CAPÍTULO 48: Bioquímica clínica

Los análisis de laboratorio de un tipo u otro son una parte esencial de la medicina. Los análisis bioquímicos pueden usarse para hacer pruebas de detección para enfermedad, para confirmación (o exclusión) de un diagnóstico hecho con base en el examen clínico, y para vigilar la progresión de una enfermedad y el resultado del tratamiento (cuadro 48-1). Las muestras de sangre y orina son las más utilizadas; en ocasiones también se emplean heces, saliva o líquido cefalorraquídeo y raras veces se utilizan muestras de biopsia de tejido. La mayor parte del conocimiento y la comprensión de las causas subyacentes de enfermedades metabólicas, así como de los efectos de la enfermedad sobre el metabolismo, provienen del análisis de metabolitos en sangre y orina, además de la medición de las enzimas en la sangre. A su vez, ese conocimiento ha permitido avances en el tratamiento de enfermedades y de la creación de mejores fármacos.

Los avances en la tecnología implican que muchas pruebas que en el pasado sólo se llevaban a cabo en laboratorios especializados, ahora pueden efectuarse al lado de la cama, en el consultorio del médico o en la práctica veterinaria, a veces incluso en el hogar por los pacientes mismos, con aparatos automatizados que son fáciles de usar y que sólo requieren una cantidad limitada de capacitación para proporcionar resultados fiables. Otras pruebas aún se efectúan en laboratorios de hospitales o en laboratorios de química clínica privados, con muestras enviadas por médicos. Algunas pruebas son menos solicitadas y requieren un nivel técnico mayor para implementarse y sólo se llevan a cabo en centros especializados. Entre ellas se cuentan técnicas especializadas para estudiar enfermedades metabólicas raras (y a veces recién descubiertas). Además, los análisis de muestras de atletas (y de caballos de carreras) para fármacos que aumentan el rendimiento y para otras sustancias prohibidas, por lo general sólo se realizan en un número limitado de laboratorios que cuentan con autorización especial.

Muchas enfermedades pueden llevar a anormalidades de los resultados de análisis de laboratorio; algunas de éstas se listan en el cuadro 48-2. La lesión de tejido que da lugar a daño de membranas celulares y un aumento de la permeabilidad de la membrana plasmática lleva a escape de material intracelular hacia el torrente sanguíneo (p. ej., escape de creatina cinasa MB hacia el torrente sanguíneo después de un infarto de miocardio). En otros casos, la síntesis de proteínas y hormonas está aumentada o disminuida (p. ej., proteína C reactiva [CRP] en estados inflamatorios u hormonas en trastornos endocrinos). Las insuficiencias renal y hepática llevan a la acumulación de diversos compuestos (p. ej., creatinina y amoníaco, respectivamente) en la sangre, debido a la incapacidad del órgano específico para excretar el compuesto en cuestión o metabolizarlo.

Para cualquier compuesto que se mide (un analito), hay un rango de valores alrededor del promedio o la media que pueden considerarse normales; se trata del resultado de variaciones biológicas entre los individuos. Además, es factible que ocurran variaciones de un día a otro o de una semana a otra en los resultados para el mismo individuo. Por ende, el primer paso en el establecimiento de cualquier análisis de laboratorio nuevo para detectar enfermedad, diagnosticarla o vigilar el tratamiento, es determinar el rango de resultados en una población de personas sanas. Para algunos análisis, esto también implica determinar los rangos normales de analitos en personas de diferentes edades. El rango normal de algunos analitos también difiere entre varones y mujeres, y es factible que haya diferencias entre diferentes grupos étnicos que deben considerarse.

Si los resultados obtenidos para un grupo de población sana blanco (en función de la edad, el sexo y quizás el grupo étnico) están distribuidos normalmente desde el punto de vista estadístico (esto es, los resultados muestran una distribución gaussiana simétrica alrededor de la media), se considera que el rango aceptable o normal es ± 2x desviación estándar alrededor de la media. Ese rango incluye 95% de la población blanco y se conoce como el rango de referencia. Los valores fuera del rango de referencia son considerados como anormales y ameritan investigación adicional. Si los resultados de la población sana no están distribuidos normalmente desde el punto de vista estadístico, sino que muestran sesgo, se requiere un paso adicional de manipulación estadística antes de establecer un rango de referencia de 95%.

Para algunas pruebas, los resultados de diferentes laboratorios diferirán, por lo general porque usan diferentes métodos de medición. Cada laboratorio establece su propio grupo de rangos de referencia para los análisis que efectúa. Algunos laboratorios reportan los resultados como el valor a ser comparado con el rango de referencia. Otros reportan los resultados como el número de desviaciones estándar desde la media (la llamada puntuación Z). Esto permite al médico ver qué tan lejos de la media está el resultado (en otras palabras, qué tan anormal es). A veces los resultados se reportarán como 5 o 10 (o más) veces por arriba del límite normal superior.

El uso del rango de 95% como el rango de referencia tiene una consecuencia desafortunada, por azar, 5% de los resultados “normales” estará fuera del rango de referencia. Esto quedó de manifiesto por vez primera durante la década de 1970-1979, cuando se crearon los analizadores multicanal que fueron capaces de determinar 20 o más analitos en cada muestra. Casi cada muestra daba un resultado que estaba fuera del rango de referencia, pero si la misma persona daba una muestra algunos días más tarde, ese resultado al parecer anormal ahora estaba dentro del rango de referencia, aunque por azar el resultado de otro analito ahora podría estar fuera del rango de referencia. Por ende, es indispensable que el médico requiera sólo los análisis que son importantes para el diagnóstico presuntivo y no solicitar una investigación bioquímica completa.

