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Receptores que afectan las concentraciones de ligandos endógenos
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Un gran número de fármacos actúan alterando la síntesis, almacenamiento, liberación, transporte o metabolismo de ligandos endógenos como neurotransmisores, hormonas y otros mediadores intercelulares. Hay muchos ejemplos de fármacos que actúan sobre la unión neuroefectora al alterar la síntesis del neurotransmisor, almacenamiento del neurotransmisor en vesículas, liberación del neurotransmisor en la hendidura sináptica y la eliminación subsiguiente del neurotransmisor de la hendidura sináptica por hidrólisis o transporte hacia la neurona presináptica o postsináptica. Los efectos de estos fármacos pueden incrementar o disminuir los efectos del neurotransmisor para lograr el efecto terapéutico deseado. Por ejemplo, algunos de los fármacos actúan sobre los neurotransmisores adrenérgicos (caps. 8 y 12) lo que incluye a la metiltirosina α que inhibe la síntesis de noradrenalina (N, norepinephrine), cocaína (bloquea la recaptación de NE), anfetaminas (favorece la liberación de NE) y seligilina (inhibe la degradación de NE). Existen ejemplos similares de otros sistemas de neurotransmisores, lo que incluye la acetilcolina (ACh; caps. 8 y 10), dopamina (DA, dopamine) y serotonina (5-HT; caps. 13 a 15). Los fármacos que afectan la síntesis de mediadores circulantes, como los péptidos vasoactivos (p. ej., inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina; cap. 26) y los autacoides derivados de lípidos (p. ej., inhibidores de la ciclooxigenasa, cap. 33) también se utilizan ampliamente en el tratamiento de la hipertensión, inflamación, isquemia miocárdica y otros estados patológicos.
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Receptores que regulan el entorno iónico
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Un número relativamente pequeño de fármacos actúa al afectar el entorno iónico de sangre, orina y tubo digestivo. Los receptores para estos fármacos son bombas y transportadores iónicos, muchos de ellos se expresan sólo en células especializadas del riñón y del tubo digestivo. Los efectos farmacológicos en varios de tales receptores pueden tener efectos en todo el cuerpo por cambios en los electrólitos y pH sanguíneos. Por ejemplo, la mayor parte de los diuréticos (furosemida, clorotiazidas, amilorida) actúan al afectar directamente las bombas y transportadores iónicos en las células epiteliales de las nefronas lo que incrementa el desplazamiento de Na+ hacia la orina o mediante la alteración de la expresión de bombas iónicas en dichas células (p. ej., aldosterona). En el capítulo 25 se proporciona una descripción detallada de los mecanismos de acción de los fármacos diuréticos. Otro objetivo terapéutico de importancia es la H+,K+-ATPasa (bomba de protones) de las células parietales gástricas. La inhibición irreversible de esta bomba de protones por fármacos como el esomeprazol reduce la secreción de ácido gástrico en 80 a 95% (cap. 45) y que es un aspecto fundamental del tratamiento para la úlcera péptica.
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Vías celulares activadas por receptores fisiológicos
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Vías de transducción de señales. Los receptores fisiológicos tienen al menos dos funciones importantes, la unión a ligandos y la propagación de mensajes (señalización). Tales funciones implican la existencia de al menos dos dominios funcionales en el receptor: un dominio al cual se une el ligando y un dominio efector. La estructura y función de estos dominios en muchas familias de receptores se ha reducido por estructuras cristalográficas de alta resolución de las proteínas que actúan como receptores, por análisis de la conducta de los receptores mutados de manera intencional o por ambos métodos. Muchos fármacos utilizan como objetivo el dominio extracelular de unión de ligando de los receptores fisiológicos. Algunos ejemplos incluyen el uso amplio de antagonistas adrenérgicos β. Sin embargo, los fármacos pueden afectar los receptores al dirigirse al dominio, como ocurre en el caso de los fármacos antineoplásicos dirigidos al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR, epidermal growth factor receptor; caps. 60 a 62). El cetuximab es un anticuerpo monoclonal que se dirige al dominio extracelular de ligando de EGFR e inhibe la señalización del factor de crecimiento epidérmico (EGF, epidermal growth factor) mientras que los fármacos de moléculas pequeñas como gefitinib y erlotinib se unen al dominio efector intracelular y bloquean la actividad de tirosina cinasa del EGFR activado.
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Las acciones reguladoras de un receptor pueden ejercerse en forma directa en su objetivo celular, en proteínas efectoras o pueden transmitirse a través de moléculas de señalización celular intermediarias conocidas como transductores. El receptor (el objetivo celular) y cualquier molécula intermediaria se conocen como sistema receptor-efector o vía de transducción de señales. Con frecuencia, la proteína efectora celular proximal no es el objetivo fisiológico final sino que más bien es una enzima, un conductor iónico o una proteína transportadora que crea, desplaza o degrada una molécula pequeña (p. ej., un nucleótido cíclico, trifosfato de inositol u NO) o un ion [p. ej., Ca2+]) conocido como segundo mensajero. Si el efector es un conductor iónico o una bomba iónica, el efecto de la unión a un ligando puede ser el cambio en el potencial de membrana que altera la excitabilidad de la célula. Los segundos mensajeros pueden difundirse en la proximidad de los sitios donde se sintetiza o liberarse y transmitir información a diversos objetivos, que pueden integrar múltiples señales. Aunque estos segundos mensajeros originalmente se diseñaron como moléculas de difusión libre en la célula, estudios de imagen muestran que su difusión y acciones intracelulares están limitadas por compartimentalización (ubicación selectiva de los complejos receptor-transductor-efector-terminación de la señal) establecidos por interacciones entre proteínas y entre proteínas y lípidos (Baillie, 2009). Todas las células expresan múltiples formas de proteínas diseñadas para localizar las vías de señalización por interacciones entre proteínas; tales proteínas se denominan proteínas de andamiaje o de fijación. Ejemplos de moléculas de andamiaje incluyen proteínas de fijación de cinasa A (AKAP, A-kinase anchoring proteins) que se unen a subunidades reguladoras en el cAMP dependiente de proteína cinasa (PKA, protein kinase) cerca del sustrato en diversos compartimientos subcelulares (Carnegie et al., 2009).
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Integración y amplificación de señales. Los receptores y proteínas efectoras y translocadas asociadas también actúan como integradores de la información conforme coordinan las señales de múltiples ligandos uno con otro y con actividad diferenciada en la célula en que ejercen sus efectos. Por ejemplo, los sistemas de transducción de señales reguladas por cambios en el cAMP (cAMP) y en el Ca2+ intracelular están integradas en muchos tejidos explicables. En los miocitos cardiacos, un incremento en el cAMP celular causado por la activación de receptores adrenérgicos β incrementa la contractilidad cardiaca al aumentar la tasa y cantidad de Ca2+ suministrado al aparato contráctil; así, cAMP y Ca2+ son señales contráctiles positivas en los miocitos cardiacos. En cambio, cAMP y Ca2+ producen el efecto opuesto en la contractilidad de las células de músculo liso: como siempre, el Ca2+ actúa como señal contráctil, sin embargo la activación de los receptores adrenérgicos β en estas células activa la vía cAMP-PKA, lo que produce relajación a través de la fosforilación de proteínas que media la señalización de Ca2+, como la miosina cinasa de cadena ligera y los conductos iónicos que hiperpolarizan la membrana celular. Así, diferentes patrones de integración de los sistemas de transducción de señales en las células objetivo pueden ocasionar diversos efectos farmacológicos que son consecuencia de interacciones funcionales con los receptores. Tales interacciones funcionales pueden ser sinergistas, aditivas o antagonistas.
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Otra propiedad importante de los receptores fisiológicos es su capacidad para amplificar de manera significativa una señal fisiológica. Los neurotransmisores, hormonas y otros ligandos extracelulares están presentes en los dominios de fijación del ligando de un receptor en concentraciones muy bajas (concentraciones en el rango de nM a μM). Sin embargo, el dominio efector o la vía de transducción de señales a menudo contiene enzimas y cascadas de enzimas que amplifican en forma catalítica la señal en cuestión. En este sentido, la descripción de ocupación de receptor-respuesta celular en la ecuación 3-1 constituye una simplificación excesiva. La capacidad de prácticamente todos los receptores para amplificar señales fisiológicas los convierte en excelentes objetivos para ligandos naturales y fármacos. Por ejemplo, cuando una molécula agonista se une a un receptor que es un conductor iónico, cientos de miles o millones de iones fluyen a través del conducto iónico cada segundo. De la misma forma, la unión de un fotón único a cis-retinal en un fotorreceptor de rodopsina finalmente se amplifica casi 1 × 106 veces. En el caso de receptores nucleares, una molécula de hormona esteroide que se une a su receptor inicia la transcripción de muchas copias de mRNA específico, que a su vez da origen a múltiples copias de una sola proteína.
