CAPÍTULO 39: Genética molecular, DNA recombinante y tecnología genómica

El desarrollo del DNA recombinante, los microarreglos de DNA de alta densidad, la investigación de alta capacidad de procesamiento, los análisis de bajo costo a escala de genoma, así como la secuenciación de DNA y otras metodologías de genética molecular, han revolucionado la biología y cada vez tienen más repercusiones sobre la medicina clínica. Aun cuando se ha aprendido mucho acerca de la enfermedad genética en humanos a partir del análisis de árbol genealógico y el estudio de las proteínas afectadas, estos métodos no pueden usarse en muchos casos en los cuales se desconoce el defecto genético específico. Las nuevas tecnologías sortean estas limitaciones al ir de forma directa a la molécula de DNA para obtener información. La manipulación de una secuencia de DNA y la construcción de moléculas quiméricas (la denominada ingeniería genética) proporcionan un medio para estudiar cómo funciona un segmento de DNA. Los nuevos recursos de genética bioquímica y molecular y la secuenciación directa de DNA permiten a los investigadores hacer preguntas y manipular secuencias genómicas, así como examinar el complemento entero de perfiles tanto de RNA como de proteínas celulares y el estatus PTM proteínico en el ámbito molecular.

El entendimiento de esta tecnología tiene importancia por varias razones: 1) ofrece un método racional para entender la base molecular de diversas enfermedades, por ejemplo, la hipercolesterolemia familiar, la enfermedad de células falciformes, las talasemias, fibrosis quística, distrofia muscular, así como enfermedades multifactoriales más complejas, como enfermedad vascular y cardiaca, enfermedad de Alzheimer, cáncer, obesidad y diabetes. 2) Es posible producir proteínas de humano en abundancia para terapia (p. ej., insulina, hormona de crecimiento, activador del plasminógeno hístico). 3) Pueden obtenerse proteínas para vacunas (p. ej., hepatitis B) y para pruebas diagnósticas (p. ej., análisis para ébola y síndrome de inmunodeficiencia adquirida [AIDS]). 4) Esta tecnología se usa para diagnosticar enfermedades existentes y predecir el riesgo de aparición de una enfermedad dada y la respuesta individual a la farmacoterapia. 5) Técnicas especiales han llevado a notorios avances en medicina forense. 6) Es factible idear terapia génica para, en potencia, curar enfermedades causadas por una deficiencia de un gen único, como la enfermedad de células falciformes, las talasemias, la deficiencia de adenosina desaminasa, entre otras.

El aislamiento y la manipulación de DNA, incluso unión término-terminal de secuencias de fuentes muy distintas para hacer moléculas quiméricas (p. ej., moléculas que contienen secuencias de DNA tanto de ser humano como bacterianas de un modo independiente de secuencia), es la esencia de la investigación del DNA recombinante. Esto incluye varias técnicas y reactivos únicos.

Las enzimas de restricción cortan cadenas de DNA en ubicaciones específicas

Ciertas endonucleasas (enzimas que cortan el DNA en secuencias de DNA específicas dentro de la molécula [en contraposición con las exonucleasas, que digieren desde los extremos de las moléculas de DNA]) son un recurso clave en la investigación del DNA recombinante. Estas enzimas se llamaron enzimas de restricción porque su presencia en una bacteria dada restringió (es decir, previno) el crecimiento de ciertos virus de bacterias denominados bacteriófagos. Las enzimas de restricción cortan el DNA de cualquier fuente en fragmentos cortos únicos de una manera específica para secuencia, en contraste con casi todos los otros métodos enzimáticos, químicos o físicos, que rompen el DNA al azar. Estas enzimas defensivas (se han descubierto cientos) protegen al DNA de la bacteria huésped contra el genoma de DNA de organismos extraños (sobre todo fagos infecciosos) al desactivar de modo específico el DNA del fago invasor por medio de digestión. El sistema de interferón inducible por RNA viral (capítulo 38, figura 38-11) proporciona la misma clase de defensa molecular contra virus RNA en células de mamífero. Sin embargo, las endonucleasas de restricción sólo están presentes en células que también tienen una enzima acompañante que metila de manera específica para sitio el DNA huésped; ello lo hace un sustrato no idóneo para digestión por esa enzima de restricción particular. Así, DNA metilasas específicas para sitio y enzimas de restricción que se dirigen a los mismos sitios exactos siempre existen en pares en una bacteria.

Las enzimas de restricción se denominan con base en la bacteria a partir de la cual fueron aisladas. Por ejemplo, EcoRI proviene de Escherichia coli, y BamHI, de Bacillus amyloliquefaciens (cuadro 39-1). Las primeras tres letras del nombre de la enzima de restricción constan de la primera letra del género (E) y las primeras dos letras de la especie (co); éstas pueden ir seguidas por designación de cepa (R) y un número romano (I) para indicar el orden de descubrimiento (p. ej., EcoRI, EcoRII). Cada enzima reconoce y divide una secuencia de DNA bicatenario específica que típicamente tiene 4 a 7 bp de largo. Estos cortes en el DNA dan por resultado extremos romos (p. ej., HpaI) o que se superponen (pegajosos o cohesivos) (p. ej., BamHI) (figura 39-1), según el mecanismo usado por la enzima. Los extremos pegajosos son en especial útiles para construir moléculas de DNA híbridas o quiméricas (véase más adelante). Si los cuatro nucleótidos están distribuidos al azar en una molécula de DNA dada, es posible calcular la frecuencia con la cual una enzima dada cortará un tramo de DNA. Para cada posición en la molécula de DNA, hay cuatro posibilidades (A, C, G y T); en consecuencia, una enzima de restricción que reconoce una secuencia de 4 bp, corta, en promedio, una vez cada 256 bp (4⁴), mientras que otra enzima que reconoce una secuencia de 6 bp, corta una vez cada 4 096 bp (4⁶). Un fragmento dado de DNA tiene una disposición lineal característica de sitios para las diversas enzimas, dictada por la secuencia lineal de sus bases; por ende, es posible construir un mapa de restricción. Cuando el DNA se digiere con una enzima particular, los extremos de todos los fragmentos tienen la misma secuencia de DNA. Los fragmentos producidos se pueden aislar mediante electroforesis en gel de agarosa o de poliacrilamida (véase la exposición de la electrotransferencia, más adelante); éste es un paso esencial en la clonación del DNA, así como en diversos análisis de DNA y un uso importante de estas enzimas.

Varias otras enzimas que actúan sobre el DNA y RNA son una parte importante de la tecnología de DNA recombinante. Se hace referencia a muchas de éstas en este capítulo y en otros subsiguientes (cuadro 39-2).

Las enzimas de restricción, endonucleasas, recombinasas y la DNA ligasa se usan para modificar y preparar moléculas de DNA quiméricas

La ligadura de extremo pegajoso o cohesivo complementario de fragmentos de DNA es fácil desde el punto de vista técnico, pero suelen requerirse algunas técnicas particulares para superar problemas inherentes en este método. Los extremos pegajosos de un vector pueden reconectarse consigo mismos, sin ganancia neta de DNA. Los extremos pegajosos de fragmentos también se renaturalizan de manera que se forman insertos en tándem heterogéneos. Asimismo, los sitios de extremo pegajoso quizá no estén disponibles o en una posición conveniente. Para sortear estos problemas, es factible emplear una enzima que genera extremos romos, mismos que se pueden ligar de modo directo; empero, la ligadura no es direccional. De esta manera, hay dos alternativas: se añaden nuevos extremos usando la enzima terminal transferasa o se añaden extremos pegajosos sintéticos. Si se añade poli d(G) a los extremos 3′ del vector, y se adiciona poli d(C) a los extremos 3′ del DNA extraño usando terminal transferasa, las dos moléculas únicamente pueden renaturalizarse una con otra, lo que sortea los problemas antes listados. Este procedimiento recibe el nombre de colocación de cola de homopolímero. De modo alternativo, enlazadores de oligonucleótido dúplex, con extremo romo, sintéticos, que contienen la secuencia de reconocimiento para una secuencia de enzima de restricción conveniente, se ligan al DNA con extremo romo. La ligadura de extremo romo directa se logra usando la enzima bacteriófago T4 DNA ligasa. Esta técnica, si bien es menos eficiente que la ligadura de extremo pegajoso, plantea la ventaja de unir cualesquiera pares de extremos. Si se usan métodos de extremos romos o de colocación de cola de homopolímero, no hay una manera fácil de recuperar el inserto. De manera alternativa, pueden añadirse terminaciones cohesivas apropiadas mediante el uso de amplificación con PCR (véase más adelante).

