nucleosomas tanto marcados con H3K27me3 como no marcados con H3 se vuelven a formar al azar en ambas cadenas de DNA hijas. El complejo represor polycomb 2 (PRC2), compuesto de subunidades EED-SUZ12-EZH2 y RbAP, se une al nucleosoma que contiene la marca de H3K27me3 preexistente por medio de la subunidad EED. La unión de PRC2 a esta marca de histona estimula la actividad de metilasa de la subunidad de PRC2, EZH2, lo que da lugar a la metilación local de H3 nucleosomal. Así, la metilación de histona H3 causa la transmisión completa y estable de la marca epigenética H3K27me3 a ambas cromátides. Por último, el direccionamiento específico para locus/secuencia de señales cis epigenéticas de histona nucleosomal puede lograrse mediante la acción de ncRNA (figura 38-9, panel C). Aquí un ncRNA específico interactúa con secuencias de DNA blanco, y el complejo de RNA-DNA resultante es reconocido por RBP, una proteína de unión a RNA. Entonces, probablemente por medio de una proteína adaptadora específica (A), el complejo de RNA-DNA-RBP recluta un complejo modificador de cromatina (CMC) que modifica localmente histonas nucleosomales. De nuevo, este mecanismo lleva a la transmisión de una marca epigenética estable.

Se requerirá más investigación para establecer los detalles moleculares completos de estos procesos epigenéticos, determinar la magnitud de la omnipresencia de la operación de estos mecanismos, identificar todas las moléculas involucradas, y los genes controlados. Las señales epigenéticas tienen importancia crucial para la regulación de gen según se evidencia por el hecho de que las mutaciones o la sobreexpresión, o ambas, de muchas de las moléculas que contribuyen al control epigenético llevan a enfermedad en humanos.

Ciertos elementos del DNA potencian o reprimen la transcripción de genes eucarióticos

Además de cambios evidentes en la cromatina que afectan la actividad transcripcional, ciertos elementos del DNA facilitan o aumentan el inicio en el promotor y, por ende, se denominan potenciadores. Los elementos potenciadores, que típicamente contienen múltiples sitios de unión para proteínas transactivadoras, difieren del promotor en aspectos notables. Pueden ejercer su influencia positiva sobre la transcripción aun cuando están separados por decenas de miles de pares de bases desde un promotor; funcionan cuando están orientados en una u otra dirección, y pueden trabajar torrente arriba (5′) o abajo (3′) desde el promotor. Los potenciadores son inespecíficos, de modo que pueden estimular cualquier promotor en la vecindad y actuar sobre más de un promotor. El potenciador SV40 viral puede ejercer una influencia sobre, por ejemplo, la transcripción de la globina β al aumentar su transcripción 200 veces en células que contienen tanto el potenciador SV40 como el gen que codifica para la globina β en el mismo plásmido (véase más adelante y la figura 38-10); en este caso, el potenciador SV40 del gen que codifica para globina β se construyó usando tecnología de DNA recombinante (capítulo 39). El elemento potenciador no produce un producto que a su vez actúa sobre el promotor, puesto que sólo es activo cuando existe dentro de la misma molécula de DNA que el (esto es, en posición cis o físicamente ligado al) promotor. Las proteínas de unión potenciadoras se encargan de este efecto. Los mecanismos exactos mediante los cuales funcionan estos activadores de la transcripción están sujetos a investigación intensiva. Los factores trans de unión a potenciador interactúan con muchísimas otras proteínas de transcripción. Estas interacciones incluyen coactivadores modificadores de cromatina, mediador, así como los componentes individuales de la maquinaria de transcripción de la RNA polimerasa II basal. Finalmente, los eventos de unión a DNA de factor trans-potenciador dan por resultado un aumento de la unión de la maquinaria de transcripción basal al promotor. Los elementos potenciadores y las proteínas de unión relacionadas a menudo transmiten hipersensibilidad a nucleasa a las regiones donde residen (capítulo 35). En el cuadro 38-2 se presenta un resumen de las propiedades de los potenciadores.

