Capítulo 7: Organización y expresión de genes que codifican para receptor de linfocito

Para proteger a su huésped, el sistema inmunitario debe reconocer una vasta gama de microorganismos que evolucionan con rapidez. Para lograr esto, debe generar un repertorio diverso y flexible de moléculas receptoras, mientras que minimiza la expresión de receptores que reconocen antígenos propios. Cada linfocito B o T expresa un receptor específico para antígeno, singular (capítulo 3). Cuando estos receptores se unen a sus antígenos correspondientes en las condiciones apropiadas (capítulos 11 y 12), los linfocitos T y B proliferan y se diferencian hacia células efectoras que eliminan la amenaza microbiana (capítulo 13).

En el capítulo 3 se describieron los aspectos bioquímicos de los receptores de linfocitos T y B, y los anticuerpos secretados formados por linfocitos B después de estimulación con antígeno. También se esbozaron los experimentos que demostraron que los anticuerpos secretados son idénticos, en cuanto a especificidad de unión a antígeno, a los receptores de célula B de la célula secretora. En este capítulo se aborda la pregunta de cómo un organismo puede codificar y expresar receptores capaces de reconocer un universo en evolución constante de amenazas microbianas usando una cantidad finita de información genética.

En la producción de receptores de linfocito específicos se emplean varios mecanismos genéticos que son singulares para el sistema inmunitario. En 1987, Susumu Tonegawa ganó el Premio Nobel para Fisiología o Medicina “por su descubrimiento del principio genético para la generación de la diversidad de anticuerpos”, un descubrimiento que desafió el concepto fundamental de que un gen codificaba para una cadena polipeptídica. Tonegawa y sus colegas mostraron que la cadena ligera de anticuerpo estaba codificada en la línea germinal no por una sino por tres familias de segmentos de gen separados por kilobases de dna (figura 7-1). (El dna de la línea germinal es la información genética codificada en el espermatozoide y el óvulo, que puede transmitirse a generaciones futuras.) Su investigación demostró que dos segmentos de dna, uno de cada familia, son co-unidos, sólo en linfocitos B, para crear la forma madura de la región variable de la cadena ligera del gen que codifica para inmunoglobulina (Ig). Un tercer segmento codifica para la región constante del gen. Diferentes combinaciones de segmentos se usan en cada célula B, para crear el diverso repertorio de genes que codifican para receptor de cadena ligera. En experimentos subsiguientes se ha mostrado que todos los genes que codifican para receptor de célula B y T se montan a partir de múltiples segmentos de gen mediante reordenamientos similares.

A continuación se describen los arreglos genéticos singulares de los segmentos de gen que codifican para receptor de células T y B, y los mecanismos mediante los cuales se reordenan y expresan. Aquí sólo se abordarán los mecanismos que conforman los repertorios de receptor de células T y B vírgenes de ratón y de ser humano, que todavía no han quedado expuestas a antígeno. Estratos adicionales de diversidad son generados en células B después de exposición a antígeno, los cuales se abordan en el capítulo 12. Estos mecanismos poderosos comprenden la generación de anticuerpos de diferentes clases de cadena pesada, cada una capaz de mediar un grupo separado de funciones efectoras, así como la creación de regiones de unión a antígeno modificadas mediante hipermutación somática, seguida por selección impulsada por antígeno. Estos dos procesos son desencadenados en células B de ser humano y de ratón sólo después de contacto con antígeno.

El sistema inmunitario se fundamenta en una vasta gama de receptores de célula B (bcr) que poseen la capacidad para unirse de manera específica a un número correspondientemente grande de agentes patógenos potenciales. La primera indicación del inmenso tamaño del repertorio de anticuerpos fue proporcionada por inmunólogos que usaron moléculas sintéticas para estimular la producción de anticuerpos. Descubrieron que los anticuerpos pueden discriminar entre moléculas sintéticas pequeñas que difieren en tan poco como la posición de un grupo amino o hidroxilo en un anillo fenilo. Si el sistema inmunitario puede discriminar entre moléculas pequeñas que probablemente nunca había encontrado durante la selección evolutiva, y que difieren de maneras tan sutiles, se razonó que el número de anticuerpos potenciales de hecho debe ser muy grande. En una serie de experimentos efectuados a finales de la década de 1970-1979 y principios de la de 1980-1989 se estimó que el número de bcr diferentes generados en un sistema inmunitario de ratón normal es de al menos 10⁷, pero ahora se sabe que ese estimado quedó corto por muchos órdenes de magnitud.

Los investigadores que intentaron comprender la genética de la Ig también encararon un enigma adicional: la secuenciación de proteína de cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos de ratón y de ser humano reveló que los primeros 110 aminoácidos (amino terminal) de las cadenas pesada y ligera de anticuerpos eran en extremo variables entre diferentes moléculas de anticuerpos; por ende, esta región se definió como la región variable (V) de la molécula de anticuerpo. En contraste, el resto de las cadenas ligera y pesada podía clasificarse en una de sólo cuatro secuencias (cadena ligera) u ocho secuencias (cadena pesada) (figura 7-2a) y, por ende, se denominó la región constante (C). Esto suscitó una interesante pregunta: si cada uno de 10⁵ a 10⁷ anticuerpos es codificado por un gen separado, ¿cómo podría la parte de la región constante del gen permanecer constante en cuanto a secuencia ante la deriva evolutiva?

Además, podían encontrarse anticuerpos en los cuales la misma región variable (V) del anticuerpo estuvo asociada con más de una región constante (C) de cadena pesada (figura 7-2b), lo que apoyó más la posibilidad de que la expresión de las regiones variable y constante de cada cadena de anticuerpo estuvo controlada de manera independiente. [Estas regiones constantes adicionales son generadas por medio del proceso de recombinación de cambio de clase inducido por antígeno (capítulo 12). En el contexto actual, el único punto de importancia es la independencia con la cual las regiones variable y constante parecen ser expresadas.] Rápidamente estuvo quedando claro que la solución al enigma del gen que codifica para anticuerpos era más compleja que lo que se había imaginado.

Los investigadores propusieron dos modelos teóricos tempranos de la genética de anticuerpos

Las teorías de la línea germinal clásicas de la diversidad de anticuerpos sugirieron que la información genética para cada anticuerpo está codificada, en su totalidad, dentro del genoma de la línea germinal. Esto significa que los genes que codifican para toda la secuencia de cada cadena pesada o ligera de anticuerpo que el animal podría alguna vez sintetizar deben estar presentes en cada célula. Sin embargo, un cálculo rápido es suficiente para demostrar que si hay 10⁷ o más anticuerpos, cada uno de los cuales necesita aproximadamente 2 000 nucleótidos, esto requeriría un gasto masivo de información genética —de hecho, se requeriría más dna para codificar los receptores del sistema inmunitario que el que está disponible para el organismo—. Si bien inicialmente se argumentó que la dedicación de una fracción considerable del genoma al sistema inmunitario puede representar una estrategia evolutiva razonable, a medida que los estimados del tamaño del repertorio de anticuerpos se revisaron en dirección ascendente, quedó claro que simplemente no había suficiente DNA para que alcanzara, y que debían encontrarse nuevas ideas.

En 1965, William Dreyer y J. Claude Bennett propusieron que las cadenas pesada y ligera de anticuerpos están, cada una, codificadas en dos segmentos separados en el genoma de la línea germinal, y que uno de cada uno de los segmentos que codifican para la región V y para la región C son unidos en el dna de la célula B para formar genes completos que codifican para las cadenas pesada y ligera de anticuerpos. La idea de que el dna en células somáticas podría emprender actividad de recombinación fue revolucionaria. Empero, los teóricos de la línea germinal empezaron a modificar sus ideas para acoger esta posibilidad.

Otros sugirieron la idea igual de innovadora de que el número de genes que codifican para la región variable en el genoma podría ser demasiado limitado y propusieron la teoría de la hipermutación somática. De acuerdo con esta hipótesis, mecanismos mutacionales desconocidos en células somáticas actúan sobre un número limitado de genes que codifican para anticuerpos para generar un repertorio de receptores diverso en linfocitos B maduros. Esta última idea tuvo la ventaja de explicar cómo un repertorio grande de anticuerpos podía generarse a partir de un número de genes relativamente pequeño, pero la desventaja de que nunca se había observado un proceso de ese tipo, como la recombinación de genes de células somáticas sugerida por otros. Hubo debate adicional respecto a si la mutación ocurriría antes de contacto con antígeno, o sólo después del mismo y, por ende, si la mutación era la causa de la generación del llamado “repertorio primario” que existe antes de unión a antígeno por la célula B.

Continuó un acalorado debate entre los defensores de las teorías de la línea germinal modificada en contraposición con la de la mutación somática a principios de la década de 1970-1979, hasta que un grupo trascendental de experimentos reveló que ambas posturas eran correctas. Ahora se sabe que cada molécula de anticuerpo es codificada por múltiples segmentos de gen que codifican para región variable, de la línea germinal, que son reordenados de manera diferente en cada célula inmunitaria virgen para producir un repertorio diverso de receptor primario. A continuación se actúa más sobre estos genes reordenados después del encuentro con antígeno, mediante hipermutación somática y selección antigénica, lo que da lugar a un repertorio expandido y muy perfeccionado de células B específicas para antígeno (capítulo 12).

Experimentos que constituyeron avances importantes revelaron que múltiples segmentos de gen codifican para la cadena ligera

Desde mediados de la década de 1970-1979 hasta mediados de la de 1980-1989, un pequeño grupo de inmunólogos brillantes completó una serie de experimentos que alteraron fundamentalmente la manera en la cual los científicos piensan acerca de los aspectos genéticos de las moléculas de receptor inmunitario. El primer avance importante ocurrió cuando Susumu Tonegawa mostró, como Dreyer y Bennett habían predicho, que múltiples segmentos de gen codifican para la cadena ligera de anticuerpo. Su logro es de lo más impresionante porque todavía no estaban disponibles los instrumentos modernos de la biología molecular. El experimento que efectuó con Nobumichi Hozumi se describe en el recuadro 7-1, Experimento clásico.

El experimento de Tonegawa mostró que, en el dna de células hepáticas embrionarias no productoras de anticuerpos, hay un sitio de endonucleasa BamHI entre las regiones variable y constante. Se sabe esto porque sondas para las regiones variable y constante, cada una, reconocieron un fragmento de dna diferente en dna de la línea germinal digerido con BamHI. Con todo, en la célula tumoral productora de anticuerpos, el dna que codifica para las regiones variable y constante pareció estar combinado en sólo un fragmento, lo que demuestra así que el reordenamiento de dna debe haber ocurrido durante la formación de un gen que codifica para cadena ligera de anticuerpo (véanse más detalles en el recuadro 7-1, Experimento clásico).

Si bien este experimento demostró que las regiones V y C de genes que codifican para anticuerpos estuvieron localizadas en diferentes contextos en el dna de células no productoras de anticuerpos, no consideró sus ubicaciones relativas; de hecho, el experimento inicial no excluyó la posibilidad de que los fragmentos V y C podían estar codificados en diferentes cromosomas en las células embrionarias. Aun así, en experimentos de secuenciación después se mostró que los segmentos que codifican para los genes V y C de las cadenas ligeras κ están en el mismo cromosoma y que, en células no B, los dos segmentos están separados por una secuencia de dna no codificadora larga.