Los laboratorios diagnósticos están sujetos a procedimientos de inspección y regulación para evaluar la validez de sus resultados y asegurar control de calidad de sus reportes. Esas medidas asegurarán que el valor de la concentración, la actividad o cantidad de una sustancia en un espécimen reportado represente el mejor valor obtenible con el método, los reactivos y los instrumentos usados, y los técnicos involucrados en la obtención del espécimen y el procesamiento del mismo. Además, es importante que el personal médico entienda la validez de los resultados de laboratorio y su interpretación.

Al establecer un nuevo análisis, o un nuevo método, es necesario contestar cuatro preguntas:

1. ¿Qué tan preciso es el método? Se trata de una medida de la reproducibilidad del método. Si la misma muestra es analizada muchas veces, ¿cuánta variación se verá en los resultados obtenidos? La figura 48-1 ilustra esto. En este ejemplo, un grupo de resultados es mucho más preciso que el otro (hay una diferencia entre los dos en la diseminación de resultados alrededor de la media), aun cuando tienen el mismo resultado medio. La precisión no es absoluta, sino que está sujeta a variaciones inherentes en la complejidad del método usado, la estabilidad de los reactivos, la sofisticación del equipo usado para la valoración y la habilidad de los técnicos involucrados.

1. ¿Qué tan exacto es el resultado? Esto alude a una medida de cuán cerca está el resultado al valor verdadero. La figura 48-2 muestra los resultados de valoraciones mediante dos métodos diferentes o mediante el mismo método pero en dos laboratorios distintos. Ambos tienen precisión similar, pero sus valores medios son muy diferentes. A partir de esa información es imposible decir cuál laboratorio está en lo correcto (ésa es, en parte, la razón por la cual los laboratorios establecen sus propios rangos de referencia). Hay varios programas de control de calidad nacionales o regionales, en los cuales a todos los laboratorios participantes se envía la misma muestra de sangre u orina (agrupada). Cada laboratorio mide los diversos analitos en la muestra agrupada. Los resultados obtenidos por todos los laboratorios se grafican como una curva de distribución. Se calcula la media de estos valores y se considera que es el “valor verdadero”. Dicho programa de control de calidad permite que cada laboratorio participante determine cuán cerca están sus resultados del “valor verdadero”.

1. ¿Cuán sensible es el método? En otras palabras, ¿qué tan poco del analito puede cuantificarse de manera fiable? ¿Cuál es el límite inferior de detección fiable? Esto tiene importancia obvia cuando los resultados por debajo del rango de referencia son importantes en clínica o cuando las muestras se están analizando para narcóticos o para sustancias que aumentan el rendimiento, que están prohibidas en deportes competitivos.

2. ¿Qué tan específico es el método? Esta pregunta aborda el tema de la confianza de que la evaluación en realidad esté midiendo el analito de interés. Por ejemplo, en el método ahora obsoleto para medir la glucosa en sangre u orina se usaba una solución de cobre (Cu²⁺) alcalina, que era reducida a Cu⁺ por la glucosa. Sin embargo, otros compuestos reductores en la orina o la sangre, como la xilosa o la vitamina C, también reducen el Cu²⁺, lo que da un valor falsamente alto. Los métodos modernos de medición de la glucosa dependen de la enzima glucosa oxidasa, que sólo reacciona con glucosa y, así, son altamente específicos. Empero, uno de los productos de la acción de la glucosa oxidasa sobre la glucosa es el peróxido de hidrógeno; el segundo paso en la valoración es reducir el peróxido de hidrógeno producido a agua y oxígeno, usando peroxidasa. El medio de la valoración también contiene un compuesto incoloro que se torna azul cuando es oxidado por el oxígeno producido. Las concentraciones altas de vitamina C, como se observaría cuando el paciente está tomando complementos vitamínicos, reducen el colorante de regreso a su forma incolora lo que, así, da un resultado falso negativo (figura 48-3).

Los cuatro criterios anteriores deben establecerse para cada método analítico. Además, el valor clínico de la prueba tiene que establecerse al tomar en consideración su sensibilidad, especificidad y valores predictivos positivo y negativo (cuadro 48-3). Aquí, lamentablemente, se usan los mismos dos términos: sensibilidad y especificidad, pero con significados muy diferentes de los que se usan en el establecimiento del método analítico.

La sensibilidad de una prueba se refiere al porcentaje de resultados de la prueba positivos en pacientes que tienen la enfermedad (“positivo verdadero”). La prueba para fenilcetonuria es altamente sensible; una prueba con resultados positivos se obtiene en todos los que padecen la enfermedad (sensibilidad de 100%). La prueba de antígeno carcinoembrionario (CEA) tiene sensibilidad más baja; sólo 72% de quienes padecen carcinoma del colon tiene un resultado positivo en la prueba cuando la enfermedad es extensa, y sólo 20% de aquellos con enfermedad temprana.

La especificidad de una prueba se refiere al porcentaje de resultados negativos de la prueba entre personas que no tienen la enfermedad. La prueba para fenilcetonuria es altamente específica; 99.9% de los individuos normales tiene un resultado negativo. Sólo 0.1% tiene un resultado positivo falso. En contraste, la prueba de CEA para carcinoma del colon tiene especificidad variable; alrededor de 3% de los individuos no fumadores tiene un resultado positivo falso (especificidad de 97%), mientras que 20% de los fumadores muestra un resultado positivo falso (especificidad de 80%).