Como un adjunto para el uso de endonucleasas de restricción, los científicos han empezado a utilizar recombinasas procariontes o eucariontes específicas, como los sitios lox P bacterianos, que son reconocidos por la recombinasa CRE, bacteriófago λ en sitios reconocidos por la proteína INT codificada por el fago λ, o sitios FRT de levadura reconocidos por la recombinasa Flp de levadura. Todos estos sistemas de recombinasa catalizan la incorporación específica de dos fragmentos de DNA que portan las secuencias de reconocimiento apropiadas y llevan a cabo recombinación homóloga (figura 35-9) entre los sitios de reconocimiento relevantes. En fecha muy reciente, se ha desarrollado un nuevo sistema de edición de DNA/regulador de gen denominado CRISPR-Cas9 (gen 9 asociado con repeticiones palindrómicas cortas intercaladas regularmente agrupadas [Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats]-CRISPR). El sistema CRISPR, que se encuentra en muchas bacterias, representa una forma de inmunidad adquirida a infección por bacteriófagos, que complementa el sistema de endonucleasas de restricción y metilasas antes descrito. En el CRISPR se usa direccionamiento basado en RNA para llevar la nucleasa Cas9 a DNA extraño (o cualquier DNA complementario). Dentro de bacterias este complejo de CRISPR-RNA-Cas9 a continuación degrada el DNA direccionado (establecido como objetivo) y lo desactiva. El sistema CRISPR se ha adaptado para uso en células eucariontes, incluso células de ser humano. Las variaciones en el uso de CRISPR permiten deleción de gen, edición de gen, e incluso modulación de la transcripción de gen. De este modo, el CRISPR ha añadido una interesante tecnología nueva, muy eficiente y muy específica, a la caja de herramientas de métodos para el análisis genético de células de mamífero. Son notables las similitudes del direccionamiento dirigido por RNA CRISPR-Cas y el método de desactivación de gen y represión (mediada por mi/siRNA) de la expresión en eucariontes superiores.

La clonación amplifica el DNA

Una clona es una población grande de moléculas, bacterias o células idénticas que surgen a partir de un ancestro común. La clonación molecular permite la producción de un gran número de moléculas de DNA idénticas, que a continuación se caracterizan o se usan para otros propósitos. Esta técnica se basa en el hecho de que moléculas de DNA quiméricas o híbridas pueden construirse en vectores de clonación (típicamente plásmidos, fagos o cósmidos bacterianos) que después se siguen replicando en una célula huésped bajo sus propios sistemas de control. De este modo, el DNA quimérico se amplifica. El procedimiento general se ilustra en la figura 39-2.

Los plásmidos bacterianos son moléculas de DNA pequeñas, circulares, dúplex, cuya función natural es conferir resistencia a antibiótico a la célula huésped. Los plásmidos tienen varias propiedades que los hacen en extremo útiles como vectores de clonación. Existen como copias únicas o múltiples dentro de la bacteria y se replican de manera independiente del DNA bacteriano como epísomas (es decir, un genoma por encima o afuera del genoma bacterial) mientras usan en forma primordial la maquinaria de replicación del huésped. Se conoce la secuencia de DNA completa de cientos a miles de plásmidos; por consiguiente, se dispone de la ubicación precisa de sitios de división de enzima de restricción para insertar el DNA extraño. Los plásmidos son de menor tamaño que el cromosoma del huésped y, por tanto, se separan con facilidad de este último, y el DNA insertado en plásmido deseado se elimina con facilidad al cortar el plásmido con la enzima específica para el sitio de restricción en el cual se insertó el fragmento original de DNA.

Los fagos (virus de bacterias) por lo general tienen moléculas de DNA lineales en las que puede insertarse DNA extraño en varios sitios de enzima de restricción. El DNA quimérico se recolecta luego de que el fago procede por su ciclo lítico y produce partículas de fago infecciosas, maduras. Una ventaja importante de los vectores fago es que mientras que los plásmidos aceptan fragmentos de DNA de alrededor de 10 kb de largo, los fagos pueden aceptar fragmentos de DNA de 10 a 20 kb de largo, limitación impuesta por la cantidad de DNA que puede aglomerarse en la cabeza del fago durante la propagación del virus.

Fragmentos de mayor tamaño de DNA se pueden clonar en cósmidos, que combinan las mejores características de los plásmidos y los fagos. Los cósmidos son plásmidos que contienen las secuencias de DNA, denominadas sitios cos, necesarias para aglomerar DNA del bacteriófago lambda hacia la partícula fago. Estos vectores crecen en la forma de plásmido en bacterias, pero dado que se ha eliminado gran parte del DNA lambda innecesario, puede aglomerarse más DNA quimérico en la cabeza de la partícula. Con cierta frecuencia los cósmidos portan insertos de DNA quimérico que tienen 35 a 50 kb de largo. Pueden incorporarse fragmentos de DNA de tamaño aún mayor hacia cromosoma artificial bacteriano (BAC), cromosoma artificial de levadura (YAC) o vectores basados en P1 (PAC) de bacteriófago de E. coli. Estos vectores aceptarán y propagarán insertos de DNA de varios cientos de kilobases o más, y en su mayor parte han reemplazado a los vectores plásmido, fago y cósmido para algunas aplicaciones de clonación y mapeo de gen eucariótico. En el cuadro 39-3 se comparan estos vectores.

Puesto que la inserción de DNA hacia una región funcional del vector interferirá con la acción de esta región, es necesario tener cuidado de no interrumpir una función esencial del vector. Con todo, este concepto se puede explotar para proporcionar una técnica de selección. Por ejemplo, un reactor plásmido temprano común pBR322 tiene genes que codifican para resistencia tanto a tetraciclina (tet) como a ampicilina (amp). Un sitio de enzima de restricción PstI único dentro del gen que codifica para resistencia a AMP a menudo se usa como el sitio de inserción para un fragmento de DNA extraño. Además de tener extremos pegajosos (cuadro 39-1 y figura 39-1), el DNA insertado en este sitio altera el gen que codifica para resistencia a ampicilina (bla) y hace a la bacteria que porta este plásmido sensible a amp. Así, las células que portan el plásmido padre, que proporciona resistencia a ambos antibióticos, pueden distinguirse y separarse con facilidad de las células que portan el plásmido quimérico, que sólo es resistente a tetraciclina (figura 39-3). Los YAC contienen funciones de selección, replicación y segregación que actúan tanto en bacterias como en células de levadura y, en consecuencia, pueden propagarse en uno u otro organismo.

Además de los vectores descritos en el cuadro 39-3, diseñados principalmente para propagación en células bacterianas, se han creado vectores para propagación en células de mamífero y para insertar expresión de gen (cDNA)/proteína. Todos estos vectores se basan en diversos virus eucarióticos que están compuestos de genomas de RNA o DNA. Los ejemplos notables de esos vectores virales son los que utilizan genomas adenovirales (Ad), o virales asociados con adenovirus (AAV) (basados en DNA) y retrovirales (basados en RNA). Aunque un poco limitados en el tamaño de secuencias de DNA que pueden insertarse, esos vectores de clonación de virus de mamífero compensan este punto débil porque infectarán con eficiencia una amplia gama de diferentes tipos de célula. Por esta razón, diversos vectores virales de mamíferos, algunos con genes de selección tanto positiva como negativa (también conocidos como “marcadores” seleccionables) como se mencionó para pBR322, se están investigando para uso en terapia génica y se usan comúnmente para experimentos de laboratorio.

Una biblioteca es una colección de clonas recombinantes

La combinación de enzimas de restricción y diversos vectores de clonación permite que todo el genoma de un organismo se aglomere de forma individual en un vector. Una colección de estas clonas recombinantes diferentes se llama biblioteca. Una biblioteca genómica se prepara a partir del DNA total de una línea celular o un tejido. Una biblioteca de cDNA comprende copias de DNA complementarias de la población del mRNA en un tejido. Las bibliotecas de DNA genómicas suelen prepararse al efectuar digestión parcial del DNA total con una enzima de restricción que corta DNA con frecuencia (p. ej., un cortador de cuatro bases como TaqI). La idea es generar más bien fragmentos grandes de modo que casi todos los genes se dejarán intactos. Se prefieren los vectores BAC, YAC y P1 porque pueden aceptar fragmentos muy grandes de DNA y, de esta manera, ofrecen una mejor oportunidad de aislar un gen que codifica para mRNA eucariótico intacto en un fragmento de DNA único.