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Familias estructurales y funcionales de receptores fisiológicos
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Los receptores de moléculas reguladoras fisiológicas pueden asignarse a familias funcionales cuyos miembros comparten estructuras moleculares y mecanismos bioquímicos similares con características comunes. En el cuadro 3-1 se resumen las seis familias principales de receptores con ejemplos de sus ligandos fisiológicos, sistemas de transducción de señales y fármacos que afectan estos sistemas. La estructura básica de los dominios de fijación de los ligandos, dominios efectores y la forma en que la unión de agonistas influye en la actividad reguladora del receptor es bien comprendida por cada uno de estos sistemas de transducción de señales. El número relativamente pequeño de mecanismos bioquímicos y formatos estructurales utilizados para la señalización celular es fundamental para las formas en las que las células integran señales de múltiples receptores para producir respuestas aditivas, secuenciales, sinergistas o inhibidoras.
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Receptores acoplados a proteínas G (GPCR)
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Receptores y proteínas G. Los GPCR se integran en la membrana plasmática como una haz de siete hélices α (Palczewski et al., 2000) (fig. 3-8). Los seres humanos expresan más de 800 GPCR lo que constituye la tercera familia más grande de genes en seres humanos, y en términos generales casi la mitad de estos GPCR se dedican a la percepción sensorial (olfato, gusto y visión). Los receptores restantes regulan un número impresionante de funciones fisiológicas lo que incluye actividad nerviosa, tensión del músculo liso, metabolismo, contracción cardiaca en cuanto a su frecuencia y fuerza y la secreción de la mayor parte de las glándulas corporales. Incluidos entre los ligandos de GPCR se encuentran neurotransmisores como ACh, aminas biógenas como noradrenalina, todos los eicosanoides y otras moléculas lipídicas de señalización, hormonas peptídicas, opioides, aminoácidos como GABA y muchos otros péptidos y ligandos de proteínas. Los GPCR son reguladores importantes de la actividad nerviosa en el SNC y son los receptores para neurotransmisores del sistema nervioso autónomo periférico. Por ejemplo, la ACh liberada por el sistema nervioso parasimpático regula las funciones de glándulas y músculo liso a través de la acción de receptores muscarínicos. La noradrenalina liberada por el sistema nervioso simpático interactúa con los receptores adrenérgicos α y β para regular la función cardiaca y el tono del músculo liso vascular (caps. 8 a 12). Por su número e importancia fisiológica, los GPCR son objetivos para muchos fármacos; es posible que casi la mitad de todos los fármacos de prescripción que no corresponden al grupo de antibióticos actúan sobre estos receptores.
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Subtipos de receptores. Existen múltiples subtipos de receptores en las familias de receptores. Los estudios de unión a ligando con múltiples entidades químicas identificaron al inicio subtipos de receptores; la clonación molecular aceleró en gran medida el descubrimiento y definición de subtipos adicionales de receptores; su expresión como proteínas recombinantes ha facilitado el descubrimiento de fármacos selectivos para los subtipos. Receptores diferentes pero relacionados pueden mostrar patrones particulares de selectividad entre ligandos agonistas o antagonistas. Cuando no se conoce un ligando selectivo, los receptores más a menudo se conocen como isoformas más que como subtipos. La diferenciación entre clases y subtipos de receptores a menudo es arbitraria o tiene objetivos históricos. Los receptores adrenérgicos α1, α2 y β difieren uno de otro en la selectividad de ligando y en el acoplamiento a proteínas G (Gq, Gi y Gs, respectivamente), y por tanto los receptores α y β se consideran clases de receptor y α1 y α2 se consideran subtipos. Las isoformas de receptores α1A, α1B y α1C difieren poco en cuanto a sus propiedades bioquímicas, aunque es diferente la distribución en los tejidos. Los subtipos de receptores adrenérgicos β1, β2 y β3 muestran diferencias tanto en la distribución y regulación en los tejidos como en la fosforilación por cinasas de receptor de proteínas G (GRK, G-protein receptor kinases) y PKA.
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Las diferencias farmacológicas entre subtipos de receptores se utilizan con fines terapéuticos a través del desarrollo y uso de fármacos selectivos para receptores. Dichos fármacos pueden utilizarse para desencadenar respuestas diferentes en un solo tejido cuando los subtipos de receptores inician diferentes señales intracelulares o pueden servir para modular de manera diferencial células o tejidos que expresaron uno u otro subtipo de receptores. Por ejemplo, los agonistas adrenérgicos β2 como la terbutalina se utilizan para broncodilatación en el tratamiento del asma con la esperanza de reducir los efectos cardiacos secundarios por estimulación de los receptores adrenérgicos β1 (cap. 12). Por el contrario, el uso de antagonistas selectivos β1 reduce la posibilidad de broncoconstricción en pacientes que reciben tratamiento por hipertensión o angina (caps. 12 y 27). El incremento de la selectividad de un fármaco en tejidos o entre las respuestas desencadenadas por un tejido único pueden determinar si los beneficios terapéuticos de un fármaco sobrepasan sus efectos indeseables.
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Dimerización de receptores. Las interacciones receptor-ligando solas no regulan toda la señalización de GPCR. Los GPCR sufren homodimerización y heterodimerización y tal vez oligomerización. La heterodimerización puede producir unidades de receptor con farmacología alterada en comparación con los receptores individuales. Como ejemplo, los receptores de opioides pueden existir como homodímeros para receptores μ o δ o como heterodímeros μδ con propiedades farmacodinámicas diferentes que cualquiera de los homodímeros (cap. 18). Está surgiendo evidencia de que la dimerización de receptores puede regular la afinidad y especificidad de los complejos ligando-receptor para proteínas G y puede regular la sensibilidad del receptor a la fosforilación por cinasas de receptores y al unirse a la arrestina, sucesos clave en la terminación de la acción de agonistas y la eliminación de receptores de la superficie celular. La dimerización también puede permitir la unión de receptores a otras proteínas reguladoras como los factores de transcripción. Así, los sistemas de receptor-proteínas G-sistemas efectores son redes complejas de interacciones convergentes y divergentes que incluyen acoplamiento receptor-receptor y receptor-proteínas G lo que permite una regulación extremadamente versátil y la función celular. La dimerización de receptores únicos que abarcan toda la membrana es fundamental para su activación (que se describe más adelante en este capítulo).
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Proteínas G. Los GPCR se acoplan a una familia de proteínas reguladoras heterotriméricas que se unen a GTP conocidas como proteínas G. Las proteínas G son transductores de señales que transmiten la información de que el agonistas se une a su receptor, desde el receptor a una o más proteínas efectoras (Gilman, 1987). Los efectores regulados por la proteína G incluyen enzimas como la adenililciclasa, fosfolipasa C, cGMP fosfodiesterasa (PDE6) y conductos iónicos de membrana selectivos para Ca2+ y K+ (cuadro 3-1, fig. 3-8). La proteína G heterotrimérica está compuesta de una subunidad α unida a un nucleótido guanina, lo que le confiere especificidad para el reconocimiento de receptores y efectores y un dímero asociado de las subunidades β y γ que ayuda a conferir la localización de la membrana del heterodímero de la proteína G por prenilación de las subunidades γ. En el estado basal del complejo receptor-heterotrímero, la subunidad α contiene GDP y el complejo α-GDP:βγ está unido al receptor sin ligando (fig. 3-8). La familia de las proteínas G está constituida por 23 subunidades α (que son producto de 17 genes), siete subunidades β y 12 subunidades γ. Las subunidades alfa (Gs, Gi, Gq, y G12/13) que participan en el acoplamiento de GPCR con efectores relativamente distintos. Las subunidades Gs α activan de manera uniforme la adenililciclasa; las subunidades Gi α pueden inhibir ciertas isoformas de adenililciclasa; las subunidades Gq α activan todas las formas de fosfolipasa Cβ y las subunidades G12/13 α se acoplan cofactores de intercambio del nucleótido guanina (GEF, guanine nucleotide exchange factors) como p115RhoGEF para las proteínas pequeñas unidas a GTP Rho y Rac. La especificidad de señalización de un gran número de posibles combinaciones β y γ no está clara; sin embargo, se sabe que los conductos de K+ y Ca2+ así como la cinasa PI-3 (PI3K) son algunos de los efectores del dímero libre βγ (fig. 3-8).