La sensibilidad y especificidad de una prueba se relacionan de manera inversa entre sí. Si el punto de corte se establece demasiado alto, muy pocas personas sanas tendrán un resultado positivo falso, pero muchas personas con la enfermedad pueden tener un resultado negativo falso. De este modo, la sensibilidad será baja, pero la especificidad será alta. Por el contrario, si el punto de corte es demasiado bajo, se detectará a la mayoría de las personas que tienen enfermedad o a todas (la prueba tendrá una sensibilidad alta). No obstante, más personas libres de enfermedad pueden tener un resultado positivo falso (la prueba tendrá especificidad baja). De este modo, a menudo, hay un término medio entre sensibilidad y especificidad de una prueba.

El valor predictivo de una prueba con resultados positivos (valor predictivo positivo) define el porcentaje de resultados positivos que son positivos verdaderos. De modo similar, el valor predictivo de una prueba con resultados negativos (el valor predictivo negativo) define el porcentaje de resultados negativos que son resultados negativos verdaderos; esto se relaciona con la prevalencia de la enfermedad. Por ejemplo, en un grupo de pacientes en un pabellón de urología, la prevalencia de enfermedad renal es más alta que en la población general. En este grupo, la concentración sérica de creatinina tendrá un valor predictivo más alto que en la población general. El cuadro 48-3 muestra las fórmulas para calcular la sensibilidad, la especificidad y los valores predictivos de una prueba diagnóstica.

Una prueba diagnóstica ideal es aquella que tiene sensibilidad de 100%, especificidad de 100% y valor predictivo de 100%. Sin embargo, esto no es así para la vasta mayoría de pruebas disponibles hoy en día o, de hecho, para alguna de ellas. Empero, antes de solicitar una prueba, es importante intentar determinar si la sensibilidad, la especificidad y el valor predictivo de la prueba son adecuados para proporcionar información útil. El resultado obtenido debe influir sobre el diagnóstico, la terapia y el pronóstico, o llevar a un mejor entendimiento del proceso patológico, lo que beneficia al paciente.

Las muestras comunes para análisis son sangre y orina. La sangre se recolecta en tubos con un anticoagulante o sin él, dependiendo de si se requiere plasma o suero para la estimación. Menos a menudo, pueden usarse muestras de saliva, líquido cefalorraquídeo o heces.

Hay una diferencia entre la medición de un analito en una muestra de sangre y en la orina. La concentración de un analito en la sangre refleja la concentración en el momento en que se obtuvo la muestra, mientras que una muestra de orina representa la excreción acumulativa del analito durante un período dado. Otra diferencia es que es habitual que los resultados de pruebas de sangre se reporten como la cantidad de analito (o actividad de enzima) por mililitro o litro de sangre (o plasma o suero). Reportar la concentración del analito en la orina de la misma manera no es útil, porque el volumen de orina depende en gran parte de la ingesta de líquido. En algunos casos se solicita al paciente que proporcione una muestra de orina de 24 horas completa, lo que representa un procedimiento tedioso y es difícil saber si en realidad ha sido una recolección de 24 horas completa. De manera alternativa, la concentración del analito se reporta por mol de creatinina. La excreción de creatinina es razonablemente constante de un día a otro para cualquier individuo, pero varía entre los individuos porque depende principalmente de la masa muscular, porque la creatinina se forma de manera no enzimática a partir de creatina y creatina fosfato, la mayor parte de las cuales se encuentra en el músculo esquelético.

Salvo para la medición de los gases en sangre (para la cual se requieren muestras arteriales), las muestras de sangre por lo general son de sangre venosa. La glucosa en sangre a menudo se mide en sangre capilar a partir de un pinchazo en un dedo. En algunos análisis se usa sangre completa; otros requieren suero o plasma. Para una muestra de suero, se permite que la sangre se coagule, y a continuación el coágulo de eritrocitos y fibrina se elimina mediante centrifugación. Para una muestra de plasma, la sangre se recolecta en un tubo que contiene un anticoagulante y los eritrocitos se eliminan mediante centrifugación. La diferencia entre suero y plasma es que el plasma contiene protrombina y los otros factores de la coagulación, incluso el fibrinógeno, no así el suero. Se usan diferentes anticoagulantes para la recolección de muestras de plasma, según la valoración que va a efectuarse: citrato, EDTA u oxalato, todos los cuales producen quelación del calcio y, así, inhiben la coagulación. La heparina, que actúa al activar la antitrombina III, es otro anticoagulante usado comúnmente. Para medir la glucosa en sangre, se añade fluoruro de potasio, como un inhibidor de la glucólisis por los eritrocitos.

Casi todas las reacciones de química clínica sistemáticas comprenden enlazar una reacción química o enzimática con la aparición de un producto coloreado que se mide mediante espectrofotometría de absorción. Diferentes compuestos absorben luz a diferentes longitudes de onda; la energía de la luz absorbida excita electrones a un orbital inestable (figura 14-8). La absorbancia de luz a una longitud de onda específica en el rango visible o ultravioleta es directamente proporcional a la concentración del producto final coloreado y, por ende, a la concentración del analito en la muestra. Si bien en una época esos análisis se efectuaban manualmente, en la actualidad casi todos los análisis son automatizados, y un instrumento único puede llevar a cabo múltiples valoraciones en una muestra única.

