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En la recombinación V(D)J el dna que codifica para una región V de anticuerpo completa es montado a partir de segmentos V, D y J (cadena pesada) o V y J (cadena ligera) que inicialmente están separados por muchas kilobases de dna. Cada célula B en desarrollo genera un nuevo par de genes que codifican para la región variable mediante recombinación en el ámbito del dna genómico. La recombinación es catalizada por un juego de enzimas, muchas de las cuales también están involucradas en funciones de reparación de dna (cuadro 7-3), y se dirige hacia los sitios apropiados del gen que codifica para Ig mediante reconocimiento de motivos de secuencia de dna específicos llamados secuencias de señal de recombinación (rss). Estas secuencias aseguran que uno de cada tipo de segmento (V y J para la cadena ligera, o V, D y J para la cadena pesada) sea incluido en el gen que codifica para la región variable recombinado. Durante división y ligadura de los segmentos, el dna es editado de diversas maneras, lo cual añade variabilidad adicional al gen recombinado.
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La recombinación es dirigida por secuencias señal
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Para que ocurra recombinación en el dna de todo linfocito, debe haber un mecanismo para asegurar que sólo ocurra en genes que codifican para anticuerpos y para receptor de célula T, y que los segmentos de dna que se estén moviendo terminen exactamente donde deben en el genoma. De otro modo, puede haber consecuencias funestas, incluso enfermedad maligna.
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A finales de la década de 1970-1979, investigadores que estaban trabajando con genes que codifican para cadena ligera, describieron dos bloques de secuencias conservadas —un nonámero (un juego de nueve pares de bases) y un heptámero (un juego de siete pares de bases)— que están altamente conservados y ocurren en las regiones no codificadoras torrente arriba de cada segmento J. El heptámero pareció terminar exactamente en la secuencia codificadora de la región J. La secuenciación adicional mostró que el mismo motivo estuvo repetido de una manera invertida en el lado torrente abajo de las secuencias que codifican la región V; de nuevo, la secuencia de heptámero terminó alineada con el segmento del gen que codifica para la región V (figura 7-5a).
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Otra característica de estas secuencias digna de mención fue la presencia de una secuencia espaciadora de 12 o 23 bp entre el heptámero y nonámero. La importancia de los tramos espaciadores estuvo clara; representaron uno o dos giros de la doble hélice. Así, la secuencia espaciadora asegura que los extremos del nonámero y heptámero más cerca a los espaciadores estarían en el mismo lado de la doble hélice y, así, accesibles a unión por la misma enzima. Los investigadores concluyeron correctamente que habían descubierto la señal que dirige la recombinación entre los segmentos de gen V y J, y llamaron a éste el motivo heptámero 12/23 nonámero, la secuencia de señal de recombinación (rss).
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En resumen, la rss consta de tres elementos:
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Una secuencia de consenso absolutamente conservada, de 7 bp (heptámero), 5′-CACAGTG -3′
Un espaciador menos conservado de 12 o 23 bp
Una segunda secuencia de consenso conservada, de 9 bp (nonámero), 5′-ACAAAAACC-3′
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En los segmentos de gen que codifican para cadena pesada, se notó un patrón similar. Las regiones espaciadoras que separan los pares tetrámero y nonámero tuvieron 23 bp de longitud después de los segmentos V y antes de los segmentos J, y 12 bp de longitud antes y después de los segmentos D. Las ubicaciones relativas de los espaciadores de 12 y 23 pares de bases (figura 7-5b) sugirieron que la enzima vdj recombinasa está diseñada para unir una secuencia que tiene un espaciador de 12 bp con una secuencia que tiene un espaciador de 23 bp, algo que ahora se sabe que es así.
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En las figuras 7-6a y 7-6b se ilustra la generación de genes que codifican para cadena ligera y para cadena pesada, completos, a partir de segmentos V y J, y V, D y J, respectivamente.