Un vector en el cual en realidad se sintetiza la proteína codificada por el gen introducido por medio de tecnología de DNA recombinante se conoce como un vector de expresión. Esos vectores ahora suelen usarse para detectar moléculas de cDNA específicas en bibliotecas y producir proteínas mediante técnicas de ingeniería genética. Estos vectores están construidos en especial para contener promotores inducibles muy activos, codones de inicio de la traducción en fase apropiados, señales de terminación tanto de la transcripción como de la traducción, y señales de procesamiento de proteína apropiadas, si es necesario. Algunos vectores de expresión incluso contienen genes que codifican para inhibidores de proteasa, de modo que el rendimiento final del producto aumenta. Es interesante que conforme el costo de las síntesis de DNA sintético ha disminuido, muchos investigadores a menudo sintetizan un cDNA completo (gen) de interés (en segmentos de 100 a 150 nt) que incorpora las preferencias de codón del huésped usado para la expresión con el fin de maximizar la producción de proteína. Una mayor eficiencia en la síntesis de DNA sintético ahora permite la síntesis de novo de genes e incluso genomas completos. Estos avances marcan el comienzo de nuevas e interesantes posibilidades en la biología sintética, mientras que al mismo tiempo introducen dilemas éticos potenciales.

Las sondas buscan bibliotecas o muestras complejas para genes o moléculas de cDNA específicos

Diversas moléculas pueden emplearse para “sondear” bibliotecas en la búsqueda de un gen o una molécula de cDNA específico o definir y cuantificar DNA o RNA separado por medio de electroforesis mediante diversos geles. Las sondas regularmente son fragmentos de DNA o RNA marcados con un nucleótido que contiene ³²P, o nucleótidos marcados con fluorescencia (más a menudo ahora). Es importante señalar que ni una ni otra modificación (marcado con ³²P o fluorescente) afecta las propiedades de hibridación de las sondas de ácido nucleico marcadas resultantes. Para que sea eficaz, es necesario que la sonda reconozca una secuencia complementaria. Un cDNA sintetizado a partir de un mRNA específico (u oligonucleótido sintético) puede usarse para investigar una biblioteca de cDNA para buscar un cDNA de mayor tamaño, o una biblioteca genómica para buscar una secuencia complementaria en la región codificadora de un gen. Las sondas de cDNA/oligonucleótidos/cRNA se usan para detectar fragmentos de DNA en las electrotransferencias Southern, y para detectar y cuantificar RNA en electrotransferencias Northern (véase después).

Técnicas de electrotransferencia e hibridación permiten visualización de fragmentos específicos

La visualización de un fragmento de DNA o RNA específico entre los muchos miles de moléculas “contaminantes” en una muestra compleja requiere la convergencia de diversas técnicas, denominadas en conjunto electrotransferencia. En la figura 39-4 se ilustran los procedimientos de electrotransferencia Southern (DNA), Northern (RNA) y Western (proteína). (El primero se denomina en honor a quien ideó la técnica [Edward Southern] y los otros nombres empezaron como jerga de laboratorio, pero ahora son términos aceptados.) Estos procedimientos son útiles para determinar cuántas copias de un gen hay en un tejido dado, o si hay alguna alteración gruesa en un gen (deleciones, inserciones o reordenamientos) porque el paso de electroforesis que constituye un requisito separa las moléculas con base en el tamaño. A veces, si una base específica se cambia y un sitio de restricción se altera, estos procedimientos pueden detectar una mutación puntual (es decir, figura 39-9, abajo). Las técnicas de electrotransferencia Northern y Western se usan para medir y cuantificar moléculas de RNA y proteínas específicas, respectivamente. Una cuarta técnica de hibridación, la electrotransferencia Southwestern, examina interacciones entre proteína y DNA (que no se muestran). En este método, las proteínas se separan por medio de electroforesis, se electrotransfieren a una membrana, se renaturalizan y son analizadas para buscar una interacción con una secuencia particular mediante incubación con una sonda de ácido nucleico marcada específica.

Todos los procesos de hibridación que se comentan en esta sección dependen de las propiedades de formación de pares de bases específicas de cadenas de ácido nucleico complementarias antes descritas. Las coincidencias perfectas se hibridan con facilidad y soportan temperaturas altas en las reacciones de hibridación y lavado. También se forman complejos específicos en presencia de concentraciones bajas de sal. Las coincidencias menos que perfectas no toleran estas condiciones difíciles (es decir, temperaturas altas y concentraciones bajas de sal); de este modo, la hibridación nunca ocurre o queda alterada durante el paso de lavado. Las familias de genes, en las cuales hay cierto grado de homología, pueden detectarse al variar lo riguroso de los pasos de hibridación y lavado. Con este método también pueden hacerse comparaciones de un gen dado a través de especies. Se han ideado condiciones de hibridación capaces de detectar sólo un error de emparejamiento de par de base (bp) única entre la sonda y el blanco.

Hay técnicas manuales y automatizadas para determinar la secuencia de DNA

Los segmentos de moléculas de DNA específicas obtenidas mediante tecnología de DNA recombinante se pueden analizar para determinar su secuencia de nucleótido. Las secuenciación de DNA depende de tener un número grande de moléculas de DNA idénticas; este requisito puede satisfacerse al clonar el fragmento de interés, usando las técnicas antes descritas, o al usar métodos PCR (ver después). En el método enzimático manual de Sanger se emplean desoxinucleótidos específicos que terminan la síntesis de cadena de DNA en nucleótidos específicos a medida que la cadena se sintetiza sobre ácido nucleico plantilla purificado. Las reacciones se ajustan de manera que se obtiene una población de fragmentos de DNA que representan terminación en cada nucleótido. Al tener una marca radiactiva incorporada en el sitio de terminación, es posible separar los fragmentos de acuerdo con el tamaño usando electroforesis en gel de poliacrilamida. Se obtiene una autorradiografía y cada uno de los fragmentos produce una imagen (banda) en una placa de rayos X o una placa de imágenes, las cuales se leen en orden para dar la secuencia de DNA (figura 39-5). Las técnicas que no necesitan el uso de radioisótopos se emplean en la secuenciación de DNA automatizada. Con mayor frecuencia se emplea un procedimiento automatizado en el cual se usan cuatro marcas fluorescentes distintas (una representa cada nucleótido). Cada una emite una señal específica en el momento de la excitación por un haz láser de una longitud de onda particular medida por detectores de densidad, y esto puede registrarse por medio de una computadora. En los aparatos de secuenciación de DNA más nuevos se usan nucleótidos marcados con fluorescencia, pero detectan incorporación usando óptica microscópica. Estos aparatos han disminuido de modo significativo, más de 100 veces, el costo de la secuenciación del DNA; estos decrementos del costo han introducido la era de la secuenciación de genomas personalizada. De hecho, usando esta nueva tecnología se determinó por completo la secuencia del codescubridor de la doble hélice, James Watson.

La síntesis de oligonucleótido ahora es sistemática

Hoy, la síntesis química automatizada de oligonucleótidos moderadamente largos (alrededor de 100 nucleótidos) de secuencia precisa, es un procedimiento de laboratorio sistemático. Cada ciclo de síntesis requiere sólo algunos minutos, de manera que puede hacerse una molécula completa al sintetizar segmentos relativamente cortos que luego se pueden ligar entre sí. Como ya se mencionó, el proceso se ha miniaturizado, y puede ponerse en paralelo de manera importante para permitir la síntesis simultánea de cientos a miles de oligonucleótidos de secuencia definida. Los oligonucleótidos ahora son indispensables para la secuenciación de DNA, las investigaciones de biblioteca, las valoraciones de unión de proteína-DNA, la reacción en cadena de polimerasa (PCR) (véase más adelante), mutagénesis dirigida hacia sitio, síntesis completa de gen sintético, así como síntesis de genoma (bacteriano) completo y muchas otras aplicaciones.

El método de reacción en cadena de polimerasa (PCR) amplifica secuencias de DNA

La PCR es un método para amplificar una secuencia de DNA blanco. El desarrollo de la PCR ha revolucionado las maneras en las cuales pueden estudiarse tanto el DNA como el RNA. La PCR proporciona un medio sensible, selectivo y en extremo rápido de amplificar cualquier secuencia de DNA deseada. La especificidad se basa en el uso de dos cebadores de oligonucleótido que se hibridan a secuencias complementarias en cadenas opuestas de DNA y flanquean la secuencia blanco (figura 39-6). Primero, la muestra de DNA se desnaturaliza por calor (> 90 °C) para separar las dos cadenas de la plantilla de DNA que contiene la secuencia blanco; se permite que los cebadores, añadidos en gran exceso, se hibriden con el DNA (típicamente a 50 a 75 °C), y cada cadena es copiada por una DNA polimerasa, empezando en los sitios de los cebadores en presencia de los cuatro dXTP (de nuevo en gran exceso). Las dos cadenas de DNA sirven, cada una, como una plantilla para la síntesis de nuevo DNA a partir de los dos cebadores. Ciclos repetidos de desnaturalización por calor, hibridación de los cebadores con sus secuencias complementarias, y extensión de los cebadores hibridados con DNA polimerasa, dan lugar a la amplificación exponencial de segmentos de DNA de longitud definida (una duplicación en cada ciclo). La síntesis de DNA es catalizada por una DNA polimerasa estable ante el calor, purificada a partir de una de varias bacterias termófilas diferentes, organismos que crecen entre 70 a 80 °C. Las DNA polimerasas termoestables resisten incubaciones breves a más de 90 °C, temperaturas que se requieren para desnaturalizar por completo el DNA. Estas DNA polimerasas termoestables han hecho posible la automatización de la PCR.