En la espectrofotometría de absorción los electrones excitados vuelven a su estado basal en una serie de pequeños saltos cuánticos y emiten luz de una longitud de onda más alta (energía más baja) que la luz que produce la excitación. Esto es fluorescencia y la técnica se conoce como espectrofotometría de fluorescencia o espectrofotofluorimetría. La muestra se ilumina con luz de una longitud de onda específica y la luz emitida se mide a ángulos rectos a la dirección de la longitud de onda de iluminación (figura 48-4). De nuevo, la intensidad de la fluorescencia es proporcional a la concentración del fluoróforo y, por ende, a la concentración del analito. La fluorimetría permite tanto mayor especificidad como sensibilidad del análisis. La especificidad es mayor que para la espectrofotometría de absorción porque tanto la longitud de onda excitadora como la longitud de onda emitida son específicas para el fluoróforo, mientras que para la espectrofotometría de absorción sólo hay una longitud de onda por ajustar, la de la luz que se absorbe. La fluorimetría es más sensible porque es más fácil detectar la emisión de una cantidad pequeña de luz que la absorción.

Cada vez más, especialmente en centros de investigación y de especialidad, múltiples analito se miden en la misma muestra usando cromatografía líquida de alta presión para separar los analitos, seguida por detección colorimétrica, fluorimétrica o electroquímica, o enlazada a espectrometría de masa para identificar compuestos. Esos métodos forman la base de la metabolómica (el estudio de toda una gama de metabolitos en una muestra única) y de la metabonómica (el estudio de cambios en analitos en respuesta a un fármaco o tratamiento experimental de alguna clase).

Históricamente, los electrólitos como el sodio y el potasio se medían mediante fotometría de llama, al medir la luz emitida cuando el ion se introducía en una llama clara. El sodio da una llama amarilla, y el potasio, una púrpura. En la actualidad, estos iones y otros se miden usando electrodos específicos para ion. En algunos casos, los iones metálicos se miden mediante espectrometría de absorción atómica. Aquí la muestra es introducida en una llama e iluminada a una longitud de onda específica. La energía lumínica absorbida excita electrones hasta un orbital inestable y la absorción de luz es directamente proporcional a la concentración del elemento en la muestra, como sucede para la espectrofotometría de absorción.

Enzimas en química clínica

Las enzimas son importantes en química clínica de tres maneras: para medir analitos en una muestra, para medir la actividad de las enzimas mismas en una muestra, y como una prueba del estado nutricional en cuanto a vitaminas.

El uso de una enzima para medir la concentración de un analito confiere un alto grado de especificidad a la valoración, porque en general una enzima actuará sobre sólo un sustrato, o sobre una pequeña gama de sustratos estrechamente relacionados, mientras que una reacción química simple bien puede responder a diversos analitos (posiblemente no relacionados). Por ejemplo, diversos compuestos reductores reaccionarán con un reactivo de cobre alcalino para dar un resultado positivo falso para glucosa, mientras que la valoración enzimática con el uso de glucosa oxidasa sólo dará un resultado positivo para glucosa, y no para otros compuestos reductores.

Cuando se usa una enzima para detectar un analito, el factor limitante en la valoración debe ser el analito mismo; la enzima y otros reactivos deben estar presentes en exceso. Lo que es más importante, la concentración del analito en la muestra se debe ajustar para que esté por debajo de la K_m de la enzima, de modo que hay un cambio grande de la tasa de reacción con un cambio pequeño de la concentración del analito (región A en la figura 48-5).

Cuando las células son dañadas o mueren, su contenido escapa hacia el torrente sanguíneo. Por ende, la medición de enzimas en el plasma puede usarse para detectar daño de tejido; la información se obtiene a partir del patrón de enzimas (y de isoenzimas específicas para tejido) liberadas. El aumento de la actividad enzimática en el plasma por arriba del límite normal a menudo indica el grado de gravedad del daño de tejido. Cuando una valoración va a determinar la actividad de una enzima en el plasma, el factor limitante debe ser la enzima misma. La concentración de sustrato añadido debe ser considerablemente mayor que la K_m de la enzima, de modo que la enzima esté actuando en la V_máx o cerca de la misma, e incluso un cambio relativamente grande de la concentración de sustrato no tiene un efecto significativo sobre la tasa de reacción (región B en la figura 48-5). En la práctica, esto significa que la concentración de sustrato añadido es alrededor de 20 veces más alta que la K_m de la enzima.

Si una enzima tiene una coenzima derivada de vitamina que es esencial para la actividad, la medición de la actividad de la enzima en eritrocitos con coenzima añadida y sin ella puede usarse como un índice del estado nutricional en cuanto a la vitamina. Esto proporciona una indicación del estado nutricional funcional, mientras que la medición de la vitamina y sus derivados a menudo refleja la ingesta reciente más que la suficiencia fisiológica. La suposición subyacente es que los eritrocitos tienen que competir con otros tejidos en el organismo por lo que puede ser un aporte limitado de la coenzima. Por ende, el grado al cual la enzima eritrocítica está saturada con su coenzima reflejará la disponibilidad de la coenzima durante un período que corresponde a la vida media de los eritrocitos. Esa valoración consta de incubar dos muestras del lisado de eritrocitos: una se ha preincubado con la adición de la coenzima, y una sin ella; a continuación se añade sustrato a ambas, y se mide la actividad de la enzima. En la muestra preincubada sin adición de la coenzima, sólo la enzima que se había unido a la coenzima (la holoenzima) será activa. En la muestra que se preincubó con la coenzima, cualquier apoenzima (proteína enzima inactiva sin coenzima unida) habrá sido activada a la holoenzima; por tanto, no habrá un cambio de la actividad de la enzima en el momento de la adición de coenzima, lo que indica saturación completa de la enzima con coenzima, o un incremento de actividad, que refleja la activación de la apoenzima por coenzima añadida. Los resultados se reportan como un coeficiente de activación de enzima (la proporción de actividad en la muestra preincubada con coenzima, y la actividad en la muestra preincubada sin coenzima). Los rangos de referencia para el coeficiente de activación se establecen de la misma manera que para cualquier otra prueba. Ese tipo de valoraciones de activación de enzima están disponibles para tiamina (vitamina B₁, usando transcetolasa de eritrocitos), riboflavina (vitamina B₂, usando glutatión reductasa eritrocítica), y vitamina B₆ (usando una u otra de las transaminasas eritrocíticas).

