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Los receptores de membrana son la diana de una gran variedad de hormonas, neurotransmisores, factores de crecimiento, etc., de estructura proteica, peptídica, o incluso de sólo algunos aminoácidos modificados y que se consideran los primeros mensajeros en la comunicación. Tras la unión del ligando se inicia una serie de eventos en la membrana que inducen la generación de un segundo mensajero intracelular, el cual dispara la activación de otra serie de moléculas e induce una cascada de señales, que en última instancia altera la fisiología de la célula.
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Estructura de los receptores de membrana
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Los receptores de membrana son proteínas integrales de membrana que se caracterizan por poseer tres diferentes dominios: extracelular, transmembrana y citoplasmático o intracelular. El dominio extracelular es el de interacción con el ligando; el dominio transmembrana es de naturaleza hidrofóbica, por lo que la molécula se encuentra “confortable” en la bicapa lipídica, y sirve como anclaje del receptor en la membrana. El dominio intracelular suele formar una cola o lazo en la parte final del receptor, y se sitúa dentro del citoplasma, donde, mediante diferentes mecanismos interacciona a través de su región efectora con otras moléculas, con lo que genera segundos mensajeros intracelulares. Los receptores de membrana se agruparon en diferentes familias con base en su estructura. A continuación se describirá cada familia de receptores, sus ligandos más representativos, los segundos mensajeros que se generaron en cada caso, y el mecanismo de señalización intracelular que desencadenan.
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Receptores acoplados a proteínas G (GPCR)
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Los receptores acoplados a proteínas G (GPCR, G protein-coupled receptors) forman la mayor familia de receptores de membrana. Si bien es más correcto denominarlos receptores con siete dominios transmembrana (7TMR), ya que se describieron casos de receptores de este tipo con capacidad de señalizar independientemente de proteínas G, en este capítulo se adoptará la nomenclatura clásica de GPCR por ser la más extendida. Los GPCR forman la mayor familia de receptores de membrana. Entre los receptores de membrana, los GPCR son los más diversos y conservados evolutivamente y, a pesar de la similitud existente en la estructura de su dominio transmembrana, cada receptor es activado por diferentes ligandos (figura 69-1). Los GPCR están involucrados en la mayoría de las funciones fisiológicas del organismo, reconociendo y transduciendo la señal de la mayoría de hormonas y neurotransmisores, así como de los estímulos sensoriales que se relacionan con la visión, el tacto y el olfato. Entre los diferentes ligandos cabe destacar a las hormonas glucoproteicas, como la tirotropina (TSH), la hormona luteinizante (LH), la hormona estimulante del folículo (FSH), la corticotropina (ACTH), otras hormonas como el glucagon, la vasopresina, la somatostina, la calcitonina, la parathormona (PTH), la adrenalina, la noradrenalina, y un largo etc. Con base en diferentes estudios se ha descrito un modelo común para estos receptores, que consiste en un núcleo central compuesto por siete hélices transmembrana (TMI-VII) que se conectan por tres lazos intracelulares (i1, i2, i3) y tres extracelulares (e1, e2, e3). La mayoría de estos receptores tiene dos residuos de cisteína altamente conservados en los lazos e1 y e2, entre los que se forma un puente disulfuro necesario para la estabilización de la estructura del receptor. La variación en cuanto a secuencia de los distintos GPCR hace que éstos difieran en la longitud de sus extremos amino y carboxiterminal, dominios extra e intracelular, respectivamente. Cada uno de estos dominios confiere propiedades específicas a cada receptor. El dominio central, transmembrana (TM), sufre un cambio conformacional tras la unión del ligando correspondiente, normalmente al dominio extracelular. Esta modificación de la estructura transmembrana se transmite al dominio intracelular del receptor, lo que le permite interaccionar con y activar a sus moléculas efectoras.
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Se pueden encontrar diversas clasificaciones de la superfamilia de GPCR atendiendo tanto a criterios fisiológicos como estructurales. La clasificación más novedosa de los receptores humanos de esta superfamilia se basa en el análisis filogenético del genoma humano, y se denomina sistema GRAFS (Glutamato, Rodopsina, Adhesión, Frizzled/Taste2 y Secretina) por las iniciales del receptor que da nombre a cada familia. Si se tiene en cuenta a los receptores de todas las especies, en función del sitio de unión del ligando, los GPCR se dividieron en tres familias y varias subfamilias (figura 69-1). La familia 1 o familia de la rodopsina es la que cuenta con el mayor número de miembros, alrededor de 670. Estos receptores se unen a una gran variedad de ligandos, tales como péptidos, aminas y purinas, y es también la familia que contiene el mayor número de receptores, que son diana de drogas que se utilizan en clínica. La subfamilia 1-a comprende receptores cuyos ligandos se unen en una cavidad formada por los dominios TM-III a TM-VI. Entre estos receptores se incluyen la rodopsina y los receptores β-adrenérgicos. La subfamilia 1-b está activada por pequeños péptidos, que interaccionan con el lazo extracelular en el extremo aminoterminal. Finalmente, la subfamilia 1-c es activada por moléculas mayores de naturaleza proteica. Los receptores de esta subfamilia presentan un gran dominio extracelular, que se encarga del reconocimiento y unión del ligando, que en este caso son hormonas glucoproteicas, como la TSH, la LH y la FSH, que se unen a los lazos extracelulares e1 y e3. La familia 2 de receptores, activada por grandes péptidos, como el glucagon, el péptido intestinal vasoactivo (VIP), el polipéptido activador de la adenilil ciclasa de pituitaria (PACAP), la secretina, la PTH, etc., posee un gran extremo aminoterminal, importante en la unión del ligando. La familia 3 de los GPCR presenta numerosas peculiaridades. Algunos de sus integrantes son los receptores metabotrópicos del glutamato (mGluR), el receptor sensible a calcio (CaR), receptores de feromonas y el receptor del ácido γ-aminobutírico (GABA). Estos receptores poseen un dominio extracelular muy largo, con una secuencia similar a la de las proteínas periplasmáticas de las bacterias, en las que están implicadas en el transporte de aminoácidos, iones, azúcares o péptidos. El final de este largo dominio extracelular está constituido por dos lóbulos que se separan por una región bisagra que se cierra cuando se une el ligando. Otros receptores que pertenecen a esta familia son los receptores frizzled y smoothened, cuyos ligandos son morfógenos, como Wnt y Shh (sonic hedgehog), que participan en las señales que controlan el desarrollo embrionario, manteniendo la polaridad celular y la segmentación.