Es posible amplificar secuencias de DNA tan cortas como de 50 a 100 bp y tan largas como de 10 kb por PCR; 20 ciclos proporcionan una amplificación de 10⁶ (esto es, 2²⁰) y 30 ciclos, 10⁹ (2³⁰). Cada ciclo requiere de ≤ 5 a 10 minutos, de modo que incluso moléculas de DNA grandes pueden amplificarse con rapidez. La PCR permite amplificar y analizar el DNA en una sola célula, folículo piloso o espermatozoide. Así, las aplicaciones de la PCR a la medicina forense son obvias. La PCR también se usa para: 1) detectar agentes infecciosos, en especial virus latentes; 2) hacer diagnósticos genéticos prenatales; 3) detectar polimorfismos alélicos; 4) establecer tipos de tejido exactos para trasplantes; 5) estudiar la evolución, usando DNA de muestras arqueológicas; 6) análisis de RNA cuantitativos después de copia de RNA y cuantificación de mRNA por medio del llamado método de RTPCR (copias de cDNA de mRNA generadas mediante una transcriptasa inversa retroviral) o 7) efectuar puntuación de ocupación de proteína-DNA in vivo usando valoraciones de inmunoprecipitación de cromatina (véase más adelante). Cada año se crean nuevas aplicaciones de la PCR.

El aislamiento de un gen que codifica para mRNA específico (alrededor de 1 000 bp) a partir de un genoma entero necesita una técnica que discriminará una parte en un millón. La identificación de una región reguladora que puede tener sólo 10 bp de longitud requiere una sensibilidad de una parte en 3 × 10⁸; una enfermedad como la anemia de células falciformes se origina por un cambio de base único, o una parte en 3 × 10⁹. La tecnología de DNA es lo bastante potente como para lograr todas estas cosas.

El mapeo de gen localiza genes específicos a distintos cromosomas

De este modo, la localización de gen puede definir un mapa del genoma humano: esto ya está produciendo información útil en la definición de enfermedad de humanos. La hibridación de células somáticas y la hibridación in situ son dos técnicas que se usan para lograr esto. En la hibridación in situ, el procedimiento más simple y más directo, se añade una sonda radiactiva a una dispersión de cromosomas en metafase sobre una laminilla de vidrio. El área precisa de hibridación se localiza al colocar capas de emulsión fotográfica sobre la laminilla y, después de exposición, alinear los granos con alguna identificación histológica del cromosoma. La hibridación in situ fluorescente (FISH), en la que se utilizan sondas fluorescentes en lugar de sondas marcadas con radiactividad, es una técnica muy sensible que también se usa para este propósito; esto suele colocar al gen en una ubicación sobre una banda o región dada en el cromosoma. El cuadro 39-4 lista algunos de los genes de humano localizados usando estas técnicas; ahí sólo hay una muestra de genes mapeados, dado que decenas de miles de genes se han mapeado como resultado de la reciente secuenciación del genoma humano. Una vez que el defecto se localiza a una región de DNA que tiene la estructura típica de un gen, puede construirse una copia de cDNA sintética del gen, que únicamente contiene exones codificadores de mRNA, y se expresa en un vector apropiado, y es posible evaluar su función (o puede sintetizarse el péptido putativo, deducido a partir del cuadro de lectura abierto en la región codificadora). Anticuerpos dirigidos contra esta proteína o fragmentos peptídicos derivados de la misma pueden usarse para evaluar si esta proteína es expresada en personas normales, y si falta, o está alterada, en quienes tienen el síndrome genético.

Es posible producir proteínas para investigación, diagnóstico y comercio

Un objetivo práctico de la investigación sobre DNA recombinante es la producción de materiales para aplicaciones biomédicas. Esta tecnología tiene dos méritos, pues puede proporcionar: 1) grandes cantidades de material que no podrían obtenerse mediante métodos de purificación convencionales (p. ej., interferón, factor activador del plasminógeno hístico), y 2) proteínas humanas (p. ej., insulina, hormona de crecimiento). Las ventajas de ambos casos son obvias. Aun cuando el objetivo primario es proporcionar productos (por lo general proteínas) para tratamiento (insulina) y diagnóstico (pruebas para síndrome de inmunodeficiencia adquirida) de enfermedades de seres humanos y otros animales, y para prevención de enfermedad (vacuna contra el virus de la hepatitis B), hay otras aplicaciones comerciales potenciales, sobre todo en la agricultura. Un ejemplo de esto último es el intento de procesar plantas con procedimientos de ingeniería para que sean más resistentes a sequía o temperaturas extremas, tengan más eficiencia para la fijación de nitrógeno, o que produzcan semillas (arroz, trigo, maíz, etc.) que contengan la totalidad de los aminoácidos esenciales.

La tecnología de DNA recombinante se usa en el análisis molecular de enfermedad

Variaciones de gen normales

Hay una variación normal de la secuencia de DNA, de la misma manera que ocurre en otros aspectos más obvios de la estructura del ser humano. Las variaciones de la secuencia de DNA, polimorfismos, ocurren aproximadamente una vez cada 500 a 1 000 nucleótidos. Una comparación reciente de la secuencia de nucleótido del genoma de James Watson, el codescubridor de la estructura del DNA, identificó alrededor de 3 300 000 polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en comparación con el genoma de referencia humano secuenciado inicialmente “estándar”. Despierta interés que más de 80% de los SNP encontrados en el DNA de Watson ya se había identificado en otros individuos. También hay deleciones genómicas e inserciones de DNA (es decir, variaciones del número de copias; CNV), así como sustituciones de base única. En personas sanas, estas alteraciones obviamente suceden en regiones no codificadoras del DNA o en sitios que no se traducen en un cambio de la función de la proteína codificada. Este polimorfismo hereditario de la estructura del DNA puede relacionarse con ciertas enfermedades dentro de una familia grande, y puede emplearse para buscar el gen específico afectado, como se ilustra a continuación. También puede usarse en diversas aplicaciones en medicina forense.

Variaciones de gen que causan enfermedad

En la genética clásica se enseñaba que casi todas las enfermedades genéticas se debían a mutaciones puntuales que daban por resultado una proteína alterada. Esto aún puede ser cierto, pero si en la lectura de capítulos previos se predijo que la enfermedad genética podría sobrevenir por alteración de cualquiera de los pasos que llevan de la replicación a la transcripción y al procesamiento/transporte de RNA y síntesis de proteína, PTM y/o localización subcelular y estado físico (esto es, agregación y polimerización), se habría hecho una evaluación apropiada. Este punto se ilustra de nuevo muy bien por medio del examen del gen que codifica para la globina β; dicho gen está ubicado en una agrupación en el cromosoma 11 (figura 39-7), y en la figura 39-8 se ilustra una versión expandida del gen. La producción defectuosa de globina β causa diversas enfermedades, y se debe a muchas lesiones diferentes en el gen que codifica para la globina β y alrededor del mismo (cuadro 39-5).

Mutaciones puntuales

El ejemplo clásico es la enfermedad de células falciformes, que se produce por mutación de una base única de las 3 × 10⁹ en el genoma, una sustitución de T a A en el DNA, que a su vez suscita un cambio de A a U en el mRNA que corresponde al sexto codón del gen que codifica para la globina β. El codón alterado especifica para un aminoácido diferente (valina en lugar de ácido glutámico), y esto produce una anormalidad estructural de la molécula de globina β lo que conduce a agregación de hemoglobina y que los eritrocitos se conviertan en falciformes. Otras mutaciones puntuales en el gen que codifica para la globina β y alrededor del mismo ocasionan menor producción o, en algunos casos, producción nula, de globina β; la talasemia β es el resultado de estas mutaciones. (Las talasemias se caracterizan por defectos de la síntesis de subunidades de hemoglobina y, de este modo, sobreviene talasemia β cuando hay producción insuficiente de globina β). En la figura 39-8 se ilustra qué mutaciones puntuales que afectan a cada uno de los muchos procesos incluidos en la generación de un mRNA normal (y, por ende, una proteína normal) han quedado implicadas como una causa de talasemia β.