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Los segmentos de gen son unidos por la RAG1/2 recombinasa
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Se mostró que dos proteínas, codificadas por genes estrechamente enlazados, RAG1 (gen activador de la recombinación 1) y RAG2 (gen activador de la recombinación 2), son necesarias para recombinar genes que codifican para anticuerpos. Los genes RAG1 y RAG2 están codificados con justo ocho kilobases de separación, y son transcritos juntos. La expresión de RAG1 y RAG2 está regulada desde el punto de vista del desarrollo en células tanto T como B (capítulos 9 y 10) y, si bien RAG1 es expresado en todas las fases del ciclo celular, RAG2 sólo es estable en células en fase G0– o G1–. RAG1 es la recombinasa predominante; forma un complejo con la rss que es estabilizado por la unión de RAG2. RAG2 en sí no muestra actividad detectable de unión a rss.
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Sólo tres de las proteínas implicadas en la recombinación V(D)J son singulares para linfocitos: RAG1, RAG2, y la desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT), que se encarga de la generación de diversidad adicional en la región CDR3 de la cadena pesada de anticuerpo (véase más adelante). TdT sólo es expresada en linfocitos en desarrollo, y añade nucleótidos “N” no de plantilla a los 3′ terminales libres de extremos codificadores después de su división por RAG1/2 recombinasas.
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Otras enzimas que participan en el proceso de recombinación no son específicas para células linfoides. Mientras que la unión de la rss por RAG1/2 puede ocurrir en ausencia de cualesquiera otras proteínas, otros factores celulares, la mayor parte de los cuales forman parte de la vía de unión (Joining) de extremos no homólogos (nhej) de reparación de dna se necesitan para completar la recombinación V(D)J. Estas otras proteínas no específicas para linfocito que se sabe que participan en la unión de V(D)J se describen en el cuadro 7-3.
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La recombinación V(D)J da lugar a un gen que codifica para región variable de Ig funcional
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El proceso de recombinación V(D)J ocurre en varias fases (figura 7-7). El producto final de cada reordenamiento exitoso es un gen que codifica para Ig intacto, en el cual los segmentos V y J (cadenas ligeras) o V, D y J (cadenas pesadas) son unidos para crear un gen que codifica para cadena pesada o ligera completo. Las nuevas uniones en el gen que codifica para la región V de anticuerpo, creado mediante este proceso de recombinación, se denominan uniones codificadoras. Las uniones entre los heptámeros de las rss se denominan uniones señal.
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La primera fase de este proceso, reconocimiento de dna y división del mismo, es catalizada por las proteínas RAG1/2. La segunda fase, el procesamiento y unión de extremo, requiere un juego más complejo de actividades enzimáticas además de RAG1/2, que incluye Artemis, TdT, dna ligasa IV, y otras proteínas nhej. Los pasos individuales involucrados en el proceso de recombinación entre segmentos Vκ y Jκ se muestran de modo secuencial en la figura 7-8.
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Paso 1 Reconocimiento de la secuencia de señal de recombinación (rss) heptámero-nonámero por el complejo enzimático RAG1/RAG2. La RAG1/2 recombinasa forma un complejo con las rss heptámero-nonámero contiguas con los dos segmentos de gen que van a ser unidos. La formación de complejo es iniciada por reconocimiento de las secuencias rss nonámero por RAG1, y durante esta unión se sigue la regla de 12-23.
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Paso 2 División monocatenaria en la unión de las secuencias de codificación y señal. Las proteínas RAG1/2 a continuación desempeñan una de sus dos funciones singulares: la creación de una muesca monocatenaria, en posición 5′ de la secuencia de señal heptamérica sobre la cadena codificadora de cada segmento V, y una muesca similar en la cadena no codificadora exactamente en la unión del heptámero-región J. (En la figura 7-8 se muestra este proceso sólo para el segmento V.)