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La diferencia fundamental entre los GPCR y el resto de receptores de membrana consiste en la presencia de un complejo de proteínas que transmiten la señal desde el receptor hasta sus enzimas efectoras. Estas proteínas intermediarias se denominan proteínas G, debido a su capacidad de relacionarse con los nucleótidos de guanina GDP (guanosina difosfato) y GTP (guanosina trifosfato) (figura 69-2). En su estado inactivo, las proteínas G presentan una composición heterotrimérica, formada por una subunidad α de 39-52 kD, una subunidad β de 35 kD y una subunidad γ de 7-9 kD, de las que se identificaron 21, 6 y 12 isoformas, respectivamente. Aunque no todas las isoformas son capaces de formar parte del mismo complejo, el número de combinaciones posibles es muy elevado, en consonancia con el gran número de receptores distintos a los que se vinculan. Estas proteínas actúan como interruptores moleculares, alternando entre dos conformaciones: Asociadas con GDP en su estado inactivo, o a GTP en su estado activo. La transmisión de la señal a través de estos complejos opera de la siguiente manera. En ausencia de estímulo, las tres subunidades de proteínas G permanecen relacionadas con la subunidad α unida a un nucleótido de GDP. La unión del ligando a la región externa del receptor promueve un cambio conformacional que permite al receptor reconocer y vincularse con el complejo de proteínas G. Dicha unión induce la separación del GDP y la entrada de un nucleótido de GTP, debido a la elevada relación GTP/GDP existente en las cercanías del receptor. En estas condiciones, la subunidad Gα pierde afinidad por el dímero Gβγ, y se separa del complejo, lo que permite que ambos interaccionen con sus efectores. La señal termina merced a la capacidad GTPasa intrínseca de la subunidad Gα, que hidroliza el GTP asociado, dando lugar a GDP. En este estado la subunidad Gα recupera la afinidad por el complejo Gβγ y se une a éste a la espera de un nuevo estímulo (figura 69-2). Las subunidades β y γ. están relacionadas covalentemente, formando un dímero estable que no se disocia, salvo en condiciones desnaturalizantes. Por el contrario, la subunidad α está unida a la β sólo por contactos discretos, y se disocia reversiblemente durante el ciclo funcional de la proteína G. Las cadenas α y las cadenas γ sufren modificaciones postraduccionales para permitir su anclaje a la membrana. En concreto, un grupo acilo (miristoílo, C12, o palmitoílo, C16) se une covalentemente con el grupo —SH de una Cys en el extremo N-terminal de Gα (en un motivo CAAX). Por otra parte, el extremo C-terminal de G-γ tiene unido un grupo isoprenoide (farnesilo o geranil-geranilo).
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Las proteínas G se dividen en cuatro familias, dependiendo de la similitud funcional y de secuencia de la proteína Gα que forma parte del complejo. Así, se distinguen entre proteínas Gs, Gi/G0, Gq/G11 y G12/13. Quizá la mejor conocida sea la familia Gs, cuya subunidad α es capaz de activar a la enzima adenilato ciclasa, que actuaría sobre su sustrato, el ATP (adenosina trifosfato), generando el segundo mensajero 3ʹ-5ʹ cAMP (3ʹ-5ʹ adenosín monofosfato cíclico) (figura 69-2). Por esta enorme variedad de ligandos, receptores y proteínas G, se acepta que los GPCR representan la forma más diversa de los sistemas de transducción de señales, y posiblemente de todas las familias de proteínas, de las células eucariotas. Las consecuencias bioquímicas y biológicas que desencadenan albergan, además, otra gran complejidad, como se verá a continuación.