Deleciones, inserciones y reordenamientos de DNA

Estudios de bacterias, virus, levaduras, moscas de la fruta y ahora humanos, muestran que fragmentos de DNA pueden moverse de un lugar a otro dentro de un genoma. La deleción de un fragmento de DNA crucial, el reordenamiento de DNA dentro de un gen, o la inserción o amplificación de un fragmento de DNA dentro de una región codificadora o reguladora, pueden causar cambios de la expresión de gen que dan por resultado enfermedad. De nuevo, un análisis molecular de las talasemias produce muchos ejemplos de estos procesos (en especial deleciones) como causas de enfermedad (figura 39-7). Las agrupaciones del gen que codifica para globina parecen tener propensión particular a esta lesión. Las deleciones en la agrupación de globina α, localizada en el cromosoma 16, suscitan talasemia α. Hay una fuerte asociación étnica para muchas de estas deleciones, de manera que los habitantes del norte de Europa, los filipinos, los sujetos de raza negra, y los pueblos del Mediterráneo tienen diferentes lesiones que producen falta de hemoglobina A y talasemia α.

Podría hacerse un análisis similar para varias otras enfermedades. Las mutaciones puntuales por lo general se definen mediante secuenciación del gen en cuestión, aunque en ocasiones, si la mutación destruye o crea un sitio de enzima de restricción, la técnica de análisis de fragmento de restricción puede emplearse para identificar con exactitud la lesión. Las deleciones o inserciones de DNA de más de 50 bp a menudo se pueden detectar por medio del procedimiento de electrotransferencia Southern, mientras que los análisis basados en PCR pueden detectar cambios mucho más pequeños en la estructura del DNA.

Análisis de ascendencia

La enfermedad de células falciformes proporciona una vez más un excelente ejemplo de cómo la tecnología de DNA recombinante puede aplicarse al estudio de la enfermedad en humanos. La sustitución de T por A en la cadena plantilla de DNA en el gen que codifica para la globina β cambia la secuencia en la región que corresponde al sexto codón desde:

hacia

y destruye un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción MstII (CCTNAGG; denotada por las flechas verticales pequeñas; cuadro 39-1).

Otros sitios de MstII 5′ y 3′ desde este sitio (figura 39-9) no quedan afectados y, así, se cortarán. Por consiguiente, la incubación de DNA de sujetos normales (AA), heterocigotos (AS) y homocigotos (SS) ocasiona tres modelos diferentes en la electrotransferencia Southern (figura 39-9). Esto ilustra de qué modo puede establecerse la ascendencia de DNA usando los principios que se comentan en este capítulo. El análisis de la ascendencia se ha aplicado a diversas enfermedades genéticas, y es más útil en las que se producen por deleciones e inserciones o los más raros casos en los cuales hay afección de un sitio de división de endonucleasa de restricción, como en el ejemplo aquí citado. Esos estudios ahora se facilitan gracias a la reacción de PCR, que amplifica y, por tanto, proporciona suficiente DNA para análisis a partir de sólo algunas células nucleadas.

Diagnóstico prenatal

Si se entiende la lesión genética, y se dispone de una sonda específica, es posible el diagnóstico prenatal. El DNA de células recolectadas a partir de una cantidad tan pequeña como 10 mL de líquido amniótico (o por medio de biopsia de vellosidades coriónicas) puede analizarse mediante electrotransferencia Southern e incluso en volumen pequeño si se utiliza análisis con base en PCR. Un feto con el modelo de restricción AA en la figura 39-9 no tiene enfermedad de células falciformes ni es un portador. Un feto con el modelo SS presentará la enfermedad. Ahora se dispone de sondas para este tipo de análisis de muchas enfermedades genéticas.

Polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP) y polimorfismo de un solo nucleótido (SNP)

Las diferencias en la secuencia de DNA antes citadas pueden dar por resultado variaciones de los sitios de restricción y, de esta manera, de la longitud de los fragmentos de restricción. De modo similar, los polimorfismos de nucleótido único, o SNP, pueden detectarse por medio del método de PCR sensible. Una diferencia hereditaria del modelo de digestión de enzima de restricción (p. ej., una variación del DNA que ocurre en más de 1% de la población general) se conoce como un polimorfismo de longitud de fragmento de restricción, (RFLP). Se han construido mapas extensos de RFLP y SNP del genoma humano. Esto ha resultado útil en el Human Genome Analysis Project, y es un componente de importancia del esfuerzo para entender diversas enfermedades de gen único y multigénicas. Los RFLP se producen por cambios de base única (p. ej., enfermedad de células falciformes), o por deleciones o inserciones (CNV) de DNA hacia un fragmento de restricción (p. ej., las talasemias) y han resultado ser instrumentos diagnósticos útiles. Se han hallado en loci de gen conocidos y en secuencias que no tienen función conocida; de esta manera, los RFLP pueden alterar la función del gen, o pueden no tener consecuencias biológicas manifiestas. Como se mencionó, 80% de los SNP en el genoma de un individuo conocido único ya se habían mapeado de modo independiente mediante los esfuerzos del componente de mapeo de SNP del International HapMap Project y ahora con el complemento de la secuenciación genómica.

Los RFLP y SNP son hereditarios, y se segregan de manera mendeliana. Un uso importante de SNP/RFLP estriba en la definición de enfermedades hereditarias en las cuales se desconoce el déficit funcional. Los SNP/RFLP pueden usarse para establecer grupos de enlace que, a su vez, por medio del proceso de caminata cromosómica, finalmente definirán el locus de la enfermedad. En la caminata cromosómica (figura 39-10), un fragmento que representa un extremo de un pedazo largo de DNA se usa para aislar otro que se superpone pero que extiende el primero. La dirección de la extensión se determina mediante mapeo de restricción, y el procedimiento se repite de modo secuencial en tanto no se obtiene la secuencia deseada. Se dispone en el comercio de colecciones de DNA genómicos del ser humano, BAC- o PAC-clonados mapeados, que se superponen. Los trastornos enlazados con el cromosoma X se prestan en especial al método de caminata cromosómica, porque sólo se expresa un alelo único. En consecuencia, 20% de los RFLP definidos está en el cromosoma X, y existe un mapa de enlace (y de secuencia genómica) completo de este cromosoma. El gen que codifica para el trastorno ligado a X, distrofia muscular tipo Duchenne, se encontró usando RFLP. De manera similar, el defecto en la enfermedad de Huntington se localizó en la región terminal del brazo corto del cromosoma 4, y el defecto que da por resultado enfermedad renal poliquística está enlazado al locus de la globina a en el cromosoma 16. La secuenciación genómica depende de esta “superposición” entre fragmentos de DNA secuenciados para montar secuencias de DNA genómicas completas.

Polimorfismos de DNA microsatélite

Unidades de DNA con repetición en tándem, hereditarias, cortas (2 a 6 bp) suceden aproximadamente 50 000 a 100 000 veces en el genoma humano (capítulo 35). Puesto que ocurren con mayor frecuencia (y en vista de la aplicación sistemática de métodos de PCR sensibles), han comenzado a reemplazar a los RFLP como los loci marcadores para diversas búsquedas en el genoma.

RFLP y VNTR en medicina forense

Los números variables de unidades repetidas en tándem (VNTR) son un tipo frecuente de “inserción” que origina un RFLP. Los VNTR pueden ser hereditarios, en cuyo caso son útiles para establecer asociación genética con una enfermedad en una familia o un clan, o pueden ser singulares para un individuo y, así, servir como una huella digital molecular de esa persona.

Secuenciación directa de DNA genómico

Como se mencionó, avances recientes en la tecnología de secuenciación de DNA, las denominadas plataformas de secuenciación de próxima generación (NGS), han reducido de modo notorio el costo de secuenciación de DNA por cada base. La secuencia inicial del genoma humano costó alrededor de $ 350 000 000 (EU); se estima que el costo de secuenciar el mismo genoma humano diploide de 3 × 10⁹ bp usando las nuevas plataformas de NGS es de < 0.03% del original. Muy recientemente se ha desarrollado la tecnología para permitir la secuenciación del genoma humano por $1 000 (EU). Esta notoria disminución del costo ha estimulado diversas iniciativas internacionales para secuenciar los genomas enteros de miles de individuos de diversos trasfondos raciales y étnicos con el objeto de determinar la magnitud verdadera de polimorfismos de DNA/genoma presentes dentro de la población. La abundante información genética resultante y el costo siempre decreciente de la secuenciación de DNA genómico están incrementando de manera notoria la capacidad para diagnosticar y, finalmente, tratar, enfermedad en humanos. Obviamente, cuando la secuenciación del genoma personal se haga común, habrá cambios notorios en la práctica de la medicina, porque finalmente se harán terapias a la medida para la conformación genética exacta de cada individuo.