Las repercusiones de este resultado sobre la comunidad biológica fueron profundas. Por vez primera, se mostró que el dna es cortado y vuelto a unir durante el proceso de diferenciación celular. Este experimento no sólo proporcionó la prueba experimental de la predicción de Dreyer y Bennett, sino que también preparó el camino para el siguiente dato sorprendente.

En el experimento de Tonegawa se habían identificado los segmentos V y C que codifican para la cadena ligera κ. De cualquier modo, cuando científicos en este grupo secuenciaron el dna que codifica para la cadena ligera de anticuerpo, encontraron otro resultado inesperado. Como se esperaba, el segmento de región V embrionario (no reordenado) tuvo, en su 5′ terminal, una secuencia líder hidrofóbica corta, una característica común de proteínas de membrana necesaria para guiar la cadena proteínica naciente hacia la membrana (figura 7-3a). Una secuencia de 93 bp de dna no codificador separó la secuencia líder de un tramo largo de dna que codificó para los primeros 97 aminoácidos de la región V. No obstante, el dominio de la región V de la cadena ligera tiene aproximadamente 110 aminoácidos de largo. ¿Dónde estuvo la información codificadora para los 13 aminoácidos restantes?

La secuenciación del fragmento de región constante de la cadena ligera a partir de dna embrionario proporcionó la respuesta. Torrente arriba desde la secuencia codificadora de la región constante, y separado de ella por un segmento de dna no codificador de 1 250 bp, estuvieron las 39 bp que codificaban para los 13 aminoácidos restantes de la región V. Este segmento codificador de cadena ligera adicional se denominó segmento de gen de unión (joining) (J) (que se muestra en rojo en la figura 7-3a). La secuenciación adicional de regiones variable y constante de cadena ligera de ratón y de ser humano confirmaron el segundo hallazgo asombroso de Tonegawa. Las regiones variable y constante no sólo están codificadas en dos segmentos separados, sino que las regiones variables de cadena ligera mismas están codificadas en dos segmentos de gen separados, los segmentos V y J, que sólo se hacen contiguos en células productoras de anticuerpos.

A continuación se mostró que el gen que codifica para la región variable de la cadena pesada requiere aún un tercer segmento genético. Al adoptar una estrategia similar de clonación y secuenciación de genes que codifican para la cadena pesada de Ig, el grupo de Lee Hood identificó un fragmento de gen que codifica para la región variable de cadena pesada (heavy) (V_H) de la línea germinal, que codificó para los residuos de aminoácidos 1 a 101 de la cadena pesada de anticuerpo, y un segundo fragmento que incluyó un segmento de gen de unión (Joining) a cadena pesada (J_H) que determinó la secuencia de residuos de aminoácidos 107 a 123. Ninguno de estos segmentos contuvo la secuencia de dna necesaria para codificar los residuos 102 a 106 de la cadena pesada. Tiene importancia que estos residuos faltantes estuvieron incluidos en la tercera región determinante de complementariedad de la cadena pesada de anticuerpo, CDR3, que proporciona residuos de contacto en la unión de casi todos los antígenos (capítulo 3). Los segmentos de gen que codifican para esta parte de la cadena pesada de anticuerpo finalmente fueron localizados en la posición 5′ de la región J en dna embrionario de ratón por Hood y colegas (figura 7-3b). La importancia de la contribución hecha por este segmento de gen a la diversidad de especificidades de anticuerpo es denotada por su nombre: la región de diversidad (D). (Puesto que no hay región D en la cadena ligera, los inmunólogos por lo general eliminan la letra en subíndice que denota la cadena pesada.)

Así, la región variable de la cadena pesada de la molécula de anticuerpo está codificada por tres segmentos de gen separados, y la región variable de la cadena ligera por dos segmentos, en el genoma de la línea germinal. Estos segmentos son unidos mediante un proceso de recombinación de dna que sólo ocurre en la línea de linfocitos B para crear el gen que codifica para la región variable completo. Además, el dna en la unión entre los segmentos V y J para cadenas ligeras, y en las uniones vd y dj en cadenas pesadas, explica la extraordinaria diversidad que fue observada por vez primera por Kabat y Wu en las regiones CDR3 de cadenas tanto pesadas como ligeras (capítulo 3). A continuación se describirá cómo se genera diversidad genética adicional en estas uniones por medio de procesos adicionales singulares para los aspectos genéticos del sistema inmunitario.

Recuérdese que todas las proteínas Ig constan de dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas (capítulo 3). Las cadenas ligeras pueden ser cadenas ligeras kappa (κ) o cadenas ligeras lambda (λ). Las familias de genes que codifican para la cadena pesada κ y λ son codificadas, cada una, en cromosomas separados (cuadro 7-1).

Los genes que codifican para la cadena ligera κ comprenden segmentos V, J y C

El locus Ig_κ de ratón abarca 3.5 Mb e incluye 91 genes V_κ en potencia funcionales, que se han agrupado hacia 18 familias de genes V con base en homología de secuencia (figura 7-4a). (Si dos secuencias son más de 80% idénticas, se clasifican como pertenecientes a la misma familia de gen V.) Estas familias de gen V pueden agruparse más hacia clanes de gen V, de nuevo con base en homología de secuencia. Cada segmento V_κ incluye el exón líder que codifica para el péptido señal. Segmentos V_κ individuales están separados por brechas no codificadoras de 5 a 100 Kb. La orientación transcripcional de segmentos V_κ particulares puede estar en la misma dirección que el segmento de región constante, o en la dirección opuesta. Las orientaciones relativas de los segmentos de región variable y constante no afectan el uso de los segmentos, pero alteran algunos detalles del mecanismo recombinacional que crea el gen que codifica para cadena ligera completo (véase más adelante).

Torrente abajo de la agrupación de la región V_κ hay cuatro segmentos J_κ funcionales y un seudogén, u otro marco de lectura abierta no funcional (cuadro 7-2). Se encuentra un arreglo similar en el locus V_κ de ser humano, aunque los números de segmentos de gen V y J varían. Un segmento C_κ único se encuentra torrente abajo de la región J y todas las regiones constantes de cadena ligera κ son codificadas por este segmento.

Los genes que codifican para la cadena ligera λ forman pares de cada segmento J con un segmento C particular

El locus Igλ de ratón abarca una región de aproximadamente 190 kb. Las cadenas ligeras λ sólo se encuentran en 5% de los anticuerpos de ratón debido a un evento de deleción en el genoma de ratón que ha eliminado casi todos los segmentos de la región variable de la cadena ligera λ. Por ende, no fue sorprendente descubrir que sólo hay tres segmentos de gen V_λ por completo funcionales, aunque este número varía un poco con la cepa (cuadro 7-2). Despierta interés que también hay tres regiones constantes de cadena λ por completo funcionales, cada una asociada con su propio segmento de región J (figura 7-4b). Los segmentos J-C_λ4 no se expresan debido a un defecto en el sitio de empalme.

Puesto que la recombinación de segmentos de gen Ig siempre ocurre en dirección torrente abajo (V a J), la ubicación de la secuencia de la región variable V_λ1 torrente arriba de los segmentos JC_λ3 y JC_λ1, pero torrente abajo desde JC_λ2, significa que V_λ1 siempre es expresado con JC_λ3 o JC_λ1, pero nunca con JC_λ2. Por la misma razón, V_λ2 por lo general se asocia con la formación de pares JC_λ2, aunque se han observado formaciones de pares ocasionales de V_λ2 con los segmentos JC_λ1 distantes de 190 kb.

En seres humanos, 40% de las cadenas ligeras son del tipo λ, y alrededor de 30 segmentos de gen que codifica para cadena V_λ se usan en cadenas ligeras de anticuerpos maduros (cuadro 7-2). Torrente abajo desde el locus V_λ de ser humano hay una serie de siete pares JC_λ, de los cuales cuatro pares son por completo funcionales.

La organización de gen que codifica para cadena pesada incluye segmentos V_H, D, J_H y C_H

Múltiples segmentos de gen V_H yacen a través de una región de aproximadamente 3.0 Mb tanto en ratones como en seres humanos (figura 7-4c). Estos segmentos pueden clasificarse, al igual que los segmentos V_κ, en familias de secuencias homólogas. Los humanos expresan al menos 38 segmentos V_H funcionales, y los ratones aproximadamente 101 (cuadro 7-2). Torrente abajo desde la agrupación de segmentos de región V_H de ratón hay una región de 80 Kb que contiene alrededor de 14 regiones D (el número real varía entre diferentes cepas de ratones). Sólo 0.7 kb torrente abajo del segmento D en posición más 3′ está la agrupación de la región J_H, que contiene cuatro regiones J_H funcionales. Otra brecha separa el último segmento J_H del primer exón de la región constante, Cμ1.

El locus V_H de ser humano tiene un arreglo similar, con aproximadamente 30 segmentos D funcionales, y seis segmentos J_H funcionales. Las regiones D de ser humano pueden leerse en los tres marcos de lectura, mientras que las regiones D de ratón se leen principalmente en el marco de lectura 1, debido a la presencia de codones de paro en los marcos de lectura 2 y 3 en casi todas las regiones D de ratón.

Las ocho regiones constantes de cadenas pesadas de anticuerpos son codificadas en un tramo de 200 kb de dna torrente abajo desde el locus J_H (figura 7-4c). Recuerde que las regiones constantes de anticuerpos determinan su clase de cadena pesada y, finalmente, sus funciones efectoras (capítulo 13).

En la recombinación V(D)J el dna que codifica para una región V de anticuerpo completa es montado a partir de segmentos V, D y J (cadena pesada) o V y J (cadena ligera) que inicialmente están separados por muchas kilobases de dna. Cada célula B en desarrollo genera un nuevo par de genes que codifican para la región variable mediante recombinación en el ámbito del dna genómico. La recombinación es catalizada por un juego de enzimas, muchas de las cuales también están involucradas en funciones de reparación de dna (cuadro 7-3), y se dirige hacia los sitios apropiados del gen que codifica para Ig mediante reconocimiento de motivos de secuencia de dna específicos llamados secuencias de señal de recombinación (rss). Estas secuencias aseguran que uno de cada tipo de segmento (V y J para la cadena ligera, o V, D y J para la cadena pesada) sea incluido en el gen que codifica para la región variable recombinado. Durante división y ligadura de los segmentos, el dna es editado de diversas maneras, lo cual añade variabilidad adicional al gen recombinado.

La recombinación es dirigida por secuencias señal

Para que ocurra recombinación en el dna de todo linfocito, debe haber un mecanismo para asegurar que sólo ocurra en genes que codifican para anticuerpos y para receptor de célula T, y que los segmentos de dna que se estén moviendo terminen exactamente donde deben en el genoma. De otro modo, puede haber consecuencias funestas, incluso enfermedad maligna.

A finales de la década de 1970-1979, investigadores que estaban trabajando con genes que codifican para cadena ligera, describieron dos bloques de secuencias conservadas —un nonámero (un juego de nueve pares de bases) y un heptámero (un juego de siete pares de bases)— que están altamente conservados y ocurren en las regiones no codificadoras torrente arriba de cada segmento J. El heptámero pareció terminar exactamente en la secuencia codificadora de la región J. La secuenciación adicional mostró que el mismo motivo estuvo repetido de una manera invertida en el lado torrente abajo de las secuencias que codifican la región V; de nuevo, la secuencia de heptámero terminó alineada con el segmento del gen que codifica para la región V (figura 7-5a).