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Vías de señalización que conectan los GPCR con el núcleo
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a) cAMP y PKA. El cAMP descubierto por Sutherland, en 1950, es un nucleótido cíclico que se genera a partir de ATP por la acción de la adenilato-ciclasa, y se le considera como el segundo mensajero más importante en la respuesta de los GPCR. La concentración intracelular de cAMP aumenta o disminuye por una gran variedad de hormonas, y estas fluctuaciones afectan una gran variedad de procesos. Uno de los efectos más destacado de las concentraciones elevadas de cAMP es la activación de la proteína quinasa dependiente de cAMP o PKA. La holoenzima inactiva es un heterotetrámero compuesto por dos subunidades reguladoras “R”, y dos catalíticas “C”. La activación se produce cuando el cAMP se une a la subunidad R, lo que provoca la separación de la subunidad C. En mamíferos existen al menos dos tipos de enzimas, PKAI y PKAII, que se distinguen por las isoformas de subunidades R que forman parte del complejo. Cada una de ellas posee una localización celular y una distribución específica de especie y de tejido, así como diferentes afinidades por el cAMP. Estas observaciones sugieren que la PKAI y PKAII descifran las señales del segundo mensajero cAMP con diferente duración y actúan sobre diferentes dianas. Para el correcto funcionamiento de la PKA se requieren, además, otras proteínas, como las fosfodiesterasas (PDE), que permiten la terminación de la señal del cAMP mediante su degradación, y las proteínas de anclaje AKAP (A-kinase anchoring protein), que localizan a la PKA en sitios específicos y crean así microambientes que permiten la señalización (figura 69-3A).
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Clásicamente la activación por la PKA promueve la fosforilación de sustratos específicos como la familia de factores de transcripción CREB (cAMP-Response Element Binding Protein) o la molécula coactivadora CBP/p300 (CREB-Binding Protein). Las proteínas CREB son factores de transcripción que se unen a secuencias específicas denominadas CRE (cAMP-Response Element), presentes en los promotores de los genes regulados por cAMP. Estos genes controlan mecanismos de crecimiento y diferenciación celular, entre otros. Sin embargo, a pesar de la linealidad de esta ruta y su aparente simplicidad, datos recientes han complicado este modelo, ya que CREB no es el único factor de transcripción que se activa en respuesta al cAMP. En el ovario, por ejemplo, es capaz de estimular al factor de transcripción Sp1 y al receptor de estrógenos α/β (ER α/β). También se demostró que CREB puede ser regulado por otras quinasas aparte de la PKA, como la calmodulina quinasa o RSK (Ribosomal S6 Kinase). A su vez, CBP/p300 no se relaciona exclusivamente con CREB, sino que se une a una cantidad considerable de otros factores de transcripción, entre los que se encuentra el NFκB, miembros de la superfamilia de receptores nucleares (véase más adelante) y más. Por otra parte, se demostró que la PKA es capaz no sólo de activar, sino también de inhibir otras cascadas de señalización, como la de las MAPK (mitogen-activated protein kinases) o la de la PI3K (phosphoinositide 3-kinase), de manera específica del tipo celular. Esta información recoge sólo algunos ejemplos de la multiplicidad de señales que se originaron por los GPCR, el cAMP y la PKA (figura 69-3B).
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Hasta hace poco se han descrito mecanismos inducidos por cAMP de manera independiente de la PKA, lo que indica que el cAMP es capaz de interaccionar con otras proteínas. Esta vía alternativa está formada por una nueva clase de proteínas de unión a cAMP que se denominan cAMP-GEF (cAMP-guanine-nucleotide exchange factor) o Epac (exchanged protein activated by cAMP) (figura 69-4). Entre los distintos efectores descritos para estas proteínas destacan las GTPasas Ras, Rap y Rho, o las fosfolipasas C-ε y D. A través de estas proteínas, Epac es capaz de activar importantes rutas de señalización como la de las MAPK o de la PI3K, y de modular canales iónicos, el citoesqueleto de actina, la adhesión celular o procesos de exocitosis.
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b) MAPK y Ras. Los mecanismos que controlan la proliferación se atribuyen, en especial, a receptores con actividad tirosina quinasa, mientras que los GPCR se relacionan, por tradición con la ejecución de funciones especializadas, en células diferenciadas finalmente y en tejidos específicos. Sin embargo, los GPCR se expresan también en células que proliferan y se han implicado en la embriogénesis, la reparación de tejidos y la inducción del crecimiento.
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En los últimos años se ha descrito que los GPCR son capaces de activar la vía de las MAPK para controlar la proliferación celular. Este mecanismo tiene lugar a través de las subunidades βγ de las proteínas G vinculadas con el receptor y de manera dependiente de la GTPasa Ras. Para que esta activación tenga lugar, en células de mamíferos, es necesaria una serie de moléculas que conectan la activación del GPCR con la de las MAPK, incluyendo a tirosina quinasas, quinasas lipídicas, moléculas adaptadoras, la PKC (fosfoquinasa C), y ciertos factores de intercambio de nucleótidos para Ras.