Terapia génica y biología de células madre

Las enfermedades causadas por deficiencia de un producto de gen único (cuadro 39-4) se prestan en teoría a terapia de reemplazo. La estrategia es clonar una copia normal del gen relevante (p. ej., el gen que codifica para la adenosina desaminasa) hacia un vector que será captado e incorporado con facilidad hacia el genoma de una célula huésped. Células precursoras de la médula ósea están bajo investigación con este propósito, porque probablemente se volverán a asentar en la médula y se replicarán ahí. El gen introducido empezaría a dirigir la expresión de su producto proteínico, lo cual corregiría la deficiencia en la célula huésped.

Como una alternativa para “reemplazar” genes defectuosos para curar enfermedad en seres humanos, muchos científicos están investigando la viabilidad de identificar y caracterizar células madre pluripotenciales, que tienen la capacidad para diferenciarse hacia cualquier tipo de célula en el cuerpo. Resultados recientes en este campo han mostrado que las células somáticas de ser humano adulto pueden convertirse con facilidad en células madre pluripotenciales inducidas (iPSC) evidentes por medio de transfección con cDNA que codifican para un puñado de factores de transcripción de unión a DNA. Estos avances y otros nuevos en los campos de la terapia génica y la biología de células madre prometen interesantes y nuevas terapias potenciales para curar enfermedades de humanos. Finalmente, la generación de iPSC a partir de células de paciente enfermas también ofrece la oportunidad de crear modelos auténticos para estudios de laboratorio de la base molecular de la enfermedad de humano.

Animales transgénicos

La terapia de reemplazo de gen de células somáticas ya descrita obviamente no se transmitiría hacia la descendencia. Se han ideado otras estrategias para alterar líneas de células germinales, pero sólo se han probado en animales de experimentación. Un cierto porcentaje de genes inyectados hacia un óvulo fecundado de ratón se incorporará hacia el genoma y se hallará en células tanto somáticas como germinales. Se han establecido cientos de animales transgénicos, y éstos son útiles para análisis de efectos específicos para tejido sobre la expresión de gen, y efectos de producción excesiva de productos de gen (p. ej., los del gen que codifica para hormona de crecimiento u oncogenes) y en el descubrimiento de genes involucrados en el desarrollo, proceso que hasta ahora ha sido difícil de estudiar en mamíferos. El método transgénico se ha usado para corregir una deficiencia genética en ratones. Óvulos fecundados obtenidos a partir de ratones con hipogonadismo genético se inyectaron con DNA que contenía la secuencia codificadora para la proteína precursora de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH). Este gen se expresó y reguló normalmente en el hipotálamo de un cierto número de los ratones resultantes, y estos animales fueron normales en todos los aspectos. Su descendencia tampoco mostró datos de deficiencia de GnRH; por ende, ésta es evidencia de expresión del transgén en células somáticas, y de su mantenimiento en células germinales.

Regulación de gen dirigida por alteración o deleción (knockout), añadidura/reemplazo de un gen (knockin), edición y expresión controlada

Varios avances técnicos han permitido la modificación dirigida, precisa, de genes de mamífero. Los métodos exactos usados para someter a procedimientos de ingeniería genética genomas de mamífero han evolucionado a partir de métodos tediosos, de baja eficiencia, basados en selecciones de fármaco positiva y negativa, y recombinación homóloga (deleción [knockout]/añadidura/reemplazo de un gen [knockin)]) al recién descrito sistema CRISPR-Cas9 ya descrito. El objetivo de todos estos métodos es finalmente generar una familia de variantes genéticas de un gen de interés que son: a) un alelo nulo o de pérdida de función completa; b) alelos recesivos, de pérdida de función, y c) en circunstancias ideales, alelos de ganancia de función dominantes. Estas alteraciones genéticas se generan en células madre pluripotentes, que finalmente permiten la introducción y la propagación en organismos modelo enteros (moscas, peces, gusanos, roedores, etc.). Tener las tres de estas variantes genéticas permite el análisis detallado y preciso del mecanismo de acción de cualquier gen. Sin embargo, el análisis genético de muchos genes se complica por el hecho de que su(s) función(es) es (son) esencial(es) para la viabilidad. Para solucionar este problema deben generarse variantes genéticas específicas para tipo de célula o para tejido. Este obstáculo se ha superado mediante el uso de potenciadores específicos para célula y específicos para tejido que pueden impulsar la expresión condicional (esto es, experimentalmente controlada) de las recombinasas de direccionamiento (esto es, CRE-lox) y/o nucleasa (CRISPR-Cas) que generan los genes alterados, alelos nulos o de pérdida o ganancia de función. De manera alternativa, puede generarse pérdida de función seleccionada por medio de expresión de siRNA equivalente para disminuir (knock down) la producción de un producto de gen específico. Estos métodos, en conjunto, permiten pruebas genéticas y bioquímicas sofisticadas de la función de gen, y permiten a los científicos sondear la estructura y función de genes de mamíferos en contextos fisiológicos. Se ha obtenido, y se seguirá obteniendo, significativa información mecanicista molecular, acerca de la causa molecular de enfermedad del humano por medio de estos métodos bioquímicos y otros. ¡Tiempos apasionantes se avecinan!

Establecimiento de perfil de RNA y proteína, y mapeo de interacción proteína-DNA

La revolución “-ómica” del último decenio ha culminado en la determinación de las secuencias completas de nucleótido de decenas de miles de genomas, incluso las de levaduras gemantes y de fisión, muchas bacterias, la mosca de la fruta, el gusano Caenorhabditis elegans, vegetales, el ratón, rata, pollo, mono y, de forma más notable, seres humanos. Se están secuenciando genomas adicionales a un ritmo acelerado. La disponibilidad de toda esta información sobre secuencia de DNA, junto con avances de ingeniería, han llevado al desarrollo de varias metodologías revolucionarias, casi todas las cuales se basan en tecnología de microarreglo de alta densidad o plataformas de secuenciación NGS. En el caso de los microarreglos, ahora es posible depositar miles de secuencias de DNA definidas, conocidas, específicas, en una laminilla estilo portaobjetos para microscopio, u otro soporte inerte, en el espacio de algunos centímetros cuadrados. Al acoplar esos microarreglos de DNA con detección muy sensible de sondas de ácido nucleico marcadas con fluorescencia, hibridadas, derivadas de mRNA, los investigadores pueden generar con rapidez y precisión perfiles de expresión de gen (p. ej., contenido de mRNA celular específico) a partir de muestras de células y de tejidos de tamaño tan pequeño como 1 g o menos. De este modo, en sólo algunos días puede obtenerse con facilidad información de transcriptoma completa (la colección completa de RNA celulares) para esas fuentes célula o tejido. En el caso de la NGS, los mRNA son convertidos en cDNA usando transcripción inversa, y estos cDNA son amplificados mediante PCR y secuenciados de manera directa; este método se denomina RNA-Seq; tales métodos permiten la descripción cuantitativa de todo el transcriptoma. En reportes recientes en la literatura se ha usado RNA-Seq para describir el transcriptoma de células únicas, y cuando se acopla con proteómica basada en espectrometría de masa de alta sensibilidad (véase más adelante), se definen con confianza perfiles de expresión de gen.

Avances metodológicos recientes (GRO-Seq, secuenciación Global Run-On, y NET-seq, secuenciación de transcrito en alargamiento nativo) permiten la secuenciación de RNA dentro de complejos ternarios de RNA polimerasa-DNA-RNA en alargamiento, lo que permite descripciones en el ámbito de nucleótido, en el ámbito de genoma, de transcripción en células vivas. Esa información de transcritoma permite predecir de manera cuantitativa el conjunto de proteínas que podrían expresarse en una célula, un tejido u órgano particular en estados normales y de enfermedad con base en los mRNA presentes en esas células.

El desarrollo reciente de métodos para mapear la localización, u ocupación de proteínas específicas unidas a secuencias de DNA separadas dentro de células vivas, complementa los métodos de muy alto rendimiento, de establecimiento de perfil de transcrito antes descritos. Este método (figura 39-11) se denomina inmunoprecipitación de cromatina (ChIP). Proteínas se unen con enlaces covalentes in situ en células o tejidos; la cromatina celular se aísla, se corta y complejos de proteína-DNA unidos por enlaces covalentes, específicos, se purifican usando anticuerpos que reconocen una proteína, o isoforma de proteína, particular. El DNA unido a esta proteína se recupera y amplifica usando PCR, y se analiza: sea usando electroforesis en gel, análisis de hibridación de microarreglo (ChIP-chip), o secuenciación directa. Hay dos versiones de la lectura de valoración de secuenciación de DNA. En la primera el DNA inmunopurificado es sujeto directamente a NGS/secuenciación de DNA de alto rendimiento (ChIP-Seq); en la segunda versión, el complejo de proteína-DNA inmunopurificado, unido por enlaces covalentes, es tratado con exonucleasas para eliminar secuencias de DNA que tengan enlaces covalentes, y que no estén en íntimo contacto con la proteína de interés; esto se denomina ChIP-Exo. En conjunto, los métodos de ChIP-chip y ChIP-Seq permiten a los investigadores identificar las ubicaciones de una proteína única en el ámbito del genoma en todos los cromosomas. El método de ChIP-Exo tiene la ventaja adicional de permitir a los investigadores mapear la ocupación de proteína in vivo a resolución en el ámbito de nucleótido único. Por último, se han desarrollado métodos para espectrometría de masa de muestras de metabolitos (metabolómica), diversas moléculas pequeñas (lípidos, lipidómica; carbohidratos, glicómica, etc.) y proteína complejas (proteómica), de alta sensibilidad, y de alto rendimiento. Los métodos de espectrometría de masa más nuevos permiten a los científicos identificar cientos a miles de proteínas en muestras complejas extraídas a partir de números muy pequeños de células (< 1 g). Esos análisis ahora pueden usarse para cuantificar las cantidades relativas de proteínas en dos muestras, así como las cifras de ciertas PTM, como fosforilación, acetilación, etc.; y con el uso de anticuerpos específicos, definir interacciones específicas entre una proteína y otra. Esta información crucial dice a los investigadores cuáles de los muchos mRNA detectados en estudios de mapeo de transcriptoma en realidad se traducen hacia proteína, por lo general el dictador final del fenotipo.