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Paso 3 Formación de horquillas de las regiones V y J y extremos señal romos. El grupo hidroxilo 3′ libre en el extremo de la cadena codificadora del segmento Vκ ahora ataca el grupo fosfato en la cadena Vκ no codificadora opuesta, lo cual forma un nuevo enlace covalente a través de la doble hélice y da una estructura en horquilla de dna sobre el lado del segmento V de la rotura (extremo codificador). De manera simultánea, se forma un extremo de dna romo en el borde de la secuencia señal heptamérica. El mismo proceso ocurre simultáneamente en el lado Jκ de la unión incipiente. En esta etapa, las proteínas RAG1/2 y las proteínas hmg aún están asociadas con los extremos codificador y señal de los segmentos tanto V como J en un complejo después de división.
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Paso 4 Ligadura de los extremos señal. La dna ligasa IV a continuación liga los extremos romos libres para formar la unión señal. La participación de enzimas particulares en este proceso se dedujo a partir de observaciones de recombinación V(D)J en sistemas naturales y generados artificialmente que carecían de una o más enzimas (cuadro 7-3).
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Paso 5 División de horquilla. Las horquillas en los extremos de las regiones V y J ahora son abiertas de una de tres maneras. El enlace idéntico que fue formado por la reacción descrita en el paso 3 puede volver a abrirse para crear un extremo romo en la unión codificadora. De manera alternativa, la horquilla puede ser abierta de modo asimétrico en la cadena “superior” o en la cadena “inferior”, para dar una saliente 5′ o 3′, respectivamente. Una saliente 3′ es más común en experimentos in vivo. La abertura de horquilla es catalizada por Artemis, un miembro de la vía nhej.
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Paso 6 Extensión de la saliente, que lleva a nucleótidos palindrómicos. En reordenamientos de cadena ligera de Ig, las salientes resultantes pueden actuar como sustratos para enzimas de reparación de extensión de dna, lo que conduce a nucleótidos palindrómicos (P) bicatenarios en la unión codificadora; por ejemplo, la hilera de bases superior en la región V en la dirección 5′ a 3′ se lee tcga. La lectura hacia atrás sobre la cadena inferior en el punto de ligadura también da tcga. La naturaleza palindrómica de las bases en esta unión es una función directa de la reacción de abertura de horquilla asimétrica. La adición de nucleótido P también puede ocurrir en las uniones tanto vd como dj de los segmentos de gen que codifican para cadena pesada, pero otros procesos pueden intervenir para añadir más diversidad en las uniones VH-D y D-JH (véase más adelante).
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Paso 7 Ligadura de segmentos V y J de cadena ligera. Miembros de la vía nhej reparan las uniones tanto señal como codificadora, pero todavía no se han caracterizado por completo los papeles precisos de cada una, y en potencia de otras enzimas en este proceso.
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Durante el desarrollo de células B, los genes que codifican para cadena pesada de Ig son reordenados primero, seguidos por los genes que codifican para cadena ligera. Esta disociación temporal de los dos procesos permite que dos mecanismos diversificadores adicionales actúen sobre segmentos de región V de cadena pesada. Las enzimas que se encargan de estos mecanismos por lo general son desactivadas antes de que empiecen los reordenamientos de cadena ligera.
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El análisis de secuencia comparativa de genes que codifican para Ig de la línea germinal y de células B maduras demostró que tanto la pérdida de nucleótidos de plantilla (nucleótidos que se encuentran en el dna de la línea germinal) como la adición de nucleótidos no de plantilla (nucleótidos que no se encuentran en el dna de la línea germinal) podían identificarse en secuencias de cadena pesada. Estos datos dependen de dos actividades catalizadas por enzimas separadas.