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Desensibilización de los GPCR
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Todos los sistemas de GPCR varían su actividad dependiendo del contexto. Es decir, la sensibilidad del receptor se modula por la cantidad de señales que generan en una célula dada, ajustando su sensibilidad al grado de concentración del agonista a la que están expuestos. De este modo los receptores se de-sensibilizan frente a una exposición prolongada o repetida a altas concentraciones de agonista, y se resensibilizan cuando no están expuestos al agonista durante cierto tiempo. La desensibilización de estos receptores es una respuesta adaptativa, mediante la cual las células regulan la señalización de las proteínas G, para prevenir los efectos perjudiciales que resultarían de la estimulación permanente del receptor en presencia de concentraciones elevadas y continuadas del agonista. El mecanismo de desensibilización parece ser universal y conservado entre todos los GPCR. Este mecanismo es responsable de más de 80% de la disminución de la señal inducida por el receptor.
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En este proceso de control de la respuesta del receptor, hay dos proteínas que presentan un papel central: las quinasas de receptores acoplados a proteínas G (GRK) y las arrestinas. Las GRK reconocen y se unen al receptor activado, lo que promueve, a su vez, su activación y la fosforilación del receptor en residuos específicos de los lazos intracelulares y del extremo carboxiterminal. Una vez fosforilados, los receptores actúan como sustratos de las arrestinas, que se unen a ellos e impiden la activación de otros complejos de proteínas G por el receptor. La fosforilación por GRK y la unión de la arrestina provoca, por tanto, la finalización de la señalización a través de proteínas G, incluso con la presencia continuada del estímulo activador del receptor. La pareja GRK-arrestina también realiza otras funciones, tales como facilitar la internalización del receptor en zonas de la membrana recubiertas con clatrina. Mediante su unión a proteínas señalizadoras adicionales, las GRK-arrestinas pueden funcionar, al mismo tiempo, como interruptores que redirigen la función del receptor de inducir la señalización a través de proteínas G heterotriméricas a la activación de rutas independientes de proteínas G. La GRK puede también inhibir la señalización del receptor al secuestrar a la subunidad Gα, lo que impide su acoplamiento a los siguientes efectores. La fosforilación de los GPCR puede realizarse por otras quinasas, como las proteínas quinasas A y C (PKA y PKC) o la quinasa c-Src. En la figura 69-5 se esquematizan y detallan los distintos mecanismos que conducen a la desensibilización de los GPCR.
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Receptores con actividad tirosina quinasa (RTK)
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Los receptores con actividad tirosina quinasa (RTK) constituyen un amplio grupo de receptores de membrana que pueden clasificarse en diferentes familias dependiendo de: (i) su reconocimiento por distintos ligandos, (ii) las respuestas biológicas que desencadenan y (iii) su estructura primaria. Estos receptores controlan procesos biológicos fundamentales, como la proliferación, la diferenciación o la migración celular. Los RTK son glucoproteínas de membrana con un dominio amino-terminal rico en cisteínas, que corresponde al dominio extracelular de unión al ligando (hormonas o factores de crecimiento). Este dominio conecta con el dominio citoplasmático mediante una única hélice transmembrana con un elevado carácter hidrofóbico. El dominio citoplasmático contiene una región conservada con actividad tirosina quinasa intrínseca, que fosforila proteínas en residuos de tirosina y un dominio carboxiterminal con capacidad de autofosforilación. Moléculas como las linfoquinas y el interferón transmiten su señal al interior de la célula a través de este tipo de receptores; sin embargo, éstos no poseen actividad tirosina quinasa intrínseca, sino que transmiten su señal reclutando proteínas que sí poseen la capacidad de fosforilar residuos de tirosina, como la familia de proteínas tirosina quinasa de tipo no receptor JAK (Janus Kinase). Con la excepción de los receptores de insulina (figura 69-6) e IGF, que son dímeros, todos los RTK (EGF-R para el epidermal growth factor, FGF-R para el fibroblast growth factor, PDGF-R para el platelet-derived growth factor, VEGF-R para el vascular endothelium growth factor, etc.) se encuentran como monómeros en la membrana celular y, tras la unión del ligando, tiene lugar su dimerización, lo que promueve su activación y la subsiguiente autofosforilación de sus dominios citoplasmáticos. En su forma activa, por tanto, todos los receptores RTK presentan una estructura homodimérica.
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Aunque los RTK se activan por dimerización, los diferentes ligandos usan estrategias distintas para inducir la asociación de los monómeros. Así, se demostró que en el caso del receptor de la hormona de crecimiento (GH), esta citoquina es bivalente, y un ligando se une simultáneamente a dos moléculas de receptor, lo que permite su acercamiento. La dimerización del receptor se estabiliza posteriormente mediante interacciones adicionales receptor-receptor.
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Otros receptores transmembrana: TGF-β-R y la vía de las Smads
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La superfamilia de TGF-β (transformin growth factor beta) comprende a miembros importantes en fisiología, ya que regula muchos procesos durante el desarrollo y en la homeostasis celular. Esta superfamilia se divide en varios subgrupos: Los propios TGF-β, las BMP (bone morphogeneic proteins), y las activinas (péptidos, que entre otras acciones activan la función ovárica) e inhibinas (que inhiben la síntesis y secreción de la FSH hipofisaria). Todos los miembros de esta superfamilia utilizan una misma clase de receptores de membrana, con actividad serina/treonina quinasa en su dominio intracelular, que se divide a su vez en dos subclases: Receptores del tipo I y del tipo II. La unión del ligando promueve la relación de los receptores en un complejo heterotetramérico, en el que el receptor de tipo II fosforila y activa al receptor de tipo I. En este estado el receptor de tipo I es capaz de reconocer a unas proteínas que se denominan Smad, que son la clave en la transducción de la señal de la familia TGF-β (figura 69-7).