También se han ideado nuevos medios genéticos para identificar interacciones entre una proteína y otra, y la función de proteína. La disminución (knockdown) de la expresión de gen en el ámbito de genoma, sistemática, usando siRNA, investigaciones de interacción genética letal sintética, o más recientemente disminución (knockdown) con CRISPR-Cas9 se ha usado para evaluar la contribución de genes individuales a diversos procesos en sistemas modelo (levadura, gusanos y moscas) y células de mamífero (humano y ratón). Mapeos de red específicos de interacciones entre una proteína y otra en el ámbito de todo el genoma se han identificado usando variantes de alta capacidad de procesamiento de la prueba de interacción de doble híbrido (figura 39-12). Este método sencillo pero potente puede llevarse a cabo en bacterias, levaduras, o células de metazoario, y permite detectar interacciones específicas entre una proteína y otra en células vivas. Experimentos de reconstrucción indican que con este método se pueden detectar fácilmente las interacciones entre una proteína y otra con afinidades de K_d ~10²⁶ mol/L o más estrechas. Juntas, estas tecnologías proporcionan nuevos y potentes recursos con los cuales disecar los pormenores de las propiedades biológicas del humano.

Las técnicas de microarreglo, la secuenciación de DNA genómica de alto rendimiento, la disminución (knockdown) genética doble híbrido, en el ámbito del genoma, ChIP-Seq, e investigaciones letales sintéticas acopladas con experimentos de identificación de proteínas y metabolitos por espectrometría de masas, han llevado a la generación de enormes cantidades de datos. El manejo de datos apropiado y la interpretación de la avalancha de información futura a partir de ese tipo de estudios se han fundamentado en la aplicación de métodos estadísticos y algoritmos nuevos para analizar o “explotar” y visualizar esos enormes conjuntos de datos, y ha llevado al desarrollo del campo de la bioinformática (capítulo 11). Estas nuevas tecnologías, junto con la enorme cantidad de datos experimentales, han llevado más al desarrollo del campo de la biología de sistemas, una disciplina cuyo objetivo es analizar cuantitativamente, e integrar esta avalancha de información biológicamente importante. La investigación futura en la intersección de la bioinformática, la ingeniería, la biofísica, genética, establecimiento de perfiles de transcrito-proteína/PTM, y biología de sistemas, revolucionarán el entendimiento de la fisiología y la medicina y finalmente la salud humana.

• En la clonación de DNA, un segmento particular de DNA es sintetizado directamente, o es eliminado de su ambiente normal usando PCR o una de las muchas endonucleasas dirigidas por DNA. Ese tipo de DNA a continuación es ligado hacia un vector en el cual el segmento de DNA se puede amplificar y producir en abundancia.

• La manipulación del DNA para cambiar su estructura, llamada ingeniería genética, es un elemento clave en la clonación (p. ej., la construcción de moléculas quiméricas), y puede usarse también para estudiar la función de un cierto fragmento de DNA, y para analizar cómo están regulados los genes.

• Diversas técnicas muy sensibles ahora pueden aplicarse al aislamiento y la caracterización de genes, y a la cuantificación de productos de genes en modos tanto estático (esto es, equilibrio) como dinámico (cinético). Estos métodos permiten la identificación de los genes de los cuales dependen enfermedades, y el estudio de cómo los genes/la regulación de genes, defectuosos, causan enfermedades.

• Los genomas de mamífero ahora pueden ser objeto de procedimientos de ingeniería con precisión para añadir/reemplazar (knockin), efectuar deleción o desactivar (knockout) y/o manipular de manera activa y condicional genes específicos usando nuevas enzimas de edición de genoma (recombinasas) y sistemas de enzima-RNA (CRISPR-Cas).

ARS:

secuencia replicante de manera autónoma; el origen de la replicación en levaduras.

la detección de moléculas radiactivas (p. ej., DNA, RNA, proteína) mediante visualización de sus efectos sobre película fotográfica o de rayos X.

un virus que infecta a una bacteria.

colección de fragmentos clonados que representa, en conjunto, todo el genoma. Las bibliotecas pueden ser DNA genómico (en el cual están representados tanto los intrones como los exones) o cDNA (en el cual sólo están representados los exones).

análisis de capucha o casquete de la expresión génica. Un método que permite la captura, amplificación, clonación y secuenciación selectivas de mRNA por medio de la estructura cubierta (capucha) 5′.

una molécula de DNA monocatenario que es complementaria a una molécula de mRNA, y se sintetiza a partir de la misma por medio de la acción de transcriptasa inversa.

una técnica que permite la determinación de la ubicación exacta de una proteína, o isoforma de proteína, particular, en cualquier ubicación genómica particular en una célula viva. El método se basa en el entrecruzamiento de células vivas, alteración de células, fragmentación del DNA, e inmunoprecipitación con anticuerpos específicos que codifican la proteína cognada enlazada de manera covalente a DNA. Los enlaces covalentes son revertidos, el DNA asociado es purificado, y las secuencias específicas que son purificadas se miden usando cualquiera de varios métodos diferentes.

Un método basado en hibridación en el que se usan técnicas de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) para mapear, en el ámbito del genoma, los sitios de unión in vivo de proteínas específicas dentro de cromatina en células vivas. La unión de secuencia se determina mediante calentamiento y enfriamiento (annealing) de muestras de DNA marcado con fluorescencia a microarreglos (arreglo).

Una variación de ChIP-Seq (véase más adelante) que permite precisión en el ámbito de nucleótido en el mapeo y la descripción de elementos cis de DNA unidos por una proteína particular.

localización de unión de DNA genómico en un ChIP determinado mediante secuenciación de alto rendimiento, en lugar de hibridación con microarreglos.

Los RNA que están unidos a proteína después se pueden purificar a partir de lisados de células mediante inmunoprecipitación y secuenciación subsiguiente.

un gran número de organismos, células o moléculas que son idénticas con un organismo, célula o molécula progenitor único.

los modelos de modificación de DNA cromosómico (esto es, metilación de citocina) y modificaciones postraduccionales de histona nucleosómica. Estos cambios del estado de modificación pueden llevar a alteraciones notorias de la expresión de gen. Aun así, es notable que la secuencia de DNA subyacente real involucrada no cambia.

un plásmido hacia el cual se han insertado las secuencias de DNA del bacteriófago lambda que son necesarias para la aglomeración de DNA (sitios cos); esto permite que el DNA del plásmido se aglomere in vitro.

un “sistema inmune” procarionte que confiere resistencia a genes externos provenientes de bacteriófagos. Este sistema proporciona una versión bacteriana de inmunidad adquirida. El RNA derivado de espaciador CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas regularmente interespaciadas, agrupadas [Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats]) se combina con la nucleasa Cas para dirigir y dividir específicamente el DNA de fago invasor, lo que desactiva estos genomas invasores y protege a la bacteria contra infección por fago productiva y lisis.

cadenas únicas complementarias de DNA que sobresalen desde extremos opuestos de un DNA dúplex o forman los extremos de diferentes moléculas dúplex (véase también DNA con extremo romo).

dos cadenas de un DNA dúplex que tienen extremos que están alineados entre sí.

el DNA alterado que se produce por la inserción de una secuencia de desoxinucleótidos no previamente presente, hacia una molécula de DNA existente, por medios enzimáticos o químicos.

un método para transferir RNA desde un gel de agarosa o de poliacrilamida hacia un filtro de nitrocelulosa, en el cual el RNA puede detectarse mediante una sonda idónea.

método para transferir DNA desde un gel de agarosa hacia filtro de nitrocelulosa, en el cual el DNA se puede detectar mediante una sonda idónea (p. ej., DNA o RNA complementario).

método para detectar interacciones entre proteína y DNA al aplicar una sonda de DNA marcada a una membrana de transferencia que contiene una proteína renaturalizada.

método para transferir proteína hacia un filtro de nitrocelulosa, en el cual la proteína se puede detectar mediante una sonda idónea (p. ej., un anticuerpo).

la eliminación de intrones del RNA, acompañada por la unión de sus exones.

el complejo macromolecular que se encarga del empalme de mRNA precursor. El empalmeosoma consta de al menos 5 RNA nucleares pequeños (snRNA; U1, U2, U4, U5 y U6) y muchas proteínas.