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Activación de proteína G. Cuando un agonista se une a un GPCR, hay un cambio conformacional en el receptor que se transmite del sitio de unión de ligando a una segunda y tercera asas intracelulares del receptor que se acoplan con el heterotrímero de proteína G. Este cambio conformacional causa que la subunidad α intercambie su unión de GDP por GTP (fig. 3-8). La unión a GTP activa a la subunidad α y produce la liberación del dímero βγ y del receptor y tanto la subunidad α unida a GTP como el heterodímero βγ se vuelven moléculas de señalización activa (Gilman, 1987). La interacción del GPCR unido al agonista con la proteína G es transitoria; después de la activación de una proteína G, se libera el receptor para interactuar con otra proteína G. Dependiendo de la naturaleza de la subunidad α activa, la unida a GTP forma sitios de unión con efectores como adenililciclasa y las regulan (a través de Gsα) o fosfolipasa Cβ (a través de Gqα). La subunidad βγ puede regular muchos efectores lo que incluye conductos iónicos y enzimas como PI3-K (fig. 3-8). La proteína G permanece activa hasta que el GTP unido a la subunidad α sufre hidrólisis a GDP. La subunidad α tiene una tasa intrínseca de hidrólisis de GTP que es modulada por una familia de proteínas conocidas como reguladores de señalización de proteína G (RGS, regulators of G protein signaling). Las proteínas RGS aceleran en gran medida la hidrólisis de GTP y son en potencia objetivos farmacológicos atractivos (Ross y Wilkie, 2000). Una vez que el GTP unido a la subunidad α sufre hidrólisis a GDP, la subunidad βγ y el receptor se combinan para formar un complejo basal de receptor inactivo-proteína G heterotrimérica que puede reactivarse por otro evento de fijación de ligando (fig. 3-8).
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cAMP. La adenililciclasa sintetiza cAMP bajo el control de muchos GPCR; la estimulación es mediada por una subunidad Gs α y la inhibición por la subunidad Gi α. La vía de cAMP proporciona buenas bases para la comprensión de la estructura y regulación de varios sistemas de señalización de segundo mensajero (para una revisión de la acción de los nucleótidos cíclicos, véase Beavo y Brunton, 2002).
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Hay nueve isoformas de adenililciclasa (AC, adenylyl ciclase) unidas a membrana y una isoforma soluble que se encuentra en mamíferos (Hanoune y Defer, 2001). Las AC unidas a membrana son glucoproteínas de alrededor de 120 kDa con considerable homología en su secuencia: un pequeño dominio citoplásmico; dos dominios hidrófobos transmembrana, cada uno con seis hélices que abarcan la totalidad de la membrana y dos dominios citoplásmicos grandes. Las AC unidas a membrana muestran actividad enzimática basal que es modulada por la unión de subunidades α ligadas a GTP de proteínas G estimuladoras e inhibidoras (Gs y Gi). Es posible que existan muchas otras interacciones reguladoras y estas enzimas se clasifican con base en su homología estructural y en su regulación característica por subunidades α y βγ de proteína G, Ca2+, proteínas cinasas y por las interacciones del diterpeno forskolina. El cAMP generado por adenililciclasa tiene tres objetivos principales en la mayor parte de las células, el cAMP dependiente de proteínas cinasas (PKA), los factores de intercambio del nucleótido guanina regulado por cAMP conocidos como EPAC (factores de intercambio activados de manera directa por cAMP) y a través de fosforilación de PKA, un factor de transcripción conocido como CREB (elemento de respuesta de cAMP unido a proteínas). En células con funciones especializadas, el cAMP puede tener objetivos adicionales como un conductor iónico controlado por nucleótidos cíclicos (Wahl-Schott y Biel, 2009), fosfodiesterasas reguladas por nucleótidos cíclicos (PDE) y varios transportadores ABC (MRP4 y MRP 5) para los cuales es su sustrato (cap. 7).
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PKA. El objetivo mejor conocido del cAMP es la holoenzima PKA que consiste de dos subunidades catalíticas (C) con unión reversible a una subunidad reguladora (R) que corresponde a un dímero para formar un complejo heterotetramérico (R2C2). Con concentraciones bajas de cAMP, las subunidades R inhiben las subunidades C; así, esta holoenzima es inactiva. Cuando se activa la AC y se incrementan las concentraciones de cAMP, cuatro moléculas de cAMP se unen al complejo R2C2, dos a cada subunidad R, produciendo un cambio conformacional en las subunidades R que disminuyen la afinidad por las subunidades C, ocasionando su activación. Las subunidades C activas producen la fosforilación de residuos de serina y treonina en sustratos proteínicos específicos.
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Existen múltiples isoformas de PKA; la clonación molecular ha revelado isoformas α y β de subunidades reguladoras (RI y RII) y también tres isoformas de las subunidades C, Cα, Cβ y Cγ. Las subunidades R muestran ubicación subcelular diferente y diferentes afinidades de fijación para cAMP, dando origen a holoenzimas de PKA con diferentes umbrales para la activación (Taylor et al., 2008). Las subunidades R y C interactúan con otras proteínas en la célula, en particular las subunidades R y estas interacciones pueden ser específicas para las isoformas. Por ejemplo, las isoformas RII están muy localizadas cerca de su sustrato en las células mediante interacciones con diversas proteínas de fijación de cinasa A (AKAP, A kinase anchoring proteins) (Carnegie et al., 2009; Wong y Scott, 2004).
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PKA puede fosforilar diversos objetivos fisiológicos como enzimas metabólicas y proteínas transportadoras y numerosas proteínas reguladoras lo que incluye otras proteínas cinasas, conductos iónicos y factores de transcripción. Por ejemplo, la fosforilación de la proteína de unión al elemento de respuesta de cAMP, CREB en la serina 133 repercute en las proteínas unidas a CREB (CBP, CREB-binding protein) una acetil transferasa de histona que interactúa con la RNA polimerasa II (POLII) y ocasiona incremento en la transcripción de aproximadamente 105 genes que contienen el elemento de respuesta a cAMP (CRE, cAMP response element) en sus regiones promotoras (p. ej., tirosina hidroxilasa, iNOS, AhR, angiotensinógeno, insulina, receptor de glucocorticoides, BC12 y CFTR) (Mayr y Montminy, 2001; Sands y Palmer, 2008).
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Factores de intercambio del nucleótido de guanina regulado por cAMP (GEF). Las proteínas pequeñas unidas a GTP son GTPasas monoméricas y reguladoras fundamentales de la función celular. Las GTPasas pequeñas operan como interruptores binarios que existen en conformaciones unidas a GTP o GDP. Ellas integran señales extracelulares provenientes de los receptores de membrana con cambios citoesqueléticos y activación de diversas vías de señalización, regulando procesos tales como fagocitosis, progresión a través del ciclo celular, adhesión celular, expresión génica y apoptosis (Etienne-Manneville y Hall, 2002). Varios estímulos extracelulares producen señales a GTPasas pequeñas de manera directa o a través de segundos mensajeros como cAMP.
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Por ejemplo, muchas GTPasas pequeñas son reguladas por GEF, los cuales actúan al unirse a la ATPasa ligada a GDP y catalizar intercambio de GDP por GTP. Los dos GEF regulados por cAMP son capaces de activar a miembros de la familia Ras de GTP pequeños, Rap1 y Rap2; estos GEF se denominan proteínas de intercambio activadas por cAMP (EPAC-1 y EPAC-2). La vía EPAC proporciona un sistema efector adicional para la señalización por cAMP y la acción farmacológica que puede actuar de manera independiente o en cooperación con PKA (Cheng et al., 2008; Roscioni et al., 2008).
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PKG. La estimulación de receptores que incrementa las concentraciones intracelulares de cAMP (fig. 3-11) ocasiona activación de la proteína cinasa dependiente de cGMP (PKG) que fosforila algunos de los sustratos en la forma en que lo hace PKA y algunos son específicos de PKG. En algunos tejidos, PKG también puede ser activado por cAMP. A diferencia de la estructura de heterotetrámero (R2C2) de la holoenzima PKA, el dominio catalítico y el dominio de unión a nucleótidos cíclicos de PKG se expresan como un solo polipéptido, el cual se dimeriza para formar la holoenzima PKG.
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PKG existe en dos formas homólogas, PKG-I y PKG-II. PKG-I tiene un extremo acetilado amino terminal y está asociado con el citoplasma y posee dos isoformas (Iα y Iβ) que se originan por corte y empalme alternativo. PKG-II tiene un extremo amino terminal miristilado que está asociado con la membrana y puede localizarse por proteínas de fijación a PKG en una forma análoga la que se conoce para PKA, aunque tales dominios de fijación de PKA y PKG son muy diferentes desde el punto de vista estructural. Los efectos de importancia farmacológica del incremento de las concentraciones de cGMP incluyen la modulación de la activación plaquetaria y la relajación del músculo liso (Rybalkin et al., 2003).