Uno de los sistemas potenciadores de mamífero que se entienden mejor es el del gen que codifica para el interferón β; este gen se induce en el momento de infección viral de células de mamífero. Un objetivo de la célula, una vez infectada por un virus, es intentar montar una respuesta antiviral (si no para salvarse, para ayudar a salvar a todo el organismo contra infección por virus). La producción de interferón es un mecanismo mediante el cual se logra esto; esta familia de proteínas se secreta por células infectadas por virus. El interferón secretado interactúa con las células vecinas para causar una inhibición de la replicación viral por diversos mecanismos, lo que limita la extensión de la infección por virus. El elemento potenciador que controla la inducción del gen que codifica para interferón β, que está localizado entre los nucleótidos –110 y –45, relativo a la transcripción del sitio de inicio (+1), se encuentra bien caracterizado; está compuesto de cuatro elementos cis agrupados, separados, cada uno de los cuales está unido por factores trans únicos. Un elemento cis es unido por el factor de acción trans NF-κB (figuras 42-10 y 42-13), uno por un miembro de la familia de factores trans IRF (factor regulador de interferón), y un tercero por el factor cremallera de leucina heterodimérico ATF-2/c-Jun (véase más adelante). El cuarto factor es el factor de transcripción estructural abundante y omnipresente conocido como HMG I(Y). En el momento de unión a sus sitios de unión degenerados, ricos en A+T, HMG I(Y) induce una flexión importante en el DNA. Hay cuatro de esos sitios de unión HMG I(Y) entremezclados en todo el potenciador. Estos sitios desempeñan una función crucial en la formación de una estructura tridimensional (3D) particular, junto con los tres factores trans mencionados, al inducir una serie de flexiones del DNA con espaciado crucial. En consecuencia, HMG I(Y) induce la formación cooperativa de una estructura 3D única, estereoespecífica, dentro de la cual los cuatro factores están activos cuando la célula detecta señales de infección viral: la estructura formada por el montaje cooperativo de estos cuatro factores se denomina el potenciosoma de interferón β (figura 38-11), así llamado debido a su obvia similitud estructural con el nucleosoma, también una estructura de proteína-DNA tridimensional singular que envuelve el DNA alrededor de un montaje de proteínas (figuras 35-1 y 35-2). El potenciosoma, una vez formado, induce un incremento grande de la transcripción de gen que codifica para interferón β en el momento de la infección por virus. No es sólo la ocupación por proteína de los sitios de elemento cis yuxtapuestos de manera lineal lo que induce la transcripción del gen que codifica para el interferón β; más bien, es la formación del potenciosoma propiamente dicho que proporciona superficies apropiadas para el reclutamiento de coactivadores lo que da por resultado la formación aumentada del PIC sobre el promotor cis-enlazado y, así, activación de la transcripción.

También se han identificado los elementos de acción cis que disminuyen o reprimen la expresión de genes específicos. Dado que se ha estudiado un menor número de estos elementos, es imposible formular generalizaciones acerca de su mecanismo de acción, aunque, de nuevo, al igual que para la activación de gen, han quedado comprendidas modificaciones covalentes en el ámbito de cromatina, de histonas y otras proteínas, por correpresores de múltiples subunidades reclutados por (represor).

La expresión específica para tejido puede depender de la acción de potenciadores o represores o una combinación de ambos elementos regulatorios de acción cis

Ahora se reconoce que muchos genes albergan elementos potenciadores o activadores en diversas ubicaciones respecto a sus regiones de codificación. Además de tener la capacidad de potenciar la transcripción de gen, algunos de estos elementos potenciadores poseen con claridad la capacidad para hacerlo de una manera específica para tejido. Mediante fusionar potenciadores específicos para tejido conocidos o sospechados a genes reporteros (véase más adelante) y al introducir estas construcciones quiméricas de potenciador-reportero vía técnicas microquirúrgicas hacia embrión unicelular, es posible crear un animal transgénico (capítulo 39), y probar de manera rigurosa si un potenciador de prueba dado en realidad impulsa la expresión de una manera específica para célula o tejido. Este método de animal transgénico ha resultado útil para estudiar la expresión de gen específica para tejido.

Los genes reporteros se usan para definir elementos potenciadores y otros elementos reguladores

Al ligar regiones de DNA que se sospecha que albergan secuencias reguladoras a diversos genes reporteros (el método del gen reportero o quimérico) (figuras 38-10, 38-12 y 38-13), es posible determinar cuáles regiones en la vecindad de genes estructurales tienen una influencia sobre su expresión. Fragmentos de DNA que se cree que albergan elementos reguladores se ligan a un gen reportero idóneo y se introducen a una célula huésped (figura 38-12). La expresión basal del gen reportero estará aumentada si el DNA contiene un potenciador. La adición de una hormona o un metal pesado al medio de cultivo aumentará la expresión del gen reportero si el DNA contiene un elemento de respuesta a hormona (HRE) o metal (MRE) (figura 38-13). La ubicación del elemento puede determinarse con precisión al usar pedazos progresivamente más cortos de DNA, deleciones o mutaciones puntuales (figura 38-13).

