Capítulo 69: Mecanismos de acción hormonal

La homeostasis de los organismos multicelulares depende de la interacción coordinada entre las distintas células del organismo. Para ello las células se comunican entre sí mediante señales químicas que se pueden dividir en tres clases: autocrinas, paracrinas y endocrinas. En las señales autocrinas la propia célula sintetiza la molécula señal, la cual puede actuar en el citoplasma o ser secretada e interaccionar después con los receptores de membrana. En las señales paracrinas, la señal química difunde al exterior celular, donde interacciona de manera local con las células más próximas. Finalmente, la señalización endocrina tiene lugar a través de las hormonas, que son moléculas orgánicas (lípidos y proteínas) pertenecientes al grupo de los biocatalizadores junto con las enzimas y las vitaminas. Las hormonas son secretadas por ciertas células especializadas, que se localizan en las glándulas de secreción interna o glándulas endocrinas, y son transportadas por el sistema circulatorio, solas o unidas a ciertas proteínas, y ejercen sus efectos en determinados órganos o tejidos diana a distancia de donde se sintetizaron. Todas las moléculas de comunicación son esenciales para la supervivencia, desarrollo y reproducción de los organismos superiores, y todas ellas tienen la capacidad de inducir y controlar una gran variedad de respuestas biológicas. La diversidad y especificidad de las acciones que controlan se vincula con sus diferentes estructuras y propiedades fisicoquímicas, lo que les permite reconocer a muy diversos receptores celulares que desencadenan rutas de señales específicas, una vez activados por su ligando. El término ligando, que en química se aplica a las moléculas que forman uniones estables mediante enlaces no covalentes, se usa en la actualidad para designar a los agentes que se unen a receptores celulares como paso previo a su acción biológica. Los ligandos actúan a concentraciones muy bajas de alrededor de ≤10⁻⁸ M, y los receptores que los reconocen se unen a ellos con una elevada constante de afinidad de Ka ≥10⁸ litros/mol. En este capítulo se va a describir el modo de acción de las hormonas y de otros ligandos, y se va a establecer una división inicial, basada en la localización de sus receptores. Así, la primera parte describirá el mecanismo de acción a través de receptores que se localizan en la membrana plasmática, y la segunda parte describirá los receptores nucleares.

Los receptores de membrana son la diana de una gran variedad de hormonas, neurotransmisores, factores de crecimiento, etc., de estructura proteica, peptídica, o incluso de sólo algunos aminoácidos modificados y que se consideran los primeros mensajeros en la comunicación. Tras la unión del ligando se inicia una serie de eventos en la membrana que inducen la generación de un segundo mensajero intracelular, el cual dispara la activación de otra serie de moléculas e induce una cascada de señales, que en última instancia altera la fisiología de la célula.

Estructura de los receptores de membrana

Los receptores de membrana son proteínas integrales de membrana que se caracterizan por poseer tres diferentes dominios: extracelular, transmembrana y citoplasmático o intracelular. El dominio extracelular es el de interacción con el ligando; el dominio transmembrana es de naturaleza hidrofóbica, por lo que la molécula se encuentra “confortable” en la bicapa lipídica, y sirve como anclaje del receptor en la membrana. El dominio intracelular suele formar una cola o lazo en la parte final del receptor, y se sitúa dentro del citoplasma, donde, mediante diferentes mecanismos interacciona a través de su región efectora con otras moléculas, con lo que genera segundos mensajeros intracelulares. Los receptores de membrana se agruparon en diferentes familias con base en su estructura. A continuación se describirá cada familia de receptores, sus ligandos más representativos, los segundos mensajeros que se generaron en cada caso, y el mecanismo de señalización intracelular que desencadenan.

Receptores acoplados a proteínas G (GPCR)

Los receptores acoplados a proteínas G (GPCR, G protein-coupled receptors) forman la mayor familia de receptores de membrana. Si bien es más correcto denominarlos receptores con siete dominios transmembrana (7TMR), ya que se describieron casos de receptores de este tipo con capacidad de señalizar independientemente de proteínas G, en este capítulo se adoptará la nomenclatura clásica de GPCR por ser la más extendida. Los GPCR forman la mayor familia de receptores de membrana. Entre los receptores de membrana, los GPCR son los más diversos y conservados evolutivamente y, a pesar de la similitud existente en la estructura de su dominio transmembrana, cada receptor es activado por diferentes ligandos (figura 69-1). Los GPCR están involucrados en la mayoría de las funciones fisiológicas del organismo, reconociendo y transduciendo la señal de la mayoría de hormonas y neurotransmisores, así como de los estímulos sensoriales que se relacionan con la visión, el tacto y el olfato. Entre los diferentes ligandos cabe destacar a las hormonas glucoproteicas, como la tirotropina (TSH), la hormona luteinizante (LH), la hormona estimulante del folículo (FSH), la corticotropina (ACTH), otras hormonas como el glucagon, la vasopresina, la somatostina, la calcitonina, la parathormona (PTH), la adrenalina, la noradrenalina, y un largo etc. Con base en diferentes estudios se ha descrito un modelo común para estos receptores, que consiste en un núcleo central compuesto por siete hélices transmembrana (TMI-VII) que se conectan por tres lazos intracelulares (i1, i2, i3) y tres extracelulares (e1, e2, e3). La mayoría de estos receptores tiene dos residuos de cisteína altamente conservados en los lazos e1 y e2, entre los que se forma un puente disulfuro necesario para la estabilización de la estructura del receptor. La variación en cuanto a secuencia de los distintos GPCR hace que éstos difieran en la longitud de sus extremos amino y carboxiterminal, dominios extra e intracelular, respectivamente. Cada uno de estos dominios confiere propiedades específicas a cada receptor. El dominio central, transmembrana (TM), sufre un cambio conformacional tras la unión del ligando correspondiente, normalmente al dominio extracelular. Esta modificación de la estructura transmembrana se transmite al dominio intracelular del receptor, lo que le permite interaccionar con y activar a sus moléculas efectoras.

Se pueden encontrar diversas clasificaciones de la superfamilia de GPCR atendiendo tanto a criterios fisiológicos como estructurales. La clasificación más novedosa de los receptores humanos de esta superfamilia se basa en el análisis filogenético del genoma humano, y se denomina sistema GRAFS (Glutamato, Rodopsina, Adhesión, Frizzled/Taste2 y Secretina) por las iniciales del receptor que da nombre a cada familia. Si se tiene en cuenta a los receptores de todas las especies, en función del sitio de unión del ligando, los GPCR se dividieron en tres familias y varias subfamilias (figura 69-1). La familia 1 o familia de la rodopsina es la que cuenta con el mayor número de miembros, alrededor de 670. Estos receptores se unen a una gran variedad de ligandos, tales como péptidos, aminas y purinas, y es también la familia que contiene el mayor número de receptores, que son diana de drogas que se utilizan en clínica. La subfamilia 1-a comprende receptores cuyos ligandos se unen en una cavidad formada por los dominios TM-III a TM-VI. Entre estos receptores se incluyen la rodopsina y los receptores β-adrenérgicos. La subfamilia 1-b está activada por pequeños péptidos, que interaccionan con el lazo extracelular en el extremo aminoterminal. Finalmente, la subfamilia 1-c es activada por moléculas mayores de naturaleza proteica. Los receptores de esta subfamilia presentan un gran dominio extracelular, que se encarga del reconocimiento y unión del ligando, que en este caso son hormonas glucoproteicas, como la TSH, la LH y la FSH, que se unen a los lazos extracelulares e1 y e3. La familia 2 de receptores, activada por grandes péptidos, como el glucagon, el péptido intestinal vasoactivo (VIP), el polipéptido activador de la adenilil ciclasa de pituitaria (PACAP), la secretina, la PTH, etc., posee un gran extremo aminoterminal, importante en la unión del ligando. La familia 3 de los GPCR presenta numerosas peculiaridades. Algunos de sus integrantes son los receptores metabotrópicos del glutamato (mGluR), el receptor sensible a calcio (CaR), receptores de feromonas y el receptor del ácido γ-aminobutírico (GABA). Estos receptores poseen un dominio extracelular muy largo, con una secuencia similar a la de las proteínas periplasmáticas de las bacterias, en las que están implicadas en el transporte de aminoácidos, iones, azúcares o péptidos. El final de este largo dominio extracelular está constituido por dos lóbulos que se separan por una región bisagra que se cierra cuando se une el ligando. Otros receptores que pertenecen a esta familia son los receptores frizzled y smoothened, cuyos ligandos son morfógenos, como Wnt y Shh (sonic hedgehog), que participan en las señales que controlan el desarrollo embrionario, manteniendo la polaridad celular y la segmentación.