Otra característica de estas secuencias digna de mención fue la presencia de una secuencia espaciadora de 12 o 23 bp entre el heptámero y nonámero. La importancia de los tramos espaciadores estuvo clara; representaron uno o dos giros de la doble hélice. Así, la secuencia espaciadora asegura que los extremos del nonámero y heptámero más cerca a los espaciadores estarían en el mismo lado de la doble hélice y, así, accesibles a unión por la misma enzima. Los investigadores concluyeron correctamente que habían descubierto la señal que dirige la recombinación entre los segmentos de gen V y J, y llamaron a éste el motivo heptámero 12/23 nonámero, la secuencia de señal de recombinación (rss).

En resumen, la rss consta de tres elementos:

• Una secuencia de consenso absolutamente conservada, de 7 bp (heptámero), 5′-CACAGTG -3′

• Un espaciador menos conservado de 12 o 23 bp

• Una segunda secuencia de consenso conservada, de 9 bp (nonámero), 5′-ACAAAAACC-3′

En los segmentos de gen que codifican para cadena pesada, se notó un patrón similar. Las regiones espaciadoras que separan los pares tetrámero y nonámero tuvieron 23 bp de longitud después de los segmentos V y antes de los segmentos J, y 12 bp de longitud antes y después de los segmentos D. Las ubicaciones relativas de los espaciadores de 12 y 23 pares de bases (figura 7-5b) sugirieron que la enzima vdj recombinasa está diseñada para unir una secuencia que tiene un espaciador de 12 bp con una secuencia que tiene un espaciador de 23 bp, algo que ahora se sabe que es así.

En las figuras 7-6a y 7-6b se ilustra la generación de genes que codifican para cadena ligera y para cadena pesada, completos, a partir de segmentos V y J, y V, D y J, respectivamente.

Los segmentos de gen son unidos por la RAG1/2 recombinasa

Se mostró que dos proteínas, codificadas por genes estrechamente enlazados, RAG1 (gen activador de la recombinación 1) y RAG2 (gen activador de la recombinación 2), son necesarias para recombinar genes que codifican para anticuerpos. Los genes RAG1 y RAG2 están codificados con justo ocho kilobases de separación, y son transcritos juntos. La expresión de RAG1 y RAG2 está regulada desde el punto de vista del desarrollo en células tanto T como B (capítulos 9 y 10) y, si bien RAG1 es expresado en todas las fases del ciclo celular, RAG2 sólo es estable en células en fase G_0– o G_1–. RAG1 es la recombinasa predominante; forma un complejo con la rss que es estabilizado por la unión de RAG2. RAG2 en sí no muestra actividad detectable de unión a rss.

Sólo tres de las proteínas implicadas en la recombinación V(D)J son singulares para linfocitos: RAG1, RAG2, y la desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT), que se encarga de la generación de diversidad adicional en la región CDR3 de la cadena pesada de anticuerpo (véase más adelante). TdT sólo es expresada en linfocitos en desarrollo, y añade nucleótidos “N” no de plantilla a los 3′ terminales libres de extremos codificadores después de su división por RAG1/2 recombinasas.

Otras enzimas que participan en el proceso de recombinación no son específicas para células linfoides. Mientras que la unión de la rss por RAG1/2 puede ocurrir en ausencia de cualesquiera otras proteínas, otros factores celulares, la mayor parte de los cuales forman parte de la vía de unión (Joining) de extremos no homólogos (nhej) de reparación de dna se necesitan para completar la recombinación V(D)J. Estas otras proteínas no específicas para linfocito que se sabe que participan en la unión de V(D)J se describen en el cuadro 7-3.

La recombinación V(D)J da lugar a un gen que codifica para región variable de Ig funcional

El proceso de recombinación V(D)J ocurre en varias fases (figura 7-7). El producto final de cada reordenamiento exitoso es un gen que codifica para Ig intacto, en el cual los segmentos V y J (cadenas ligeras) o V, D y J (cadenas pesadas) son unidos para crear un gen que codifica para cadena pesada o ligera completo. Las nuevas uniones en el gen que codifica para la región V de anticuerpo, creado mediante este proceso de recombinación, se denominan uniones codificadoras. Las uniones entre los heptámeros de las rss se denominan uniones señal.

La primera fase de este proceso, reconocimiento de dna y división del mismo, es catalizada por las proteínas RAG1/2. La segunda fase, el procesamiento y unión de extremo, requiere un juego más complejo de actividades enzimáticas además de RAG1/2, que incluye Artemis, TdT, dna ligasa IV, y otras proteínas nhej. Los pasos individuales involucrados en el proceso de recombinación entre segmentos V_κ y J_κ se muestran de modo secuencial en la figura 7-8.

Paso 1 Reconocimiento de la secuencia de señal de recombinación (rss) heptámero-nonámero por el complejo enzimático RAG1/RAG2. La RAG1/2 recombinasa forma un complejo con las rss heptámero-nonámero contiguas con los dos segmentos de gen que van a ser unidos. La formación de complejo es iniciada por reconocimiento de las secuencias rss nonámero por RAG1, y durante esta unión se sigue la regla de 12-23.

Paso 2 División monocatenaria en la unión de las secuencias de codificación y señal. Las proteínas RAG1/2 a continuación desempeñan una de sus dos funciones singulares: la creación de una muesca monocatenaria, en posición 5′ de la secuencia de señal heptamérica sobre la cadena codificadora de cada segmento V, y una muesca similar en la cadena no codificadora exactamente en la unión del heptámero-región J. (En la figura 7-8 se muestra este proceso sólo para el segmento V.)

Paso 3 Formación de horquillas de las regiones V y J y extremos señal romos. El grupo hidroxilo 3′ libre en el extremo de la cadena codificadora del segmento V_κ ahora ataca el grupo fosfato en la cadena V_κ no codificadora opuesta, lo cual forma un nuevo enlace covalente a través de la doble hélice y da una estructura en horquilla de dna sobre el lado del segmento V de la rotura (extremo codificador). De manera simultánea, se forma un extremo de dna romo en el borde de la secuencia señal heptamérica. El mismo proceso ocurre simultáneamente en el lado J_κ de la unión incipiente. En esta etapa, las proteínas RAG1/2 y las proteínas hmg aún están asociadas con los extremos codificador y señal de los segmentos tanto V como J en un complejo después de división.

Paso 4 Ligadura de los extremos señal. La dna ligasa IV a continuación liga los extremos romos libres para formar la unión señal. La participación de enzimas particulares en este proceso se dedujo a partir de observaciones de recombinación V(D)J en sistemas naturales y generados artificialmente que carecían de una o más enzimas (cuadro 7-3).

Paso 5 División de horquilla. Las horquillas en los extremos de las regiones V y J ahora son abiertas de una de tres maneras. El enlace idéntico que fue formado por la reacción descrita en el paso 3 puede volver a abrirse para crear un extremo romo en la unión codificadora. De manera alternativa, la horquilla puede ser abierta de modo asimétrico en la cadena “superior” o en la cadena “inferior”, para dar una saliente 5′ o 3′, respectivamente. Una saliente 3′ es más común en experimentos in vivo. La abertura de horquilla es catalizada por Artemis, un miembro de la vía nhej.

Paso 6 Extensión de la saliente, que lleva a nucleótidos palindrómicos. En reordenamientos de cadena ligera de Ig, las salientes resultantes pueden actuar como sustratos para enzimas de reparación de extensión de dna, lo que conduce a nucleótidos palindrómicos (P) bicatenarios en la unión codificadora; por ejemplo, la hilera de bases superior en la región V en la dirección 5′ a 3′ se lee tcga. La lectura hacia atrás sobre la cadena inferior en el punto de ligadura también da tcga. La naturaleza palindrómica de las bases en esta unión es una función directa de la reacción de abertura de horquilla asimétrica. La adición de nucleótido P también puede ocurrir en las uniones tanto vd como dj de los segmentos de gen que codifican para cadena pesada, pero otros procesos pueden intervenir para añadir más diversidad en las uniones V_H-D y D-J_H (véase más adelante).

Paso 7 Ligadura de segmentos V y J de cadena ligera. Miembros de la vía nhej reparan las uniones tanto señal como codificadora, pero todavía no se han caracterizado por completo los papeles precisos de cada una, y en potencia de otras enzimas en este proceso.

Durante el desarrollo de células B, los genes que codifican para cadena pesada de Ig son reordenados primero, seguidos por los genes que codifican para cadena ligera. Esta disociación temporal de los dos procesos permite que dos mecanismos diversificadores adicionales actúen sobre segmentos de región V de cadena pesada. Las enzimas que se encargan de estos mecanismos por lo general son desactivadas antes de que empiecen los reordenamientos de cadena ligera.

El análisis de secuencia comparativa de genes que codifican para Ig de la línea germinal y de células B maduras demostró que tanto la pérdida de nucleótidos de plantilla (nucleótidos que se encuentran en el dna de la línea germinal) como la adición de nucleótidos no de plantilla (nucleótidos que no se encuentran en el dna de la línea germinal) podían identificarse en secuencias de cadena pesada. Estos datos dependen de dos actividades catalizadas por enzimas separadas.

Paso 8 Recorte por exonucleasa. Una actividad de exonucleasa, que queda por identificar, recorta los bordes de las uniones de dna de la región V. Puesto que las proteínas rag mismas pueden recortar dna cerca de un colgajo 3′, es posible que las proteínas rag puedan cortar algunos de los nucleótidos perdidos. De manera alternativa, también se ha mostrado que Artemis tiene actividad de exonucleasa, así como de endonucleasa, y podría ser la enzima de la cual depende la función de exonucleasa asociada a V(D)J. El recorte por exonucleasa no necesariamente ocurre en juegos de tres nucleótidos y, así, puede llevar a unión desfasada. Las secuencias de segmento V en las cuales el recorte ha causado la pérdida del marco de lectura correcto para la cadena no pueden codificar para moléculas de anticuerpos, y se dice que esos reordenamientos son no productivos. Ese recorte por exonucleasa es más común en las dos uniones de gen V que codifica para cadena pesada (V-D y D-J) que en la unión V-J de cadena ligera (véase antes). En casos en los cuales el recorte es extenso, puede llevar a la pérdida de la región D entera, así como a la eliminación de cualesquiera nucleótidos P que se forman como resultado de división de horquilla asimétrica.

Paso 9 Adición de nucleótido N. Los nucleótidos no de plantilla (N) son agregados por la TdT a las uniones codificadoras de genes que codifican para cadena pesada después de división de horquilla; esta enzima puede añadir hasta 20 nucleótidos a cada lado de la unión. Los dos extremos son mantenidos juntos durante todo este proceso mediante el complejo enzimático y, de nuevo, puede ocurrir pérdida de la fase correcta si no se añaden nucleótidos en los múltiplos de tres correctos que se requieren para preservar el marco de lectura.

Paso 10 Ligadura y reparación del gen que codifica para cadena pesada. Esto ocurre para los genes que codifican para cadena ligera.

Al describir la recombinación V(D)J, los investigadores deben explicar no sólo el mecanismo de reconocimiento división y ligadura de rss sino también abordar la pregunta de cómo dos rss, situadas a muchos kilobases de distancia una de otra en la secuencia de dna lineal, son llevadas hacia aposición estrecha. Además, una vez que ha ocurrido recombinación exitosa en un alelo de cadena pesada y un alelo de cadena ligera, esta información debe comunicarse al cromosoma homólogo, de modo que otros alelos puedan ser silenciados. ¿Cómo ocurre esto?