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Las Smad componen una clase única de moléculas de señalización. Se han descrito 8 proteínas Smad en el genoma de mamíferos, que se subdividen en tres clases diferentes: (i) las Smad reguladas por el receptor (R-Smad 1, 2, 3, 5 y 8); (ii) el mediador común Smad4 y (iii) las Smad inhibidoras (I-Smad 6 y 7). Todas ellas están estructuralmente relacionadas, y poseen un dominio amino terminal que se conoce como MH1 (MAD Homology Domain 1) seguido de una región de unión y un extremo carboxiterminal o región MH2. Cada uno de estos dominios es crítico para la funcionalidad de estas proteínas, que modulan a sus efectores principalmente a través de interacciones proteína-proteína y proteína-ADN.
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Las interacciones entre el receptor del tipo I y las R-Smad son importantes en la respuesta a los diferentes ligandos. Así, los receptores de BMP del tipo I fosforilan a las R-Smad1, 5 y 8; mientras que los de TGF-β y activina sólo fosforilan a las R- Smad2 y 3. Además, diversas proteínas de anclaje como SARA (Smad anchor for receptor activation) pueden facilitar la activación de las R-Smad de la vía TGFβ/activina, uniéndose directamente a la R-Smad2 no fosforilada y reclutándola a la membrana. La fosforilación de las R-Smad induce su disociación de la proteína SARA y del receptor, quedándose en forma monomérica o heterodimérica tras su unión a Smad4. La fosforilación también es la responsable de la translocación de los anteriores dímeros al núcleo, donde organiza la transcripción por interacción directa con el ADN o con proteínas de unión al ADN, regulando de este modo la expresión de sus genes diana. Cabe también destacar que las proteínas Smad están reguladas por un mecanismo de degradación, que incluye su ubiquitinación y posterior degradación por la vía del proteosoma.
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Otras proteínas quinasas como mediadoras de la respuesta celular
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Las proteínas quinasas son una gran familia de proteínas que comprende hasta 2% de los genes eucariotas. La fosforilación de proteínas afecta a mecanismos esenciales de las células, como son el metabolismo, la proliferación, la diferenciación, la motilidad, etc. Diferentes quinasas regulan mecanismos de respuesta celular, entre ellas: las calcio/calmodulina quinasas (CAMKII), la glucógeno sintasa kinasa-3 (GSK3), la proteína quinasa C (PKC), etc. En este apartado daremos una visión general de la PKC por su importancia en el mecanismo de transmisión de señales en respuesta a hormonas y factores de crecimiento.
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Proteína quinasa C (PKC)
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Constituye una amplia familia compuesta por 10 miembros que se agrupan en función de sus dominios estructurales, los cuales dictan la dependencia de cofactores. La PKC transduce las señales extracelulares a partir de la hidrólisis de lípidos. Dependiendo de la isoforma, las distintas PKC son activadas en respuesta a diacilglicerol (DAG), calcio y/o fosfolípidos. La PKC fosforila una serie de proteínas diana implicada en respuestas proliferativas y de diferenciación. La función de la PKC depende de la regulación coordinada de tres parámetros: Fosforilación/desfosforilación, translocación y anclaje a la membrana celular. Cualquier suceso que altere estos tres parámetros provoca la inhibición de su actividad enzimática. En apartados anteriores se ha hecho mención al papel de la PKC en el mecanismo de señalización de los GPCR, de la insulina y la GH, entre otros. La importancia de esta quinasa estriba en que es la diana de acción de los ésteres de forbol, promotores tumorales importantes en el proceso de tumorigénesis. Estos compuestos, a través de PKC, inducen una cascada de fosforilaciones que desencadenan la activación de los factores de transcripción jun, fos y fra, la formación de complejos AP1 y la inducción de genes cuyos promotores contienen sitios AP1, que se relacionaron con la progresión tumoral.
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Proteína quinasa dependiente de cGMP
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Una vez establecido el papel del cAMP como mediador de la acción hormonal, se consideró que otros nucleótidos cíclicos estructuralmente relacionados también podrían participar como mensajeros intracelulares de la acción hormonal. Aunque la hipótesis era atractiva, sólo permitió caracterizar una actividad guanilato ciclasa en la membrana y el citosol de algunos tipos celulares, pero no identificar un sistema de regulación basado en la conversión de GTP en cGMP. La participación del cGMP intracelular se determinó al identificar a dos familias de enzima con actividad guanilato ciclasa: La familia del receptor del péptido natriurético auricular y las guanilato ciclasas regulables por óxido nítrico (NO). El receptor del péptido natriurético es una proteína de membrana que sufre un cambio conformacional tras la unión del ligando y aumenta la actividad guanilato ciclasa acoplada al dominio citoplasmático.
