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Casi todas las reacciones de química clínica sistemáticas comprenden enlazar una reacción química o enzimática con la aparición de un producto coloreado que se mide mediante espectrofotometría de absorción. Diferentes compuestos absorben luz a diferentes longitudes de onda; la energía de la luz absorbida excita electrones a un orbital inestable (figura 14-8). La absorbancia de luz a una longitud de onda específica en el rango visible o ultravioleta es directamente proporcional a la concentración del producto final coloreado y, por ende, a la concentración del analito en la muestra. Si bien en una época esos análisis se efectuaban manualmente, en la actualidad casi todos los análisis son automatizados, y un instrumento único puede llevar a cabo múltiples valoraciones en una muestra única.
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En la espectrofotometría de absorción los electrones excitados vuelven a su estado basal en una serie de pequeños saltos cuánticos y emiten luz de una longitud de onda más alta (energía más baja) que la luz que produce la excitación. Esto es fluorescencia y la técnica se conoce como espectrofotometría de fluorescencia o espectrofotofluorimetría. La muestra se ilumina con luz de una longitud de onda específica y la luz emitida se mide a ángulos rectos a la dirección de la longitud de onda de iluminación (figura 48-4). De nuevo, la intensidad de la fluorescencia es proporcional a la concentración del fluoróforo y, por ende, a la concentración del analito. La fluorimetría permite tanto mayor especificidad como sensibilidad del análisis. La especificidad es mayor que para la espectrofotometría de absorción porque tanto la longitud de onda excitadora como la longitud de onda emitida son específicas para el fluoróforo, mientras que para la espectrofotometría de absorción sólo hay una longitud de onda por ajustar, la de la luz que se absorbe. La fluorimetría es más sensible porque es más fácil detectar la emisión de una cantidad pequeña de luz que la absorción.
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Cada vez más, especialmente en centros de investigación y de especialidad, múltiples analito se miden en la misma muestra usando cromatografía líquida de alta presión para separar los analitos, seguida por detección colorimétrica, fluorimétrica o electroquímica, o enlazada a espectrometría de masa para identificar compuestos. Esos métodos forman la base de la metabolómica (el estudio de toda una gama de metabolitos en una muestra única) y de la metabonómica (el estudio de cambios en analitos en respuesta a un fármaco o tratamiento experimental de alguna clase).
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Históricamente, los electrólitos como el sodio y el potasio se medían mediante fotometría de llama, al medir la luz emitida cuando el ion se introducía en una llama clara. El sodio da una llama amarilla, y el potasio, una púrpura. En la actualidad, estos iones y otros se miden usando electrodos específicos para ion. En algunos casos, los iones metálicos se miden mediante espectrometría de absorción atómica. Aquí la muestra es introducida en una llama e iluminada a una longitud de onda específica. La energía lumínica absorbida excita electrones hasta un orbital inestable y la absorción de luz es directamente proporcional a la concentración del elemento en la muestra, como sucede para la espectrofotometría de absorción.
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Enzimas en química clínica
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Las enzimas son importantes en química clínica de tres maneras: para medir analitos en una muestra, para medir la actividad de las enzimas mismas en una muestra, y como una prueba del estado nutricional en cuanto a vitaminas.
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El uso de una enzima para medir la concentración de un analito confiere un alto grado de especificidad a la valoración, porque en general una enzima actuará sobre sólo un sustrato, o sobre una pequeña gama de sustratos estrechamente relacionados, mientras que una reacción química simple bien puede responder a diversos analitos (posiblemente no relacionados). Por ejemplo, diversos compuestos reductores reaccionarán con un reactivo de cobre alcalino para dar un resultado positivo falso para glucosa, mientras que la valoración enzimática con el uso de glucosa oxidasa sólo dará un resultado positivo para glucosa, y no para otros compuestos reductores.
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Cuando se usa una enzima para detectar un analito, el factor limitante en la valoración debe ser el analito mismo; la enzima y otros reactivos deben estar presentes en exceso. Lo que es más importante, la concentración del analito en la muestra se debe ajustar para que esté por debajo de la Km de la enzima, de modo que hay un cambio grande de la tasa de reacción con un cambio pequeño de la concentración del analito (región A en la figura 48-5).
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Cuando las células son dañadas o mueren, su contenido escapa hacia el torrente sanguíneo. Por ende, la medición de enzimas en el plasma puede usarse para detectar daño de tejido; la información se obtiene a partir del patrón de enzimas (y de isoenzimas específicas para tejido) liberadas. El aumento de la actividad enzimática en el plasma por arriba del límite normal a menudo indica el grado de gravedad del daño de tejido. Cuando una valoración va a determinar la actividad de una enzima en el plasma, el factor limitante debe ser la enzima misma. La concentración de sustrato añadido debe ser considerablemente mayor que la Km de la enzima, de modo que la enzima esté actuando en la Vmáx o cerca de la misma, e incluso un cambio relativamente grande de la concentración de sustrato no tiene un efecto significativo sobre la tasa de reacción (región B en la figura 48-5). En la práctica, esto significa que la concentración de sustrato añadido es alrededor de 20 veces más alta que la Km de la enzima.