Investigación reciente indica que tanto la estructura como la ubicación de dna que codifica para la región V de Ig, activo desde el punto de vista recombinacional, cambia significativamente conforme procede el desarrollo de células B, y que algunos de estos cambios son señalados por alteraciones epigenéticas en la estructura de la cromatina, mediados por reacciones de metilación específicas sobre residuos de histona asociados. El dna cerca de la membrana nuclear (dna pericéntrico) no incluye regiones V activas desde el punto de vista de recombinación; más bien, el dna que pasa por recombinación se aleja de la membrana nuclear, y va hacia el centro del núcleo. La estructura de la cromatina que pasa por recombinación también se altera, de modo que tramos largos de dna son condensados hacia asas que permiten que las secuencias que se están recombinando tengan contacto más cercano entre sí. Una vez que ha ocurrido recombinación exitosa, se ha mostrado que el alelo inactivo migra hacia las regiones pericéntricas. Así, el proceso de recombinación está ocurriendo dentro de un contexto nucleoplasmático que modula de manera activa, y es controlado por enzimas que alteran la estructura de la cromatina, además de las que dividen el dna y lo recombinan.

La recombinación V(D)J puede ocurrir entre segmentos transcritos en la misma dirección o en direcciones opuestas

La secuenciación de fragmentos cromosómicos que contenían múltiples genes que codifican para la región V de anticuerpos mostró que la transcripción de algunos genes que codifican para dicha región ocurre en una dirección opuesta desde la de segmentos D y J torrente abajo. Sin embargo, el trabajo con sustratos de recombinasa artificiales ha demostrado que se usa el mismo mecanismo general de recombinación, independiente de la dirección de la transcripción de los segmentos de gen involucrados. Cuando la recombinación ocurre entre dos segmentos de gen que son transcritos en la misma dirección, el dna interpuesto es eliminado y se pierde (figura 7-9a). Cuando son transcritos en direcciones opuestas, el dna que estuvo situado entre los segmentos V y J es retenido, en una orientación invertida, en el dna torrente arriba de la región vj reordenada (figura 7-9b).

Cinco mecanismos generan la diversidad de anticuerpos en células B vírgenes

Esta descripción del complejo y sofisticado aparato mediante el cual se crean los genes que codifican para Ig, permite entender cómo puede generarse un repertorio de anticuerpos inmensamente diversificado a partir de una cantidad finita de material genético. En resumen, la diversidad del repertorio de bcr virgen es conformada por los mecanismos que siguen:

1. Hay segmentos de gen múltiples en loci de cadena pesada (V, D y J) y de cadena ligera (V y J); éstos pueden combinarse con otro para proporcionar diversidad combinatoria extensa (cuadro 7-4).

2. La adición de nucleótido P se produce cuando la horquilla de dna en la unión codificadora es dividida de manera asimétrica. El rellenado en la pieza de dna monocatenaria que se produce por esta división asimétrica genera una secuencia palindrómica corta.

3. El recorte por exonucleasa ocurre en las uniones vdj y vj, lo que causa pérdida de nucleótidos.

4. La adición de nucleótido N no de plantilla en cadenas pesadas se produce por la actividad de la TdT. Los mecanismos 2, 3 y 4 dan lugar a diversidad extra en las uniones entre segmentos de gen, que contribuye a CDR3.

   Además de estos cuatro mecanismos para generar diversidad de anticuerpos, que operan en segmentos variables de cadena pesada o ligera individuales, la combinación de diferentes pares de cadena pesada y ligera para formar una molécula de anticuerpo completa proporciona oportunidades adicionales para aumentar el número de sitios de combinación de anticuerpos disponibles (cuadro 7-4).

5. Diversidad combinatoria: la misma cadena pesada puede combinarse con diferentes cadenas ligeras, y viceversa.

De estos cinco mecanismos depende la creación del diverso repertorio de bcr y anticuerpos que está disponible para el organismo antes de que haya ocurrido cualquier contacto con agentes patógenos o antígeno. Después de estimulación antigénica, las células B son capaces de usar aún otro mecanismo, singular para el sistema inmunitario, para diversificar y refinar más los receptores y anticuerpos específicos para antígeno: la hipermutación somática. Un complejo enzimático especializado establece como objetivo los genes que codifican para las regiones variables de genes que codifican para Ig sólo en las células que han pasado por activación específica para antígeno en presencia de ayuda de célula T (capítulo 12). Las células B quedan expuestas a ciclos de mutación sucesivos en los loci bcr, seguidos por selección mediada por antígeno en regiones especializadas del ganglio linfático y el bazo. El resultado final de este proceso es que la afinidad promedio de bcr y anticuerpos específicos para antígeno formados al final de una respuesta inmunitaria es considerablemente más alta que en el momento de su instigación; este proceso se denomina maduración de afinidad.

En esta sección se ha descrito el proceso de la generación del repertorio de región variable de IgG primaria como ocurre en seres humanos y roedores. Aunque se aplican los mismos principios a casi todas las especies de vertebrados, diferentes especies han adquirido por evolución sus propias variaciones. Por ejemplo, el proceso de conversión de gen se utiliza en pollos, y algunas especies, como ovejas y vacas, usa hipermutación somática en la generación del repertorio primario, así como del que tiene experiencia con antígeno.

En el recuadro 7-2, Evolución, se describe la evolución de este sistema de receptores de linfocito recombinados, y se aborda la hipótesis actual de que el evento clave fue la introducción del segmento de gen RAG1/2 hacia el genoma de vertebrado temprano como un transposón.

La expresión de un receptor sobre la superficie de una célula B es el resultado final de una serie de eventos complejos y estrechamente regulados. En primer lugar, la célula debe asegurar que los diversos eventos de recombinación de gen culminen en reordenamientos productivos de loci de cadenas tanto pesadas como ligeras. En segundo lugar, sólo un alelo de cadena pesada y uno de cadena ligera debe expresarse en cada célula B. Por último, el receptor debe probarse para asegurar que no se una a antígenos propios, a fin de proteger al huésped contra la generación de una respuesta autoinmunitaria.

La exclusión alélica asegura que cada célula B sólo sintetice una cadena pesada y una cadena ligera

La naturaleza al azar del reordenamiento de gen que codifica para cadena pesada y para cadena ligera significa que en potencia podría expresarse más de un par de cadena pesada y ligera sobre la superficie de células B individuales. Además, puesto que cada cadena pesada podría en potencia combinarse con ambas cadenas ligeras, y viceversa, esto podría dar lugar a la creación de células B que porten diversos sitios de unión a antígeno diferentes. En tanto esta oportunidad para incrementar el número de receptores disponibles inicialmente tal vez suene ventajosa para el organismo, en la práctica la presencia de más de un receptor por cada célula B crea dificultades prohibitivas para los mecanismos que protegen contra la generación de autoinmunidad. El mecanismo mediante el cual las células B aseguran que sólo un alelo de cadena pesada y uno de cadena ligera se transcriba y se traduzca se denomina exclusión alélica.

El reordenamiento de genes Ig ocurre de una manera ordenada, y empieza con recombinación en uno de los dos cromosomas homólogos que portan los loci de cadena pesada. La producción de una cadena pesada completa y su expresión sobre la superficie de célula B conjuntamente con una cadena ligera sustituto, constituida de dos proteínas, VpreB y λ5 (figura 7-10), señala el final del reordenamiento de gen que codifica para cadena pesada y, así, sólo se permite que una cadena pesada de anticuerpo complete el proceso de reordenamiento. Aún se está investigando el mecanismo mediante el cual ocurre esta exclusión alélica. Empero, se sabe que después de ordenamiento exitoso en un alelo, el locus del gen que codifica para V_H en los otros cromosomas es metilado y reclutado hacia la heterocromatina.

Si el primer intento de un reordenamiento de cadena pesada es no productivo (esto es, da lugar a la formación de uniones fuera de marco causadas por la adición de nucleótidos P y N o por recorte por exonucleasa en la unión), se iniciará reordenamiento en el segundo alelo de cadena pesada. Si esto también fracasa, la célula B morirá. Una vez que se expresa una cadena pesada completa, empieza el reordenamiento de cadena ligera. En ratones, el reordenamiento de cadena ligera siempre empieza en uno de los alelos κ, y continúa hasta que se completa un reordenamiento de cadena ligera productivo. En humanos puede empezar en un locus de cadena ligera κ o en uno λ. Dado que es posible que ocurran ordenamientos sucesivos (usando regiones V torrente arriba y regiones J torrente abajo) en el mismo cromosoma que codifica para cadena ligera (véase más adelante) y hay cuatro alelos (2 κ y 2 λ) a partir de los cuales elegir, una vez que una célula B ha sintetizado una cadena pesada completa, en circunstancias normales progresará hacia la madurez. La compleción exitosa de reordenamiento de cadena ligera da lugar a la expresión del bcr sobre la superficie celular y esto señala el final de eventos adicionales de reordenamiento de gen que codifica para receptor Ig (figura 7-11).

El proceso de generación de un juego por completo funcional de células B es costoso en cuanto a energía para el organismo debido a la cantidad de desperdicio involucrada. En promedio, dos de cada tres intentos en el primer locus cromosómico de cadena pesada dará lugar a una cadena pesada reordenada de manera improductiva; sucede lo mismo para el proceso de reordenamiento en el segundo locus de cadena pesada. Por ende, la probabilidad de generar con éxito una cadena pesada funcional es de sólo 1/3 (en el primer alelo) + {2/3 (probabilidad de que el primer reordenamiento haya sido fallido) × 1/3 (probabilidad de que el segundo reordenamiento sea exitoso)} = 0.55 o 55 por ciento.

La edición de receptor de receptores en potencia autorreactivos ocurre en cadenas ligeras

El sistema inmunitario aún puede hacer algunos cambios incluso después de que el receptor completado esté sobre la superficie celular. Si se encuentra que el receptor es autorreactivo, la célula puede intercambiarlo por uno diferente, en un proceso denominado edición de receptor. Puesto que el sitio de unión del receptor contiene elementos de las cadenas tanto pesada como ligera, el cambio de sólo uno de éstos a menudo basta para alterar la especificidad, y se ha mostrado que la edición de receptor de cadena ligera ocurre con bastante frecuencia.

En este proceso, la maquinaria de reordenamiento de dna es reactivada después de que se ha encontrado que el primer receptor completado en la célula B inmadura tiene especificidad autoinmunitaria. Por ejemplo, el reordenamiento inicial de V3 a J3 puede dar lugar a una molécula de receptor de Ig que se une a un antígeno propio (figura 7-12). La célula B entonces puede reordenar un gen que codifica para cadena ligera en el segundo alelo de la cadena κ, puede reordenar un alelo de la cadena λ, o puede editar el reordenamiento de la cadena κ original. Todas estas opciones se han demostrado en diferentes células B. Con todo, el término edición de receptor se refiere al proceso mediante el cual una célula B usa el mismo alelo más de una vez, y emprende un segundo proceso de reordenamiento en el cual un segmento de gen que codifica para región variable torrente arriba del segmento original (en este caso V2) es recombinado con un segmento J torrente abajo de la región J utilizada inicialmente (en este caso, J4).