Esta estrategia, en la que típicamente se usan células en cultivo que fueron objeto de transfección (esto es, células inducidas para captar DNA exógenos), ha llevado a la identificación de cientos de potenciadores, represores, elementos específicos para tejido, y elementos de respuesta a hormona, metal pesado y fármaco. La actividad de un gen en cualquier momento refleja la interacción de estos muchos elementos de DNA de acción cis con sus respectivos factores de acción trans. El gasto transcripcional general está determinado por el balance de emisión de señales positivas y negativas hacia la maquinaria de transcripción. El desafío ahora es averiguar exactamente cómo se produce esta regulación en el ámbito molecular, de modo que finalmente sea posible tener la capacidad para modular la transcripción de gen en un contexto terapéutico.

Las combinaciones de elementos de DNA y proteínas relacionadas proporcionan diversidad en las respuestas

Los genes procarióticos a menudo están regulados de una manera de activación-desactivación en respuesta a indicios ambientales simples. Algunos genes eucarióticos están regulados de la manera de activación-desactivación simple, pero en casi todos los genes, especialmente en mamíferos, el proceso es mucho más complicado. Señales que representan diversos estímulos ambientales complejos pueden converger en un gen único. La respuesta del gen a estas señales puede tener varias características fisiológicas. En primer lugar, la respuesta puede extenderse en un rango considerable; esto se logra al tener respuestas positivas aditivas y sinérgicas contraequilibradas por efectos negativos o represores. En algunos casos, la respuesta positiva o la negativa puede ser dominante. También se requiere un mecanismo por medio del cual un efector, como una hormona, puede activar a algunos genes en una célula mientras que reprime a otros, y deja a otros más no afectados. Cuando todos estos procesos se acoplan con factores de elemento específicos para tejido, se proporciona considerable flexibilidad. Es obvio que estas variables fisiológicas requieren un ordenamiento mucho más complejo que un interruptor de activación-desactivación. La gama de elementos de DNA en un promotor especifica (con factores relacionados)de qué modo un gen dado mostrará respuesta, y durante cuánto tiempo se mantiene una respuesta particular. La figura 38-14 ilustra algunos ejemplos simples.

Los dominios de transcripción pueden definirse por regiones de control de locus y por aisladores

El gran número de genes en las células eucarióticas, y las disposiciones complejas de factores reguladores de la transcripción, plantean un problema organizacional. ¿Por qué algunos genes están disponibles para transcripción en una célula dada, mientras que otros no lo están? Si los potenciadores pueden regular varios genes desde distancias de decenas de kilobases, y no son dependientes de la posición ni de la orientación, ¿cómo se evita que desencadenen transcripción de todos los genes enlazados a cis en la vecindad? Se llega a parte de la solución a estos problemas al tener la cromatina dispuesta en unidades funcionales que restringen modelos de expresión de gen; esto puede lograrse al hacer que la cromatina forme una estructura con la matriz nuclear u otra entidad física, o compartimiento dentro del núcleo. De manera alternativa, algunas regiones están controladas por elementos de DNA complejos llamados regiones de control de locus (LCR). Una LCR (con proteínas unidas relacionadas) controla la expresión de una agrupación de genes. La LCR mejor definida regula la expresión de la familia de genes que codifica para globina en una región grande de DNA. Los aisladores proporcionan otro mecanismo. Estos elementos de DNA, también en asociación con una o más proteínas, evitan que un potenciador actúe sobre un promotor en el otro lado de un aislador en otro dominio de transcripción. De este modo, los aisladores sirven como elementos de frontera transcripcionales.

La especificidad comprendida en el control de la transcripción requiere que las proteínas reguladoras se unan con afinidad y especificidad altas a la región correcta de DNA. Tres motivos únicos (la hélice-giro-hélice, el dedo de cinc y la cremallera de leucina) explican muchas de estas interacciones específicas entre proteína y DNA. En el cuadro 38-3 se presentan ejemplos de proteínas que contienen estos motivos.

La comparación de las actividades de unión de las proteínas que contienen estos motivos lleva a varias generalizaciones importantes.

1. La unión debe ser de alta afinidad al sitio específico, y de baja afinidad a otro DNA.

2. Regiones pequeñas de la proteína hacen contacto directo con el DNA; el resto de la proteína, además de proporcionar los dominios de activación trans, puede estar comprendida en la dimerización de monómeros de la proteína de unión, proporcionar una superficie de contacto para la formación de heterodímeros, proveer uno o más sitios de unión a ligando, o proporcionar superficies para interacción con coactivadores, correpresores o la maquinaria de transcripción.