Proteínas G

La diferencia fundamental entre los GPCR y el resto de receptores de membrana consiste en la presencia de un complejo de proteínas que transmiten la señal desde el receptor hasta sus enzimas efectoras. Estas proteínas intermediarias se denominan proteínas G, debido a su capacidad de relacionarse con los nucleótidos de guanina GDP (guanosina difosfato) y GTP (guanosina trifosfato) (figura 69-2). En su estado inactivo, las proteínas G presentan una composición heterotrimérica, formada por una subunidad α de 39-52 kD, una subunidad β de 35 kD y una subunidad γ de 7-9 kD, de las que se identificaron 21, 6 y 12 isoformas, respectivamente. Aunque no todas las isoformas son capaces de formar parte del mismo complejo, el número de combinaciones posibles es muy elevado, en consonancia con el gran número de receptores distintos a los que se vinculan. Estas proteínas actúan como interruptores moleculares, alternando entre dos conformaciones: Asociadas con GDP en su estado inactivo, o a GTP en su estado activo. La transmisión de la señal a través de estos complejos opera de la siguiente manera. En ausencia de estímulo, las tres subunidades de proteínas G permanecen relacionadas con la subunidad α unida a un nucleótido de GDP. La unión del ligando a la región externa del receptor promueve un cambio conformacional que permite al receptor reconocer y vincularse con el complejo de proteínas G. Dicha unión induce la separación del GDP y la entrada de un nucleótido de GTP, debido a la elevada relación GTP/GDP existente en las cercanías del receptor. En estas condiciones, la subunidad Gα pierde afinidad por el dímero Gβγ, y se separa del complejo, lo que permite que ambos interaccionen con sus efectores. La señal termina merced a la capacidad GTPasa intrínseca de la subunidad Gα, que hidroliza el GTP asociado, dando lugar a GDP. En este estado la subunidad Gα recupera la afinidad por el complejo Gβγ y se une a éste a la espera de un nuevo estímulo (figura 69-2). Las subunidades β y γ. están relacionadas covalentemente, formando un dímero estable que no se disocia, salvo en condiciones desnaturalizantes. Por el contrario, la subunidad α está unida a la β sólo por contactos discretos, y se disocia reversiblemente durante el ciclo funcional de la proteína G. Las cadenas α y las cadenas γ sufren modificaciones postraduccionales para permitir su anclaje a la membrana. En concreto, un grupo acilo (miristoílo, C12, o palmitoílo, C16) se une covalentemente con el grupo —SH de una Cys en el extremo N-terminal de Gα (en un motivo CAAX). Por otra parte, el extremo C-terminal de G-γ tiene unido un grupo isoprenoide (farnesilo o geranil-geranilo).

Las proteínas G se dividen en cuatro familias, dependiendo de la similitud funcional y de secuencia de la proteína Gα que forma parte del complejo. Así, se distinguen entre proteínas Gs, Gi/G0, Gq/G11 y G12/13. Quizá la mejor conocida sea la familia Gs, cuya subunidad α es capaz de activar a la enzima adenilato ciclasa, que actuaría sobre su sustrato, el ATP (adenosina trifosfato), generando el segundo mensajero 3ʹ-5ʹ cAMP (3ʹ-5ʹ adenosín monofosfato cíclico) (figura 69-2). Por esta enorme variedad de ligandos, receptores y proteínas G, se acepta que los GPCR representan la forma más diversa de los sistemas de transducción de señales, y posiblemente de todas las familias de proteínas, de las células eucariotas. Las consecuencias bioquímicas y biológicas que desencadenan albergan, además, otra gran complejidad, como se verá a continuación.

Vías de señalización que conectan los GPCR con el núcleo

a) cAMP y PKA. El cAMP descubierto por Sutherland, en 1950, es un nucleótido cíclico que se genera a partir de ATP por la acción de la adenilato-ciclasa, y se le considera como el segundo mensajero más importante en la respuesta de los GPCR. La concentración intracelular de cAMP aumenta o disminuye por una gran variedad de hormonas, y estas fluctuaciones afectan una gran variedad de procesos. Uno de los efectos más destacado de las concentraciones elevadas de cAMP es la activación de la proteína quinasa dependiente de cAMP o PKA. La holoenzima inactiva es un heterotetrámero compuesto por dos subunidades reguladoras “R”, y dos catalíticas “C”. La activación se produce cuando el cAMP se une a la subunidad R, lo que provoca la separación de la subunidad C. En mamíferos existen al menos dos tipos de enzimas, PKAI y PKAII, que se distinguen por las isoformas de subunidades R que forman parte del complejo. Cada una de ellas posee una localización celular y una distribución específica de especie y de tejido, así como diferentes afinidades por el cAMP. Estas observaciones sugieren que la PKAI y PKAII descifran las señales del segundo mensajero cAMP con diferente duración y actúan sobre diferentes dianas. Para el correcto funcionamiento de la PKA se requieren, además, otras proteínas, como las fosfodiesterasas (PDE), que permiten la terminación de la señal del cAMP mediante su degradación, y las proteínas de anclaje AKAP (A-kinase anchoring protein), que localizan a la PKA en sitios específicos y crean así microambientes que permiten la señalización (figura 69-3A).

Clásicamente la activación por la PKA promueve la fosforilación de sustratos específicos como la familia de factores de transcripción CREB (cAMP-Response Element Binding Protein) o la molécula coactivadora CBP/p300 (CREB-Binding Protein). Las proteínas CREB son factores de transcripción que se unen a secuencias específicas denominadas CRE (cAMP-Response Element), presentes en los promotores de los genes regulados por cAMP. Estos genes controlan mecanismos de crecimiento y diferenciación celular, entre otros. Sin embargo, a pesar de la linealidad de esta ruta y su aparente simplicidad, datos recientes han complicado este modelo, ya que CREB no es el único factor de transcripción que se activa en respuesta al cAMP. En el ovario, por ejemplo, es capaz de estimular al factor de transcripción Sp1 y al receptor de estrógenos α/β (ER α/β). También se demostró que CREB puede ser regulado por otras quinasas aparte de la PKA, como la calmodulina quinasa o RSK (Ribosomal S6 Kinase). A su vez, CBP/p300 no se relaciona exclusivamente con CREB, sino que se une a una cantidad considerable de otros factores de transcripción, entre los que se encuentra el NFκB, miembros de la superfamilia de receptores nucleares (véase más adelante) y más. Por otra parte, se demostró que la PKA es capaz no sólo de activar, sino también de inhibir otras cascadas de señalización, como la de las MAPK (mitogen-activated protein kinases) o la de la PI3K (phosphoinositide 3-kinase), de manera específica del tipo celular. Esta información recoge sólo algunos ejemplos de la multiplicidad de señales que se originaron por los GPCR, el cAMP y la PKA (figura 69-3B).

Hasta hace poco se han descrito mecanismos inducidos por cAMP de manera independiente de la PKA, lo que indica que el cAMP es capaz de interaccionar con otras proteínas. Esta vía alternativa está formada por una nueva clase de proteínas de unión a cAMP que se denominan cAMP-GEF (cAMP-guanine-nucleotide exchange factor) o Epac (exchanged protein activated by cAMP) (figura 69-4). Entre los distintos efectores descritos para estas proteínas destacan las GTPasas Ras, Rap y Rho, o las fosfolipasas C-ε y D. A través de estas proteínas, Epac es capaz de activar importantes rutas de señalización como la de las MAPK o de la PI3K, y de modular canales iónicos, el citoesqueleto de actina, la adhesión celular o procesos de exocitosis.

b) MAPK y Ras. Los mecanismos que controlan la proliferación se atribuyen, en especial, a receptores con actividad tirosina quinasa, mientras que los GPCR se relacionan, por tradición con la ejecución de funciones especializadas, en células diferenciadas finalmente y en tejidos específicos. Sin embargo, los GPCR se expresan también en células que proliferan y se han implicado en la embriogénesis, la reparación de tejidos y la inducción del crecimiento.

En los últimos años se ha descrito que los GPCR son capaces de activar la vía de las MAPK para controlar la proliferación celular. Este mecanismo tiene lugar a través de las subunidades βγ de las proteínas G vinculadas con el receptor y de manera dependiente de la GTPasa Ras. Para que esta activación tenga lugar, en células de mamíferos, es necesaria una serie de moléculas que conectan la activación del GPCR con la de las MAPK, incluyendo a tirosina quinasas, quinasas lipídicas, moléculas adaptadoras, la PKC (fosfoquinasa C), y ciertos factores de intercambio de nucleótidos para Ras.

Desensibilización de los GPCR

Todos los sistemas de GPCR varían su actividad dependiendo del contexto. Es decir, la sensibilidad del receptor se modula por la cantidad de señales que generan en una célula dada, ajustando su sensibilidad al grado de concentración del agonista a la que están expuestos. De este modo los receptores se de-sensibilizan frente a una exposición prolongada o repetida a altas concentraciones de agonista, y se resensibilizan cuando no están expuestos al agonista durante cierto tiempo. La desensibilización de estos receptores es una respuesta adaptativa, mediante la cual las células regulan la señalización de las proteínas G, para prevenir los efectos perjudiciales que resultarían de la estimulación permanente del receptor en presencia de concentraciones elevadas y continuadas del agonista. El mecanismo de desensibilización parece ser universal y conservado entre todos los GPCR. Este mecanismo es responsable de más de 80% de la disminución de la señal inducida por el receptor.