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La isoforma constitutiva de la NO sintasa (cNO), presente en células endoteliales, convierte la arginina en citrulina y NO. El radical gaseoso NO difunde desde las células endoteliales a las células del tejido muscular liso, donde se une al centro activo de la guanilato ciclasa y estimula la formación del cGMP en las células vecinas de la musculatura lisa, donde activa a una proteína quinasa denominada PKG. Aunque la PKG se descubrió hace más de 30 años, su papel en los sistemas biológicos aún no está bien definido. La PKG es miembro de la familia de serina/treonina quinasas y une con alta afinidad tanto cAMP como cGMP. En la actualidad se considera a la PKG como una proteína quinasa muy importante en procesos biológicos como la contracción de células musculares lisas, regulando procesos como la presión sanguínea, la función eréctil y la motilidad gastrointestinal. El conocido fármaco Viagra® funciona como un inhibidor de la PDE5, lo que permite mantener la producción de cGMP y la activación de PKG. La importancia que ha adquirido el NO en los sistemas biológicos en las dos últimas décadas, ha abierto nuevas áreas de exploración de su mecanismo de actuación en áreas de investigación vascular, así como de su farmacología.
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Otras moléculas implicadas en la señalización celular
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Entre el conjunto de todas las moléculas que se han descrito hasta el momento, cabe destacar a otras moléculas importantes en la interpretación de las señales de ligandos como hormonas, citoquinas, neurotransmisores, etc. Además de las quinasas ya descritas, no podemos dejar de mencionar a las fosfatasas (serina/treonina fosfatasas y tirosina fosfatasas). Estas enzimas funcionan desfosforilando residuos específicos y, por tanto, cumplen funciones opuestas a las de las quinasas. A cada quinasa suele contraponerse una fosfatasa. Las funciones de estas fosfatasas son muy diversas, y están reguladas con gran precisión. Están cobrando cada día más relevancia, no sólo en la señalización intracelular sino también en medicina. Un ejemplo de este importante grupo de enzimas sería la fosfatasa PTEN (fosfatasa y homólogo de tensina delecionado en el cromosoma 10), que se opone a la acción de la PI3K, y desfosforila al segundo mensajero PIP3 (fosfatidilinositol 3,4,5 trifosfato), con lo que se permite la finalización de su señal. Las mutaciones inactivadoras de PTEN se relacionan con la progresión y malignidad de numerosos tumores en humanos.
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Otros mediadores importantes son el Ca2+ y las enzimas encargadas de su movilización, como la fosfolipasa C (PLC), la inositol 1,4,5-trifosfato (InsP3) 3-quinasa o la 5-fosfatasa. La isoforma β de la PLC está regulada por hormonas que transmiten su señal al interior celular a través de GPCR acoplados a proteínas de tipo Gq/G11.
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Finalmente, se debe resaltar el papel de los lípidos y de sus derivados como segundos mensajeros. A los que ya se mencionó en el apartado 1 como, DAG, inositoles y fosfolipasas, hay que añadir el ácido araquidónico, las prostaglandinas, los leucotrienos y las ceramidas. Estas últimas median respuestas celulares variadas, entre las que cabe destacar los procesos de apoptosis y senescencia, como los inducidos por el TNFα (tumor necrosis factor α). Esta citoquina, se une a receptores específicos de membrana no relacionados estructuralmente con otras familias de receptores. Tras la unión del TNFα a su receptor, se induce la activación de la esfingomielinasa neutra (N-SMasa), mecanismo en el que participa una proteína denominada FAN (factor associated with N-SMase activation). La N-SMasa procesa la esfingomielina y genera ceramida, que estimula a una serina/treonina quinasa que se denomina CAPK (ceramide activated protein kinase), la cual actúa directamente sobre Raf y activa la vía MEK/MAPK de forma independiente de Ras. Los efectos sobre esta cascada de señales se relacionaron tanto con la respuesta proliferativa como con la respuesta antiinflamatoria, y desempeñan, en este caso, un papel importante la activación por estas quinasas de la PLA2 (figura 69-8); sin embargo, un número creciente de artículos relacionan a esta esfingomielinasa con el proceso de apoptosis.
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La activación de la esfingomielinasa acídica (A-SMasa) lisosómica tiene lugar a través de su unión a la proteína TRADD (TNFRSF1A-associated via death domain), que se une a una región del receptor del TNFα denominada death domain por su implicación con procesos de apoptosis celular. La A-SMasa puede activarse en respuesta a agentes que producen daño celular, como radiaciones ionizantes, luz ultravioleta, choque térmico y agentes antimitóticos. Las señales antiproliferativas del TNFα y de los otros agentes estimuladores de la A-SMasa convergen en la activación de un nuevo tipo de MAPK sensibles a ceramida, que se denominan quinasas del extremo N-terminal de Jun (JNK). Además de usar un mecanismo de acción diferente, estas quinasas se distinguen de las MAPK clásicas por regular respuestas biológicas diferentes. Tanto la ceramida generada por las A-SMasa, como el ácido araquidónico (AA) que deriva de la activación de la PLA2 por acción de la N-SMasa de membrana, activan a la PKCξ, implicada junto con la JNK en la activación del NFκB, que se transloca al núcleo, donde actúa regulando la transcripción de genes específicos implicados en la inflamación. En conclusión, la generación de ceramida por diferentes esfingomielinasas (SMasa), condiciona la activación de dos vías de señalización diferentes, que regulan distintos procesos celulares, y que van desde la proliferación a la inflamación o la apoptosis (figura 69-8).