Valoraciones e inmunovaloraciones de unión a ligando competitivas

Si hay una proteína que se unirá a un analito, y el analito unido y libre (ligando) se puede separar y medir, es posible idear una valoración para el analito. Quizá la más simple de ese tipo de valoración de unión a ligando es la valoración para la hormona cortisol, que es transportada en el torrente sanguíneo unida a una globulina transportadora de cortisol específica. Es fácil preparar una muestra de plasma que contenga la globulina transportadora que se ha separado de su ligando (cortisol) mediante incubación con óxido de aluminio o carbón. Esto se efectúa usando una muestra grande de plasma combinado con una proporción de globulina transportadora para un gran número de ensayos. La hormona se extrae a partir de cada muestra por analizar, usando un solvente orgánico, evaporado hasta que se seca, y después disuelto en etanol y un amortiguador idóneo, con la adición de una cantidad trazadora de hormona radiactiva de actividad específica alta. A continuación se incuba cada muestra con la globulina transportadora a 37 °C, y después se enfría a 4 °C. Se añade carbón para adsorber el ligando no unido y se elimina con rapidez mediante centrifugación, tras lo cual procede medir la radiactividad en el sobrenadante. Esto da la cantidad de ligando unido y se expresa como un porcentaje de la radiactividad total añadida a cada muestra. Se construye una curva estándar usando cantidades conocidas de hormona, de modo que pueda determinarse la concentración de la hormona en la muestra.

Una amplia variedad de otras hormonas y otros analitos puede medirse de la misma manera, al producir anticuerpos monoclonales o antisueros policlonales contra el analito, por ejemplo, al inyectar el analito unido de manera covalente a una proteína a un animal. El antisuero contra una hormona producido en un único conejo puede usarse para muchos miles de valoraciones. Por supuesto, cada lote de antisuero debe probarse respecto a su especificidad para la hormona (al asegurarse de que no se une también a hormonas relacionadas, un problema especial con las hormonas esteroides), y respecto a su sensibilidad. Cuando la proteína de unión es un anticuerpo o antisuero, la valoración por lo general se llama una radioinmunoensayo.

En una variante del ensayo de unión competitiva, el anticuerpo es unido de manera covalente a la superficie de perlas. Entonces es fácil separar el ligando unido y libre simplemente al lavar las perlas con amortiguador frío, dejando el ligando unido fijo a las perlas para medición de radiactividad unida. De manera alternativa, el anticuerpo puede unirse covalentemente a la superficie de un tubo de ensayo, o a cada pozo en una placa de múltiples pozos. Después de incubación, se toma la muestra para medición de la radiactividad que no está unida.

Cada vez más, a fin de minimizar la exposición a materiales radiactivos, se usa ligando o anticuerpo marcado con fluorescencia. Un desarrollo adicional es la valoración tipo sándwich, en la cual se usan dos anticuerpos diferentes contra el ligando, cada uno de los cuales se une a una región diferente del analito. El primer anticuerpo se une de manera covalente a la superficie de cada pozo de una placa de pozos múltiples, se añade la muestra y se incuba. Después de retirar del medio de incubación y de lavar cada pozo, se agrega el segundo anticuerpo, con lo cual el analito queda a manera de sándwich entre los dos anticuerpos. El segundo anticuerpo es marcado con un isótopo radiactivo o con un fluoróforo, lo que permite medir el segundo anticuerpo unido y, por ende, el ligando unido. En algunos casos, el segundo anticuerpo se marca con una enzima, y la medición del segundo anticuerpo unido y, por ende, del ligando unido, se efectúa al medir la actividad de la enzima que ahora está unida al pozo de cada celda de la placa, después de lavar para eliminar el segundo anticuerpo no unido y añadiendo un exceso del sustrato enzima. Se trata del ensayo de inmunosorbente ligada a enzima (ELISA).

Tiras sumergibles de química seca

En diversas valoraciones las enzimas o anticuerpos y reactivos pueden combinarse en una tira de plástico especialmente diseñada. Para la medición de la glucosa en sangre, una muestra de sangre obtenida mediante pinchazo en un dedo de la mano se coloca en la tira de prueba y la concentración de glucosa se mide usando un dispositivo manual llamado el glucómetro. Esto proporciona un método sencillo y fiable para estimar la glucosa al lado de la cama en un pabellón de hospital, la clínica de un médico o incluso en el hogar. Para pruebas de orina, ensayos diferentes pueden realizarse con reactivos separados en una tira de plástico llamada una tira sumergible (p. ej., para detectar o estimar de manera semicuantitativa las concentraciones de glucosa, cuerpos cetónicos, proteína, y varios otros analitos al mismo tiempo). Se dispone de tiras sumergibles similares para detectar gonadotropina coriónica humana (hCC) en la orina, como una prueba de embarazo para uso en el hogar.