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Paso 8 Recorte por exonucleasa. Una actividad de exonucleasa, que queda por identificar, recorta los bordes de las uniones de dna de la región V. Puesto que las proteínas rag mismas pueden recortar dna cerca de un colgajo 3′, es posible que las proteínas rag puedan cortar algunos de los nucleótidos perdidos. De manera alternativa, también se ha mostrado que Artemis tiene actividad de exonucleasa, así como de endonucleasa, y podría ser la enzima de la cual depende la función de exonucleasa asociada a V(D)J. El recorte por exonucleasa no necesariamente ocurre en juegos de tres nucleótidos y, así, puede llevar a unión desfasada. Las secuencias de segmento V en las cuales el recorte ha causado la pérdida del marco de lectura correcto para la cadena no pueden codificar para moléculas de anticuerpos, y se dice que esos reordenamientos son no productivos. Ese recorte por exonucleasa es más común en las dos uniones de gen V que codifica para cadena pesada (V-D y D-J) que en la unión V-J de cadena ligera (véase antes). En casos en los cuales el recorte es extenso, puede llevar a la pérdida de la región D entera, así como a la eliminación de cualesquiera nucleótidos P que se forman como resultado de división de horquilla asimétrica.
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Paso 9 Adición de nucleótido N. Los nucleótidos no de plantilla (N) son agregados por la TdT a las uniones codificadoras de genes que codifican para cadena pesada después de división de horquilla; esta enzima puede añadir hasta 20 nucleótidos a cada lado de la unión. Los dos extremos son mantenidos juntos durante todo este proceso mediante el complejo enzimático y, de nuevo, puede ocurrir pérdida de la fase correcta si no se añaden nucleótidos en los múltiplos de tres correctos que se requieren para preservar el marco de lectura.
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Paso 10 Ligadura y reparación del gen que codifica para cadena pesada. Esto ocurre para los genes que codifican para cadena ligera.
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Al describir la recombinación V(D)J, los investigadores deben explicar no sólo el mecanismo de reconocimiento división y ligadura de rss sino también abordar la pregunta de cómo dos rss, situadas a muchos kilobases de distancia una de otra en la secuencia de dna lineal, son llevadas hacia aposición estrecha. Además, una vez que ha ocurrido recombinación exitosa en un alelo de cadena pesada y un alelo de cadena ligera, esta información debe comunicarse al cromosoma homólogo, de modo que otros alelos puedan ser silenciados. ¿Cómo ocurre esto?
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Investigación reciente indica que tanto la estructura como la ubicación de dna que codifica para la región V de Ig, activo desde el punto de vista recombinacional, cambia significativamente conforme procede el desarrollo de células B, y que algunos de estos cambios son señalados por alteraciones epigenéticas en la estructura de la cromatina, mediados por reacciones de metilación específicas sobre residuos de histona asociados. El dna cerca de la membrana nuclear (dna pericéntrico) no incluye regiones V activas desde el punto de vista de recombinación; más bien, el dna que pasa por recombinación se aleja de la membrana nuclear, y va hacia el centro del núcleo. La estructura de la cromatina que pasa por recombinación también se altera, de modo que tramos largos de dna son condensados hacia asas que permiten que las secuencias que se están recombinando tengan contacto más cercano entre sí. Una vez que ha ocurrido recombinación exitosa, se ha mostrado que el alelo inactivo migra hacia las regiones pericéntricas. Así, el proceso de recombinación está ocurriendo dentro de un contexto nucleoplasmático que modula de manera activa, y es controlado por enzimas que alteran la estructura de la cromatina, además de las que dividen el dna y lo recombinan.
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La recombinación V(D)J puede ocurrir entre segmentos transcritos en la misma dirección o en direcciones opuestas
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La secuenciación de fragmentos cromosómicos que contenían múltiples genes que codifican para la región V de anticuerpos mostró que la transcripción de algunos genes que codifican para dicha región ocurre en una dirección opuesta desde la de segmentos D y J torrente abajo. Sin embargo, el trabajo con sustratos de recombinasa artificiales ha demostrado que se usa el mismo mecanismo general de recombinación, independiente de la dirección de la transcripción de los segmentos de gen involucrados. Cuando la recombinación ocurre entre dos segmentos de gen que son transcritos en la misma dirección, el dna interpuesto es eliminado y se pierde (figura 7-9a). Cuando son transcritos en direcciones opuestas, el dna que estuvo situado entre los segmentos V y J es retenido, en una orientación invertida, en el dna torrente arriba de la región vj reordenada (figura 7-9b).