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Receptores acoplados a canales iónicos
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Otras proteínas de membrana decisivas para la comunicación celular son las proteínas de transporte y las proteínas receptoras que se relacionan con canales iónicos. Las proteínas transportadoras se unen al soluto específico el cual va a ser transportado, y sufren una serie de cambios conformacionales que permiten su transferencia a través de la membrana. Las proteínas asociadas con canales iónicos no se unen al soluto, sino que forman poros hidrofílicos que atraviesan la bicapa lipídica; cuando estos poros están abiertos permiten que determinados solutos, habitualmente iones inorgánicos de tamaño y carga apropiados, pasen a través de ellos. Esta comunicación por canales es rápida y ocurre en la transmisión sináptica entre células excitables eléctricamente. Así, los neurotransmisores abren o cierran transitoriamente el canal iónico al que están unidos, alterando brevemente la permeabilidad iónica de la membrana plasmática y, por tanto, modificando la excitabilidad de la célula postsináptica. Estos receptores pertenecen a una familia de proteínas transmembrana que la atraviesan varias veces y que son homólogas entre sí; cada una de ellas es responsable de la transferencia de una molécula o un ion específicos, o de un grupo de moléculas o iones afines.
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Todas las proteínas de canal y muchas proteínas transportadoras, sólo permiten que los solutos atraviesen la membrana de forma pasiva mediante un proceso de difusión facilitada. Sin embargo, las células también necesitan proteínas de transporte que bombeen activamente ciertos solutos en contra de su gradiente electroquímico, en un proceso de transporte activo acoplado a una fuente de energía metabólica como la hidrólisis de ATP o un gradiente iónico.
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Entre las proteínas de transporte activo se encuentran los transportadores sencillos o uniportes, que simplemente transportan un soluto de un lado al otro de la membrana, y los transportadores acoplados, en los que la transferencia del soluto depende del transporte simultáneo o secuencial de un segundo soluto. Cuando ambos solutos se transportan en el mismo sentido el transportador se denomina simporte; si se transportan en sentidos opuestos, se conoce como antiporte (figura 69-9).
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Como ejemplo de transportadores, por su función en la fisiología endocrina, se deben citar los transportadores de glucosa (GLUT), que son transportadores pasivos, las bombas de iones (ATPasa de Na+/K−, ATPasa de Ca2+) como ejemplo de transporte activo, y el transportador de I− de la célula tiroidea, que es un simporte dependiente de Na+.
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A diferencia de las proteínas transportadoras, las proteínas de canal son proteínas integrales de membrana que forman poros acuosos a través de la bicapa lipídica y permiten a los iones inorgánicos de un tamaño y carga adecuados atravesarla. La importancia de los canales iónicos en la función celular se ha reconocido en los últimos años, y se sabe que participan de manera crucial en mecanismos de transducción de señales externas e internas que permiten a la célula modular su actividad de acuerdo con el medio que la rodea. Los canales iónicos están involucrados en fenómenos tan diversos como la excitabilidad eléctrica y química, la secreción, la contracción muscular, la fecundación, la diferenciación celular, las reacciones inmunitarias, etc. Estos canales iónicos son muy eficientes, ya que a través de ellos pueden pasar más de un millón de iones cada segundo. Así, los iones inorgánicos, mayoritariamente Na+, K+, Ca2+ o Cl−, pueden difundir en favor de gradiente electroquímico. Este flujo está regulado de manera muy precisa, y ejemplo de ello son las células musculares y nerviosas, que se especializaron en la utilización de canales iónicos para recibir, conducir y transmitir señales. Los canales son selectivos para el ion que transportan y fluctúan entre estados abiertos y cerrados. La apertura del canal está finamente regulada por: (i) ligandos extracelulares o intracelulares, (ii) voltaje y (iii) impulsos mecánicos.
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Entre los ligandos que regulan canales están los neurotransmisores, que convierten las señales químicas en eléctricas durante la sinapsis. Así, los neurotransmisores excitadores, como la acetilcolina y el glutamato abren de forma transitoria canales catiónicos despolarizando la membrana postsináptica hacia el potencial de disparo para iniciar un potencial de acción; los neurotransmisores inhibidores, como el GABA abren canales de Cl− suprimiendo la generación del potencial de acción al hacer a la membrana postsináptica más polarizada. Una subclase especial de canales iónicos regulados por glutamato, son los que regulan los receptores del NMDA (ácido N-metil-d-aspártico), que son muy permeables al Ca2+, el cual puede desencadenar cambios a largo plazo en las sinapsis. Estos tipos de canales están implicados en algunas formas de aprendizaje y de memoria.