En este proceso de control de la respuesta del receptor, hay dos proteínas que presentan un papel central: las quinasas de receptores acoplados a proteínas G (GRK) y las arrestinas. Las GRK reconocen y se unen al receptor activado, lo que promueve, a su vez, su activación y la fosforilación del receptor en residuos específicos de los lazos intracelulares y del extremo carboxiterminal. Una vez fosforilados, los receptores actúan como sustratos de las arrestinas, que se unen a ellos e impiden la activación de otros complejos de proteínas G por el receptor. La fosforilación por GRK y la unión de la arrestina provoca, por tanto, la finalización de la señalización a través de proteínas G, incluso con la presencia continuada del estímulo activador del receptor. La pareja GRK-arrestina también realiza otras funciones, tales como facilitar la internalización del receptor en zonas de la membrana recubiertas con clatrina. Mediante su unión a proteínas señalizadoras adicionales, las GRK-arrestinas pueden funcionar, al mismo tiempo, como interruptores que redirigen la función del receptor de inducir la señalización a través de proteínas G heterotriméricas a la activación de rutas independientes de proteínas G. La GRK puede también inhibir la señalización del receptor al secuestrar a la subunidad Gα, lo que impide su acoplamiento a los siguientes efectores. La fosforilación de los GPCR puede realizarse por otras quinasas, como las proteínas quinasas A y C (PKA y PKC) o la quinasa c-Src. En la figura 69-5 se esquematizan y detallan los distintos mecanismos que conducen a la desensibilización de los GPCR.

Receptores con actividad tirosina quinasa (RTK)

Los receptores con actividad tirosina quinasa (RTK) constituyen un amplio grupo de receptores de membrana que pueden clasificarse en diferentes familias dependiendo de: (i) su reconocimiento por distintos ligandos, (ii) las respuestas biológicas que desencadenan y (iii) su estructura primaria. Estos receptores controlan procesos biológicos fundamentales, como la proliferación, la diferenciación o la migración celular. Los RTK son glucoproteínas de membrana con un dominio amino-terminal rico en cisteínas, que corresponde al dominio extracelular de unión al ligando (hormonas o factores de crecimiento). Este dominio conecta con el dominio citoplasmático mediante una única hélice transmembrana con un elevado carácter hidrofóbico. El dominio citoplasmático contiene una región conservada con actividad tirosina quinasa intrínseca, que fosforila proteínas en residuos de tirosina y un dominio carboxiterminal con capacidad de autofosforilación. Moléculas como las linfoquinas y el interferón transmiten su señal al interior de la célula a través de este tipo de receptores; sin embargo, éstos no poseen actividad tirosina quinasa intrínseca, sino que transmiten su señal reclutando proteínas que sí poseen la capacidad de fosforilar residuos de tirosina, como la familia de proteínas tirosina quinasa de tipo no receptor JAK (Janus Kinase). Con la excepción de los receptores de insulina (figura 69-6) e IGF, que son dímeros, todos los RTK (EGF-R para el epidermal growth factor, FGF-R para el fibroblast growth factor, PDGF-R para el platelet-derived growth factor, VEGF-R para el vascular endothelium growth factor, etc.) se encuentran como monómeros en la membrana celular y, tras la unión del ligando, tiene lugar su dimerización, lo que promueve su activación y la subsiguiente autofosforilación de sus dominios citoplasmáticos. En su forma activa, por tanto, todos los receptores RTK presentan una estructura homodimérica.

Aunque los RTK se activan por dimerización, los diferentes ligandos usan estrategias distintas para inducir la asociación de los monómeros. Así, se demostró que en el caso del receptor de la hormona de crecimiento (GH), esta citoquina es bivalente, y un ligando se une simultáneamente a dos moléculas de receptor, lo que permite su acercamiento. La dimerización del receptor se estabiliza posteriormente mediante interacciones adicionales receptor-receptor.

Otros receptores transmembrana: TGF-β-R y la vía de las Smads

La superfamilia de TGF-β (transformin growth factor beta) comprende a miembros importantes en fisiología, ya que regula muchos procesos durante el desarrollo y en la homeostasis celular. Esta superfamilia se divide en varios subgrupos: Los propios TGF-β, las BMP (bone morphogeneic proteins), y las activinas (péptidos, que entre otras acciones activan la función ovárica) e inhibinas (que inhiben la síntesis y secreción de la FSH hipofisaria). Todos los miembros de esta superfamilia utilizan una misma clase de receptores de membrana, con actividad serina/treonina quinasa en su dominio intracelular, que se divide a su vez en dos subclases: Receptores del tipo I y del tipo II. La unión del ligando promueve la relación de los receptores en un complejo heterotetramérico, en el que el receptor de tipo II fosforila y activa al receptor de tipo I. En este estado el receptor de tipo I es capaz de reconocer a unas proteínas que se denominan Smad, que son la clave en la transducción de la señal de la familia TGF-β (figura 69-7).

Las Smad componen una clase única de moléculas de señalización. Se han descrito 8 proteínas Smad en el genoma de mamíferos, que se subdividen en tres clases diferentes: (i) las Smad reguladas por el receptor (R-Smad 1, 2, 3, 5 y 8); (ii) el mediador común Smad4 y (iii) las Smad inhibidoras (I-Smad 6 y 7). Todas ellas están estructuralmente relacionadas, y poseen un dominio amino terminal que se conoce como MH1 (MAD Homology Domain 1) seguido de una región de unión y un extremo carboxiterminal o región MH2. Cada uno de estos dominios es crítico para la funcionalidad de estas proteínas, que modulan a sus efectores principalmente a través de interacciones proteína-proteína y proteína-ADN.

Las interacciones entre el receptor del tipo I y las R-Smad son importantes en la respuesta a los diferentes ligandos. Así, los receptores de BMP del tipo I fosforilan a las R-Smad1, 5 y 8; mientras que los de TGF-β y activina sólo fosforilan a las R- Smad2 y 3. Además, diversas proteínas de anclaje como SARA (Smad anchor for receptor activation) pueden facilitar la activación de las R-Smad de la vía TGFβ/activina, uniéndose directamente a la R-Smad2 no fosforilada y reclutándola a la membrana. La fosforilación de las R-Smad induce su disociación de la proteína SARA y del receptor, quedándose en forma monomérica o heterodimérica tras su unión a Smad4. La fosforilación también es la responsable de la translocación de los anteriores dímeros al núcleo, donde organiza la transcripción por interacción directa con el ADN o con proteínas de unión al ADN, regulando de este modo la expresión de sus genes diana. Cabe también destacar que las proteínas Smad están reguladas por un mecanismo de degradación, que incluye su ubiquitinación y posterior degradación por la vía del proteosoma.

Otras proteínas quinasas como mediadoras de la respuesta celular

Las proteínas quinasas son una gran familia de proteínas que comprende hasta 2% de los genes eucariotas. La fosforilación de proteínas afecta a mecanismos esenciales de las células, como son el metabolismo, la proliferación, la diferenciación, la motilidad, etc. Diferentes quinasas regulan mecanismos de respuesta celular, entre ellas: las calcio/calmodulina quinasas (CAMKII), la glucógeno sintasa kinasa-3 (GSK3), la proteína quinasa C (PKC), etc. En este apartado daremos una visión general de la PKC por su importancia en el mecanismo de transmisión de señales en respuesta a hormonas y factores de crecimiento.

Proteína quinasa C (PKC)

Constituye una amplia familia compuesta por 10 miembros que se agrupan en función de sus dominios estructurales, los cuales dictan la dependencia de cofactores. La PKC transduce las señales extracelulares a partir de la hidrólisis de lípidos. Dependiendo de la isoforma, las distintas PKC son activadas en respuesta a diacilglicerol (DAG), calcio y/o fosfolípidos. La PKC fosforila una serie de proteínas diana implicada en respuestas proliferativas y de diferenciación. La función de la PKC depende de la regulación coordinada de tres parámetros: Fosforilación/desfosforilación, translocación y anclaje a la membrana celular. Cualquier suceso que altere estos tres parámetros provoca la inhibición de su actividad enzimática. En apartados anteriores se ha hecho mención al papel de la PKC en el mecanismo de señalización de los GPCR, de la insulina y la GH, entre otros. La importancia de esta quinasa estriba en que es la diana de acción de los ésteres de forbol, promotores tumorales importantes en el proceso de tumorigénesis. Estos compuestos, a través de PKC, inducen una cascada de fosforilaciones que desencadenan la activación de los factores de transcripción jun, fos y fra, la formación de complejos AP1 y la inducción de genes cuyos promotores contienen sitios AP1, que se relacionaron con la progresión tumoral.