La desactivación de los segmentos V_H reordenados es menos común. Puesto que el reordenamiento de la región variable de la cadena pesada elimina las rss a ambos lados de las secuencias de la región D, al principio se creyó que era imposible. Aun así, avances recientes han demostrado que hay rss crípticas que pueden ser usadas en la edición de cadena pesada y, así, ocurre cierta medida de edición de receptor de cadena pesada.

La transcripción del gen que codifica para Ig está estrechamente regulada

Los genes que codifican para inmunoglobulina sólo se expresan en células de la línea de linfocitos B y, dentro de esta línea, la expresión de genes Ig está regulada por el desarrollo (capítulo 10). Por ende, el control de la transcripción del gen Ig es necesariamente complejo, aunque comprende el paradigma familiar de factores de transcripción que se unen a elementos de secuencia en el dna (cuadro 7-5 y figura 7-13).

La expresión de los genes que codifican para Ig requiere la coordinación de dos tipos de elementos reguladores cis: promotores y amplificadores o potenciadores (enhancers). Al igual que otros promotores, los promotores del gen que codifica para las cadenas pesada y ligera de Ig contienen una secuencia rica en at, altamente conservada, llamada la secuencia tata, que sirve como el sitio de unión para la rna polimerasa. La rna polimerasa II empieza a transcribir el dna desde el sitio de inicio, alrededor de 25 pares de bases (bp) torrente abajo de la secuencia tata. Cada segmento de gen V_H y V_L tiene un promotor ubicado justo torrente arriba desde su secuencia líder. Los promotores torrente arriba de los segmentos de gen que codifica para V_H y V_L de Ig se unen a la rna polimerasa II bastante débilmente, y la tasa de transcripción de regiones codificadoras de V_H y V_L es muy baja en dna de la línea germinal no reordenado. El reordenamiento de genes que codifican para Ig acerca lo suficiente los promotores a los amplificadores situados en las secuencias intrón y en regiones torrente abajo de los genes que codifican para la región C para que ellos influyan sobre los promotores de la región V. En consecuencia, la tasa de transcripción es aumentada por un factor de 10⁴ en el momento de reordenamiento del gen V.

De cualquier modo, si bien la transcripción de genes no reordenados es baja, no está ausente en células B en desarrollo; la evidencia ahora sugiere que, a medida que los genes que codifican para Ig se mueven hacia afuera de las regiones pericéntricas del núcleo y adoptan configuraciones más eucromáticas antes de la recombinación, ocurre un nivel bajo de transcripción que indica a la maquinaria de recombinación que se encuentran en un estado de preparación para que ocurra reordenamiento.

La agrupación J_κ y cada uno de los genes D del locus de la cadena pesada también están precedidos por promotores. Estos promotores D y J_κ permiten la transcripción transitoria de segmentos dj y J, que parece tener importancia para el reordenamiento vdj eficiente. Hasta ahora no hay evidencia de secuencias promotoras convencionales torrente arriba de cualquiera de los loci J_λ, aunque se ha detectado algo de transcripción de la línea germinal de secuencias J_λ.

El control de la transcripción de gen que codifica para Ig depende de la interacción entre un gran número de factores de transcripción que se unen a las regiones promotora y amplificadora de los genes que codifican para Ig, y la unión de diferentes combinaciones de estas proteínas a promotores y amplificadores puede llevar a resultados muy diferentes. En el capítulo 10 se comenta cómo la transcripción de los genes que codifican para Ig es controlada por medio de combinaciones variables de factores de transcripción durante el desarrollo de células B.

En ocasiones, los poderosos amplificadores de Ig de célula B pueden emprender actividades que no son precisamente muy benignas. La translocación del oncogén c-myc cerca de las regiones amplificadoras de Ig da lugar a la expresión constitutiva de la proteína c-Myc y la generación de un linfoma de células B, altamente proliferativo, agresivo. De manera similar, la translocación del gen bcl-2 cerca del amplificador de Ig da pie a suspensión de la muerte celular programada en células B, lo cual da lugar a linfoma de células B folicular.

Las células B maduras expresan anticuerpos tanto IgM como IgD por medio de un proceso que involucra empalme de mRNA

Como se describió, la misma región variable de cadena pesada de Ig puede expresarse en asociación con más de una región constante de cadena pesada. Además, cada una de las regiones constantes de cadena pesada puede sintetizarse como forma unida a membrana y como forma secretada.

Células B inmaduras en la médula ósea sólo expresan receptores IgM de membrana. No obstante, conforme las células B maduran, también colocan receptores IgD sobre su superficie celular. Estos receptores IgD portan la región V de unión a antígeno idéntica, pero portan una región constante δ, en lugar de una región constante μ. En esta sección se describe cómo las células crean las formas unida a membrana y secretada de IgM e IgD mediante empalme de rna. La generación de anticuerpos que pertenecen a las clases de cadena pesada que no son IgM e IgD ocurre mediante un proceso de recombinación de dna adicional, denominado recombinación de cambio (switch) de clase (csr), y da lugar a la pérdida del dna que codifica para los segmentos de gen μ y δ. La csr se describe en el capítulo 12, porque es un proceso que sólo ocurre después de activación de células B mediada por antígeno.

El transcrito de cadena pesada primario en una célula B que todavía no ha quedado expuesta a antígeno codifica para las regiones constantes tanto Cμ como Cδ, y tiene aproximadamente 15 kb de longitud. La determinación de si una célula sintetizará las formas unida a membrana o secretada de las cadenas pesadas μ, o δ, o ambas, se toma mediante proteínas nucleares que seleccionan elecciones particulares de sitios de poliadenilación, y de empalme de rna. Durante el procesamiento del mRNA, los sitios de poliadenilación emiten señales para la división y la adición de una secuencia poli-A en un sitio particular en el transcrito primario, que entonces se convierte en el 3′ terminal del mRNA maduro, procesado. (Las colas Poli-A se encuentran de manera característica en los 3′ terminales de muchas especies de mRNA eucariontes.) Un complejo nuclear llamado el espliceosoma determina los sitios en los cuales el transcrito primario será dividido y empalmado para formar el mRNA maduro.

En la figura 7-14 se ilustran las elecciones de empalme y poliadenilación que se hacen cuando una célula genera IgM unida a membrana (la única especie de Ig expresada por células B inmaduras) en contraposición con IgD unida a membrana, que es expresada en el momento de maduración de célula B. Estas dos especies se encuentran presentes en la membrana celular antes de encuentro con antígeno.

El análisis del transcrito de Ig primario reveló que el exón Cμ4 (el exón en posición más 3′ de la cadena pesada μ) termina en una secuencia de nucleótidos llamada S (secretada), que codifica para la porción hidrofílica del dominio CH4 de IgM secretada. La porción S de la secuencia de mRNA incluye un sitio de poliadenilación, el sitio de poliadenilación 1. Dos exones adicionales, M1 y M2 (M de membrana), están situados 1.8 kb torrente abajo del 3′ terminal del exón Cμ4. M1 codifica para la región de la cadena pesada que abarca la membrana. M2 codifica para los tres aminoácidos citoplasmáticos en el C terminal de IgM, seguido por el sitio de poliadenilación 2 (figura 7-14a). La producción de mRNA que codifica para la forma unida a membrana de la cadena μ ocurre cuando la división del transcrito primario y la adición de la cola poli-A ocurren en el sitio de poliadenilación 2 (figura 7-14b). A continuación, el empalme de rna elimina la secuencia S en el 3′ terminal del exón Cμ4, y une el resto del exón Cμ4 a los exones M1 y M2. La secuencia de rna entre los exones M1 y M2 también es desempalmada, lo que da lugar a la producción del mRNA que codifica para la forma unida a membrana de la cadena pesada de IgM; éste es el único patrón de empalme que ocurre en células B inmaduras.

Conforme la célula B madura, empieza a expresar IgD unida a membrana además de IgM de membrana (figura 7-14c). Los exones que codifican para las formas unida a membrana y secretada de IgD están dispuestos de modo similar a los de IgM; los sitios de poliadenilación 3 y 4 en los 3′ terminales de las secuencias codifican para las formas secretada y unida a membrana de IgD, respectivamente. Si ocurre poliadenilación en el sitio 4, y el rna que codifica para Cμ es desempalmado, la célula sintetizará la cadena δ unida a membrana, y expresará IgD así como IgM sobre la superficie celular. Dado que las células B maduras portan tanto IgM como IgD sobre su superficie, está claro que ambos patrones de empalme pueden ocurrir de manera simultánea.

Después de estimulación con antígeno, la célula B empieza a generar la forma secretada de IgM (figura 7-15a). La poliadenilación cambia al sitio 1, y las secuencias de mRNA torrente abajo del sitio 1 son degradadas. (De modo similar, el uso del sitio de empalme 3 genera IgD secretada, aunque esto no se muestra en aras de la claridad.) La forma secretada de IgD se utiliza menos a menudo que la forma secretada de las otras clases de cadena pesada de anticuerpo; así, el sitio de empalme 3 se usa relativamente raras veces.

En el ámbito de proteína, el carboxilo terminal de la forma unida a membrana de la cadena μ de Ig consta de una secuencia de alrededor de 40 aminoácidos, que está compuesta de un segmento hidrofílico que se extiende fuera de la célula, un segmento transmembrana hidrofóbico, y un segmento hidrofílico muy corto en el extremo carboxilo que se extiende hacia el citoplasma (figura 7-15b). En la forma secretada, estos 40 aminoácidos son reemplazados por una secuencia hidrofílica de alrededor de 20 aminoácidos en el dominio carboxilo terminal.

¿Qué mecanismo determina cuáles sitios de empalme se utilizan? Esta pregunta no se ha respondido por completo. Sin embargo, la investigación con construcciones artificiales que contienen diferentes combinaciones de los distintos sitios de empalme sugiere que hay una “fuerza” intrínseca para cada uno de los sitios de empalme que determina la frecuencia con la cual se utilizan, y que esta fuerza refleja la afinidad de unión entre la secuencia de dna en el sitio de empalme y el espliceosoma. El análisis de las secuencias de los sitios de empalme en el mRNA que codifica para Ig sugiere que el sitio de empalme 2 es considerablemente “más fuerte” que el sitio de empalme 1, lo cual explica por qué las células B inmaduras sintetizan de manera preponderante la forma de membrana de la cadena μ. La estimulación de células B parece causar un incremento de la concentración de las proteínas de reconocimiento de sitio de empalme, así como la terminación temprana de la transcripción antes de las secuencias M1 y M2, lo que facilita el uso del sitio de empalme 1, y la generación de la forma secretada de la proteína. Un mecanismo similar puede controlar el empalme diferencial de las formas unida a membrana y secretada de la cadena δ.

La caracterización inicial de la molécula de bcr fue facilitada por el hecho de que el producto Ig secretado de la célula B comparte la región de unión a antígeno con el receptor de membrana. Las proteínas Ig secretadas podían usarse como antígenos para generar anticuerpos en otras especies que reconocieron el receptor de superficie de célula B, y estos anticuerpos contra receptor podían emplearse entonces como reactivos para aislar el bcr y caracterizarlo. Además, estuvo disponible un grupo de tumores de células B monoclonales que secretan concentraciones altas de antígenos solubles.