3. Las interacciones entre proteína y DNA se mantienen mediante enlaces de hidrógeno, interacciones iónicas, y fuerzas de Van der Waals.

4. Los motivos que se encuentran en estas proteínas son singulares; su presencia en una proteína de función desconocida sugiere que la proteína puede unirse al DNA.

5. Las proteínas con los motivos de hélice-giro-hélice o de cremallera de leucina forman dímeros, y sus sitios de unión a DNA respectivos son palíndromos simétricos. En proteínas con el motivo de dedo de cinc, el sitio de unión se repite dos a nueve veces. Estas características permiten que haya interacciones cooperativas entre sitios de unión, y aumentan el grado de unión y la afinidad de la misma.

El motivo hélice-giro-hélice

El primer motivo descrito fue la hélice-giro-hélice. El análisis de la estructura tridimensional (3D) del regulador de la transcripción Cro lambda ha revelado que cada monómero consta de tres hojas β antiparalelas y tres hélices α (figura 38-15). El dímero se forma mediante asociación de las hojas β₃ antiparalelas. Las hélices α₃ forman la superficie de reconocimiento de DNA, y el resto de la molécula parece estar involucrada en la estabilización de estas estructuras. El diámetro promedio de una hélice a es de 1.2 nm, que es la anchura aproximada del surco mayor en la forma B del DNA.

El dominio de reconocimiento de DNA de cada monómero Cro interactúa con 5 bp, y los sitios de unión a dímero abarcan 3.4 nm, lo que permite que se adapten en medios giros sucesivos del surco mayor en la misma superficie (figura 38-15). Análisis con rayos X del represor cI λ, CAP (la proteína receptora de cAMP de E. coli), represor de triptófano, y represor del fago 434, también despliegan esta estructura de hélice-giro-hélice dimérica que asimismo está presente en proteínas de unión a DNA eucarióticas (cuadro 38-3).

El motivo dedo de cinc

El dedo de cinc fue el segundo motivo de unión a DNA cuya estructura atómica se elucidó. Se supo que la actividad de la proteína TFIIIA, un regulador positivo de la transcripción del gen que codifica para RNA 5S, requería cinc. Análisis estructurales y biofísicos revelaron que cada molécula de TFIIIA contiene nueve iones de cinc en un complejo de coordinación repetitivo formado por residuos cisteína-cisteína estrechamente espaciados, seguidos por 12 a 13 aminoácidos más tarde por un par de histidina-histidina (figura 38-16). En algunas circunstancias (entre las que destaca la familia de receptor de hormona nuclear esteroide-tiroidea) el doblete His-His es reemplazado por un segundo par Cis-Cis. La proteína que contiene dedos de cinc parece yacer sobre una cara de la hélice de DNA, con dedos sucesivos ubicados de manera alternativa en un giro del surco mayor. Como sucede con el dominio de reconocimiento en la proteína de hélice-giro-hélice, cada dedo de cinc TFIIIA entra en contacto con alrededor de 5 bp de DNA. La importancia de este motivo en la acción de hormonas esteroides es subrayada por un “experimento de la Naturaleza”. Una mutación de aminoácido único en uno u otro de los dos dedos de cinc de la proteína receptora de 1,25 (OH)₂-D₃ da por resultado resistencia a la acción de esta hormona, y el síndrome clínico de raquitismo.

El motivo cremallera de leucina

El análisis cuidadoso de una secuencia de 30 aminoácidos en la región carboxilo terminal de la proteína de unión potenciadora C/EBP reveló una estructura nueva, el motivo cremallera de leucina. Esta región de la proteína forma una hélice α en la cual hay una repetición periódica de residuos leucina en cada séptima posición (figura 38-17); esto ocurre para ocho giros de hélice y cuatro repeticiones de leucina. Se han encontrado estructuras similares en varias otras proteínas relacionadas con la regulación de la transcripción en células de mamífero y de levadura. Esta estructura permite que dos monómeros idénticos o no idénticos (p. ej., Jun-Jun o Fos-Jun) se “unan con cremallera” en una espiral enrollada y que formen un complejo dimérico estrecho (figura 38-17). Esta interacción entre una proteína y otra puede servir para aumentar la asociación de los DBD separados, con su blanco (figura 38-17).