Proteína quinasa dependiente de cGMP

Una vez establecido el papel del cAMP como mediador de la acción hormonal, se consideró que otros nucleótidos cíclicos estructuralmente relacionados también podrían participar como mensajeros intracelulares de la acción hormonal. Aunque la hipótesis era atractiva, sólo permitió caracterizar una actividad guanilato ciclasa en la membrana y el citosol de algunos tipos celulares, pero no identificar un sistema de regulación basado en la conversión de GTP en cGMP. La participación del cGMP intracelular se determinó al identificar a dos familias de enzima con actividad guanilato ciclasa: La familia del receptor del péptido natriurético auricular y las guanilato ciclasas regulables por óxido nítrico (NO). El receptor del péptido natriurético es una proteína de membrana que sufre un cambio conformacional tras la unión del ligando y aumenta la actividad guanilato ciclasa acoplada al dominio citoplasmático.

La isoforma constitutiva de la NO sintasa (cNO), presente en células endoteliales, convierte la arginina en citrulina y NO. El radical gaseoso NO difunde desde las células endoteliales a las células del tejido muscular liso, donde se une al centro activo de la guanilato ciclasa y estimula la formación del cGMP en las células vecinas de la musculatura lisa, donde activa a una proteína quinasa denominada PKG. Aunque la PKG se descubrió hace más de 30 años, su papel en los sistemas biológicos aún no está bien definido. La PKG es miembro de la familia de serina/treonina quinasas y une con alta afinidad tanto cAMP como cGMP. En la actualidad se considera a la PKG como una proteína quinasa muy importante en procesos biológicos como la contracción de células musculares lisas, regulando procesos como la presión sanguínea, la función eréctil y la motilidad gastrointestinal. El conocido fármaco Viagra® funciona como un inhibidor de la PDE5, lo que permite mantener la producción de cGMP y la activación de PKG. La importancia que ha adquirido el NO en los sistemas biológicos en las dos últimas décadas, ha abierto nuevas áreas de exploración de su mecanismo de actuación en áreas de investigación vascular, así como de su farmacología.

Otras moléculas implicadas en la señalización celular

Entre el conjunto de todas las moléculas que se han descrito hasta el momento, cabe destacar a otras moléculas importantes en la interpretación de las señales de ligandos como hormonas, citoquinas, neurotransmisores, etc. Además de las quinasas ya descritas, no podemos dejar de mencionar a las fosfatasas (serina/treonina fosfatasas y tirosina fosfatasas). Estas enzimas funcionan desfosforilando residuos específicos y, por tanto, cumplen funciones opuestas a las de las quinasas. A cada quinasa suele contraponerse una fosfatasa. Las funciones de estas fosfatasas son muy diversas, y están reguladas con gran precisión. Están cobrando cada día más relevancia, no sólo en la señalización intracelular sino también en medicina. Un ejemplo de este importante grupo de enzimas sería la fosfatasa PTEN (fosfatasa y homólogo de tensina delecionado en el cromosoma 10), que se opone a la acción de la PI3K, y desfosforila al segundo mensajero PIP3 (fosfatidilinositol 3,4,5 trifosfato), con lo que se permite la finalización de su señal. Las mutaciones inactivadoras de PTEN se relacionan con la progresión y malignidad de numerosos tumores en humanos.

Otros mediadores importantes son el Ca²⁺ y las enzimas encargadas de su movilización, como la fosfolipasa C (PLC), la inositol 1,4,5-trifosfato (InsP3) 3-quinasa o la 5-fosfatasa. La isoforma β de la PLC está regulada por hormonas que transmiten su señal al interior celular a través de GPCR acoplados a proteínas de tipo Gq/G11.

Finalmente, se debe resaltar el papel de los lípidos y de sus derivados como segundos mensajeros. A los que ya se mencionó en el apartado 1 como, DAG, inositoles y fosfolipasas, hay que añadir el ácido araquidónico, las prostaglandinas, los leucotrienos y las ceramidas. Estas últimas median respuestas celulares variadas, entre las que cabe destacar los procesos de apoptosis y senescencia, como los inducidos por el TNFα (tumor necrosis factor α). Esta citoquina, se une a receptores específicos de membrana no relacionados estructuralmente con otras familias de receptores. Tras la unión del TNFα a su receptor, se induce la activación de la esfingomielinasa neutra (N-SMasa), mecanismo en el que participa una proteína denominada FAN (factor associated with N-SMase activation). La N-SMasa procesa la esfingomielina y genera ceramida, que estimula a una serina/treonina quinasa que se denomina CAPK (ceramide activated protein kinase), la cual actúa directamente sobre Raf y activa la vía MEK/MAPK de forma independiente de Ras. Los efectos sobre esta cascada de señales se relacionaron tanto con la respuesta proliferativa como con la respuesta antiinflamatoria, y desempeñan, en este caso, un papel importante la activación por estas quinasas de la PLA2 (figura 69-8); sin embargo, un número creciente de artículos relacionan a esta esfingomielinasa con el proceso de apoptosis.

La activación de la esfingomielinasa acídica (A-SMasa) lisosómica tiene lugar a través de su unión a la proteína TRADD (TNFRSF1A-associated via death domain), que se une a una región del receptor del TNFα denominada death domain por su implicación con procesos de apoptosis celular. La A-SMasa puede activarse en respuesta a agentes que producen daño celular, como radiaciones ionizantes, luz ultravioleta, choque térmico y agentes antimitóticos. Las señales antiproliferativas del TNFα y de los otros agentes estimuladores de la A-SMasa convergen en la activación de un nuevo tipo de MAPK sensibles a ceramida, que se denominan quinasas del extremo N-terminal de Jun (JNK). Además de usar un mecanismo de acción diferente, estas quinasas se distinguen de las MAPK clásicas por regular respuestas biológicas diferentes. Tanto la ceramida generada por las A-SMasa, como el ácido araquidónico (AA) que deriva de la activación de la PLA2 por acción de la N-SMasa de membrana, activan a la PKCξ, implicada junto con la JNK en la activación del NFκB, que se transloca al núcleo, donde actúa regulando la transcripción de genes específicos implicados en la inflamación. En conclusión, la generación de ceramida por diferentes esfingomielinasas (SMasa), condiciona la activación de dos vías de señalización diferentes, que regulan distintos procesos celulares, y que van desde la proliferación a la inflamación o la apoptosis (figura 69-8).

Receptores acoplados a canales iónicos

Otras proteínas de membrana decisivas para la comunicación celular son las proteínas de transporte y las proteínas receptoras que se relacionan con canales iónicos. Las proteínas transportadoras se unen al soluto específico el cual va a ser transportado, y sufren una serie de cambios conformacionales que permiten su transferencia a través de la membrana. Las proteínas asociadas con canales iónicos no se unen al soluto, sino que forman poros hidrofílicos que atraviesan la bicapa lipídica; cuando estos poros están abiertos permiten que determinados solutos, habitualmente iones inorgánicos de tamaño y carga apropiados, pasen a través de ellos. Esta comunicación por canales es rápida y ocurre en la transmisión sináptica entre células excitables eléctricamente. Así, los neurotransmisores abren o cierran transitoriamente el canal iónico al que están unidos, alterando brevemente la permeabilidad iónica de la membrana plasmática y, por tanto, modificando la excitabilidad de la célula postsináptica. Estos receptores pertenecen a una familia de proteínas transmembrana que la atraviesan varias veces y que son homólogas entre sí; cada una de ellas es responsable de la transferencia de una molécula o un ion específicos, o de un grupo de moléculas o iones afines.

Todas las proteínas de canal y muchas proteínas transportadoras, sólo permiten que los solutos atraviesen la membrana de forma pasiva mediante un proceso de difusión facilitada. Sin embargo, las células también necesitan proteínas de transporte que bombeen activamente ciertos solutos en contra de su gradiente electroquímico, en un proceso de transporte activo acoplado a una fuente de energía metabólica como la hidrólisis de ATP o un gradiente iónico.

Entre las proteínas de transporte activo se encuentran los transportadores sencillos o uniportes, que simplemente transportan un soluto de un lado al otro de la membrana, y los transportadores acoplados, en los que la transferencia del soluto depende del transporte simultáneo o secuencial de un segundo soluto. Cuando ambos solutos se transportan en el mismo sentido el transportador se denomina simporte; si se transportan en sentidos opuestos, se conoce como antiporte (figura 69-9).

Como ejemplo de transportadores, por su función en la fisiología endocrina, se deben citar los transportadores de glucosa (GLUT), que son transportadores pasivos, las bombas de iones (ATPasa de Na⁺/K⁻, ATPasa de Ca²⁺) como ejemplo de transporte activo, y el transportador de I⁻ de la célula tiroidea, que es un simporte dependiente de Na⁺.