Pruebas de detección de errores congénitos del metabolismo en recién nacidos

Muchos de los errores congénitos del metabolismo pueden llevar a retraso mental muy grave si el tratamiento no se inicia en etapas muy tempranas. Para enfermedades como fenilcetonuria y enfermedad de la orina con olor a jarabe de arce, la restricción en la dieta de los aminoácidos que no se metabolizan normalmente (fenilalanina en la fenilcetonuria; los aminoácidos de cadena ramificada leucina, isoleucina y valina en la enfermedad de la orina con olor a jarabe de arce) es esencial para el manejo de la enfermedad. Por ende, en casi todos los países desarrollados es habitual que se efectúen pruebas en recién nacidos para detectar esas enfermedades. La(s) concentración(es) de(l) (los) aminoácido(s) perjudicial(es) se mide(n) en una muestra de sangre que normalmente se toma una semana después del nacimiento, cuando las enzimas que están afectadas en la enfermedad deben haber alcanzado expresión completa. Más a menudo, se obtiene una muestra de sangre capilar por medio de un pinchazo en el talón y se transfiere sobre papel absorbente para ser enviada al laboratorio para análisis.

La primera prueba de detección de ese tipo para un error congénito del metabolismo fue la prueba de la inhibición bacteriana de Guthrie. Un disco del papel que contiene la muestra de sangre se coloca sobre una placa de agar que se ha sembrado con una cepa de Bacillus subtilis que requiere fenilalanina, junto con un inhibidor competitivo de la captación de fenilalanina hacia las bacterias (β-tienilalanina) a una concentración tal que competirá con la fenilalanina a las cifras que normalmente se encuentran en la sangre, de modo que las bacterias no crecerán. Si la concentración de fenilalanina es mayor que la que suele encontrarse en sangre, será captada por las bacterias más que el inhibidor, y las bacterias formarán colonias visibles en el agar.

En casi todos los centros, la prueba de la inhibición bacteriana ha sido reemplazada por técnicas cromatográficas que permiten la detección de diversos metabolitos anormales y, por ende, la detección de diversos errores congénitos del metabolismo.

Las pruebas que proporcionan información acerca del funcionamiento de órganos particulares a menudo se agrupan como pruebas de función de órgano. Esas pruebas agrupadas comprenden pruebas de la función de los riñones, el hígado y la tiroides.

Pruebas de función renal

El cuadro 48-4 lista las principales pruebas de función renal. Un examen general de orina completo incluye evaluación de las características físicas y químicas de la orina. Las características físicas por evaluar son el volumen de orina (esto requiere una muestra de orina cronometrada, por lo general de 24 horas), el olor, el color, aspecto (transparente o turbia), densidad y pH. La proteína, la glucosa, la sangre, cuerpos cetónicos, sales biliares y pigmentos biliares son constituyentes anormales de la orina que aparecen en diferentes estados patológicos (cuadro 48-5).

La urea y creatinina se excretan en la orina; sus concentraciones séricas pueden usarse como marcadores de la función renal porque la concentración sérica aumenta conforme la función renal se deteriora. La creatinina es un mejor marcador de la función renal que la urea porque su concentración en sangre no es afectada de manera significativa por factores no renales, lo que hace de ella un indicador específico de la función renal. Varios factores “prerrenales” y “posrenales” aumentan de manera significativa la concentración sanguínea de urea.

En circunstancias normales, menos de 150 mg de proteína y menos de 30 mg de albúmina, se excretan en la orina por 24 horas, lo cual se ubica por debajo del límite de detección mediante pruebas sistemáticas. La presencia de una cantidad de proteína mayor que la mencionada recibe el nombre de proteinuria y es un signo importante de enfermedad renal. La causa más común de proteinuria es la pérdida de la integridad de la membrana basal glomerular (proteinuria glomerular), como se observa en el síndrome nefrótico y en la nefropatía diabética. La principal proteína que se encuentra en la proteinuria glomerular es la albúmina. El cuadro 48-5 lista otras causas importantes de proteinuria. La microalbuminuria se define como la presencia de 30 a 300 mg de albúmina en una muestra de orina de 24 horas y es un marcador temprano de daño renal en la diabetes mellitus.

Aun cuando la creatinina sérica es un marcador de la función renal, sólo se observa un incremento significativo de su concentración en sangre cuando ha habido una declinación de alrededor de 50% de la tasa de filtración glomerular (GFR). Por ende, la medición de la creatinina sérica es una prueba con baja sensibilidad. La medición de la depuración de creatinina da un estimado de la GFR y, así, puede usarse para detectar las etapas tempranas de insuficiencia renal. La depuración es el volumen de plasma a partir del cual un compuesto se depura por completo por los riñones en una unidad de tiempo. Se calcula mediante la fórmula:

donde U es la concentración del analito medido en una muestra cronometrada de orina (por lo general de 24 horas); P es la concentración plasmática del analito y V es el volumen de orina producido por minuto (calculado al dividir el valor para el volumen de orina recolectada durante 24 horas por 1 440 [24 × 60]).

Un compuesto que es útil para medir la depuración renal tiene una concentración sanguínea bastante constante, sólo es excretado en la orina, es filtrado libremente en el glomérulo y no se resorbe ni se secreta por los túbulos renales. Si bien la depuración de creatinina se mide con frecuencia, sobreestima la GFR porque es secretada por los túbulos renales en un grado pequeño. La depuración de inulina es el método estándar para medir la GFR, porque satisface todos los criterios esenciales para que un compuesto se use en pruebas de depuración. No obstante, a diferencia de la creatinina, la inulina es un compuesto exógeno que tiene que administrarse por vía intravenosa a un ritmo constante.