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PDE. Las fosfodiesterasas de nucleótidos cíclicos forman otra familia de proteínas de señalización importantes, cuyas actividades se regulan a través de la tasa de transcripción génica y por segundos mensajeros (nucleótidos cíclicos o Ca2+) e interacción con otras proteínas de señalización como arrestina β y otras proteínas cinasas. La PDE causa hidrólisis de enlaces fosfodiéster 3′,5′ cíclico en cAMP y en cGMP, con lo que termina su acción.
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Las enzimas comprenden una superfamilia con más de 50 proteínas PDE diferentes divididas en 11 subfamilias con base en la secuencia de aminoácidos, especificidad de sustrato, propiedades farmacológicas y regulación alostérica (Conti y Beavo, 2007). Las PDE comparten un dominio catalítico conservado en el extremo carboxilo terminal, así como dominios reguladores y dominios objetivo que localizan una enzima dada a un compartimiento celular específico. Las especificidades de sustrato de las diferentes PDE incluyen aquellos específicos para la hidrólisis de cAMP, hidrólisis de cGMP y algunos que hidrolizan ambos nucleótidos cíclicos. Las PDE (principalmente la forma PDE3) son fármacos utilizados para el tratamiento de enfermedades como el asma, enfermedades cardiovasculares como la insuficiencia cardiaca, ateroesclerosis coronaria y enfermedad arterial periférica y algunos trastornos neurológicos. Los inhibidores de PDE5 (p. ej., sildenafil) se utilizan en el tratamiento de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica y disfunción eréctil. Al inhibir PDE5, estos fármacos incrementan la acumulación celular de cGMP en el músculo liso de los cuerpos cavernosos, con lo que incrementan su relajación y mejoran su capacidad de ingurgitación (Mehats et al., 2002).
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Otros segundos mensajeros
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Ca2+. El calcio es un mensajero importante en todas las células y puede regular diversas respuestas, lo que incluye expresión génica, contracción, secreción, metabolismo y actividad eléctrica. El Ca2+ puede entrar a la célula a través de los conductos de Ca2+ en la membrana plasmática (véase la sección “Conductos iónicos”, más adelante) o puede ser liberado por hormonas o factores de crecimiento de su almacenamiento intracelular. Al conservar su función como señalizador, las concentraciones iniciales de Ca2+ en las células se mantienen en el intervalo de 100 n por acción de las bombas de Ca2+ en la membrana que expulsa Ca2+ hacia el espacio extracelular y una ATPasa de Ca2+ en el retículo sarcoplásmico (SERCA, sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase) en la membrana del retículo endoplásmico (ER, endoplasmic reticulum) que acumula Ca2+ en el sitio de almacenamiento en el retículo endoplásmico/retículo sarcoplásmico.
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Las hormonas y factores de crecimiento liberan Ca2+ de sus sitios de almacenamiento intracelular (el ER) a través de vías de señalización que inician con la activación de fosfolipasa C en la membrana plasmática, de las cuales existen dos formas primarias, PLCβ y PLCγ. Los GPCR que se acoplan a Gq o Gi activan PLCβ al activar la subunidad α de la proteína G (fig. 3-8) y liberar el dímero βγ. La subunidad unida a Gq-GTP y el dímero βγ pueden activar ciertas isoformas de PLCβ. Las isoformas de PLCγ se activan por la fosforilación de tirosina, lo que incluye la fosforilación por el receptor y por tirosinas cinasas que no están acopladas a receptores. Por ejemplo, los receptores de factores de crecimiento, como el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR, epidermal growth factor receptor) son tirosinas cinasas de receptores (RTK) que se autofosforilan en los residuos de tirosina hasta que se unen con un factor de crecimiento relacionado. La fosfotirosina formada en el dominio citoplásmico de RTK es un sitio de unión para las proteínas de señalización que contienen dominios SH2, como PLCγ. Una vez que se ha reclutado al dominio SH2 de RTK, PLCγ es fosforilado/activado por acción de RTK.
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Las PLC son enzimas citosólicas que se translocan hacia la membrana plasmática hasta la estimulación del receptor. Cuando se activan, hidrolizan un fosfolípido menor de membrana, el fosfatidilinositol-4,5-difosfato para generar dos señales intracelulares, inositol-1,4,5-trifosfato (IP3) y el lípido diacilglicerol (DAG, diacylglycerol). Ambas moléculas producen vías de señalización mediante la activación de familias de proteínas cinasas. El DAG activa en forma directa miembros de la proteína cinasa C (PKC). IP3 difunde hacia el ER donde activa a los receptores IP3 en la membrana de ER causando liberación del Ca2+ almacenado en el ER. La liberación de dicho ion de estas reservas intracelulares incrementa las concentraciones de Ca2+ en el citoplasma varias veces en el lapso de unos cuantos segundos y activa enzimas sensibles a calmodulina como fosfodiesterasas de cAMP y una familia de proteínas cinasas sensibles a Ca2+/calmodulina (p. ej., fosforilasa cinasa, cinasa de cadena ligera de miosina y cinasa CaM II y IV) (Hudmon y Schulman, 2002). Dependiendo de la función de la célula diferenciada, la cinasa de Ca2+/calmodulina y PKC pueden regular varios eventos sucesivos en las células activadas. Por ejemplo, la liberación de noradrenalina, un transmisor simpático, hacia las células de músculo liso vascular estimula a los receptores adrenérgicos α, activa la vía Gq-PLC-IP3, desencadena la liberación de Ca2+ y produce contracción por estimulación de la cinasa de cadena ligera de miosina sensible a Ca2+/calmodulina para producir fosforilación de la subunidad reguladora de la miosina, una proteína contráctil.
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El calcio liberado del retículo endoplásmico por estimulación de IP3 es recapturado y llena las reservas del RE de Ca2+ lo que es regulado por un grupo de nuevos conductos de Ca2+. El receptor de IP3 es un conducto de calcio controlado por ligando que se encuentra en altas concentraciones en la membrana del ER (Patterson et al., 2004). Es una proteína grande de casi 2 700 aminoácidos con tres dominios principales. La región amino terminal contiene el sitio de unión de IP3 y en la región media se encuentra un dominio regulador que puede sufrir fosforilación por diversas proteínas cinasas, lo que incluye PKA y PKG. La región carboxilo terminal contiene seis hélices que abarcan la membrana y que forman el polo de Ca2+. El conducto funcional está formado por cuatro subunidades dispuestas como tetrámero. Además de IP3, que estimula de manera notable el flujo de Ca2+, los conductos de IP3 están regulados por Ca2+ y por actividad de PKA y PKG. Las concentraciones de Ca2+ en el intervalo de 100 a 300 nmol incrementa la liberación de Ca2+, pero concentraciones cercanas a 1 µmol inhiben la liberación, lo que puede crear patrones oscilatorios de la liberación de Ca2+ en ciertas células. La fosforilación del receptor IP3 por PKA incrementa la liberación de Ca2+, pero la fosforilación de una proteína accesoria, IRAG, por acción de PKG inhibe la liberación de Ca2+. En el músculo liso, este efecto de PKG representa parte del mecanismo por el cual el cGMP relaja el tono vascular. En el músculo estriado y cardiaco, ocurre liberación de Ca2+ de las reservas intracelulares (el retículo sarcoplásmico) a través de un proceso conocido como liberación de Ca2+ inducido por Ca2+ que es mediada principalmente por el receptor rianodina (RyR). La entrada de Ca2+ en el miocito cardiaco o estriado a través de conductos de Ca2+ de tipo L causa cambios de conformación en el receptor de rianodina lo que induce la liberación de grandes cantidades de Ca2+ hacia el sarcoplasma. Los fármacos que inhiben RyR incluyen dantroleno.