La unión de DNA podría dar por resultado un cambio conformacional general que permite que la proteína unida active la transcripción, o estas dos funciones podrían ser desempeñadas por dominios independientes y separados. Experimentos de intercambio de dominio sugieren que típicamente sucede esto último.

El producto de gen GAL1 participa en el metabolismo de la galactosa en levaduras. La transcripción de este gen está regulada de manera positiva por la proteína GAL4, que se une a una secuencia activadora torrente arriba (UAS), o potenciador, por medio de un dominio amino terminal. El dominio de unión a DNA (DBD) de 73 aminoácidos amino terminal de GAL4 se eliminó y fue reemplazado por el DBD de LexA, una proteína de unión a DNA de E. coli. Este intercambio de dominio dio por resultado una molécula que no se unió al UAS GAL1 y, por supuesto, no activó al gen GAL1 (figura 38-18). Sin embargo, si el operador lexA (la secuencia de DNA que normalmente es unida por el lexADBD) se insertó en la región promotora del gen GAL, lo que reemplazó el potenciador GAL1 normal, la proteína híbrida se unió a este promotor (en el operador lexA) y activó la transcripción de GAL1. Este experimento, que se ha repetido varias veces, proporciona evidencia sólida de que la región carboxilo terminal de GAL4 contiene un dominio de activación transcripcional; estos datos también demuestran que el DBD y los dominios de transactivación (AD) son independientes. La jerarquía comprendida en el montaje de complejos activadores de la transcripción de gen incluye proteínas que se unen al DNA y lo transactivan; otras que forman complejos proteína-proteína que forman puentes con proteínas de unión a DNA para transactivar proteínas, y otras que forman complejos proteína-proteína con componentes de correguladores o el aparato de transcripción basal. De esta manera, una proteína dada puede tener varias superficies modulares o dominios que desempeñan diferentes funciones (figura 38-19). (No se muestran aquí, pero las proteínas represoras de unión a DNA están organizadas de manera similar con dominios DBD y silenciador separables). El propósito primario de estos montajes de complejo es facilitar el montaje, o la actividad, o ambos, del aparato de transcripción basal en el promotor cis-enlazado (capítulo 36).

Además de la transcripción, las células eucarióticas emplean diversos mecanismos para regular la expresión de gen (cuadro 38-4). Participan muchos más pasos en la expresión de genes eucarióticos, especialmente en el procesamiento del RNA, que en la de genes procarióticos, y tales etapas proporcionan sitios adicionales para influencias reguladoras que no pueden existir en procariotas. Estos pasos de procesamiento del RNA en eucariotas, descrito en detalle en el capítulo 36, comprenden cubierta de los extremos 5′ de las transcripciones primarias, adición de una cola de poliadenilato a los extremos 3′ de transcripciones, y escisión de regiones intrón para generar exones empalmados en la molécula de mRNA maduro. Hasta la fecha, los análisis de expresión de gen eucariótico proporcionan evidencia de que ocurre regulación en el ámbito de la transcripción, el procesamiento de RNA nuclear, la estabilidad de mRNA, y la traducción. Además, la amplificación y el reordenamiento de gen influyen sobre la expresión de gen.

Debido al advenimiento de la tecnología de DNA recombinante y a la secuenciación de DNA y RNA de alto rendimiento (capítulo 39), en los años recientes se ha hecho mucho progreso en el entendimiento de la expresión de gen eucarionte. Sin embargo, dado que la mayor parte de los organismos eucarióticos contiene mucho más información genética que los procariotas, y puesto que la manipulación de sus genes es mucho más difícil, los aspectos moleculares de la regulación de gen eucariótico se entienden menos bien que los ejemplos que se comentaron antes en este capítulo. En esta sección se describen de manera breve algunos tipos diferentes de regulación de gen eucariótico.

Los ncRNA modulan la expresión de gen al alterar la función del mRNA

Como se resalta en el capítulo 35, la clase de RNA no codificantes eucariontes omnipresentes recién descubierta, denominada mi/siRNA e lncRNA contribuye de manera importante al control de la expresión de gen. El mecanismo de acción del miRNA y del siRNA se entiende mejor. Estos RNA de ∽ 22 nucleótidos regulan la función/expresión de mRNA específicos al inhibir la traducción o inducir degradación de mRNA por medio de diferentes mecanismos; en muy pocos casos se ha mostrado que los miRNA simulan la función del mRNA. Se cree que al menos una parte de la modulación de la actividad de mRNA impulsada por miRNA ocurre en el cuerpo P (figura 37-11). La acción de miRNA puede dar por resultado cambios notorios de la producción de proteína y, por ende, de la expresión de gen. Esos pequeños miRNA han quedado implicados en muchas enfermedades de humanos, como enfermedad del corazón, cáncer, emaciación muscular, infección viral y diabetes.