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Cinco mecanismos generan la diversidad de anticuerpos en células B vírgenes
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Esta descripción del complejo y sofisticado aparato mediante el cual se crean los genes que codifican para Ig, permite entender cómo puede generarse un repertorio de anticuerpos inmensamente diversificado a partir de una cantidad finita de material genético. En resumen, la diversidad del repertorio de bcr virgen es conformada por los mecanismos que siguen:
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Hay segmentos de gen múltiples en loci de cadena pesada (V, D y J) y de cadena ligera (V y J); éstos pueden combinarse con otro para proporcionar diversidad combinatoria extensa (cuadro 7-4).
La adición de nucleótido P se produce cuando la horquilla de dna en la unión codificadora es dividida de manera asimétrica. El rellenado en la pieza de dna monocatenaria que se produce por esta división asimétrica genera una secuencia palindrómica corta.
El recorte por exonucleasa ocurre en las uniones vdj y vj, lo que causa pérdida de nucleótidos.
La adición de nucleótido N no de plantilla en cadenas pesadas se produce por la actividad de la TdT. Los mecanismos 2, 3 y 4 dan lugar a diversidad extra en las uniones entre segmentos de gen, que contribuye a CDR3.
Además de estos cuatro mecanismos para generar diversidad de anticuerpos, que operan en segmentos variables de cadena pesada o ligera individuales, la combinación de diferentes pares de cadena pesada y ligera para formar una molécula de anticuerpo completa proporciona oportunidades adicionales para aumentar el número de sitios de combinación de anticuerpos disponibles (cuadro 7-4).
Diversidad combinatoria: la misma cadena pesada puede combinarse con diferentes cadenas ligeras, y viceversa.
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De estos cinco mecanismos depende la creación del diverso repertorio de bcr y anticuerpos que está disponible para el organismo antes de que haya ocurrido cualquier contacto con agentes patógenos o antígeno. Después de estimulación antigénica, las células B son capaces de usar aún otro mecanismo, singular para el sistema inmunitario, para diversificar y refinar más los receptores y anticuerpos específicos para antígeno: la hipermutación somática. Un complejo enzimático especializado establece como objetivo los genes que codifican para las regiones variables de genes que codifican para Ig sólo en las células que han pasado por activación específica para antígeno en presencia de ayuda de célula T (capítulo 12). Las células B quedan expuestas a ciclos de mutación sucesivos en los loci bcr, seguidos por selección mediada por antígeno en regiones especializadas del ganglio linfático y el bazo. El resultado final de este proceso es que la afinidad promedio de bcr y anticuerpos específicos para antígeno formados al final de una respuesta inmunitaria es considerablemente más alta que en el momento de su instigación; este proceso se denomina maduración de afinidad.
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En esta sección se ha descrito el proceso de la generación del repertorio de región variable de IgG primaria como ocurre en seres humanos y roedores. Aunque se aplican los mismos principios a casi todas las especies de vertebrados, diferentes especies han adquirido por evolución sus propias variaciones. Por ejemplo, el proceso de conversión de gen se utiliza en pollos, y algunas especies, como ovejas y vacas, usa hipermutación somática en la generación del repertorio primario, así como del que tiene experiencia con antígeno.
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En el recuadro 7-2, Evolución, se describe la evolución de este sistema de receptores de linfocito recombinados, y se aborda la hipótesis actual de que el evento clave fue la introducción del segmento de gen RAG1/2 hacia el genoma de vertebrado temprano como un transposón.
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RECUADRO 7-2
EVOLUCIóN: Evolución de receptores de linfocitos recombinados
Los científicos están empezando lentamente a entender cómo puede haber evolucionado el proceso de recombinación V(D)J. Ese entendimiento se ha acompañado de una apreciación del hecho de que los bcr y tcr del sistema inmunitario adaptativo de vertebrados pueden no ser las únicas moléculas de receptor inmunitario generadas mediante genética recombinacional.