A diferencia de las proteínas transportadoras, las proteínas de canal son proteínas integrales de membrana que forman poros acuosos a través de la bicapa lipídica y permiten a los iones inorgánicos de un tamaño y carga adecuados atravesarla. La importancia de los canales iónicos en la función celular se ha reconocido en los últimos años, y se sabe que participan de manera crucial en mecanismos de transducción de señales externas e internas que permiten a la célula modular su actividad de acuerdo con el medio que la rodea. Los canales iónicos están involucrados en fenómenos tan diversos como la excitabilidad eléctrica y química, la secreción, la contracción muscular, la fecundación, la diferenciación celular, las reacciones inmunitarias, etc. Estos canales iónicos son muy eficientes, ya que a través de ellos pueden pasar más de un millón de iones cada segundo. Así, los iones inorgánicos, mayoritariamente Na⁺, K⁺, Ca²⁺ o Cl⁻, pueden difundir en favor de gradiente electroquímico. Este flujo está regulado de manera muy precisa, y ejemplo de ello son las células musculares y nerviosas, que se especializaron en la utilización de canales iónicos para recibir, conducir y transmitir señales. Los canales son selectivos para el ion que transportan y fluctúan entre estados abiertos y cerrados. La apertura del canal está finamente regulada por: (i) ligandos extracelulares o intracelulares, (ii) voltaje y (iii) impulsos mecánicos.

Entre los ligandos que regulan canales están los neurotransmisores, que convierten las señales químicas en eléctricas durante la sinapsis. Así, los neurotransmisores excitadores, como la acetilcolina y el glutamato abren de forma transitoria canales catiónicos despolarizando la membrana postsináptica hacia el potencial de disparo para iniciar un potencial de acción; los neurotransmisores inhibidores, como el GABA abren canales de Cl⁻ suprimiendo la generación del potencial de acción al hacer a la membrana postsináptica más polarizada. Una subclase especial de canales iónicos regulados por glutamato, son los que regulan los receptores del NMDA (ácido N-metil-d-aspártico), que son muy permeables al Ca²⁺, el cual puede desencadenar cambios a largo plazo en las sinapsis. Estos tipos de canales están implicados en algunas formas de aprendizaje y de memoria.

Entre los canales regulados por voltaje están los canales de Na⁺, de K⁺ y de Ca²⁺. La integración neuronal requiere la combinación de al menos tres tipos de canales de K⁺ diferentes y uno selectivo para el Ca²⁺. Los tres tipos de canales de K⁺ presentan propiedades diferentes y se dividen en canales retardados, tempranos y activados por Ca²⁺. En la mayoría de las células animales, el canal retardado de K⁺ desempeña un papel importante en la generación del potencial de reposo de la membrana plasmática. El canal de K⁺ activado por Ca²⁺ es estructural y funcionalmente diferente de cualquier otro tipo de canal descrito anteriormente, y se abre en respuesta a una elevada concentración de Ca²⁺.

El Ca²⁺ está más concentrado en el exterior que en el interior de la célula, por lo que este ion tiende a entrar en la célula, y los canales de Ca²⁺ producen despolarización cuando se abren, lo mismo que sucede con los canales de Na⁺. La despolarización que producen los canales de Ca²⁺ es menos acentuada que la que producen otros canales, pues la concentración extracelular de Ca²⁺ no es tan elevada. Los canales de Ca²⁺, además de producir despolarización, hacen que aumente la concentración intracelular de Ca²⁺, lo que constituye una señal para la activación de muchas funciones celulares. El Ca²⁺ es un regulador clave de una gran cantidad de procesos celulares que van desde la transcripción génica a la proliferación o la apoptosis (figura 69-10A). Este ion es movilizado desde los compartimientos intracelulares por la activación de receptores acoplados a la producción de inositol trifosfato. Además, el Ca²⁺ entra en la célula a través de canales de Ca²⁺ tanto dependientes como independientes de voltaje, mientras que es expulsado por la ATPasa de Ca²⁺ de la membrana. La entrada de Ca²⁺ en la célula puede ser inducida por diversos ligandos, como neurotransmisores y hormonas. El Ca₂₊ intracelular es considerado como un segundo mensajero, y es de destacar el hecho de la existencia cruzada entre el aumento en los niveles de Ca²⁺ y el cAMP.

Algunas proteínas G heterotriméricas regulan directamente canales iónicos en la membrana plasmática de la célula diana, alterando así su permeabilidad iónica y, por tanto, la excitabilidad de la membrana. Éste es el caso de la acetilcolina, cuya acción a través de los receptores muscarínicos o nicotínicos está mediada por receptores relacionados con canales iónicos.

En el sistema endocrino la regulación y la función de los canales de Ca²⁺ son importantes en las respuestas hormonales. Ejemplo de esta regulación lo constituye la tirotropina (TSH), que es capaz de movilizar el Ca²⁺ intracelular y regular los canales de Ca²⁺ para inducir la salida del I⁻ del tirocito. En células de la granulosa ovárica se ha descrito la existencia de los dos tipos de canales de Ca²⁺, dependientes e independientes del voltaje, cuya regulación por la LH y progesterona es fundamental en la fisiología del ovario.

Los canales de Ca²⁺ sensibles al voltaje (VSCC) se encuentran en la membrana plasmática de células musculares, neuronas y células gliales (figura 69-10B). Estos canales regulan la entrada de Ca²⁺ a la célula y median funciones fisiológicas como el crecimiento neuronal, la regulación enzimática, la expresión génica y la salida de neurotransmisores de las terminales nerviosas.

Los VSCC se clasifican, según sus propiedades electrofisiológicas y farmacológicas, en tipos L, T, N, P/Q y R. Los VSCC son proteínas compuestas por una subunidad α 1, que forma el poro, y las unidades accesorias α2-δ y β.

El canal tipo L, que se expresa en el sistema nervioso, es activado por potenciales de alto voltaje. Está formado por una subunidad α 1D que constituye el poro y las subunidades α-2-δ, β y γ reguladoras y de anclaje. Las subunidades α1, β y γ son codificadas por genes separados, mientras que las subunidades α-2 y δ son producto de la proteólisis de un precursor mayor codificado por un solo gen. Las subunidades α1 y β están fuertemente unidas y se les relaciona con la regulación de la actividad del canal tipo L. La subunidad γ del receptor es una glucoproteína de 30-33 kD. La subunidad δ es de 24-33 kD.

El canal tipo N es activado por potenciales de alto voltaje. Fue descrito sólo en células de origen neuronal. El canal de calcio N participa en la excitabilidad de la membrana, el crecimiento axonal, la migración neuronal y la salida de neurotransmisores. Consiste en una subunidad 1B de 230 kD, una α2-δ de 150 KD, una β3 de 57 kD y un polipéptido de 94 kD que no se encuentra en el canal tipo L.

También existen canales de Ca²⁺ activados por ligandos. Los receptores ionotrópicos son sensibles a agonistas como el NMDA y el kainato, los cuales inducen su apertura. La activación de los canales regulados por los receptores del NMDA se relacionó con fenómenos de plasticidad sináptica y muerte celular. Los receptores metabotrópicos median la acción de los canales iónicos por mecanismos dependientes de proteínas que unen GTP, con formación de IP₃ y DAG, lo cual moviliza el Ca²⁺ de los depósitos intracelulares.

En resumen, los canales de Ca²⁺ sensibles a voltaje son proteínas transmembrana que se encuentran ampliamente distribuidas en diferentes tipos celulares excitables y no excitables. Corresponden a la principal vía de entrada de Ca²⁺ en el músculo cardíaco y en el músculo liso, participan también en la salida de neurotransmisores desde las células endocrinas y las neuronas sensitivas, así como en procesos de degeneración axonal.

Pequeñas moléculas lipofílicas, como las hormonas esteroideas y tiroideas, o las formas activas de las vitaminas liposolubles (la 1,25-dihidroxi-vitamina D₃ y los retinoides), juegan un papel fundamental en procesos de crecimiento, desarrollo, diferenciación, metabolismo y morfogénesis de los animales superiores y el ser humano. Las acciones de estos compuestos están mediadas a través de su unión a receptores intracelulares, que tras la interacción con sus correspondientes ligandos actúan como factores de transcripción, regulando la expresión de genes específicos. En el cuadro 69-1 se presenta la lista de receptores nucleares de mamíferos y sus ligandos. Como se puede observar para muchos receptores nucleares existen diversas variantes que están codificadas por genes distintos y que van a dar lugar a diferentes isoformas. Las distintas variantes de un receptor nuclear se pueden expresar de forma diferencial en diferentes tipos celulares y en diversos momentos del desarrollo ontogénico, lo que sugiere que podrían tener funciones distintas, aunque complementarias. La mayoría de los genes de los receptores nucleares se inactivaron en el ratón por técnicas de recombinación homóloga, y los fenotipos obtenidos demuestran la existencia de funciones específicas, así como en algunos casos de un cierto grado de redundancia, por lo que se asegura que algunas de las funciones de una forma de receptor pueden asumirse por otras formas en su ausencia. También puede observarse en el cuadro 69-1 que para muchos de los receptores no existe un ligando conocido y, por ello, se les denomina “receptores huérfanos”. Sin embargo, algunos de estos huérfanos se “adoptaron” recientemente, ya que se identificaron sus ligandos, y se demostró que productos del metabolismo lipídico, como derivados del colesterol, ciertos ácidos grasos, derivados de prostaglandinas, leucotrienos o incluso los ácidos biliares, pueden regular la expresión génica a través de su unión a receptores nucleares. Estos ligandos, a diferencia de las hormonas clásicas, se originan intracelularmente como producto del metabolismo, lo que explica por qué la experimentación fisiológica no había identificado su papel como reguladores de receptores nucleares. Este hecho condujo al descubrimiento de nuevas respuestas hormonales y al concepto de la “endocrinología a la inversa”, en la cual la caracterización del receptor precede al estudio de su función fisiológica. De forma opuesta a lo que ocurre con los receptores endocrinos clásicos que se activan por la unión de un ligando extracelular que tiene una alta afinidad por el receptor, estos receptores se activan por ligandos que son muy abundantes, pero que se unen con baja afinidad.