Los miRNA y siRNA, al igual que los factores de transcripción de unión a DNA descritos con detalle antes, tienen actividad trans, y una vez sintetizados y procesados de manera apropiada, interactúan con proteínas específicas y se unen a mRNA blanco (figura 36-17). La unión de miRNA a blancos de mRNA está dirigida por reglas de formación de pares de bases normales. En general, si la formación de par de base de miRNA-mRNA tiene uno o más errores de emparejamiento, la traducción del mRNA “blanco” cognado se inhibe, mientras que si la formación de pares de base de miRNA-mRNA es perfecta en los 22 nucleótidos, el mRNA correspondiente se degrada.

Dada la enorme y siempre creciente importancia de los miRNA, muchos científicos y compañías de biotecnología estudian de manera activa la biogénesis, el transporte y la función de miRNA con la esperanza de curar enfermedades en humanos. El tiempo dirá la magnitud y universalidad de la regulación de gen mediada por miRNA.

Los genes eucarióticos se pueden amplificar o reordenar durante el desarrollo o en respuesta a fármacos

Durante el desarrollo temprano de metazoarios, hay un aumento repentino de la necesidad de moléculas específicas, como moléculas de RNA ribosómico y RNA mensajero para proteínas que constituyen tipos de tejido o celulares específicos. Una manera de aumentar el índice al cual pueden formarse esas moléculas es incrementar el número de genes disponibles para la transcripción de estas moléculas específicas. Entre las secuencias de DNA repetitivas dentro del genoma figuran cientos de copias de genes que codifican para RNA ribosómico. Estos genes preexisten de manera repetitiva en el DNA de los gametos y, así, se transmiten en altos números de copias de una generación a otra. En algunos organismos específicos, como la mosca de la fruta (Drosophila), ocurre durante la oogénesis una amplificación de algunos genes preexistentes como los que codifican para las proteínas del corion (cascarón de huevo). Después, estos genes amplificados, probablemente generados por un proceso de inicios repetidos durante la síntesis de DNA, proporcionan múltiples sitios para la transcripción de gen (figuras 36-4 y 38-20). El lado oscuro de la amplificación de gen específico es el hecho de que en células humanas puede aparecer resistencia a fármacos luego de tratamiento terapéutico prolongado debido a la amplificación y expresión aumentada de genes que codifican para proteínas que degradan, o bombean, fármacos para células blanco.

Como se explica en el capítulo 36, las secuencias codificadoras de las cuales depende la generación de moléculas de proteína específicas, a menudo son no contiguas en el genoma de mamífero. En el caso de genes que codifican para anticuerpo, esto es particularmente cierto. Como se describe a detalle en el capítulo 52, las inmunoglobulinas están compuestas de dos polipéptidos, las llamadas cadena pesada (de alrededor de 50 kDa) y ligera (de unos 25 kDa). Los mRNA que codifican para estas dos subunidades proteínicas están codificados por secuencias de gen sujetas a extensos cambios de codificación de la secuencia de DNA. Estos cambios de codificación de DNA son esenciales para generar la diversidad de reconocimiento indispensable fundamental para la función inmunitaria apropiada.