Se han identificado receptores tipo Ig en especies tan antiguas como los primeros vertebrados con mandíbulas. Aun así, análisis extensos de los únicos vertebrados sin mandíbulas sobrevivientes (agnatos), los mixinos y las lampreas, no muestran evidencia de segmentos V(D)J de tcr o bcr, genes que codifican para RAG1/2, o genes que codifican para elementos de un sistema primitivo de complejo mayor de histocompatibilidad (mhc). Esto sugiere que el grupo de receptores de la inmunidad adaptativa generado por recombinación, basado en rss, surgió por vez primera en un ancestro común de los vertebrados con mandíbulas, muy probablemente hace más de 500 millones de años (figura 1).
La fuerza impulsora en el desarrollo del sistema inmunitario adaptativo muy probablemente fue la incorporación de un ancestro de los genes que codifican para RAG1 hacia el genoma ancestral en la forma de un elemento susceptible de transposición. Esta hipótesis recibe apoyo por varias observaciones y experimentos:
La región de unión a dna de RAG1 es notoriamente homóloga a la de elementos susceptibles de transposición conocidos, y muestra relación evolutiva con miembros de la familia de transposasa Transib, en la actualidad expresada en especies como moscas de la fruta, mosquitos, gusano de seda y el escarabajo rojo de la harina.
Las repeticiones invertidas en la rss de los segmentos de gen que codifican para Ig y tcr son estructuralmente similares a las que se encuentran en otros transposones.
El mecanismo de acción de las proteínas rag involucra la formación de un intermediario de horquilla de dna que recuerda la acción de ciertas transposasas. Por ejemplo, se ha mostrado que otro transposón conservado filogenéticamente en moscas, el transposón hermes, induce una rotura bicatenaria por medio del mecanismo de formación de horquilla antes descrito para la recombinación V(D)J.
Las proteínas rag tienen la habilidad para efectuar transposición de un segmento de dna que contiene rss a un dna blanco no relacionado in vitro.
El pensamiento actual apoya la hipótesis de que la aparición del transposón en un gen primordial que codifica para receptor de antígeno podría haber separado el gen que codifica para receptor en dos o más piezas. Esta hipótesis recibe apoyo por la presencia, en cordados inferiores, de genes que están relacionados con las regiones V de bcr y tcr y que, por ende, podrían haber proporcionado el sustrato para la invasión de transposón. Cuando el transposón después salió del gen, habría quedado la rss. Múltiples rondas de transposición de ese tipo seguidas por duplicación de gen habrían dado lugar a los loci de tcr y bcr que se conocen en la actualidad. Despierta interés que el conocimiento de la filogenia sugiere que dos ondas de duplicaciones de gen ocurrieron en la época del origen de los vertebrados, justamente alrededor de la época de la entrada del transposón propuesta.
Aún se desconocen muchos aspectos acerca de la evolución de las moléculas de receptor de la inmunidad adaptativa. ¿Cuál fue la naturaleza del receptor primordial de antígeno que fue el blanco para la primera transposición? ¿En qué etapa el gen que codifica para RAG2 quedó asociado con el componente RAG1? Y ¿cómo se explica la evolución de los receptores de Ig de especies como el tiburón, en la cual hay genes V(D)J por completo reordenados en el genoma de la línea germinal?
Evidencia reciente ha sugerido que la estrategia recombinacional para generar receptores de antígeno no se limita a los sistemas de Ig y tcr basados en rss de vertebrados. Los peces sin mandíbula, como las lampreas y los mixinos, poseen células tipo linfocito que pueden ser estimuladas para que se dividan y se diferencien. Más aún, estas células liberan aglutininas específicas después de inmunización con antígenos, y tras una inmunización secundaria se secretan concentraciones séricas más altas de estas aglutininas que después de una inmunización primaria, lo que sugiere que hay memoria inmunológica en estos peces. Por ende, estas células tipo linfocito parecen expresar todos los datos característicos de la inmunidad adaptativa, y aún así las aglutininas que secretan no parecen tener una estructura tipo Ig.