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Entre los canales regulados por voltaje están los canales de Na+, de K+ y de Ca2+. La integración neuronal requiere la combinación de al menos tres tipos de canales de K+ diferentes y uno selectivo para el Ca2+. Los tres tipos de canales de K+ presentan propiedades diferentes y se dividen en canales retardados, tempranos y activados por Ca2+. En la mayoría de las células animales, el canal retardado de K+ desempeña un papel importante en la generación del potencial de reposo de la membrana plasmática. El canal de K+ activado por Ca2+ es estructural y funcionalmente diferente de cualquier otro tipo de canal descrito anteriormente, y se abre en respuesta a una elevada concentración de Ca2+.
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El Ca2+ está más concentrado en el exterior que en el interior de la célula, por lo que este ion tiende a entrar en la célula, y los canales de Ca2+ producen despolarización cuando se abren, lo mismo que sucede con los canales de Na+. La despolarización que producen los canales de Ca2+ es menos acentuada que la que producen otros canales, pues la concentración extracelular de Ca2+ no es tan elevada. Los canales de Ca2+, además de producir despolarización, hacen que aumente la concentración intracelular de Ca2+, lo que constituye una señal para la activación de muchas funciones celulares. El Ca2+ es un regulador clave de una gran cantidad de procesos celulares que van desde la transcripción génica a la proliferación o la apoptosis (figura 69-10A). Este ion es movilizado desde los compartimientos intracelulares por la activación de receptores acoplados a la producción de inositol trifosfato. Además, el Ca2+ entra en la célula a través de canales de Ca2+ tanto dependientes como independientes de voltaje, mientras que es expulsado por la ATPasa de Ca2+ de la membrana. La entrada de Ca2+ en la célula puede ser inducida por diversos ligandos, como neurotransmisores y hormonas. El Ca2+ intracelular es considerado como un segundo mensajero, y es de destacar el hecho de la existencia cruzada entre el aumento en los niveles de Ca2+ y el cAMP.
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Algunas proteínas G heterotriméricas regulan directamente canales iónicos en la membrana plasmática de la célula diana, alterando así su permeabilidad iónica y, por tanto, la excitabilidad de la membrana. Éste es el caso de la acetilcolina, cuya acción a través de los receptores muscarínicos o nicotínicos está mediada por receptores relacionados con canales iónicos.
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En el sistema endocrino la regulación y la función de los canales de Ca2+ son importantes en las respuestas hormonales. Ejemplo de esta regulación lo constituye la tirotropina (TSH), que es capaz de movilizar el Ca2+ intracelular y regular los canales de Ca2+ para inducir la salida del I− del tirocito. En células de la granulosa ovárica se ha descrito la existencia de los dos tipos de canales de Ca2+, dependientes e independientes del voltaje, cuya regulación por la LH y progesterona es fundamental en la fisiología del ovario.
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Los canales de Ca2+ sensibles al voltaje (VSCC) se encuentran en la membrana plasmática de células musculares, neuronas y células gliales (figura 69-10B). Estos canales regulan la entrada de Ca2+ a la célula y median funciones fisiológicas como el crecimiento neuronal, la regulación enzimática, la expresión génica y la salida de neurotransmisores de las terminales nerviosas.
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Los VSCC se clasifican, según sus propiedades electrofisiológicas y farmacológicas, en tipos L, T, N, P/Q y R. Los VSCC son proteínas compuestas por una subunidad α 1, que forma el poro, y las unidades accesorias α2-δ y β.
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El canal tipo L, que se expresa en el sistema nervioso, es activado por potenciales de alto voltaje. Está formado por una subunidad α 1D que constituye el poro y las subunidades α-2-δ, β y γ reguladoras y de anclaje. Las subunidades α1, β y γ son codificadas por genes separados, mientras que las subunidades α-2 y δ son producto de la proteólisis de un precursor mayor codificado por un solo gen. Las subunidades α1 y β están fuertemente unidas y se les relaciona con la regulación de la actividad del canal tipo L. La subunidad γ del receptor es una glucoproteína de 30-33 kD. La subunidad δ es de 24-33 kD.
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El canal tipo N es activado por potenciales de alto voltaje. Fue descrito sólo en células de origen neuronal. El canal de calcio N participa en la excitabilidad de la membrana, el crecimiento axonal, la migración neuronal y la salida de neurotransmisores. Consiste en una subunidad 1B de 230 kD, una α2-δ de 150 KD, una β3 de 57 kD y un polipéptido de 94 kD que no se encuentra en el canal tipo L.
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También existen canales de Ca2+ activados por ligandos. Los receptores ionotrópicos son sensibles a agonistas como el NMDA y el kainato, los cuales inducen su apertura. La activación de los canales regulados por los receptores del NMDA se relacionó con fenómenos de plasticidad sináptica y muerte celular. Los receptores metabotrópicos median la acción de los canales iónicos por mecanismos dependientes de proteínas que unen GTP, con formación de IP3 y DAG, lo cual moviliza el Ca2+ de los depósitos intracelulares.
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En resumen, los canales de Ca2+ sensibles a voltaje son proteínas transmembrana que se encuentran ampliamente distribuidas en diferentes tipos celulares excitables y no excitables. Corresponden a la principal vía de entrada de Ca2+ en el músculo cardíaco y en el músculo liso, participan también en la salida de neurotransmisores desde las células endocrinas y las neuronas sensitivas, así como en procesos de degeneración axonal.