Los mRNA que codifican para cadenas pesada y ligera de IgG son codificados por varios segmentos diferentes que se repiten en tándem en la línea germinal. Así, por ejemplo, la cadena ligera de IgG está compuesta de dominios o segmentos variable (V_L), de unión (J_L) y constante (C_L). Para subgrupos particulares de cadenas ligeras de IgG, hay aproximadamente 300 segmentos codificadores de gen V_L repetidos en tándem, cinco secuencias codificadoras J_L dispuestas en tándem, y alrededor de 10 segmentos codificadores de gen C_L. Todas estas regiones codificadoras múltiples, separadas, están ubicadas en la misma región del mismo cromosoma, y cada tipo de segmento codificador (V_L, J_L y C_L) se repite en tándem de manera cabeza a cola dentro de la región de repetición de segmento. Al tener múltiples segmentos V_L, J_L y C_L a partir de los cuales elegir, una célula inmunitaria tiene un repertorio mayor de secuencias con las cuales trabajar para desarrollar tanto flexibilidad como especificidad inmunitaria. Sin embargo, una unidad de transcripción de cadena ligera de IgG funcional dada (al igual que todas las otras unidades de transcripción de mamífero “normales”) sólo contiene las secuencias codificadoras para una proteína única. De este modo, antes de que pueda expresarse una cadena ligera de IgG particular, deben recombinarse secuencias codificadoras V_L, J_L y C_L únicas para generar una unidad de transcripción contigua, única, con exclusión de los múltiples segmentos no utilizados (esto es, los otros alrededor de 300 segmentos V_L, los otros cuatro segmentos J_L, y los otros nueve segmentos C_L, no usados). Esta deleción de información genética no usada se logra mediante recombinación de DNA selectiva que elimina el DNA codificador no deseado, mientras que retiene las secuencias codificadoras requeridas: una secuencia V_L, una J_L, y una C_L. (Las secuencias V_L están sujetas a mutagénesis puntual adicional para generar aún más variabilidad —de ahí el nombre—). De esta manera, las secuencias recién recombinadas forman una unidad de transcripción única que es competente para la transcripción mediada por RNA polimerasa II hacia un mRNA monocistrónico único. Si bien los genes IgG representan uno de los casos mejor estudiados de reordenamiento de DNA dirigido que modula la expresión genética, en la literatura médica se han descrito otros casos de reordenamiento de DNA regulador de gen.

El procesamiento de RNA alternativo es otro mecanismo de control

Además de afectar la eficiencia de la utilización de promotor, las células eucarióticas emplean procesamiento de RNA alternativo para controlar la expresión de gen. Esto puede ocurrir cuando se usan promotores, sitios de empalme de intrón-exón, o sitios de poliadenilación, alternativos. En ocasiones sobreviene heterogeneidad dentro de una célula, pero con mayor frecuencia la misma transcripción primaria se procesa de manera diferente en distintos tejidos. A continuación se presentan algunos ejemplos de cada uno de estos tipos de regulación.

El uso de sitios de inicio de la transcripción alternativos origina un exón 5′ diferente en mRNA que codifica para amilasa y cadena ligera de miosina de ratón, glucocinasa de rata, y alcohol deshidrogenasa y actina de Drosophila. Los sitios de poliadenilación alternativos en la transcripción primaria de cadena pesada de inmunoglobulina μ dan por resultado mRNA que tienen 2 700 bases (μ_m) o 2 400 bases (μ_s) de largo. Esto produce una región carboxilo terminal diferente de las proteínas codificadas, de modo que la proteína μ_m permanece fija a la membrana del linfocito B, y la inmunoglobulina μ_s se secreta. El empalme y procesamiento alternativos dan por resultado la formación de siete mRNA que codifican para α-tropomiosina únicos en siete tejidos diferentes. No está claro de qué modo se toman estas decisiones de procesamiento-empalme o si estos pasos se pueden regular.

La regulación de la estabilidad de RNA mensajero proporciona otro mecanismo de control

Aunque casi todos los mRNA en células de mamífero son muy estables (vida media que se mide en horas), algunos se recambian con mucha rapidez (vida media de 10 a 30 minutos). En ciertas circunstancias, la estabilidad del mRNA se encuentra sujeta a regulación, lo cual tiene inferencias importantes puesto que por lo general hay una relación directa entre la cantidad de mRNA y la traducción de ese mRNA hacia su proteína cognada. Por ende, los cambios de la estabilidad de un mRNA específico pueden tener efectos importantes sobre procesos biológicos.

Los RNA mensajeros existen en el citoplasma como partículas de ribonucleoproteína (RNP). Algunas de estas proteínas protegen al mRNA contra digestión por nucleasas, mientras que otras, en ciertas condiciones, pueden promover el ataque por nucleasa. Se cree que los mRNA se estabilizan o desestabilizan por la interacción de proteínas con estas diversas estructuras o secuencias. Ciertos efectores, como las hormonas, pueden regular la estabilidad del mRNA al aumentar o disminuir la cantidad de estas proteínas.

Parece ser que los extremos de moléculas de mRNA participan en la estabilidad del mRNA (figura 38-21). La estructura de cubierta 5′ en el mRNA eucariótico evita ataque por 5′ exonucleasas, y la cola poli(A) impide la acción de 3′ exonucleasas. En moléculas de mRNA que tienen esas estructuras, se cree que un corte endonucleolítico único permite que las exonucleasas ataquen y digieran toda la molécula. Se cree que otras estructuras (secuencias) en la región 5′ no traducida (UTR 5′), la región codificadora, y el UTR 3′ favorecen o impiden esta acción endonucleolítica inicial (figura 38-21). A continuación se citan algunos ejemplos ilustrativos.