El análisis de las aglutininas ha revelado que los “linfocitos” de lamprea activados expresan abundantes cantidades de proteínas que contienen repeticiones ricas en leucina (lrr). Las lrr son motivos de proteína que se asocian frecuentemente con reconocimiento proteína-proteína, y esos motivos ya se han encontrado en el contexto de los receptores tipo toll (capítulo 5). Los receptores de aglutinina de lamprea son generados mediante recombinación de segmentos de gen durante el desarrollo de linfocitos, y los repertorios de receptor de lrr de estos peces son notoriamente diversos. Por ende, estos receptores se han nombrado moléculas de receptor de linfocito variables (vlr).
En la figura 2a se muestra un ejemplo del ordenamiento de las moléculas de proteína en una de estas moléculas de vlr. En el amino terminal de la proteína hay un péptido señal invariante, seguido por una repetición rica en leucina N terminal (lrrnt) de 27 a 34 residuos. Esto va seguido por la primera de varias moléculas de repetición rica en leucina (lrr) de 24 residuos, LRR1, conectada a una serie de hasta ocho moléculas de lrrv de 24 residuos con secuencias variables (lrrv). En el C terminal de la molécula, un segmento de lrrv terminal (end) (lrrve) de 24 residuos está fijo a un péptido conector (cp) de 16 residuos corto, que culmina en un lrr C terminal (lrrct) de 48 a 63 residuos. Las moléculas de vlr están fijas a la membrana del linfocito por medio de un tallo invariante, rico en residuos de treonina y prolina, que se conectan a un ancla de glucosil-fosfatidil (phosphatidyl)-inositol (gpi) y un péptido hidrofóbico. La activación de linfocito lleva a división por fosfolipasa en el ancla de gpi, lo que permite que formas solubles de los vlr se liberen desde el linfocito después de estimulación con antígeno.
El proceso de montaje que genera la proteína completada sólo ocurre en linfocitos. En el dna de la línea germinal, secuencias lrr flanquean los genes lrr esqueleto, que inicialmente sólo constan de secuencias que codifican para partes del lrrnt y lrrct, separadas por dna no codificador (figura 2b). Durante el desarrollo de linfocitos, la secuencia no codificadora es reemplazada con lrr variables. Los segmentos de gen son copiados desde una parte del genoma hacia otra en un proceso unidireccional, similar a la conversión de gen. Cada linfocito de lamprea expresa un gen que codifica para vlr singular desde un alelo único, y la diversidad del repertorio sólo es limitada por el número de linfocitos.
En la figura 2c se muestra la estructura de uno de estos receptores, generada a partir de un modelo cristalográfico de rayos X. La comparación de las secuencias de varias de estas estructuras principalmente de cadena β ha mostrado que su diversidad de secuencia está concentrada en el lado cóncavo (izquierdo) de la molécula, y puede atribuirse a la diversidad inherente de las secuencias lrr.
¿Los dos juegos de receptores inmunitarios derivados por recombinación, basados en lrr y V(D)J, existieron lado a lado en una especie ancestral? Esto se desconoce. Los agnatos que no son las lampreas y los mixinos se extinguieron hace 400 millones de años, y sólo se tiene acceso a los restos fósiles de ostracodermos (agnatos con esqueleto dérmico), que se cree que son los ancestros de los gnatóstomos. Una teoría sostendría que el sistema de recombinación de vlr evolucionó en un ancestro común sólo a los mixinos y las lampreas, y podría haber sido casual en su capacidad para sobrevivir cuando otra especie de agnato sucumbió a los fenómenos ambientales adversos. De manera alternativa, los sistemas basados en vlr y en Ig pueden haber coexistido durante cierto tiempo, con linfocitos que portaban ambos tipos de receptores, hasta que uno de los sistemas se perdió.
La genética combinacional en la generación de los receptores de antígeno de vertebrados puede no ser un mecanismo tan singular como los inmunólogos habían creído previamente.
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