Mecanismo de acción de los receptores nucleares

Algunos receptores, como el de glucocorticoides, en ausencia de ligando se encuentran unidas a otras proteínas, entre ellas la proteína de choque térmico Hsp90, que los retienen en el citosol. Tras la unión del ligando el receptor sufre un cambio conformacional por el cual se disocia del complejo citoplásmico y es transportado al núcleo. No se puede excluir que los receptores de esteroides sean de localización tanto citoplásmica como nuclear con un equilibrio núcleo-citoplásmico desplazado hacia el citoplasma en el caso de los glucocorticoides, y posiblemente la vitamina D, y hacia la fracción nuclear en el caso de los esteroides gonadales. Sin embargo, los receptores de hormonas tiroideas son de localización nuclear en ausencia de hormona, y lo mismo ocurre con los receptores de ácido retinoico y algunos receptores “huérfanos”. En la figura 69-11 se presenta un esquema del mecanismo de acción de los receptores nucleares en el que muestran los dos modelos: en un caso los receptores citosólicos se transportarían al núcleo tras la unión del ligando, y en el segundo caso los receptores estarían ya en el núcleo en ausencia del ligando. Los complejos hormona-receptor se unirían a secuencias específicas de ADN, los denominados “elementos de respuesta hormonal” o HRE, y como consecuencia se produciría un cambio en la velocidad de transcripción de los genes que contienen dichos elementos. En algunos casos, el ligando activo entra en la célula y se une al receptor, mientras que en otros casos es un precursor del ligando el que se transforma en el ligando activo dentro de la célula diana. Éste sería el caso de la tiroxina (T₄), que se desyoda por la acción de enzimas específicas para dar lugar a la triyodotironina (T₃), cuya afinidad por los receptores de hormonas tiroideas (TR) es mucho mayor. Como hemos indicado, algunos ligandos recién identificados, que son productos del metabolismo celular, pueden producirse intracelularmente y unirse a sus receptores en la misma célula en el que son sintetizados.

Existen mecanismos alternativos a la unión del ligando para la activación de los receptores nucleares (figura 69-11). Algunos receptores pueden ser activados por fosforilación mediada por diversas vías de transducción de señales. Estas vías de señalización pueden también regular la transcripción dependiente de ligando modificando la actividad de los coactivadores y correpresores que median los efectos transcripcionales de los receptores nucleares. Los receptores y estos correguladores pueden sufrir además otras modificaciones postraduccionales que pueden regular su actividad, niveles y localización. Los ligandos de los receptores nucleares pueden también causar efectos rápidos denominados “no-genómicos” o “no-transcripcionales”. Estos efectos rápidos se han atribuido a una fracción de los receptores nucleares, que se encontraría en una localización extranuclear interaccionando con la membrana plasmática, o a la ocupación de receptores putativos de membrana acoplados con sistemas de segundos mensajeros que pueden aumentar los niveles de calcio intracelular o activar las MAPK o la PI3K y provocar diferentes respuestas biológicas (figura 69-11).

Dominios funcionales de los receptores nucleares

Los receptores nucleares tienen una estructura modular y están formados por diferentes regiones que se corresponden con dominios funcionales autónomos. Un receptor nuclear típico contiene un extremo N terminal (A/B), un dominio de unión a ADN (DBD) o región C, una región bisagra D, y una región E/F carboxiterminal que contiene el dominio de unión al ligando (LBD) (figura 69-12). Los receptores nucleares también contienen dos dominios de activación transcripcional, uno de activación transcripcional independiente de ligando (AF-1), que se encuentra en la región A/B, y un dominio de activación transcripcional dependiente de ligando (AF-2), que se localiza en el extremo C-terminal del LBD.

La región A/B. Esta región moduladora es la más variable, y en muchos casos contiene el dominio AF-1. En algunos receptores, residuos localizados en esta región, son dianas de fosforilación por distintas quinasas. Un caso interesante es el del receptor de estrógenos α (ERα) que se fosforila por la MAPK en la serina 118 de este dominio. Esta fosforilación hace que el receptor sea transcripcionalmente activo, incluso en ausencia de ligando, y puede jugar un papel importante en células como las de cáncer de mama que dependen del ER para su proliferación y en las que la vía Ras/MAPK se encuentra estimulada constitutivamente.

El dominio de unión a ADN (DBD, DNA binding domain). El dominio C es el que muestra mayor homología y está compuesto de dos “dedos de zinc”, en los que un átomo de zinc coordina tetrahédricamente cuatro cisteínas, y de una extensión carboxiterminal que contiene las denominadas cajas A y T (figura 69-12). El DBD está formado por dos hélices α y, a través de la primera, los receptores se unen con alta afinidad al surco mayor del ADN y reconocen secuencias específicas que se denominan “elementos de respuesta a hormonas” o HRE. La secuencia de la caja P, que se localiza en la base del primer dedo de zinc en el extremo de la primera hélice α (figura 69-12), permite dividir a los receptores nucleares en dos grandes subfamilias que reconocen dos tipos de HRE diferentes. La primera de ellas está compuesta por los receptores de glucocorticoides, mineralocorticoides, andrógenos y progesterona que tienen la caja P idéntica entre ellos, y en la segunda estarían incluidos el resto de los receptores de hormonas y vitaminas, así como diferentes receptores “huérfanos”. En el segundo dedo de zinc existe la denominada caja D, que es diferente entre los distintos miembros de las diferentes subfamilias de los receptores y que interviene en dimerización y en el reconocimiento del espaciamiento dentro de las dos partes de los HRE (figura 69-12).

El dominio D. Esta región sirve como bisagra entre el DBD y el LBD, permitiendo la rotación del DBD. En muchos receptores contiene una señal de localización nuclear, así como residuos que, aunque no forman parte de la superficie de interacción con los correpresores, son necesarios para la unión de éstos al receptor.

El dominio de unión al ligando (LBD, ligand binding domain). El LBD, además de ser la zona de unión al ligando, media la dimerización de los receptores, la unión con proteínas de choque térmico y en algunos casos la represión transcripcional. El dominio E/F está bien conservado en dos regiones: el motivo τi y el motivo de activación transcripcional AF-2. También está conservada la estructura general de los LBD, que están formados por 12 hélices α, numeradas desde H1 a H12, con una vuelta β entre H5 y H6. El ligando se acomoda en una cavidad hidrofóbica haciendo contacto con diferentes residuos contenidos en diferentes hélices. Se ha resuelto la estructura cristalina de diferentes receptores, y se puede observar que la unión del ligando produce un cambio conformacional en el receptor que adquiere una estructura más compacta, debido, sobre todo, al cambio de posición de la H12 que contiene el dominio AF-2. Esta hélice se proyecta hacia afuera en el receptor vacío, pero tras la unión del ligando cambia de posición y se empaqueta estrechamente con las hélices 3 y 4.

Elementos de respuesta a hormonas (HRE)

Los HRE son sitios específicos de unión de alta afinidad de los receptores y se encuentran, por lo general, localizados en la zona 5ʹ flanqueante del gen regulado. Los HRE se pueden encontrar en la vecindad del promotor, aunque recientemente se demostró que es muy frecuente la existencia de HRE en regiones muy alejadas del sitio de inicio de la transcripción. La secuencia básica de ADN de reconocimiento de los receptores se forma por seis pares de bases, y existen dos motivos consenso: La secuencia AGAACA reconocida por los receptores de esteroides (excepto el ER) que tienen la misma caja P, y la secuencia AGGTCA a la que se une el resto de los receptores de la superfamilia. Los elementos de respuesta están, por lo regular, compuestos de dos copias de estas secuencias, aunque excepcionalmente algún receptor “huérfano” reconoce una secuencia AGGTCA no repetida, precedida de una zona rica en nucleótidos A y T (figura 69-13). Los receptores de esteroides se unen a palíndromos de la secuencia AGAACA separados por 3 nucleótidos, con la excepción de ER, que reconoce el motivo consenso AGGTCA con la misma configuración. En cambio, los receptores no-esteroideos pueden unirse a HRE formados por palíndromos (Pal), palíndromos invertidos (IP) o repeticiones directas (DR) de esta misma secuencia consenso. Así, a elementos constituidos por DR separadas por tres, cuatro o cinco nucleótidos (DR3, DR4 y DR5) se unen con mayor afinidad los receptores VDR, TR y RAR, respectivamente. En cambio, una DR1 actúa como elemento de respuesta para el RXR y el PPAR. Los HRE de los diferentes receptores clásicos y huérfanos se incluyeron en el cuadro 69-1.