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El calcio liberado hacia el citoplasma desde el ER es retirado con rapidez por bombas de Ca2+ en la membrana plasmática y las reservas de Ca2+ del ER se llenan con el calcio extracelular que fluye a través de los conductos de Ca2+ operados por almacenamiento (SOC, store-operated Ca2+) en la membrana plasmática. Estas corrientes se conocen como corrientes activadas por la liberación de Ca2+ o ICRAC. El mecanismo por el cual las reservas agotadas en el ER abren los conductos operados por almacenamiento precisa de dos proteínas, el conducto mismo, conocido como Orai1, y un sensor del RE denominado STIM1. El primero es una proteína de 33 kDa con cuatro hélices que abarcan la membrana y que no tienen homología con otros conductos de Ca2+ (Prakriya, 2009). Orai1 es muy selectivo para Ca2+. El extremo carboxilo terminal del conducto contiene dominios enrollados que se cree interactúan con el sensor STIM1. Este último es una proteína de 77 kDa que contiene un dominio sensor de Ca2+ conocida como mano EF. Este dominio se ubica en el extremo amino terminal de la proteína en el interior de la membrana del ER antes que el dominio único que abarca la membrana. Existen múltiples motivos de interacciones entre proteínas en la porción media y en el extremo amino terminal de la molécula. En específico, hay dos dominios enrollados en el extremo carboxilo terminal del dominio transmembrana en STIM1 que interactúan con los dominios enrollados en el conducto Orai1. En condiciones de reposo, la proteína STIM1 presenta distribución uniforme en la membrana del retículo endoplásmico. La liberación de Ca2+ de las reservas del ER ocasiona dimerización de STIM1 y desplazamiento hacia la membrana plasmática, donde STIM1 y Orai1 forman grupos, abriendo el polo de Ca2+ y Orai1 llena de nuevo las reservas de Ca2+ en el ER (Fahrner et al., 2009).
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La bicapa lipídica de la membrana plasmática es impermeable a aniones y cationes, por cambios en el flujo de iones a través de la membrana plasmática que son eventos reguladores críticos en células excitables y no excitables. A fin de establecer y conservar los gradientes electroquímicos necesarios para mantener el potencial de membrana, todas las células expresan transportadores iónicos para Na+, K+, Ca2+, y Cl−. Por ejemplo, la bomba de Na+,K+-ATPasa consume ATP para expulsar Na+ de la célula y K+ hacia el interior de la misma. Los gradientes electroquímicos establecidos de esta manera son utilizados por los tejidos excitables (como tejido nervioso y muscular) para generar y transmitir impulsos eléctricos a través de células no excitables a fin de desencadenar eventos bioquímicos y secretores y por células para sostener diversos mecanismos de transporte paralelo y antiparalelo (cap. 5).
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Los flujos pasivos de iones siguiendo gradientes electroquímicos están regulados por una gran familia de conductos iónicos ubicados en la membrana. Los seres humanos expresan casi 232 conductos iónicos distintos para regular con precisión el flujo de Na+, K+, Ca2+, y Cl− a través de la membrana celular (Jegla et al., 2009). Por su participación como reguladores en la función celular, tales proteínas son objetivos farmacológicos importantes. Las diversas familias de conductos iónicos pueden dividirse en subfamilias con base en los mecanismos de abertura de los conductos, su estructura y los iones que transportan. También pueden clasificarse como activados por voltaje, activados por ligando, activados por almacenamiento, activados por estiramiento y activados por temperatura. A continuación se mencionan ejemplos de conductos que son objetivos farmacológicos de importancia.
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Conductos controlados por voltaje. Los seres humanos expresan múltiples isoformas de conductos controlados por voltaje para iones de Na, K+, Ca2+ y Cl−. En células nerviosas y musculares, los conductos de sodio más controlados por voltaje son los causantes de la generación de potenciales de acción que despolarizan la membrana desde su potencial de reposo de −70 mV hasta +20 mV en unos cuantos milisegundos. Tales conductos están compuestos por tres subunidades, una subunidad α formadora de poros y dos subunidades β reguladoras. La subunidad α es una proteína de 260 kDa que contiene cuatro dominios que forman un poro selectivo para Na+ y que están dispuestos en forma de un seudotetrámero. Las subunidades β son proteínas de alrededor de 36 kDa que abarcan la membrana una sola ocasión (fig. 3-9A). Cada dominio de la subunidad α contiene seis hélices que abarcan la membrana (S1 a S6) con un asa extracelular entre S5 y S6, conocida como asa P o formadora de poros; el asa P desciende hacia el polo y, en combinación con los residuos del asa P correspondiente de los otros dominios, proporciona un filtro selectivo para el ion Na+. Otras cuatro hélices rodean el poro (una hélice S4 de cada uno de los dominios), contienen un grupo de aminoácidos cargados que forman el sensor de voltaje y que producen un cambio conformacional en el polo a voltajes más positivos, lo que da origen a la abertura del poro y la despolarización de la membrana (Purves y McNamara, 2008). Los conductos de Na+ activados por voltaje en neuronas de dolor son objetivo para los anestésicos locales como lidocaína y tetracaína, los cuales bloquean los poros, inhiben la despolarización y de esta forma bloquean la sensación de dolor. También son objetivos para las toxinas marinas naturales, tetrodotoxina y saxitoxina (cap. 20). Los conductos de Na+ activados por voltaje son objetivos importantes para muchos fármacos utilizados para el tratamiento de arritmias cardiacas (cap. 29).
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Los conductos de Ca2+ controlados por voltaje tienen una estructura similar a los conductos de Na+ controlados por voltaje, con subunidades α grandes (cuatro dominios de seis hélices que abarcan la membrana) y tres subunidades reguladoras (subunidades β, δ y γ). Existen múltiples isoformas de los conductos que tienen expresión amplia en células nerviosas, cardiacas y de músculo liso. Los conductos de Ca2+ pueden iniciar el potencial de acción (como en las células de marcapaso en el corazón), pero más a menudo responden a la modificación de la forma y duración del potencial de acción iniciado por conductos rápidos de Na+ controlados por voltaje (Purves y McNamara, 2008). Tales conductos inician la entrada de Ca2+ a la célula lo que estimula la liberación de neurotransmisores en los sistemas nerviosos central, entérico y autonómico y controlan la frecuencia cardiaca y conducción de impulsos en el tejido cardiaco (caps. 8, 14 y 27). Los conductos de Ca2+ controlados por voltaje de tipo L están sujetos a regulación adicional a través de fosforilación por PKA. Así, cuando el sistema nervioso simpático libera noradrenalina hacia los receptores adrenérgicos β en el tejido cardiaco, se incrementan las concentraciones de cAMP y se activa PKA y los conductos fosforilados de tipo L permiten un mayor flujo de Ca2+ hacia el citoplasma, lo que incrementa la fuerza de contracción. Los conductos de Ca2+ controlados por voltaje que se expresan en el músculo liso regulan el tono vascular; la concentración intracelular de Ca2+ es decisiva para regular el estado de fosforilación del aparato contráctil a través de la actividad de la cinasa de cadena ligera de miosina sensible a Ca2+/calmodulina. En consecuencia, los antagonistas de los conductos de Ca2+ como nifedipina, diltiazem y verapamilo no son vasodilatadores eficaces y se utilizan ampliamente para el tratamiento de la angina, arritmias cardiacas e hipertensión.
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Los conductos de K+ controlados por voltaje se encuentran entre los miembros más numerosos y con mayor diversidad estructural entre la familia de conductos controlados por voltaje. Los seres humanos expresan alrededor de 78 conductos diferentes para K+ y casi la totalidad de ellos están controlados por voltaje (Jegla et al., 2009). Los conductos de Kv controlados por voltaje forman conductos en forma de tetrámeros con topología similar a la de los conductos de Na+ y Ca2+, pero en vez de contar con cuatro dominios, están formados por cuatro subunidades separadas cada una de las cuales incorpora seis dominios que abarcan la membrana. Las subunidades de los conductos de K+ rectificadores de entrada sólo contienen dos dominios que abarcan la membrana y que rodean el poro. En cada uno de los casos, los conductos originales son un tetrámero formado por cuatro subunidades individuales. Un grupo final de conductos de K+ es el grupo de dos dominios de poros conocidos como conductos de K+ “con fuga”; cada subunidad en este grupo tiene cuatro dominios que abarcan la membrana y que rodean dos asas P y éstas forman conductos como dímeros. Los conductos de rectificación de entrada y los conductos de dos poros no son sensibles al voltaje y están regulados por proteínas G y por iones H+ y son estimulados en gran medida por anestésicos generales. Todos estos conductos se expresan en tejido nervioso, cardiaco, músculo liso y estriado y en tejidos no excitables. El incremento en la conductancia de K+ a través de estos conductos hace que el potencial de membrana sea más negativo; así, dichos conductos son importantes en la regulación del potencial de membrana en reposo y modifican el potencial en reposo de membrana de −70 a −90 mV después de la despolarización. Algunas formas de epilepsia son causadas por mutaciones naturales en los conductos Kv y fármacos como la retigabina, que favorecen la abertura de los conductos de Kv y se encuentran bajo estudio para el tratamiento de la epilepsia (Rogawski y Bazil, 2008). El conducto cardiaco KCNH2, conocido como hERG (human ether-a-go-go-related gene) es causante de un trastorno hereditario bien conocido, el síndrome de QT largo (inducido por fármacos). Éste es el objetivo primario de muchos fármacos antiarrítmicos que prolongan la repolarización.