La deleción del UTR 5′ da por resultado una prolongación de tres a cinco veces la vida media del mRNA c-myc. El acortamiento de la región del mRNA que codifica para histona da por resultado una vida media prolongada. Una forma de autorregulación de la estabilidad del mRNA involucra de manera indirecta la región codificadora. La tubulina libre se une a los primeros cuatro aminoácidos de una cadena naciente de tubulina a medida que surge desde el ribosoma. Esto parece activar a una RNasa relacionada con el ribosoma, que después digiere el mRNA que codifica para tubulina.

Las estructuras en el extremo 3′, incluso la cola poli(A), aumentan o disminuyen la estabilidad de mRNA específicos. La ausencia de una cola poli(A) se relaciona con degradación rápida de mRNA y la eliminación de poli(A) desde algunos RNA suscita su desestabilización. Los mRNA que codifican para histona carecen de una cola poli(A) pero tienen una secuencia cerca de la terminal 3′ que puede formar una estructura en forma de tallo-asa, y esto parece proporcionar resistencia al ataque exonucleolítico. El mRNA que codifica para histona H4, por ejemplo, se degrada en la dirección 3′ a 5′, pero sólo después de que ocurre un corte endonucleolítico único a unos nueve nucleótidos del extremo 3′ en la región de la estructura de tallo-asa putativa. Las estructuras de tallo-asa en la secuencia no codificadora 3′ también son cruciales para la regulación, por hierro, del mRNA que codifica para el receptor de transferrina. Las estructuras en tallo-asa también se relacionan con la estabilidad del mRNA en bacterias, lo que sugiere que este mecanismo quizá sea común.

Otras secuencias en los extremos 3′ de ciertos mRNA eucarióticos parecen estar involucradas en la desestabilización de estas moléculas. Como se comentó, parte de esto está mediado por la acción de miRNA específicos. Además, despiertan particular interés las regiones ricas en AU, muchas de las cuales contienen la secuencia AUUUA. Esta secuencia aparece en mRNA que tienen vida media muy breve, entre ellos algunos que codifican para proteínas oncogén y citocinas. La importancia de esta región es subrayada por un experimento en el cual una secuencia que corresponde al UTR 3′ del mRNA que codifica para el factor estimulante de colonia (CSF) de vida breve, que contiene un motivo AUUUA, se añadió al extremo 3′ del mRNA que codifica para la globina β. En lugar de hacerse muy estable, este mRNA que codifica para globina β híbrido ahora tuvo la vida media breve característica del mRNA que codifica para el CSF. Gran parte de este metabolismo del mRNA quizá ocurre en los cuerpos P citoplásmicos.

A partir de los ejemplos citados, está claro que se usan varios mecanismos para regular la estabilidad y, por ende, la función, del mRNA, del mismo modo que se emplean varios mecanismos para regular la síntesis de mRNA. La regulación coordinada de estos dos procesos confiere notoria adaptabilidad a la célula.

• Casi todas las constituciones genéticas de células somáticas de metazoario son idénticas.

• El fenotipo (especificidad de tejido o célula) está dictado por diferencias de la expresión de gen de la totalidad de estos genes.

• Las alteraciones de la expresión de gen permiten a una célula adaptarse a cambios ambientales, indicios vinculados con el desarrollo y señales fisiológicas.

• La expresión de gen puede controlarse en múltiples niveles por cambios en la transcripción, el procesamiento de RNA, la ubicación, y la estabilidad o utilización. La amplificación y los reordenamientos de gen también influyen sobre la expresión de gen.

• Los controles de la transcripción operan en el ámbito de interacciones entre proteína y DNA, y entre una proteína y otra. Estas interacciones despliegan modularidad y especificidad alta de dominio de proteína.

• En factores de transcripción se han identificado varias clases diferentes de dominios de unión a DNA.

• Las modificaciones de cromatina y DNA contribuyen de manera importante en el control de la transcripción eucariótica al modular la accesibilidad al DNA y especificar el reclutamiento de coactivadores y correpresores específicos hacia genes blanco.

• Se han descrito varios mecanismos epigenéticos para el control de gen, y los mecanismos moleculares mediante los cuales operan estos procesos están empezando a elucidarse en el ámbito molecular.

• miRNA y siRNA modulan la traducción y la estabilidad del mRNA; estos mecanismos complementan controles de la transcripción para regular la expresión de gen.