Monómeros, dímeros y heterodímeros

Aunque algunos receptores nucleares son monoméricos, la mayoría se une a los HRE como dímeros. Los receptores monoméricos utilizan la extensión carboxiterminal del DBD para aumentar los contactos con el DNA y estabilizar la unión al HRE. En el caso de los dímeros, cada monómero reconocería la mitad del palíndromo o de la repetición del elemento de respuesta formándose de este modo una unión estable de alta afinidad. La región E contiene una serie de héptadas hidrofóbicas, es decir, una secuencia en la que el séptimo aminoácido es de naturaleza hidrofóbica, a través de la cual interaccionan los monómeros de los receptores. Además de este fuerte dominio de dimerización, también existen secuencias en el DBD que colaboran a la formación de los dímeros.

El homodímero es la forma activa de los receptores de esteroides. Sin embargo, muchos receptores se unen a los HRE preferentemente en forma de heterodímeros con el receptor X de retinoides (RXR), que sirve de pareja promiscua para los demás receptores (ver cuadro 69-1). La heterodimerización con el RXR aumenta no sólo la afinidad de los receptores por el HRE, sino también su actividad transcripcional y las formas heterodiméricas son las biológicamente activas. La capacidad de los heterodímeros para unirse a palíndromos, palíndromos invertidos y repeticiones directas indica que los DBD de los receptores deben ser capaces de rotar con respecto a los LBD que se encuentran unidos a través de las héptadas hidrofóbicas (figura 69-14), lo que se consigue gracias a la estructura del dominio D o bisagra.

El RXR juega, pues, un papel central en la regulación de la transcripción por los receptores nucleares. Esta proteína puede formar homodímeros y en presencia de su ligando, el ácido 9-cis retinoico, regular la expresión génica a través de sus propios HRE, pero también puede regular la respuesta transcripcional a otros ligandos como las hormonas tiroideas, el ácido all-trans-retinoico, la vitamina D, etc. a través de la heterodimerización con sus receptores.

Mecanismos de regulación de la transcripción por los receptores nucleares

Activación transcripcional dependiente de ligando

La ocupación de los receptores nucleares por el ligando conduce a la activación transcripcional de los genes que contienen los HRE. Para esta activación son necesarios los denominados factores “coactivadores”, que por sí mismos no se unen al ADN, pero que conectan los factores de transcripción con la maquinaria basal de transcripción. En la célula el ADN se encuentra de forma altamente organizado en la cromatina. En estas condiciones de alto empaquetamiento la transcripción se encuentra dificultada y los sitios de unión de los factores basales de transcripción pueden ser inaccesibles. Existen dos mecanismos principales para aliviar este bloqueo transcripcional: i) la modificación covalente de las colas de las histonas y ii) la disrupción de los nucleosomas por la acción de los denominados complejos remodeladores de cromatina dependientes de ATP.

En cuanto al primer mecanismo, las histonas están sujetas a una gran variedad de modificaciones postraduccionales que incluyen la acetilación, metilación, fosforilación, ADP-ribosilación, ubiquitinación y sumoilación. Estas modificaciones, que normalmente ocurren en los extremos N-terminal y C-terminal denominados “colas” de las histonas, juegan un papel esencial en el empaquetamiento de los nucleosomas y pueden crear nuevas superficies de reconocimiento de reguladores transcripcionales. Todo esto condujo a la hipótesis del “código de las histonas”, según el cual combinaciones específicas de diversas modificaciones de las colas de las histonas dictan la activación o represión transcripcional. Se sabe que la acetilación de histonas produce descompactación de la cromatina y activación de la transcripción. Los niveles de acetilación están determinados por la actividad de histonas acetiltransferasas (HAT) que transfieren grupos acetilos y desacetilasas (HDAC) que los eliminan, causando hipoacetilación de las histonas, compactación de la cromatina y represión transcripcional. Por otra parte, la metilación de argininas en las colas de histonas a través de la acción de histonas metiltransferasas se relaciona con activación transcripcional, mientras que la metilación de ciertas lisinas produce represión. En cuanto al segundo mecanismo, los complejos remodeladores de cromatina están formados, junto con otras proteínas, por una subunidad que tiene actividad ATPasa. Estos complejos utilizan la energía que se produce en la hidrólisis del ATP para producir un cambio en la posición del octámero de histonas respecto al ADN, lo que facilita también la unión de factores cuyos sitios de unión no estaban expuestos en los nucleosomas.

Se han identificado diferentes complejos de coactivadores que interaccionan con los receptores nucleares de forma dependiente de ligando y que son esenciales para la activación de la transcripción por estos factores. El cambio conformacional que ocurre en los receptores tras la unión del ligando (y que como se ha mencionado implica fundamentalmente el reposicionamiento de la H12 que contiene el dominio de activación transcripcional dependiente de ligando AF-2), permite la formación de una superficie de interacción con los coactivadores. Esta superficie está constituida por un surco del que forman parte residuos de la H12, así como de las H3 y H4 contenidas en el dominio conservado τi.

El primer coactivador de receptores nucleares clonado fue el SRC-1 (steroid receptor coactivor 1). Esta proteína forma parte, junto con otros dos miembros, de la familia de coactivadores p160. Estos coactivadores tienen una estructura conservada con un dominio central de interacción con los receptores que contiene tres copias del motivo LxxLL, donde L es leucina y x un aminoácido cualquiera. Un residuo conservado de ácido glutámico presente en la H12 de los receptores, así como un residuo de lisina presente en la H3 también conservado en toda la superfamilia, hacen contactos directos con las leucinas 1 y 5 del motivo LxxLL de los coactivadores, formando una estructura que orienta y posiciona al coactivador en el surco formado en el receptor tras la unión del ligando. Los coactivadores p160 tienen actividad HAT intrínseca e interaccionan con otras HAT y con histonas arginina metiltransferasas. Estas interacciones proteína-proteína permiten que la unión del ligando produzca el reclutamiento de complejos que causan la acetilación y metilación local de las histonas en las regiones que contienen los HRE. Los receptores nucleares también reclutan factores remodeladores de cromatina dependientes de ATP. La presencia de la subunidad con actividad ATPasa es requerida para la activación dependiente de ligando por varios receptores nucleares, y se ha demostrado la existencia de interacciones directas entre los receptores y otros componentes de estos complejos. Existe un tercer tipo de coactivadores que se reclutan al receptor nuclear tras la unión del ligando. Estos coactivadores forman parte del complejo denominado TRAP (proteínas relacionadas con el TR) o DRIP (proteínas que interaccionan con el VDR) que es análogo al complejo transcripcional de levaduras que se denomina Mediator y cuya función sería atraer a la RNA polimerasa II al promotor diana. Recientemente se demostró que los receptores nucleares también interaccionan con quinasas que fosforilan las histonas, desmetilasas de histonas que remueven la metilación en lisinas, e incluso desmetilasas de ADN, que prepararían a la cromatina para la acción posterior de los complejos coactivadores citados.

Represión transcripcional en ausencia de ligando

Algunos receptores, entre los que se encuentran el TR y el RAR, en ausencia del ligando, reprimen activamente la transcripción de genes que contienen HRE. Esta represión se debe a que los receptores vacíos, que se encontrarían unidos al ADN, interaccionan con “correpresores” como el NCoR (correpresor nuclear) y el SMRT (mediador del silenciamiento por TR y RAR). Aunque los correpresores en sí no tienen actividad desacetilasa, interaccionan complejos que contienen HDAC. El dominio del receptor que interacciona con los correpresores solapa de manera parcial con el de la unión con los coactivadores, por lo que la unión al receptor de ambos tipos de factores es mutuamente excluyente. Los receptores de esteroides en ausencia de hormona no unen correpresores, pero la unión de ligandos antagonistas a estos receptores permite la unión de correpresores y excluye la de los coactivadores. Por tanto, el efecto de los antagonistas de los receptores de estrógenos o andrógenos, de amplia utilización clínica en el tratamiento de los tumores dependientes de hormonas, es debido no solamente a la inhibición de los efectos de las hormonas naturales, sino a que además transforman a sus receptores en represores transcripcionales.

Así pues, el mecanismo de regulación de la transcripción de genes que contienen HRE por los receptores nucleares sería el siguiente (figura 69-15): los receptores en ausencia de ligando o unidos a un antagonista reprimen la transcripción a través del reclutamiento de los complejos correpresores que contienen actividad desacetilasa lo que causa la compactación de la cromatina y la represión de la transcripción. La unión del agonista causa el reposicionamiento de la H12 y desencadena la liberación de estos complejos y el reclutamiento de complejos coactivadores. Estos complejos que modifican el “código de histonas” remodelan los nucleosomas y atraen a la RNA polimerasa II, alteran la estructura de la cromatina, permitiendo su descompactación y la activación de la transcripción del gen diana.