Encyclopedia of DNA Elements Project; un esfuerzo de múltiples laboratorios de todo el mundo para proporcionar una representación detallada, informativa desde el punto de vista bioquímico, del genoma humano usando métodos de secuenciación de alta capacidad de procesamiento para identificar y catalogar los elementos funcionales dentro del genoma humano.

una enzima que divide enlaces internos en el DNA o el RNA.

una endodesoxinucleasa que ocasiona división de ambas cadenas de DNA en sitios muy específicos dictados por la secuencia de bases.

la nucleasa de escisión comprendida en la reparación de DNA por intercambio de nucleótido.

el uso de RFLP o de DNA de secuencia de repetición para establecer un modelo único de fragmentos de DNA para un individuo.

el DNA con proteína unida es resistente a digestión por enzimas DNasa. Cuando se realiza una reacción de secuenciación usando ese DNA, se detectará un área protegida, que representa la “huella digital del pie” de la proteína unida, porque las nucleasas son incapaces de dividir el DNA directamente unido por la proteína.

la secuencia de nucleótidos de todos los exones de mRNA expresados en una célula, tejido, órgano u organismo particular. El exoma difiere del transcriptoma, que representa la totalidad de transcritos de genoma; el exoma representa un subgrupo de secuencias de RNA que componen el transcriptoma.

la secuencia de un gen que se representa (expresa) como mRNA.

enzima que divide nucleótidos desde los extremos 3′ o 5′ del DNA o RNA.

hibridación in situ fluorescente, método que se usa para mapear la ubicación de secuencias de DNA específicas dentro de núcleos fijos.

un método en el cual transcritos nacientes son captados de manera específica y secuenciados usando secuenciación de nueva generación (NGS)/secuenciación profunda. Este método permite el mapeo de la ubicación de complejos de transcripción activos.

la reasociación específica de cadenas complementarias de ácidos nucleicos (DNA con DNA, DNA con RNA, o RNA con RNA).

un tramo de doble hélice constituido por formación de pares de bases entre secuencias complementarias vecinas de una cadena única de DNA o RNA.

un tramo adicional de pares de bases en el DNA, por lo general introducido mediante las técnicas de tecnología de DNA recombinante.

la secuencia de un gen que codifica para mRNA que se transcribe pero que se escinde antes de la traducción. Los genes que codifican para tRNA también pueden contener intrones.

la unión catalizada por enzima en enlace fosfodiéster de dos tramos de DNA o RNA hacia uno; las enzimas respectivas son DNA y RNA ligasas.

secuencias repetidas entremezcladas largas.

microRNA, especies de RNA de 21 a 22 nucleótidos de largo derivadas a partir de unidades de transcripción de RNA polimerasa II, de 500 a 1 500 bp de longitud por medio de procesamiento de RNA. Se cree que estos RNA, recién descubiertos, desempeñan funciones cruciales en la regulación de gen mediante alterar la función del mRNA.

una molécula (p. ej., DNA, RNA, proteína) que contiene secuencias derivadas de dos especies diferentes.

análisis en el ámbito de genoma de extremos 3′ de cadena naciente de mRNA eucarionte mapeados a resolución en el ámbito de nucleótido. Los complejos de alargamiento de RNA polimerasa II son captados por medio de inmunopurificación con IgG anti-Pol II, y RNA nacientes que contienen un grupo 3′OH libre son marcados por medio de ligadura con un enlazador de RNA y después amplificados mediante PCR y sujetados a secuenciación profunda.

una secuencia corta y definida de nucleótidos unidos entre sí en el enlace fosfodiéster típico.

el origen de replicación de DNA.

un vector de clonación de alta capacidad (70 a 95 kb) basado en el bacteriófago P1 de E. coli lítico que se replica en bacterias como un elemento extracromosómico.

secuencia de DNA dúplex que es la misma cuando las dos cadenas se leen en direcciones opuestas.

pequeña molécula circular, extracromosómica, de DNA, que se replica de modo independiente del DNA huésped.

heterocigosidad de una cierta repetición microsatélite en un individuo.

el complejo móvil de helicasa y primasa que está involucrado en la replicación del DNA.

la colección completa de proteínas expresadas en un organismo.

método enzimático para el copiado repetido (y, de esta manera, la amplificación) de las dos cadenas de DNA que constituyen una secuencia de gen particular.

un método de inmunoprecipitación de RNA, efectuado como ChIP, que se usa para asignar una puntuación a la unión específica de una proteína a un RNA específico in vivo. En la RIP se usa formación de enlaces covalentes de formaldehído para inducir fijación covalente de proteínas a RNA (véase también CLIP).

un método en el cual poblaciones de RNA celular son convertidas, por medio de ligadura a enlazador y PCR, en cDNA que a continuación quedan sujetos a secuenciación profunda para determinar la secuencia completa de esencialmente todos los RNA en la preparación.

método usado para cuantificar las concentraciones de mRNA, que se fundamenta en un primer paso de copia de cDNA de mRNA catalizado por la transcriptasa inversa antes de amplificación con PCR y cuantificación.

secuencias de repetición dispersas o en grupo, de 2 a 5 bp repetidas hasta 50 veces. Pueden suceder en 50 000 a 100 000 ubicaciones en el genoma.

el producto terminal observado cuando una secuencia específica de DNA o RNA se detecta mediante autorradiografía o algún otro método. Generalmente se usa hibridación con un polinucleótido radiactivo complementario (p. ej., por medio de electrotransferencia Southern o Northern) para generar la señal.

un segmento de DNA inactivo que surge por mutación de un gen activo progenitor; típicamente se genera por transposición de una copia de cDNA de un mRNA.

secuencias de repetición entremezcladas cortas.

RNA silenciadores, de 21 a 25 nt de longitud, generados por degradación nucleolítica selectiva de RNA bicatenarios de origen celular o viral. Los siRNA se renaturalizan a diversos sitios específicos dentro del blanco en RNA que conducen a degradación de mRNA, de ahí el nombre “noqueo (knock-down) de gen”.

polimorfismo de nucleótido único. Se refiere al hecho de que la variación genética de nucleótido único en la secuencia del genoma existe en loci separados en todos los cromosomas. La medición de diferencias de SNP alélicas es útil para estudios de mapeo de gen.

RNA nuclear pequeño. Esta familia de RNA se conoce mejor por su función en el procesamiento de mRNA.

una molécula usada para detectar la presencia de un fragmento de DNA o RNA específico en, por ejemplo, una colonia de bacterias que se forma a partir de una biblioteca genética o durante análisis por medio de técnicas de electrotransferencia; las sondas comunes son moléculas de cDNA, oligodesoxinucleótidos sintéticos de secuencia definida o anticuerpos contra proteínas específicas.

usado para describir múltiples copias de la misma secuencia (p. ej., DNA) que yacen adyacentes entre sí.

enzima que añade nucleótidos de un tipo (p. ej., residuos desoxiadenonucleotidilo) al extremo 3′ de cadenas de DNA.

síntesis de proteína usando mRNA como plantilla.

técnica para marcar DNA que se basa en la capacidad de la DNA polimerasa de E. coli para degradar una cadena de DNA que se ha mellado, y después para volver a sintetizar la cadena; si se emplea un nucleósido trifosfato radiactivo, la cadena reconstruida queda marcada y puede usarse como una sonda radiactiva.

síntesis de ácidos nucleicos dirigida por DNA plantilla; típicamente síntesis de RNA dirigida por DNA.

síntesis de DNA dirigida por RNA, catalizada por la transcriptasa inversa.

la colección completa de mRNA expresados en un organismo, célula, tejido u órgano; incluye mRNA y ncRNA.

describe la introducción de DNA nuevo hacia células germinales por medio de su inyección hacia el núcleo del huevo.

cambio del número de copias de regiones de DNA genómicas específicas entre dos o más sujetos. Las CNV pueden ser tan grandes como de 10⁶ bp de DNA, e incluir deleciones o inserciones.

un plásmido o bacteriófago hacia el cual puede introducirse DNA extraño para los propósitos de clonación.