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Conductos controlados por ligando. Los conductos activados por la unión de ligandos a un sitio específico en una proteína de conducto tienen estructura diversa y constituyen un grupo diverso de ligandos. Los principales conductos controlados por ligando en el sistema nervioso central son aquellos que responden a neurotransmisores excitadores como la acetilcolina o glutamato (o agonistas como AMPA y NMDA) y neurotransmisores inhibidores como glicina o ácido gamma amino butírico (GABA, γ-aminobutyric acid) (Purves y McNamara, 2008). La activación de estos conductos es la causante de la mayor parte de la transmisión sináptica por neuronas tanto en el SNC como en la periferia (caps. 8, 11 y 14). Además, hay otros conductos iónicos más especializados que se activan por moléculas pequeñas intracelulares y que son distintos desde el punto de vista estructural de los conductos iónicos convencionales controlados por ligando. Éstos incluyen los conductos iónicos que son miembros formales de la familia Kv, como la hiperpolarización de los conductos controlados por cAMP (HCN, hyperpolarization and cAMP-gated) expresados en el corazón (Wahl-Schott y Biel, 2009) y que son los causantes de la despolarización lenta que se observa en la fase 4 de los potenciales de acción en las células de los nodos AV y SA (cap. 29) y en los conductos controlados por nucleótidos cíclicos (CNG, cyclic nucleotide-gated) que son importantes para la visión (cap. 64). La categoría de moléculas pequeñas intracelulares de los conductos iónicos también incluye conductos de Ca2+ sensibles a IP3 y que son los causantes de la liberación de Ca2+ del ER y los “receptores” de sulfonilureas (SUR1) que se asocian con los conductos Kir6.2 para regular los conductos de K+ dependientes de ATP (KATP) en las células β del páncreas. Los conductos KATP son el objetivo de los hipoglucemiantes orales como las sulfonilureas y meglitinidas que estimulan la liberación de insulina de las células β del páncreas y que se emplean para el tratamiento de la diabetes tipo 2 (cap. 43). Otros conductos especializados incluyen los conductos regulados por 5-HT3 que se expresan en diferentes nervios vagales aferentes que estimulan el vómito. El ondansetrón es un antagonista importante de los conductos controlados por 5-HT3, que se utiliza para inhibir el vómito causado por fármacos o por enfermedades (cap. 46).
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El receptor nicotínico de acetilcolina proporciona un ejemplo de los conductos iónicos controlados por ligando. Las isoformas de este conducto se expresan en el SNC, ganglios autonómicos y en la unión neuromuscular (fig. 3-9B). El conducto pentamérico consiste de cuatro subunidades diferentes (2α, β, δ, γ) en la unión neuromuscular o de dos subunidades diferentes (2α, 3β) en los ganglios autonómicos (Purves y McNamara, 2008). Cada subunidad α tiene un sitio de unión de acetilcolina idéntico; las diferentes composiciones de las otras tres subunidades entre los receptores de unión neuromuscular y neuronales explican la capacidad de antagonistas competitivos como el rocuronio para inhibir los receptores en la unión neuromuscular sin efectos en los receptores ganglionares. Esta propiedad se explota para proporcionar relajación muscular durante cirugía con la aparición de efectos secundarios mínimos de tipo autonómico (cap. 11). Cada subunidad del receptor contiene un dominio extracelular grande en el extremo amino terminal con cuatro hélices que abarcan la membrana (una de las cuales cubre el poro en el complejo ensamblado) y un asa interna entre las hélices 3 y 4 que forman el dominio intracelular del conducto. La abertura del poro en el conducto mide alrededor de 3 nm en tanto que el diámetro del ion de Na+ o K+ es de sólo 0.3 nm o menos. En consecuencia, los conductos iónicos controlados por ligando no poseen la selectividad iónica exquisita que se encuentra en la mayor parte de los conductos activados por voltaje y la activación de los receptores nicotínicos de acetilcolina permite el paso de iones Na+ y K+.
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El principal transmisor excitador en la sinapsis del SNC es el glutamato. Hay tres tipos de receptores inotrópicos de glutamato (AMPA, NMDA, y kainato) denominados después que algún ligando los ha activado de manera selectiva. Tienen una distribución similar a la de los receptores nicotínicos de acetilcolina; el conducto está constituido por cinco subunidades organizadas con regiones extracelulares grandes, un poro y una cara intracelular pequeña. La activación de estos conductos con glutamato incrementa de manera notable la conductancia de Na+ y K+ ocasionando despolarización. Los receptores de NMDA son menos selectivos para los iones; la activación incrementa la conductancia de Na+, K+ y Ca2+ utilizando la señal de este último para eventos de señalización adicionales.
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Casi una tercera parte de las sinapsis en el encéfalo son inhibidoras; los principales transmisores inhibidores son glicina y GABA. La glicina y los receptores inotrópicos de GABAA tienen distribución similar a la del glutamato y receptores nicotínicos de acetilcolina con cinco subunidades (α, β, γ, δ y ρ), un dominio de unión de ligando y hélices formadoras de poros. La activación de sus conductos incrementa la conductancia de Cl−, lo que produce hiperpolarización de la membrana celular e inhibe la excitabilidad (Purves y McNamara, 2008). Los receptores de GABAA son objetivos farmacológicos para importantes sedantes-hipnóticos como benzodiazepinas y barbitúricos y también son importantes en los mecanismos de etanol y de anestésicos generales (caps. 17, 19 y 23).
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Conductos TRP. Los conductos de potencial transitorio acoplados a receptor (TRP, transient receptor potential) comprenden una superfamilia de conductos iónicos expresados de manera ubicua y que se caracterizan por su diversidad y estructura de dominios (Clapham 2003; Venkatachalam y Montell, 2007). Aunque, a la fecha, los conductos TRP no son objetivos de fármacos aprobados, existe interés significativo en desarrollar fármacos que puedan alterar la función de dichos conductos iónicos, por su participación en varios fenómenos sensoriales como dolor, temperatura, osmolaridad, tacto, olfacción, visión y audición. Tales conductos contienen múltiples dominios y pueden actuar como integradores de señales y en su mayor parte pueden ser activados por múltiples mecanismos. Hay 27 genes de conductos TRP en seres humanos, lo que representa seis familias diferentes de conductos TRP; contienen seis segmentos transmembrana y el conducto iónico funcional consiste de un complejo tetramérico. Los conductos TRP estrechamente relacionados pueden formar heterotetrámeros. Los conductos TRP son conductos catiónicos, pero al igual que otros conductos iónicos heteromultiméricos, la composición de subunidades de los conductos multiméricos puede ser la causa de varias características importantes de los conductos, lo que incluye propiedades de selectividad iónica y activación. Se sabe que los dominios intracelulares de los conductos TRP pueden incluir dominios de ankirina, dominios de proteína cinasa y dominios de ATP-ribosa pirofosfatasa. También se sabe que las mutaciones en los conductos TRP causan varias enfermedades lo que incluye hipomagnesiemia e hipocalciemia y diversos trastornos renales y enfermedades neurodegenerativas.
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Receptores transmembrana vinculados con enzimas intracelulares
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Las células de mamífero expresan un grupo diverso de receptores de membrana fisiológicos con dominios de fijación de ligandos extracelulares y actividad enzimática intrínseca en la superficie citoplásmica de la célula. Estas moléculas incluyen los receptores de tirosinas cinasas (RTK, receptor tyrosine kinases) como el factor de crecimiento epidérmico (EGF, epidermal growth factor) y los receptores de insulina, que presentan actividad de tirosinas cinasas intrínsecas en el dominio citoplásmico del receptor; los receptores asociados tirosina cinasa sin actividad enzimática, como los receptores de interferón gamma, que reclutan tirosina cinasa citoplásmica de tipo Janus (JAK, Janus tyrosine kinases); serina-treonina cinasas como el receptor de TGF-β y los receptores asociados con otras actividades enzimáticas como los receptores para péptidos natriuréticos, que tienen actividad de guanilato ciclasa citoplásmica y que producen un segundo mensajero soluble, el cGMP (véase la siguiente sección). Los receptores que participan en la inmunidad innata, los receptores tipo Toll, y aquellos para el factor de necrosis tumoral (TNF-α), tienen diversas características en común con los receptores JAK-STAT.