Investigadores que estuvieron intentando purificar el receptor de célula T (tcr) y analizarlo no disfrutaron de esas ventajas y, por ende, no debe sorprender que hayan transcurrido varias décadas entre la caracterización del bcr y la de su homólogo en la célula T. De hecho, la caracterización del tcr fue tan difícil y fastidiosa, que una de las escritoras distinguidas para la revista científica Nature, Miranda Robertson, hizo referencia a ella como “La caza del Snark”, en referencia al poema de Lewis Carroll del mismo nombre, en el que describió la búsqueda de una criatura mítica.

En el capítulo 3 se describió la proteína tcr. A continuación se describe la historia paralela del descubrimiento de los genes que codifican para tcr.

El entendimiento de la estructura proteínica del tcr fue crucial para el proceso del descubrimiento de los genes

En el capítulo 3 se describió cómo los investigadores lograron usar un anticuerpo monoclonal (mAb) específico para el tcr para purificarlo y caracterizarlo como una proteína heterodimérica αβ. Se mostró que cada cadena consta de un dominio de región variable y un dominio de región constante, y ambas cadenas contuvieron regiones dispuestas en el pliegue de Ig característico (figura 7-16). La presencia de estas regiones variable y constante proporcionó indicios respecto al ordenamiento potencial de los genes que codifican para las proteínas tcr, y permitieron a los investigadores diseñar los experimentos que finalmente llevaron a la caracterización de los genes que codifican para tcr.

El gen que codifica para la cadena β se descubrió simultáneamente en dos laboratorios diferentes

En el mismo número de Nature en 1984, dos grupos de investigación diferentes publicaron artículos que describieron el descubrimiento de los genes que codifican para tcr en ratones y humanos, respectivamente. Mark Davis, Stephen Hedrick y colaboradores, utilizaron un método singularmente creativo para aislar los genes que codifican para receptor a partir de varias líneas de células de hibridoma de células T murino, que se describe a continuación. El otro grupo, encabezado por Tak Mak, usó métodos de análisis genético más clásicos para aislar los genes que codifican para tcr desde líneas de células de ser humano.

La estrategia del grupo de Davis-Hedrick se basó en cuatro suposiciones acerca de los genes que codifican para tcr:

• Los genes que codifican para tcr se expresarán en células T pero no en células B.

• Puesto que los genes codifican para un receptor unido a membrana, el mRNA transcrito se encontrará asociado con polirribosomas unidos a membrana.

• Al igual que los genes que codifican para Ig, los genes que codifican para tcr codificarán para una región variable y una región constante.

• Al igual que los genes que codifican para Ig, los genes que codifican para tcr pasarán por reordenamiento en células T.

Experimentos previos habían revelado que sólo alrededor de 2% de los genes expresados por linfocitos difirieron entre células T y B. Además, se había mostrado que sólo una pequeña proporción (aproximadamente 3%) del mRNA de células T está asociado con polirribosomas unidos a membrana. Davis y Hedrick razonaron que si podían generar copias de dna marcado con ³²P (cDNA) de la fracción polirribosomal unida a membrana de mRNA de célula T específico para antígeno, y eliminar de esa población las secuencias que también se expresaron en células B, quedarían con cDNA derivado de células T, marcado, que estaría muy enriquecido en secuencias que codifican para el tcr (figura 7-17).

Por consiguiente, efectuaron los pasos que siguen:

• Extraer mRNA polisomal unido a membrana (secuencias de rna que codifican para proteínas unidas a membrana) desde varias líneas de hibridoma T.

• Efectuar transcripción inversa del mRNA polisomal en presencia de nucleótidos marcados con ³²P, para generar copias de cDNA radiactivo de cada una de las especies de mRNA.

• Mezclar el cDNA de células T marcado con ³²P, con mRNA de célula B, y eliminar todo el cDNA que se hibridó con mRNA de célula B. (Esto deja sólo el mRNA de célula T que codifica para proteínas no expresadas en células B.)

• Recuperar los “cDNA específicos para célula T” y usarlos para identificar clonas de dna que pasan por hibridación a partir de una biblioteca específica de células T.

• Efectuar marcado radiactivo de las clonas que se hibridaron a los cDNA “específicos para célula T”, y usar sondas clonadas individualmente para sondear inmunoelectrotransferencias Southern de dna de células hepáticas y linfomas de células B (que no se esperaría que reordenaran genes que codifican para tcr) y dna proveniente de diferentes hibridomas de células T (que se esperaría que mostraran distintos patrones de reordenamientos en diferentes clonas de células T).

El sondeo con la sonda de cDNA TM90 (parte inferior de la figura 7-17) dio lugar a un patrón de bandas que no varió dependiendo del origen del dna celular. Esto indicó que TM90 reconoce dna que se encuentra en células T, pero no en células B, que no se reordena de diferentes maneras en distintas células y, por ende, que probablemente no es complementario a un gen que codifica para tcr. En contraste, la sonda de cDNA TM86 se hibridó a bandas en el dna de células T de diferentes tamaños que en el dna de células del hígado o de célula B. Además, TM86 mostró patrones de hibridación diferentes en distintos hibridomas de células T, lo que indica que la secuencia reconocida por la sonda TM86 se encuentra en contextos variados dentro del dna de diferentes hibridomas. Note que esta sonda también muestra el mismo patrón de bandas en células hepáticas y células B. Esto es congruente con la noción de que los genes que codifican para el tcr se recombinan en células T, pero no en cualquier otro tipo de célula. Estos resultados indicaron que la sonda de cDNA TM86 estuvo unida a dna que es reordenado de manera específica sólo en células T y, así, lo más probable es que codifique para un gen que codifica para una proteína tcr. De esta manera se aisló el primer gen que codifica para tcr murino.

La comparación de la secuencia de dna de la clona de ser humano de Mak con la secuencia de aminoácidos de un hibridoma de humano confirmó que Davis, Hedrick y colaboradores, así como Mak y colaboradores, habían aislado las formas murina y humana del gen que codifica para tcr β, respectivamente.

Una búsqueda del gen que codifica para la cadena α llevó en lugar de eso al gen que codifica para la cadena γ

El enfoque cambió a partir de entonces a la búsqueda de la cadena α del tcr. Empero, aquí, la inmunología dio uno de sus giros extraños y maravillosos.

En el laboratorio de Tonegawa, esta vez usando el método de hibridación sustractiva del cual fueron pioneros Hedrick y Davis, se logró clonar un gen que al principio pareció tener todas las características del gen que codifica para la cadena α del tcr. Se expresaba en células T, pero no en células B; fue reordenado en clonas de células T, y en la secuenciación reveló regiones que correspondieron a un péptido señal, dos dominios de familia Ig, una región transmembrana, y un péptido citoplasmático corto. Además, el peso molecular predicho de la cadena codificada pareció estar muy cerca del de la proteína de la cadena α. En el laboratorio de Tonegawa inicialmente se sugirió que “si bien queda por producir evidencia directa, es muy probable que pHDS4/203 codifique para la subunidad α del receptor de célula T”.

Con todo, el análisis bioquímico de las proteínas de las cadenas α y β del tcr en otro laboratorio había demostrado con claridad que las cadenas tanto α como β del heterodímero de tcr estaban glucosiladas. Una búsqueda de secuencias potenciales que corresponden a sitios de fijación de carbohidrato sobre la secuencia de cadena α putativa de Tonegawa no dio los resultados esperados; por ende, pareció que el gen que se había aislado en el laboratorio de Tonegawa no era la cadena α, sino algo muy similar. Investigación adicional demostró que ellos habían descubierto un gen que codifica para un receptor hasta entonces desconocido que contenía regiones tanto variable como constante y sólo se recombinaba en células T. Nombraron a este gen (y a la cadena de receptor que codificó) γ.

A continuación, Davis y colegas aislaron una secuencia genómica expresada en células T y no en células B que codificó para una proteína con cuatro sitios de glucosilación enlazados a N potenciales, y un peso molecular congruente con el de la cadena α del tcr. Con los genes que codifican para las cadenas α y β del tcr por completo caracterizados, quienes intentaban entender los aspectos genéticos del tcr quedaron con una serie de preguntas interesantes. ¿La cadena γ era expresada por las mismas células T que expresaron el receptor αβ? ¿La cadena γ que Tonegawa había descubierto también existe como un heterodímero? De ser así, ¿cuál era su pareja, y quién la encontraría primero?

Luego de tres años de investigación, Chien y colegas, que trabajaban en el laboratorio de Davis, describieron un cuarto gen que codifica para tcr, que llamaron δ. Despierta interés que se encontró que el gen que codifica para la cadena V_δ yace torrente abajo de los genes V_α previamente descritos, y justo en posición 5′ a las regiones codificadoras J_αC_α. Se encontró que el reordenamiento de este locus ocurre en etapas muy tempranas de la diferenciación del timo, y la expresión del rna que codifica para la cadena δ corrió parejas con la de la expresión de la cadena γ en subpoblaciones tímicas, que ocurre en las mismas células T. Lo más notable acerca de la ubicación de los genes δ fue la observación de que, si una célula T reordenaba la cadena α, los genes δ interpuestos se perderían (figura 7-18). El estudio de las células T que expresan estos receptores γ,δ demostró que las células T que portan γ,δ representaron un subgrupo de células T por completo nuevo, con un repertorio de antígenos distinto del de células T α,β y con una distribución anatómica diferente dentro del sistema linfoide en el huésped.

Los genes que codifican para tcr pasan por un proceso de reordenamiento muy similar al de los genes que codifican para Ig

En el cuadro 7-6 se muestran las ubicaciones cromosómicas de los genes que codifican para el receptor tcr en ratones y humanos, y en la figura 7-18 se muestra el ordenamiento de los genes que codifican para tcr en el genoma murino. Los cuatro loci de tcr están organizados en la línea germinal de una manera notoriamente similar a la organización multigén de los loci de Ig (figura 7-4), y como en el caso de los genes que codifican para Ig, los genes que codifican para tcr funcionales se producen mediante reordenamientos de segmentos V y J en las familias de cadena α y γ, y entre los segmentos V, D y J en los genes que codifican para las cadenas β y δ.

En el cuadro 7-7 se muestran los números aproximados de diferentes segmentos V, D y J en cada una de las familias de genes que codifican para tcr de ratones y seres humanos. Despierta interés que se ha mostrado que algunos de los segmentos de gen V_α y V_δ se usan en cadenas de tcr tanto α como δ, lo que contribuye más a la diversidad del repertorio de tcr.

El reordenamiento de los genes que codifican para la región variable del tcr sigue el mismo esbozo general que el de los genes que codifican para Ig. Aun así, un punto de contraste es que, mientras que las cadenas ligeras de Ig incorporan pocos nucleótidos N debido a la regulación descendente vinculada con el desarrollo de la expresión de la enzima TdT en células B para el momento de reordenamiento de cadena ligera, se observan nucleótidos N a frecuencias similares en todas las cadenas de tcr.

Los genes variables que codifican para las cadenas α y γ, al igual que el gen que codifica para la cadena ligera de Ig, son generados a partir de un segmento V y uno J. Los genes que codifican para la región variable de las cadenas β y δ del tcr son montados a partir de segmentos V, D y J, como las cadenas pesadas de Ig. De cualquier modo, en contraste con los genes que codifican para Ig, las familias de tcr carecen de un grupo funcionalmente diverso de regiones C. Hay un gen que codifica para la región constante para cada una de las familias de genes α y δ, y si bien hay más de un gen que codifica para cada una de las regiones C_β y C_γ, son altamente homólogos y no parecen diferir en cuanto a función.