Represión transcripcional dependiente de ligando

Los receptores nucleares pueden también reprimir la transcripción de forma dependiente de ligando. Son en particular importantes los mecanismos de autoinhibición implicados en la síntesis hormonal. Así, los glucocorticoides regulan negativamente la expresión del gen de la proopiomelanocortina (POMC) uno de cuyos productos es la ACTH (hormona corticotropa) que estimula la síntesis de los esteroides suprarrenales. De la misma forma, las hormonas tiroideas inhiben la transcripción del gen de la tirotropina (TSH), que a su vez estimula el tiroides. En los promotores de la POMC y de la subunidad β de la TSH existen los denominados HRE “negativos” que median la acción inhibidora de los glucocorticoides y las hormonas tiroideas, respectivamente. Los mecanismos moleculares por los que los receptores nucleares inhiben la transcripción a través de su unión a los HRE “negativos” aún no están bien definidos.

Existen mecanismos adicionales por los que los ligandos de los receptores nucleares causan una inhibición de la transcripción. Uno de ellos proviene del hecho de que los receptores actúen en forma de dímeros. Así, la dimerización de un receptor funcional con receptores mutados o truncados puede dar origen a la formación de dímeros inactivos que bien no se unen a ADN o son transcripcionalmente inactivos. Este tipo de mecanismos de competición por unión al HRE y/o por otro receptor puede ser la causa molecular de la denominada “actividad dominante negativa” de los receptores de hormonas tiroideas mutados que causan el síndrome de resistencia a hormonas tiroideas.

Por último, se demostró que los receptores nucleares pueden inhibir respuestas transcripcionales de genes que no contienen un HRE a través de la regulación de la actividad de los factores de transcripción que se unen a otros elementos del promotor regulado, un mecanismo al que se denomina “transrepresión”. En este caso la inhibición se produciría por interacciones directas proteína-proteína con otros factores de transcripción y/o por inhibición de la liberación de complejos correpresores. Por ejemplo, diferentes ligandos de receptores nucleares reprimen la expresión de genes que contienen sitios de unión para el complejo AP-1 (formado por las oncoproteínas Jun y Fos), que parecen jugar un papel fundamental en los procesos de proliferación celular. Muchos de los efectos antiproliferativos y diferenciadores de los glucocorticoides y otras hormonas esteroideas, así como de los retinoides, podrían implicar este mecanismo de antagonismo transcripcional. Otro importante caso de antagonismo transcripcional sería el que ocurre entre el receptor de glucocorticoides y el factor de transcripción NFκB. Los glucocorticoides reprimen la activación de genes que contienen sitios NFκB por las citoquinas proinflamatorias, lo que parece jugar un papel fundamental en las acciones antiinflamatorias de estas hormonas. Que los mecanismos de transrepresión juegan un papel importante in vivo se ha demostrado en ratones modificados genéticamente en los que el GR o TR nativos se han reemplazado por mutantes que no se unen al ADN.

Moduladores selectivos de los receptores nucleares

Los ligandos agonistas y antagonistas de los receptores nucleares tienen un indudable interés terapéutico pero, a su vez, causan diversos efectos secundarios que limitan su uso. Por ejemplo, la potente actividad antiinflamatoria de los glucocorticoides está limitada por causar hiperglucemia, pérdida de masa ósea y síndrome de Cushing, los efectos favorecedores de la vitamina D por la producción de hipercalcemia y la terapia hormonal posmenopáusica con estrógenos por su actividad proliferativa en mama y endometrio que aumenta el riesgo de cáncer. Para evitar estas complicaciones se desarrollan ligandos selectivos, denominados SNuRM (selective nuclear receptor modulators), que pueden modular la actividad del receptor de forma específica de tejido o que no son capaces de estimular la expresión de genes con HRE, pero que sí son capaces de transreprimir. Estos ligandos son prometedores como herramientas farmacológicas en una gran variedad de enfermedades incluyendo el cáncer o las enfermedades inflamatorias e inmunitarias. Los denominados SERM (moduladores selectivos del receptor de estrógenos) (ver capítulo 83) son un buen ejemplo de este tipo de ligandos. Existen SERM no esteroideos que pueden producir efectos selectivos dependiendo del tipo de tejido. Así, el tamoxifeno no actúa como un antagonista puro, y mientras que inhibe el cáncer de mama, produce un aumento pequeño, pero significativo en la incidencia del cáncer de endometrio. Últimamente se utilizó otro SERM, el raloxifeno, que no sólo disminuye el cáncer de endometrio, sino que también tiene efectos benéficos sobre la osteoporosis o sobre la función vascular. La explicación de las acciones específicas de tejido de los SERM, que les permite actuar como estrógenos en algunos tejidos y como antiestrógenos en otros, se basa en la diferente conformación que adquiere el receptor tras la unión de distintos ligandos, y en el reclutamiento selectivo de coactivadores y correpresores distintos en los diferentes tejidos.

La existencia de dos isoformas de los ER (α y β) creó, además, la posibilidad de obtener ligandos específicos. Sería posible, por ejemplo, el desarrollo de un antagonista específico del ERα para prevenir el cáncer de mama, o de un agonista específico del ERβ con efectos favorecedores sobre el sistema nervioso.

Defectos genéticos de los receptores nucleares

Diversas enfermedades se relacionan con defectos en la función de los receptores nucleares. Así, se demostró la existencia de defectos genéticos en el receptor de vitamina D en casos de raquitismo hipocalcémico tipo II con resistencia a esta vitamina (VDRR). Este síndrome que es autosómico recesivo es causado, en algunos casos, por mutaciones puntuales en el VDR que afectan la unión al ADN o al ligando, o dan lugar a un receptor truncado que carece de gran parte del LBD. También se ha detectado una mutación en el ácido glutámico del dominio AF-2 del VDR implicado en el reclutamiento de coactivadores en pacientes con VDRR que cursa sin alopecia.

En el síndrome de feminización testicular, también denominado AIS (de insensibilidad a andrógenos), individuos que son genéticamente XY presentan una resistencia tisular a los andrógenos y un fenotipo femenino. Se ha caracterizados una serie de defectos genéticos en el receptor de andrógenos (AR) que causan AIS. Este receptor se localiza en el cromosoma X, lo que hace que dichos defectos se puedan poner de manifiesto clínicamente en estado hemicigótico. En algunos casos hay alteraciones en el receptor que producen un síndrome de feminización testicular completa, mientras que en otras situaciones se detectaron mutaciones puntuales que producen resistencia parcial a andrógenos con feminización testicular incompleta o síndrome de Reifenstein. Es importante señalar que existe una buena correlación entre la capacidad de transactivación del receptor mutado y el fenotipo de los pacientes. Sorprendentemente, se demostró que el denominado síndrome de Kennedy, que no cursa con feminización, pero que causa neurodegeneración de las motoneuronas, se debe a la amplificación de un tracto de glutaminas en el dominio AF-1 del AR.

Se han encontrado también mutaciones en otros receptores como el PPARγ, que juega un importante papel en la diferenciación de los adipocitos. En una de ellas, que se localiza en el dominio AF-1 se produce un aumento de la sensibilidad a la insulina, mientras que la mutación de un residuo en el DBD se vincula con obesidad extrema. Por último, dos mutaciones en el LBD, que afectan a la unión de coactivadores, cursan con resistencia a la insulina e hipertensión. También existen resistencias primarias al cortisol que se heredan de forma autosómica recesiva y son debidas a mutaciones del receptor de glucocorticoides que reducen la afinidad por la hormona. Estas formas de resistencia, además de causar diferentes síntomas, cursan con altos niveles de cortisol y ACTH.

En los síndromes de resistencia a las hormonas tiroideas, que son heredados con un patrón autosómico dominante, existen altos niveles de hormonas tiroideas que no reprimen la expresión de tirotropina que presenta niveles desproporcionadamente altos, así como diferentes grados de bocio, retraso mental, retraso en la maduración ósea y sordera. Estos defectos se relacionan con mutaciones en el gen TRβ y se ha estudiado un gran número de casos. En la mayoría existen mutaciones puntuales que se concentran en la misma región del LBD y que incluso son idénticas en diferentes familias. La afinidad por la hormona suele estar poco afectada, pero las mutaciones afectan con frecuencia la capacidad de heterodimerización o transactivación, habiéndose observado además en muchos casos un aumento de la unión de correpresores. Como se ha mencionado estos receptores pueden actuar de forma “dominante negativa”, interfiriendo la actividad transcripcional del receptor nativo. Esto podría explicar que estas resistencias hormonales se hereden de forma dominante y tengan manifestaciones clínicas incluso en presencia del alelo β no mutado y de formas de receptor α normales.