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Si una enzima tiene una coenzima derivada de vitamina que es esencial para la actividad, la medición de la actividad de la enzima en eritrocitos con coenzima añadida y sin ella puede usarse como un índice del estado nutricional en cuanto a la vitamina. Esto proporciona una indicación del estado nutricional funcional, mientras que la medición de la vitamina y sus derivados a menudo refleja la ingesta reciente más que la suficiencia fisiológica. La suposición subyacente es que los eritrocitos tienen que competir con otros tejidos en el organismo por lo que puede ser un aporte limitado de la coenzima. Por ende, el grado al cual la enzima eritrocítica está saturada con su coenzima reflejará la disponibilidad de la coenzima durante un período que corresponde a la vida media de los eritrocitos. Esa valoración consta de incubar dos muestras del lisado de eritrocitos: una se ha preincubado con la adición de la coenzima, y una sin ella; a continuación se añade sustrato a ambas, y se mide la actividad de la enzima. En la muestra preincubada sin adición de la coenzima, sólo la enzima que se había unido a la coenzima (la holoenzima) será activa. En la muestra que se preincubó con la coenzima, cualquier apoenzima (proteína enzima inactiva sin coenzima unida) habrá sido activada a la holoenzima; por tanto, no habrá un cambio de la actividad de la enzima en el momento de la adición de coenzima, lo que indica saturación completa de la enzima con coenzima, o un incremento de actividad, que refleja la activación de la apoenzima por coenzima añadida. Los resultados se reportan como un coeficiente de activación de enzima (la proporción de actividad en la muestra preincubada con coenzima, y la actividad en la muestra preincubada sin coenzima). Los rangos de referencia para el coeficiente de activación se establecen de la misma manera que para cualquier otra prueba. Ese tipo de valoraciones de activación de enzima están disponibles para tiamina (vitamina B1, usando transcetolasa de eritrocitos), riboflavina (vitamina B2, usando glutatión reductasa eritrocítica), y vitamina B6 (usando una u otra de las transaminasas eritrocíticas).
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Valoraciones e inmunovaloraciones de unión a ligando competitivas
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Si hay una proteína que se unirá a un analito, y el analito unido y libre (ligando) se puede separar y medir, es posible idear una valoración para el analito. Quizá la más simple de ese tipo de valoración de unión a ligando es la valoración para la hormona cortisol, que es transportada en el torrente sanguíneo unida a una globulina transportadora de cortisol específica. Es fácil preparar una muestra de plasma que contenga la globulina transportadora que se ha separado de su ligando (cortisol) mediante incubación con óxido de aluminio o carbón. Esto se efectúa usando una muestra grande de plasma combinado con una proporción de globulina transportadora para un gran número de ensayos. La hormona se extrae a partir de cada muestra por analizar, usando un solvente orgánico, evaporado hasta que se seca, y después disuelto en etanol y un amortiguador idóneo, con la adición de una cantidad trazadora de hormona radiactiva de actividad específica alta. A continuación se incuba cada muestra con la globulina transportadora a 37 °C, y después se enfría a 4 °C. Se añade carbón para adsorber el ligando no unido y se elimina con rapidez mediante centrifugación, tras lo cual procede medir la radiactividad en el sobrenadante. Esto da la cantidad de ligando unido y se expresa como un porcentaje de la radiactividad total añadida a cada muestra. Se construye una curva estándar usando cantidades conocidas de hormona, de modo que pueda determinarse la concentración de la hormona en la muestra.
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Una amplia variedad de otras hormonas y otros analitos puede medirse de la misma manera, al producir anticuerpos monoclonales o antisueros policlonales contra el analito, por ejemplo, al inyectar el analito unido de manera covalente a una proteína a un animal. El antisuero contra una hormona producido en un único conejo puede usarse para muchos miles de valoraciones. Por supuesto, cada lote de antisuero debe probarse respecto a su especificidad para la hormona (al asegurarse de que no se une también a hormonas relacionadas, un problema especial con las hormonas esteroides), y respecto a su sensibilidad. Cuando la proteína de unión es un anticuerpo o antisuero, la valoración por lo general se llama una radioinmunoensayo.