Los animales con deficiencia de RAG1/2 o de las otras enzimas que afectan la recombinación del gen que codifica para Ig, como Artemis o TdT, muestran deficiencia similar en la generación tanto de sus bcr como de sus tcr y, así, se cree que las características esenciales de los procesos de reordenamiento son similares en células B y T (recuadro 7-3, Enfoque clínico). Las secuencias de señal de recombinación heptámero-nonámero se encuentran en los 3′ terminales de las secuencias V, los 5′ y 3′ terminales de las secuencias D, y los 5′ terminales de las secuencias J, del mismo modo que para los segmentos de gen que codifican para región variable de Ig.

Recuerde que la regla 12-23 especifica que la recombinación sólo puede ocurrir entre segmentos de gen contiguos en un caso con una rss que contiene un espaciador de 12 (un giro) bp y el otro con una rss que contiene un espaciador de 23 (dos giros) bp (figura 7-5). Con base en esta regla, no se permite la recombinación entre segmentos de gen que codifican para inmunoglobulina V_H y J_H y, por ende, todas las regiones V de cadena pesada reordenadas de manera apropiada deben tener representados los tres segmentos.

En contraste, las regiones D de los genes que codifican para las cadenas β y δ del tcr están limitadas en un lado por un espaciador de 12 bp, y en el otro por un espaciador de 23 bp (figura 7-19). Con base en la regla 12-23, los segmentos V y J de las familias de gen β y δ en teoría pueden recombinarse de manera directa, sin un segmento D interpuesto. Además, la regla también permitiría la recombinación de segmento D-D. ¿Estas recombinaciones poco comunes ocurren in vivo?

En el caso del gen que codifica para la cadena β, la respuesta parece ser que no ocurre. Evidencia obtenida a partir de secuenciación de fragmentos de cDNA que contienen secuencias V, D y J que se conocen con precisión, ha demostrado que los genes que codifican para cadena β de tcr funcionante siempre contienen uno, cada uno, de los segmentos V, D y J. No obstante, la situación no es tan sencilla para los genes que codifican para cadena δ de tcr.

Los científicos notaron que muchos genes que codifican para V_δ de tcr fueron considerablemente más largos que los genes que codifican para V_β de tcr; además, la longitud de secuencia aumentada pareció ocurrir de manera primaria en las partes del gen que codifican para los residuos CDR3 que hacen contacto con antígeno. El análisis subsiguiente mostró que muchos genes que codifican para V_δ de tcr tienen incorporados no uno sino dos segmentos de región D, y este segmento adicional es el responsable primario del incremento observado de la longitud del gen. En algunos genes que codifican para V_δ, se añadió longitud adicional al gen que codifica para la cadena δ de tcr por adición de nucleótido N en la unión D-D.

En contraste con las cifras notorias de diversidad facilitadas por la incorporación de nucleótidos N en todas las cadenas del tcr, los tcr no parecen pasar por hipermutación somática a cualquier tasa apreciable después de contacto con antígeno.

En el cuadro 7-8 se comparan los mecanismos de la generación y la expresión de diversidad en moléculas de bcr en contraposición con tcr.

La expresión de tcr es controlada mediante exclusión alélica

La exclusión alélica ocurre entre genes que codifican para tcr casi con tanta eficiencia como entre genes que codifican para bcr, con una excepción: una fracción de células T porta más de una cadena α de tcr. Sin embargo, sería poco probable, aunque no imposible, que una célula T que porta dos cadenas α fuera capaz de reconocer más de un antígeno, dada la complejidad del reconocimiento de antígeno por células T. En el capítulo 8 se explica cómo las células T reconocen un antígeno constituido de un péptido extraño presentado al sistema inmunitario en un surco especializado en un antígeno del complejo mayor de histocompatibilidad (mhc). Los tcr son probados dos veces dentro del timo a fin de determinar su funcionalidad antes de que las células T sean liberadas hacia la periferia (capítulo 9). En primer lugar, las células T son probadas para asegurar que las cadenas α y β pueden formar pares hacia un tcr funcionante que es capaz de reconocer con afinidad baja a moderada antígenos del mhc propios que portan péptidos propios (selección positiva). Esto es necesario porque la célula T debe tener cierta capacidad mínima para reconocer mhc propio para que sea capaz de unirse a un péptido presentado sobre la superficie del antígeno del mhc. Entonces, las células T que portan receptores que reconocen con afinidad alta péptidos propios en asociación con antígenos del mhc son eliminadas para suprimir la generación de receptores autorreactivos (selección negativa). La probabilidad de que una cadena β de tcr única podría formar pares con más de una cadena α de tcr y satisfacer todos estos criterios estrictos es en extremo baja. La presencia de incluso un tcr αβ capaz de unirse con afinidad alta a antígenos propios daría lugar a la eliminación de la célula, independientemente de la especificidad del receptor formado usando una cadena α alternativa.

Aunque las células B y T usan mecanismos muy similares para reordenamientos de gen que codifica para región variable, el reordenamiento completo de genes que codifican para Ig no ocurre en células T, y el reordenamiento completo de genes que codifican para tcr no ocurre en células B. El sistema de enzima recombinasa no sólo está regulado de manera diferente en cada línea de linfocitos, sino que la cromatina está reconfigurada de manera singular en células B y células T para permitir el acceso a recombinasa sólo a los genes que codifican para receptor de antígeno específico apropiado.

La expresión de gen que codifica para tcr está estrechamente regulada

Como en los loci de Ig, la expresión de genes que codifican para tcr requiere el uso coordinado de promotores y amplificadores transcripcionales que sirven en etapas específicas del desarrollo de células T para hacer a la cromatina receptora abierta y accesible para recombinación (capítulo 9). Las células T empiezan a reordenar el gen β que codifica para tcr en la etapa de pro-célula T. El locus TCR_β murino (figura 7-18) consta de aproximadamente 40 genes V_β situados torrente arriba de dos agrupaciones D_βJ_β separadas. Inmediatamente torrente arriba de cada uno de los dos genes que codifican para D_β hay una región promotora (PD_β1 y PD_β2); estos promotores requieren la actividad de un amplificador único, E_β, situado en el extremo 3′ del locus. La activación del amplificador sirve para facilitar la abertura de la cromatina en todo el locus D_βJ_β, y la activación de cada uno de los dos promotores PD_β localiza el reordenamiento a su propio juego de regiones DJ.

Se han identificado varias proteínas de unión a amplificador de tcr y, al igual que para los genes que codifican para Ig de célula B, algunas de éstas están compartidas entre células de muchos tipos diferentes. Entre las proteínas específicas para célula T figura GATA-3, que se une de una manera específica para secuencia a los elementos amplificadores de los cuatro genes que codifican para tcr. La expresión específica para tejido y específica para etapa de proteínas de unión a amplificador en los loci de tcr ayuda a facilitar la accesibilidad al locus, que a su vez permite los complejos procesos de recombinación y transcripción de los genes que codifican para tcr y, finalmente, expresión de las proteínas tcr en la superficie celular.

• El receptor de antígeno sobre la superficie de una célula B es una Ig con el mismo sitio de unión que el anticuerpo que la progenie de células B finalmente secretará.

• El número de diferentes moléculas de anticuerpo que pueden ser sintetizadas por un ratón o ser humano individual único es vasto: cerca de 10^13-14. Este número se logra mediante asociación combinacional de múltiples segmentos de gen llamados V (variable) y J (de unión), que juntos codifican para la región variable de la cadena ligera de la molécula de Ig, y V, D (diversidad) y J, que codifican para la región variable de la cadena pesada de la molécula de Ig.

• La recombinación V(D)J ocurre en el ámbito del dna, y es catalizada por las enzimas específicas para células linfoides RAG1 y RAG2.

• RAG1 y RAG2 reconocen secuencias de señal de recombinación (rss) que son contiguas con las regiones codificadoras. Las rss constan de una secuencia heptámero y una secuencia nonámero conservadas, separadas por una región espaciadora conservada en longitud, pero no por completo en secuencia. Las regiones espaciadoras tienen una longitud que corresponde a un giro de la doble hélice (espaciador de 12 bp) o dos giros de la doble hélice (espaciador de 23 bp). RAG1/2 cataliza la recombinación entre segmentos limitados por diferentes espaciadores.

• En los sitios de recombinación, la división de horquilla puede ser asimétrica, lo que da lugar a nucleótidos P, y en los genes que codifican para cadena pesada, la adición de nucleótido no de plantilla puede dar lugar a nucleótidos N. La rotura por exonucleasa puede reducir el número de nucleótidos N y P en los productos de gen que codifica para receptor final.

• Las regiones variables de tcr son generadas mediante el mismo mecanismo general. Casi todas las células T tienen receptores del tipo αβ. Las regiones variables de cadenas α están constituidas de segmentos V y J, mientras que las de cadenas β tienen regiones V, D y J. Otras células T tienen receptores γδ. Las regiones variables de cadenas γ, al igual que las de cadenas α, tienen segmentos V y J. Las cadenas δ están codificadas dentro del locus de TCRα, y sus regiones variables están constituidas de segmentos V, D y J. Las cadenas δ, no así las cadenas β, pueden expresar más de una región D por cada cadena.

Sitios web útiles

http://imgt.org Los creadores de este sitio web vigilan la literatura médica para buscar información sobre los números de genes que codifican para Ig y tcr en diversas especies, y actualizan regularmente la información respecto a los números de segmentos de gen que han sido secuenciados. También incluye información sobre otras familias de gen relacionadas con el sistema inmunitario, como el mhc.

http://cellular-immunity.blogspot.com/2007/12/vdjrecombination.html Una explicación clara y breve de la recombinación V(D)J, con enlaces en los que se puede hacer clic.

http://highered.mcgraw-hill.com/sites/0072556781/student_view0/chapter32/animation_quiz_2.html Una animación clara pero sencilla, de la recombinación V(D)J, que ofrece un panorama general del proceso; puede ser útil verlo antes de emprender lectura más detallada. Note que esta animación habla de que hay cinco regiones constantes, en lugar de las ocho a las que se hace referencia en este capítulo; esto se debe a que dos de las clases de cadena pesada —γ y α— pueden dividirse en subclases, que se omiten en esta animación.

http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/A/AgReceptorDiversity.html Una útil revisión de la diversidad de receptor de antígeno con enlaces en los que se puede hacer clic. No debe desecharse por diferencias menores entre este sitio web y este capítulo en los números de segmentos de gen identificados como pertenecientes a familias particulares —estos números se están actualizando constantemente, y varían entre distintos individuos y cepas de animales endogámicos—.

http://biophilessurf.info/immuno.html Una útil colección de bases de datos que se refieren a temas inmunológicos, incluso mutaciones de RAG1 que dan lugar a inmunodeficiencias.

www.ncbi.nlm.nih.gov El sitio del National Center for Biotechnology Information (ncbi) ofrece herramientas de biblioteca, así como muchos recursos de análisis de secuencia, y estructura de proteína (bajo la pestaña “Resources”), pertinentes a la inmunología.

1. Indique si cada una de las afirmaciones que siguen es verdadera o falsa. Si cree que una afirmación es falsa, explique por qué.

   1. En la generación de un gen que codifica para receptor de célula B, segmentos V_κ a veces se unen a segmentos Cλ.

   2. En la generación de un gen que codifica para receptor de célula T, los segmentos V_α a veces se unen a C_δ.

   3. El cambio en el uso de región constante desde IgM hacia IgD está mediado por reordenamientos de dna.

   4. Si bien cada célula B porta dos alelos que codifican para las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, sólo un alelo es expresado.