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Receptores de tirosina cinasa. Los receptores de tirosina cinasa incluyen receptores para hormonas como insulina, varios factores de crecimiento como EGF, factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF, platelet-derived growth factor), factor de crecimiento nervioso (NGF, nerve growth factor), factor de crecimiento de los fibroblastos (FGF, fibroblast growth factor), factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF, vascular endothelial growth factor) y efrinas. Con la excepción del receptor de insulina, que tiene cadenas α y β (capítulo 43) estas moléculas consisten de cadenas polipeptídicas únicas con grandes dominios extracelulares ricos en cisteína, dominios transmembrana cortos y una región intracelular que contiene un dominio de proteína tirosina cinasa (dos, en algunos casos). La activación de receptores de factores de crecimiento ocasiona la supervivencia de la célula, proliferación celular y diferenciación. La activación de los receptores de efrina produce una angiogénesis neuronal, migración y guía axonales (Ferguson, 2008; Hubbard y Till, 2000).
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El estado inactivo de los receptores de factores de crecimiento es en forma de monómero; la unión de ligando induce dimerización del receptor y fosforilación cruzada de los dominios de cinasa en múltiples residuos de tirosina. Algunos residuos de tirosina se encuentran en el asa de activación de la cinasa y su fosforilación sirve para la activación adicional del receptor de cinasa (fig. 3-10 A). La fosforilación de otros residuos de tirosina forma sitios de fijación para los dominios SH2 contenidos en un gran número de proteínas de señalización (Ferguson, 2008). Hay más de 100 proteínas codificadas en el genoma que contienen dominios SH2 y después de la activación del receptor, se forman grandes complejos de señalización en el receptor que finalmente producen la proliferación celular. Las moléculas se reclutan por proteínas que contienen fósforo tirosina en sus dominios SH2 lo que incluye PLCγ que incrementa la concentración intracelular de Ca2+ y activa PKC como se describió antes. Las isoformas α y β de la fosfatidilinositol 3-cinasa (PI3-K) contienen dominios SH2, el punto de fijación en el receptor fosforilado es activado con lo que se incrementan las concentraciones de fosfatidilinositol 3,4,5 trifosfato (PIP3), una molécula que forma otras clases de sitios de fijación en la membrana plasmática para moléculas de señalización como proteína cinasa B (PKB, también conocida como Akt). PKB puede regular el objetivo de la rapamicina (mTOR) en varias vías de señalización y de la proteína Bad que es importante en la apoptosis.
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Además del reclutamiento de enzimas, las proteínas que presentan fosfotirosina pueden atraer moléculas adaptadoras que contienen dominios SH2 sin actividad como Grb2, que a su vez atraen factores de intercambio de nucleótido de guanina (GEF, guanine nucleotide exchange factors) como Sos que pueden activar pequeñas proteínas de fijación a GTP. Las proteínas pequeñas de fijación a GTP como Ras y Rho pertenecen a una gran familia de GTPasas monoméricas; sólo los miembros de las subfamilias Ras y Rho son activados por receptores extracelulares. La familia Ras incluye cuatro isoformas: H-ras, K-ras, n-ras y Rheb (activada por el receptor de insulina). Las mutaciones de activación espontánea en Ras explican una gran proporción de los cánceres en humanos; así, las moléculas que inhiben Ras son de gran interés en la quimioterapia contra el cáncer. La familia Rho incluye Rho, Rac y Cdc42, que son causantes de la repetición de señales de la membrana al citoesqueleto. Todas las GTPasas pequeñas activadas por GEF están reguladas por diversos mecanismos y son inhibidas por proteínas que activan a la GTPasa (GAP, GTPase activating proteins) (Etienne-Manneville y Hall, 2002).
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La activación de miembros de la familia Ras ocasiona a su vez activación de la cascada de proteína cinasa denominada vía de proteína cinasa activada por mitógeno (MAP, MAPK). La activación de la vía MAPK es una de las principales vías utilizadas por los receptores de factores de crecimiento para enviar señales al núcleo y estimular el crecimiento celular. La primera enzima en la vía es Rap que es una cinasa de cinasa de cinasa MAP (MKKK, MAP kinase kinase kinase). Rap fosforila y activa la cinasa de cinasa MAP (MKK) denominada MEK, que causa la fosforilación de la cinasa de MAP denominada ERK; esta última es un miembro interesante de la familia de cinasas, pues su activación se logra por fosforilación en un espacio donde coexisten residuos de tirosina y treonina en el asa de activación de cinasa. ERK produce la fosforilación de varios factores de transcripción en el núcleo, lo que incluye Elk-1 y CREB para regular la transcripción génica y causar la proliferación celular (Manning y Davis, 2003). Los fármacos que actúan sobre esta familia de receptores incluyen insulina para el tratamiento de la diabetes mellitus e imatinib, una molécula pequeña inhibidora de la proteína cinasa diseñada para inhibir tirosinas cinasas acopladas o no a receptores. El imatinib se utiliza para el tratamiento de la leucemia mielógena crónica y varios tumores sólidos con pérdida de la regulación de la tirosina cinasa.
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Vías de receptor JAK-STAT. Las células expresan una familia de receptores para citocinas como interferón gamma y hormonas como hormona de crecimiento y prolactina, las cuales envían señales hacia el núcleo en forma más directa que los receptores de tirosina cinasa. Tales receptores no tienen actividad enzimática intrínseca, más bien se unen a dominios intracelulares separados, una tirosina cinasa intracelular conocida como cinasa Janus (JAK). Cuando se induce dimerización por la fijación de un ligando, JAK causa la fosforilación de otras proteínas conocidas como transductores de señales y activadores de transcripción (STAT, signal transducers and activators of transcription) que se translocan hacia el núcleo y regulan la transcripción (fig. 3-10B). Toda la vía se conoce como vía JAK-STAT (Gough et al., 2008; Wang et al., 2009). Hay cuatro JAK y seis STAT en mamíferos, lo que depende del tipo de señalización celular, cuyas diferentes combinaciones activan la transcripción de genes. Por ejemplo, la prolactina aparece al utilizar JAK1, JAK2, y STAT5 para estimular la producción de leche.
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Receptores de serina-treonina cinasas. Los ligandos de tipo proteínico como TGF-β activan una familia de receptores que son análogos a los receptores de tirosina cinasa con excepción de que tienen dominios de serina/treonina cinasa en la región citoplásmica de la proteína. Hay dos isoformas de proteínas receptoras monoméricas, las de tipo I (siete formas) y las de tipo II (cinco formas). En estado basal, tales proteínas existen como monómeros; al momento de la unión del ligando agonista, se dimerizan y dan origen a la fosforilación del dominio de cinasa del monómero tipo I, que activa al receptor. El receptor activado sufre fosforilación de una proteína reguladora de genes conocida como Smad. Hay múltiples Smad en las células; una vez que es fosforilada por el receptor activado del residuos de serina, Smad se disocia del receptor, migra hacia el núcleo y se asocia con factores de transcripción y regula genes que ocasionan morfogénesis y transformación. También existen Smad inhibidoras (isoformas Smad6 o Smad7) que compiten con las Smad fosforiladas para terminar la señalización.
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Receptores tipo Toll. La señalización relacionada con el sistema inmunitario innato se lleva a cabo por una familia de más de 10 receptores de membrana conocidos como receptores tipo Toll (TLR, Toll-like receptors) que tienen expresión elevada en células hematopoyéticas. En una sola cadena polipeptídica, dichos receptores contienen un gran dominio extracelular de fijación de ligandos, un dominio corto que abarca la membrana y una región citoplásmica conocida como dominio TIR que carece de actividad enzimática intrínseca. Los ligandos para TLR abarcan múltiples productos de patógenos entre los que se incluyen lípidos, peptidoglucanos, lipopéptidos y virus. La activación de estos receptores produce una respuesta inflamatoria a los microorganismos patógenos. Al igual que todos los receptores que abarcan la membrana, el primer paso en activación de TLR por ligandos es la dimerización, que a su vez causa que se unan proteínas de señalización a los receptores para formar un complejo de señalización.
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La dimerización inducida por ligando recluta una serie de proteínas adaptadoras lo que incluye a la proteína Mal de la proteína de diferenciación mieloide 88 (MyD88) hacia los dominios intracelulares TIR, que a su vez reclutan cinasas relacionadas con interleucinas conocidas como IRAK; estas últimas sufren autofosforilación en el complejo y más tarde forman un complejo más estable con MyD88. La fosforilación también recluta TRAF6 al complejo, lo que facilita la interacción con la ubiquitina ligasa que une a la molécula de poliubiquitina con TRAF6. Este complejo puede interactuar con la proteína cinasa TAK1 y el adaptador TAB1. TAK1 es un miembro de la familia de cinasas MAP que activa las cinasas NF-κB; la fosforilación de factores de transcripción NF-κB causa la translocación hacia el núcleo y la activación transcripcional de diversos genes inflamatorios (Gay y Gangloff, 2007).