Pruebas de función hepática

Las pruebas de función hepática (LFT) son un grupo de pruebas que ayudan en el diagnóstico, la evaluación del pronóstico y la vigilancia de la terapia de enfermedad del hígado (cuadro 48-6). Cada prueba evalúa un aspecto específico de la función hepática. Un aumento de la bilirrubina sérica ocurre debido a muchas causas y da por resultado ictericia. En la obstrucción del conducto biliar (ictericia obstructiva), es principalmente la bilirrubina conjugada la que aumenta. En la enfermedad hepatocelular, la bilirrubina tanto conjugada como no conjugada a menudo está alta, lo que refleja la incapacidad del hígado para captar bilirrubina, conjugarla y excretarla hacia la bilis (capítulo 31). Las concentraciones séricas totales de proteína y albúmina están bajas en enfermedades hepáticas crónicas, como la cirrosis. El tiempo de protrombina (PT, capítulo 55) puede estar prolongado en trastornos agudos del hígado debido a síntesis alterada de factores de la coagulación.

Las actividades de la alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST) séricas (capítulo 28) se encuentran significativamente elevadas varios días antes del inicio de ictericia en pacientes con hepatitis viral aguda. Se considera que la ALT es más específica para enfermedad del hígado que la AST, porque esta última se encuentra alta en casos de lesión de músculo cardíaco o esquelético, no así la ALT. La actividad de la fosfatasa alcalina (ALP) sérica está alta en presencia de ictericia obstructiva. También se observa una actividad alta de ALP sérica en pacientes con enfermedad ósea.

El hígado también es el sitio primario para la destoxificación de amoníaco (en el ciclo de la urea, capítulo 28). El aumento del amoníaco en sangre es un signo importante de enfermedad del hígado y desempeña una importante función en la patogenia de la encefalopatía hepática en pacientes con cirrosis hepática e hipertensión portal. El amoníaco en sangre también está alto en presencia de trastornos genéticos del ciclo de la urea.

La proporción albúmina:globulina (proporción A:G) a menudo proporciona información clínica útil. La proporción normal varía entre 1.2:1 y 1.6:1. Una inversión de la proporción A:G puede observarse en enfermedades en las cuales la concentración de albúmina es baja (hipoalbuminemia), o cuando las globulinas están anormalmente altas, por ejemplo, en el mieloma múltiple. La reversión de la proporción A:G a menudo es la primera investigación que despierta la sospecha de mieloma múltiple.

Pruebas de función tiroidea

La glándula tiroides secreta las hormonas tiroideas-tiroxina o tetrayodotironina (T₄) y triyodotironina (T₃). Las enfermedades asociadas con incremento o decremento de la síntesis de hormonas tiroideas (hipertiroidismo e hipotiroidismo, respectivamente) ocurren a menudo. Un diagnóstico clínico de un trastorno tiroideo se confirma al medir las cifras séricas de hormona estimulante de la tiroides, de tiroxina libre y triyodotironina.

La medición de la hormona estimulante de la tiroides (TSH) a menudo es la primera prueba que se efectúa en la evaluación de la función tiroidea. La concentración sérica de TSH está alta en el hipotiroidismo primario, y es baja o indetectable en el hipertiroidismo primario. La medición de tiroxina y triyodotironina libres ayudará a establecer el diagnóstico en la mayor parte de los casos en los cuales se obtiene un valor anormal de TSH (cuadro 48-7).

La concentración de tiroxina sérica total puede ser afectada por cambios de la concentración de la globulina transportadora de hormona tiroidea (TBG), en ausencia de enfermedad de la tiroides. La tiroxina total rara vez se mide actualmente, porque ahora se dispone de valoraciones para medir la tiroxina libre. También se dispone de otras pruebas, como la medición de autoanticuerpos contra la tiroides. Por ejemplo, la enfermedad de Graves suele asociarse con la presencia de anticuerpos contra el receptor de TSH, mientras que la tiroiditis autoinmunitaria (tiroiditis de Hashimoto) se vincula con la presencia de anticuerpos contra peroxidasa tiroidea.

Pruebas de función suprarrenal

Un diagnóstico clínico de hiperfunción suprarrenal (síndrome de Cushing) o hipofunción suprarrenal (enfermedad de Addison) se confirma mediante pruebas de función suprarrenal. La secreción de cortisol a partir de la glándula suprarrenal muestra variación diurna; las cifras séricas de cortisol son más altas durante las primeras horas de la mañana y más bajas alrededor de la medianoche. La pérdida de esta variación diurna es uno de los signos más tempranos de hiperfunción suprarrenal. Por ende, la medición del cortisol sérico en muestras de sangre extraídas a la medianoche y a las 8 a.m. es útil como una prueba de detección. Un diagnóstico de hiperfunción suprarrenal se confirma mediante la demostración de falta de supresión de la concentración de cortisol temprano por la mañana después de la administración de 1 mg de dexametasona (un potente glucocorticoide sintético) a la medianoche; ésta es la prueba de supresión con dexametasona. La medición de la hormona adrenocorticotrópica (ACTH) puede ayudar a diferenciar entre hipercortisolismo debido a producción excesiva de ACTH (dependiente de ACTH) y enfermedades en las cuales la producción de ACTH es normal o está suprimida (independiente de ACTH). La falta de aumento del cortisol sérico después de una dosis única de Synacthen (un análogo sintético de la ACTH) es diagnóstica de hipofunción suprarrenal (prueba de estimulación con Synacthen). Quizá se requieran otras pruebas bioquímicas y técnicas de obtención de imágenes (CT o MRI) para diagnosticar la causa de hiperfunción o hipofunción suprarrenal.