   5. Al igual que las regiones variables de la cadena pesada del receptor de Ig de la célula B, todos los genes variables que codifican para tcr están codificados en tres segmentos.

2. Explique por qué un segmento V_H no puede unirse directamente con un segmento J_H en el reordenamiento del gen que codifica para cadena pesada.

3. Para cada afirmación incompleta que aparece a continuación, seleccione la(s) frase(s) que complete(n) correctamente la afirmación. Más de una opción puede ser correcta.

   1. La recombinación de segmentos de gen que codifica para Ig sirve para:

      1. Promover la diversificación de Ig

      2. Montar una secuencia codificadora de Ig completa

      3. Permitir cambios de la información de codificación durante la maduración de células B

      4. Aumentar la afinidad de la Ig por anticuerpos

      5. Todas las anteriores

   2. Los genes que codifican para cadenas ligeras κ y λ:

      1. Están situados en el mismo cromosoma

      2. Se asocian con sólo un tipo de cadena pesada

      3. Pueden ser expresados por la misma célula B

      4. Todas las anteriores

      5. Ninguna de las anteriores

   3. La generación de diversidad combinacional dentro de las regiones variables de Ig comprende

      1. Empalme de mRNA

      2. Reordenamiento de dna

      3. Secuencias señal de recombinación

      4. Regla de unión de un giro/dos giros

      5. Sitios de cambio

   4. El mecanismo que permite que se sintetice Ig en forma unida a membrana o secretada es:

      1. Exclusión alélica

      2. Expresión codominante

      3. Recombinación de cambio de clase

      4. La regla de unión de un giro/dos giros

      5. Procesamiento de rna diferencial

   5. Durante la recombinación de V_H de Ig, los procesos que contribuyen a diversidad adicional en la tercera región determinante de complementariedad de regiones variables de Ig incluyen:

      1. Introducción de los segmentos de gen que codifican para D_H hacia el gen V que codifica para cadena pesada

      2. Empalme de mRNA de la forma de membrana de la región C de la cadena constante

      3. División por exonucleasa de los extremos de los segmentos de gen

      4. Adición de nucleótido P

      5. Adición de nucleótido N

4. Se ha dado a usted una línea de células de mieloma murino clonada que secreta IgG con la fórmula molecular γ₂λ₂. Las cadenas tanto pesadas como ligeras en esta línea de células están codificadas por genes derivados del alelo 1 (es decir, el primero de los dos alelos homólogos que codifican para cada tipo de cadena). Indique la(s) forma(s) en la(s) cual(es) cada uno de los genes listados a continuación existiría en esta línea de células, usando los símbolos que siguen: G = forma de la línea germinal; P = forma reordenada de manera productiva; NP = forma reordenada de manera no productiva. Diga la razón de su elección en cada caso.

   1. Alelo de cadena pesada 1

   2. Alelo de cadena pesada 2

   3. Alelo de cadena κ 1

   4. Alelo de cadena κ 2

   5. Alelo de cadena λ 1

   6. Alelo de cadena λ 2

5. Usted ha identificado un linfoma de células B que ha hecho reordenamientos no productivos para ambos alelos de cadena pesada. ¿Cuál es el ordenamiento de su dna que codifica para cadena pesada? ¿Por qué?

6. La adición al azar de nucleótidos por TdT es una estrategia evolutiva que genera mucho desperdicio y que en potencia es riesgosa. Diga por qué puede ser desventajosa para el organismo y por qué, por ende, cree que es suficientemente útil como para haber sido retenida durante la evolución de vertebrados.

7. ¿Hay alguna diferencia en las estrategias genéticas usadas para generar genes V completos en T y bcr?

8. ¿Qué características conocidas del tcr usaron Hedrick, Davis y colegas en su investigación para aislar los genes que codifican para tcr?

9. En la figura que sigue se describe el final de una secuencia de región V y el principio de la secuencia de la región D a la cual está a punto de unirse. Las flechas marcan los puntos de división donde el complejo RAG1/RAG2 hará el corte y donde se dirigirá la recombinación.

   

   1. ¿Se trata de una secuencia de cadena pesada o de cadena ligera? ¿Cómo lo sabe?

   2. ¿Qué estructura de secuencia de dna encontraría usted justo torrente abajo de la secuencia agcatc inmediatamente adyacente al extremo 3′ del segmento V?

   3. Hay una posible estructura de unión vd formada después de recombinación entre estos dos segmentos de gen:

      

      1. ¿Cuál(es) residuo(s) PUEDE(N) ser nucleótido(s) de la región P?

      2. ¿Es posible saber con certeza que este residuo es un nucleótido de la región P?

      3. ¿Cuáles residuos deben haber sido añadidos por TdT y, por ende, deben ser nucleótidos de la región N?

      4. ¿Es posible saber con certeza si un residuo es un nucleótido de la región N?

10. Pregunta de desafío de datos. En la figura 1 del recuadro 7-1, Experimento clásico, se observa el patrón de bandas que el experimento de Hozumi y Tonegawa habría revelado, usando la línea celular que ellos utilizaron. Abajo, se observa un par de geles que representan los resultados de un experimento hipotético efectuado usando el mismo protocolo general. En este experimento hipotético, las sondas corresponden a la región V o la región C. Además, los investigadores usaron una línea de células tumorales diferente y una endonucleasa de restricción diferente.

    

    1. ¿Por qué hay dos bandas de la región C en la mancha de la línea germinal?

    2. ¿Por qué estas dos bandas aún están presentes en la mancha del mieloma, y por qué hay dos bandas reconocidas por la sonda de la región V en la mancha del mieloma?

    3. A partir de este gráfico, ¿emitiría usted la hipótesis de que la célula había alcanzado un ordenamiento exitoso del primer alelo κ? ¿Por qué sí o por qué no?

    4. ¿Cómo probaría su respuesta a la parte c?

1. a) Falso: los segmentos de gen V_κ y C_λ están situados en cromosomas separados, y no pueden ser juntados durante el reordenamiento de gen. b) Cierto. c) Falso. Las células B vírgenes producen un transcrito primario largo que porta la región variable y el mRNA para las regiones constantes tanto μ como δ. El cambio de expresión desde la cadena pesada μ hacia la cadena pesada δ ocurre por empalme de mRNA, no por reordenamiento de dna. El cambio a todas las otras clases de cadena pesada está mediado por reordenamientos de dna. d) Verdadero. e) Falso. En las regiones variables de los genes que codifican para TCR β y δ están codificadas en tres segmentos, análogos a los segmentos V, D y J de la región variable de la cadena pesada de Ig. Las regiones V_α y V_γ están codificadas, cada una, en dos segmentos.

2. Los segmentos de gen V_H y J_H no pueden unirse porque ambos están flanqueados por secuencias de señal de recombinación (rss) que contienen un espaciador de 23 bp (2 vueltas) (figura 7-5b). De acuerdo con la regla de unión una vuelta/dos vueltas, las secuencias de señal que tienen un espaciador de dos vueltas sólo pueden unirse con secuencias de señal que tienen un espaciador de una vuelta (12 bp).

3. a) 1, 2, 3. b) 5. c) 2, 3, 4. d) 5. e) 1, 3, 4, 5.

4. a) P: debe haber ocurrido reordenamiento productivo del alelo de cadena pesada 1 porque la línea celular expresa cadenas pesadas codificadas por este alelo. b) G: la exclusión alélica prohíbe que el segundo alelo de cadena pesada pase por reordenamiento productivo o no productivo. c) np: en ratones, los genes κ se reordenan antes que los genes λ. Dado que la línea celular expresa cadenas ligeras λ, ambos alelos κ deben haber pasado por reordenamiento no productivo, lo que así permite que ocurra reordenamiento del gen λ. d) np: misma razón que la que se dio en c) antes. e) P: debe haber ocurrido reordenamiento productivo del primer alelo de cadena λ porque la línea celular expresa cadenas ligeras λ codificadas por este alelo. f) G: la exclusión alélica prohíbe que el alelo de cadena λ 2 pase por reordenamiento productivo o no productivo (figura 7-11).

5. El dna de la cadena κ debe tener la configuración de línea germinal porque antes de que el dna de la cadena ligera (κ) pueda empezar a reordenarse debe ocurrir un reordenamiento de cadena pesada productivo.

6. La adición al azar de nucleótidos N en las uniones D-J y V-DJ contribuye a la diversidad dentro de las regiones CDR3 de cadenas pesadas, pero este proceso puede dar lugar a un reordenamiento no productivo si no se preserva el marco de lectura de tripleta.

7. Mientras que la adición de región N ocurre en las uniones de regiones variables de cadena pesada, pero no de cadena ligera de Ig, todas las uniones de región variable de tcr pueden incluir nucleótidos de región N. La mutación somática añade diversidad al bcr, después de estimulación con antígeno, pero no contribuye a la diversidad de tcr.

8. Usaron el hecho de que el receptor es una proteína unida a membrana para aislar polisomas unidos a membrana, y usaron el rna asociado con los polisomas para generar sondas de cDNA específicas para genes que codifican para receptor de membrana. Usaron el hecho de que el tcr es expresado en células T pero no en células B para eliminar todos los cDNA que estuvieron expresados en células tanto B como T. Emitieron la hipótesis de que el gen que codifica para el tcr estaría codificado en segmentos que se estaban recombinando, y que el patrón de fragmentos de dna que codifican para los genes que codifican para receptor estarían ordenados de manera diferencial en diferentes clonas de células T.

9. a) Debe ser una cadena pesada porque las cadenas ligeras no tienen regiones D. b) El rss. El heptámero de la secuencia de heptámero-espaciador-nonámero linda de manera directa con el extremo de la región V c) 1). Los nucleótidos de la región P se forman mediante división asimétrica de la horquilla en la unión codificadora antes de ligadura de dna. Los residuos ga en cursivas en la cadena codificadora, y los residuos ct en la cadena no codificadora, podrían haber sido generados mediante ese mecanismo. c) 2). Es imposible saber con certeza que se formaron por adición de nucleótido P, porque podrían simplemente con igual facilidad haber sido insertados al azar mediante TdT. c) 3). Los residuos que se muestran en negritas no tienen lugar de origen en la secuencia original; así, deben haber sido añadidos mediante adición de nucleótidos N. c) 4) Sí, es posible, si no pueden encontrarse nucleótidos correspondientes en la secuencia de la línea germinal, y no podrían explicarse por unión de horquilla asimétrica.

10. a) Las endonucleasas de restricción deben cortar en un sitio dentro de la región constante, así como en sitios torrente arriba y torrente abajo desde ella. b) La recombinación ha ocurrido en sólo uno de los dos alelos. Lo más probable es que las bandas de la línea germinal complementarias a las sondas de la región tanto constante como variable se deriven del otro alelo. c) Dado que las bandas adicionales han permanecido en las mismas posiciones en el gel tanto en el dna de la línea germinal como en el dna de mieloma, parece probable que hubo un reordenamiento exitoso en el primer alelo. d) Yo clonaría y secuenciaría el dna torrente arriba desde la región C_κ de ambos alelos y sondearía la que desplegara un ordenamiento exitoso, aunque la otra todavía estuvo en la configuración de la línea germinal.