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Receptores de TNF-α. El mecanismo de acción del factor de necrosis tumoral α (TNF-α) para la señalización al factor de transcripción NF-κB es muy similar al utilizado por los receptores tipo Toll en el dominio intracelular del receptor que no tiene actividad enzimática. El receptor TNF-α es otro receptor de membrana con un dominio de fijación extracelular del ligando, un dominio transmembrana y un dominio citoplásmico conocido como dominio de muerte.
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TNF-α se une a un complejo compuesto por el receptor 1 de TNF y el receptor 2 de TNF. Hasta la trimerización el dominio de muerte se une a la proteína adaptadora TRADD, que recluta la proteína 1 de interacción con el receptor (RIP1, receptor interacting protein 1) para formar un complejo receptor y un adaptador en la membrana. RIP1 está poliubiquinado, lo que ocasiona el reclutamiento de la cinasa TAK1 y de la cinasa IκB (IKK) a las moléculas ubiquitinadas (Skaug et al., 2009). La activación del asa IKK se fosforila en el complejo lo que finalmente causa que se libere IκBα del complejo lo que permite que el heterodímero p50/p65 del complejo sufra translocación al núcleo y active la transcripción de los genes inflamatorios (Ghosh y Hayden, 2008; Hayden y Ghosh, 2008; Kataoka, 2009). A la fecha no existen fármacos que bloqueen las porciones citoplásmicas de las vías de señalización de TNF-α; los anticuerpos monoclonales humanizados de TNF-α como infliximab y adalimumab son importantes para el tratamiento de la artritis reumatoide y de la enfermedad de Crohn (caps. 35 y 47).
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Receptores que estimulan la síntesis de GMP cíclico
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Las vías de señalización que regulan la síntesis de cGMP en las células incluyen regulación hormonal de las guanilato ciclasas transmembrana como el receptor del péptido auricular natriurético (ANP, natriuretic peptide receptor) y la activación de formas solubles de guanilato ciclasa por el óxido nítrico (NO). Los efectos subsiguientes del cAMP son llevados a cabo por múltiples isoformas de PKG, conductos iónicos controlados por cGMP y fosfodiesterasas moduladas por cGMP que desdoblan el cAMP (lo que se describe más adelante).
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Receptores del péptido natriurético. La clase de receptores de membrana con actividad enzimática intrínseca incluye los receptores para tres ligandos peptídicos pequeños liberados de las células en los tejidos cardiacos y en el sistema vascular. Tales péptidos constituyen el péptido auricular natriurético (ANP), que se libera de sus gránulos de almacenamiento auricular después del incremento del volumen intravascular o estimulación con hormonas presoras; el péptido natriurético encefálico (BNP, brain natriuretic peptide), que se sintetiza y libera en grandes cantidades en el tejido ventricular en respuesta a la sobrecarga de volumen (pese a su nombre) y el péptido natriurético tipo C (CNP, C-type natriuretic peptide), que se sintetiza en el tejido encefálico y en las células endoteliales. Al igual que BNP, CNP no se almacena en gránulos si no que su síntesis y liberación se incrementan por acción de factores de crecimiento y la presión sobre las células del endotelio vascular (Potter et al., 2009). Los principales efectos fisiológicos de estas hormonas son disminución de la presión arterial (ANP, BNP) para reducir la fibrosis e hipertrofia cardiacas (BNP) y para estimular el crecimiento de los huesos largos (CNP).
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Los receptores transmembrana para ANP, BNP y CNP son del tipo de guanilato ciclasas activadas por ligando. Los receptores para ANP y BNP contienen alrededor de 450 aminoácidos en un dominio extracelular en el que se fije el péptido, un dominio transmembrana corto de 20 aminoácidos y un gran dominio intracelular que contiene homología con la región de cinasa, un dominio de dimerización y un dominio de guanilato ciclasa en el extremo carboxilo terminal. La fosforilación de los residuos de serina en los dominios de cinasa es importante para la actividad; la desfosforilación de estos residuos produce desensibilización del receptor. La unión del ligando une las regiones transmembrana y estimula la actividad de la guanilato ciclasa (fig. 3-11).
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El receptor de ANP (NPR-A) es la molécula que responde a ANP y BNP. La proteína se expresa en forma amplia y prominente en riñón, pulmón, tejido adiposo y células de músculo liso vascular y cardiacas. ANP y BNP participan en la conservación del estado normal del sistema cardiovascular porque los ratones con bloqueo génico de NPR-A tienen hipertensión e hipertrofia cardiaca. La nesiritida es un agonista sintético de BNP que se utiliza para el tratamiento de la insuficiencia cardiaca descompensada aguda (cap. 28). El receptor de NPR-B responde a CNP y tiene una estructura física similar al receptor de NPR-A. También se expresa ampliamente pero de manera más notable en hueso, encéfalo, riñón, pulmón, hígado y músculo liso vascular y músculo cardiaco. La participación de CNP en el hueso se sugiere porque los ratones con bloqueo génico de NPR-B muestran enanismo e hipertrofia cardiaca. El receptor C del péptido natriurético (NPR-C) tiene un dominio extracelular similar al de NPR-A y NRP-B pero no contiene la cinasa intracelular o los dominios de guanilato ciclasa. No tiene actividad enzimática y parece que su función es como receptor de eliminación, al retirar el exceso de péptido de la circulación (Potter et al., 2009).
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NO sintasa y guanilato ciclasa soluble. El óxido nítrico (NO) es una señal singular; es un gas muy lábil producido de manera local en las células por la actividad de la enzima óxido nítrico sintasa (NOS); el NO resultante tiene la capacidad de estimular la forma soluble de la guanilato ciclasa para producir cGMP. Existen tres formas de NOS, NOS neuronal (nNOS u NOS1), NOS endotelial (eNOS u NOS3) y NOS inducible (iNOS o NOS2). Las tres formas de la enzima se expresan en forma amplia pero son de especial importancia en el sistema cardiovascular, donde se encuentran en los miocitos, células de músculo liso vascular, células endoteliales, hematopoyéticas y plaquetas.
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La NOS produce NO mediante la catálisis de la oxidación del nitrógeno guanido de L-arginina, dando origen a L-citrulina y NO. Las enzimas requieren cofactores entre los que se incluye tetrahidrobiopterno y calmodulina. Las formas enzimáticas de nNOS y eNOS son estimuladas por Ca2+/calmodulina; la forma inducible es menos sensible a Ca2+ pero la concentración de proteínas iNOS en las células pueden incrementarse hasta 1 000 veces por un estímulo inflamatorio como endotoxinas, TNFα, interleucina-1β e interferón gamma. La capacidad del Ca2+ para activar eNOS y nNOS es importante en ciertas células en las cuales los neurotransmisores abren los conductos de Ca2+ o activan PLC lo que relaja el músculo liso. Un ejemplo es la capacidad de la ACh liberada por el sistema nervioso parasimpático para la relajación de los esfínteres. La guanilato ciclasa soluble es un heterotrímero compuesto por subunidades α y β. El extremo amino terminal de la molécula contiene un dominio hem de protoporfirina IX. El NO se une a este dominio con bajas concentraciones nanomolares y produce un incremento de 200 a 400 veces en la Vmáx de la guanilato ciclasa, lo que produce elevación notable del cGMP en las células (Tsai y Kass, 2009).
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Los efectos celulares del cGMP en el sistema vascular son mediados por diversos mecanismos, pero en especial por PKG. Por ejemplo, en el músculo liso vascular la activación de PKG produce vasodilatación por:
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Inhibición de la liberación de Ca2+ de las reservas intracelulares mediada por IP3 de las reservas intracelulares.
Fosforilación de los conductos de Ca2+ controlados por voltaje e inhiben la entrada de Ca2+.
Fosforilación del fosfolambano, un modulador de la bomba sarcoplásmica de Ca2+, lo que produce una recaptación más rápida de Ca2+ en las reservas intracelulares.
Fosforilación y abertura de los conductos de K+ activados por Ca2+ lo que produce hiperpolarización de la membrana celular, que cierra los conductos de Ca2+ de tipo L y reduce el flujo de Ca2+ hacia la célula (Tsai y Kass, 2009).