Marcadores de riesgo cardiovascular e infarto de miocardio

Como se considera en el capítulo 25, el colesterol total plasmático y en especial la proporción de colesterol de LDL:HDL proporciona un índice del riesgo de aparición de aterosclerosis. Las lipoproteínas plasmáticas originalmente se separaban mediante centrifugación, de ahí su clasificación por densidad. Los métodos posteriores comprendieron separación mediante electroforesis. En la actualidad, se mide el colesterol total plasmático y después las lipoproteínas que contienen apoproteína B (cuadro 25-1) son precipitadas usando un catión divalente, lo que permite la medición del colesterol asociado con HDL.

Un electrocardiograma quizá no siempre muestre cambios típicos después de un infarto de miocardio. En esas circunstancias, el aumento de la concentración sérica de troponina o isoenzima MB de la creatina cinasa, cardíacas, confirma que ha sucedido un infarto de miocardio, porque estos dos marcadores son específicos para el músculo cardíaco.

Marcadores de la función gastrointestinal

La infección gástrica por Helicobacter pylori, la causa subyacente de casi todas las úlceras pépticas, es detectada principalmente al encontrar anticuerpos contra el microorganismo en el plasma o las heces. Sin embargo, H. pylori tiene una ureasa activa, e hidroliza urea a amoníaco y dióxido de carbono; esta producción de amoníaco permite al organismo sobrevivir en las condiciones ácidas del estómago. Una prueba diagnóstica temprana y que aún se usa para confirmar la erradicación o la persistencia de la infección después de antibioticoterapia, se basa en administrar una dosis de [¹³C] urea y después medir el isótopo en el dióxido de carbono exhalado. Las úlceras pépticas atípicas debidas a la secreción excesiva de gastrina (a menudo como resultado de un tumor secretor de gastrina, un gastrinoma) pueden probarse al medir la concentración plasmática de gastrina en ayunas mediante inmunoensayo.

En la pancreatitis aguda, la actividad plasmática de la amilasa está aumentada, aunque en casos leves puede ser normal, porque la amilasa es lo bastante pequeña como para que algo se filtre en el glomérulo y se excrete en la orina. Esto significa que la medición de la amilasa en la orina también es útil en el diagnóstico de esta enfermedad. La concentración sérica de lipasa pancreática también se encuentra elevada en la pancreatitis aguda, y se considera que es más específica para pancreatitis que la amilasa, que también se sintetiza en las glándulas salivales.

En el pasado, las deficiencias de disacaridasas se probaban mediante la administración de una dosis relativamente grande del disacárido que se sospecha sea el responsable y se mide el incremento de la glucosa en sangre. Típicamente, se usaba una dosis de 50 g de lactosa a fin de efectuar pruebas para alactasia. En un paciente alactásico, ésa era una dosis lo bastante grande como para causar dolor abdominal intenso y diarrea acuosa explosiva debido al metabolismo bacteriano intestinal de la lactosa no absorbida. Una prueba más reciente comprende la administración de sólo una pequeña cantidad del disacárido, seguida por medición del hidrógeno en el aire exhalado como resultado de metabolismo por bacterias intestinales.

• Las pruebas de laboratorio pueden proporcionar información útil para el diagnóstico y el tratamiento de enfermedad, así como proporcionar información acerca del metabolismo normal y de los aspectos patológicos de la enfermedad.

• El rango de referencia de un analito es el rango ± 2 x desviaciones estándar alrededor del valor medio para el grupo de población bajo consideración. Los valores fuera de este rango de referencia son sugestivos de una anormalidad que amerita más investigación.

• La precisión de un método analítico es una medida de su reproducibilidad; la exactitud de un método es una medida de qué tan cerca está el resultado del valor verdadero.

• La sensibilidad de un método analítico es una medida de cuán poco del analito puede detectarse. La especificidad es el grado al cual otros compuestos presentes en la muestra pueden dar un resultado falso positivo.

• La sensibilidad de una prueba se refiere al porcentaje de pacientes que padecen la enfermedad, que darán un resultado positivo. La especificidad de una prueba es el porcentaje de pacientes sin la enfermedad que darán un resultado negativo.

• Las muestras para análisis por lo general se realizan en sangre y orina, aunque a veces también se usan saliva, heces y líquido cefalorraquídeo. Pueden recolectarse muestras de sangre en tubos que contienen un anticoagulante (para muestras de plasma) o sin este último (para muestras de suero).

• Muchos análisis de laboratorio se fundamentan en la producción de un producto coloreado que puede medirse mediante espectrofotometría de absorción o fluorimetría.

• Muchos compuestos pueden medirse mediante cromatografía líquida de alta presión, a veces conjuntamente con espectrometría de masa. La medición de un gran número de analitos en una muestra es la base de la metabolómica, y de la metabonómica, que es el efecto de una enfermedad, un fármaco u otro tratamiento sobre el metabolismo.

• Las enzimas pueden usarse como reactivos para proporcionar métodos de valoración sensibles y específicos para analitos. En este caso debe haber un exceso de enzima en la muestra, de modo que el factor limitante es la concentración del analito en la muestra.

• Muchas enzimas son liberadas hacia el torrente sanguíneo a partir de células que están muriendo en presencia de enfermedad, y su medición puede proporcionar información diagnóstica y pronóstica útil. A fin de determinar la actividad de una enzima en una muestra, debe haber un exceso de sustrato, de modo que el factor limitante es la cantidad de enzima presente.

• Muchos analitos (y en especial hormonas) se miden mediante valoraciones de unión competitivas, usando sea una proteína transportadora natural o un antisuero o anticuerpo monoclonal para unirse al ligando. Se usan cantidades traza de ligando radiactivo de actividad específica alta, o ligando o proteína transportadora marcado con fluorescencia.