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En una variante del ensayo de unión competitiva, el anticuerpo es unido de manera covalente a la superficie de perlas. Entonces es fácil separar el ligando unido y libre simplemente al lavar las perlas con amortiguador frío, dejando el ligando unido fijo a las perlas para medición de radiactividad unida. De manera alternativa, el anticuerpo puede unirse covalentemente a la superficie de un tubo de ensayo, o a cada pozo en una placa de múltiples pozos. Después de incubación, se toma la muestra para medición de la radiactividad que no está unida.
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Cada vez más, a fin de minimizar la exposición a materiales radiactivos, se usa ligando o anticuerpo marcado con fluorescencia. Un desarrollo adicional es la valoración tipo sándwich, en la cual se usan dos anticuerpos diferentes contra el ligando, cada uno de los cuales se une a una región diferente del analito. El primer anticuerpo se une de manera covalente a la superficie de cada pozo de una placa de pozos múltiples, se añade la muestra y se incuba. Después de retirar del medio de incubación y de lavar cada pozo, se agrega el segundo anticuerpo, con lo cual el analito queda a manera de sándwich entre los dos anticuerpos. El segundo anticuerpo es marcado con un isótopo radiactivo o con un fluoróforo, lo que permite medir el segundo anticuerpo unido y, por ende, el ligando unido. En algunos casos, el segundo anticuerpo se marca con una enzima, y la medición del segundo anticuerpo unido y, por ende, del ligando unido, se efectúa al medir la actividad de la enzima que ahora está unida al pozo de cada celda de la placa, después de lavar para eliminar el segundo anticuerpo no unido y añadiendo un exceso del sustrato enzima. Se trata del ensayo de inmunosorbente ligada a enzima (ELISA).
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Tiras sumergibles de química seca
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En diversas valoraciones las enzimas o anticuerpos y reactivos pueden combinarse en una tira de plástico especialmente diseñada. Para la medición de la glucosa en sangre, una muestra de sangre obtenida mediante pinchazo en un dedo de la mano se coloca en la tira de prueba y la concentración de glucosa se mide usando un dispositivo manual llamado el glucómetro. Esto proporciona un método sencillo y fiable para estimar la glucosa al lado de la cama en un pabellón de hospital, la clínica de un médico o incluso en el hogar. Para pruebas de orina, ensayos diferentes pueden realizarse con reactivos separados en una tira de plástico llamada una tira sumergible (p. ej., para detectar o estimar de manera semicuantitativa las concentraciones de glucosa, cuerpos cetónicos, proteína, y varios otros analitos al mismo tiempo). Se dispone de tiras sumergibles similares para detectar gonadotropina coriónica humana (hCC) en la orina, como una prueba de embarazo para uso en el hogar.
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Pruebas de detección de errores congénitos del metabolismo en recién nacidos
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Muchos de los errores congénitos del metabolismo pueden llevar a retraso mental muy grave si el tratamiento no se inicia en etapas muy tempranas. Para enfermedades como fenilcetonuria y enfermedad de la orina con olor a jarabe de arce, la restricción en la dieta de los aminoácidos que no se metabolizan normalmente (fenilalanina en la fenilcetonuria; los aminoácidos de cadena ramificada leucina, isoleucina y valina en la enfermedad de la orina con olor a jarabe de arce) es esencial para el manejo de la enfermedad. Por ende, en casi todos los países desarrollados es habitual que se efectúen pruebas en recién nacidos para detectar esas enfermedades. La(s) concentración(es) de(l) (los) aminoácido(s) perjudicial(es) se mide(n) en una muestra de sangre que normalmente se toma una semana después del nacimiento, cuando las enzimas que están afectadas en la enfermedad deben haber alcanzado expresión completa. Más a menudo, se obtiene una muestra de sangre capilar por medio de un pinchazo en el talón y se transfiere sobre papel absorbente para ser enviada al laboratorio para análisis.
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La primera prueba de detección de ese tipo para un error congénito del metabolismo fue la prueba de la inhibición bacteriana de Guthrie. Un disco del papel que contiene la muestra de sangre se coloca sobre una placa de agar que se ha sembrado con una cepa de Bacillus subtilis que requiere fenilalanina, junto con un inhibidor competitivo de la captación de fenilalanina hacia las bacterias (β-tienilalanina) a una concentración tal que competirá con la fenilalanina a las cifras que normalmente se encuentran en la sangre, de modo que las bacterias no crecerán. Si la concentración de fenilalanina es mayor que la que suele encontrarse en sangre, será captada por las bacterias más que el inhibidor, y las bacterias formarán colonias visibles en el agar.
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En casi todos los centros, la prueba de la inhibición bacteriana ha sido reemplazada por técnicas cromatográficas que permiten la detección de diversos metabolitos anormales y, por ende, la detección de diversos errores congénitos del metabolismo.