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Los timocitos CD4+CD8+ (dp), células pequeñas que no proliferan y que residen en la corteza del timo, son la subpoblación más abundante en el timo; comprende más de 80% de las células. Lo que es más importante, son la primera subpoblación de timocitos que expresan un complejo TCRαβ/CD3 de superficie por completo maduro y, por ende, son los blancos primarios de la selección tímica (figura 9-1). La selección tímica conforma el repertorio de tcr de timocitos dp con base en la afinidad de sus receptores de célula T por los mhc/péptidos que encuentran conforme recorren la corteza tímica.
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¿Por qué es necesaria la selección tímica? La propiedad más distintiva de las células T maduras es que sólo reconocen antígeno extraño combinado con moléculas de mhc propias; sin embargo, tcr generados al azar ciertamente no tendrán afinidad inherente por “antígeno extraño más moléculas de mhc propias”. Podrían simplemente también reconocer combinaciones de mhc/péptido extrañas, lo cual no sería útil, o combinaciones de mhc propio/péptido propio, lo cual podría ser peligroso.
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Se requieren dos procesos de selección distintos:
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Selección positiva, que selecciona para aquellos timocitos que portan receptores capaces de unirse a moléculas de mhc propias, lo que da lugar a restricción a mhc.
Selección negativa, que selecciona contra timocitos que portan receptores de alta afinidad para complejos de mhc/péptido propios, lo que da lugar a autotolerancia.
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Dado que sólo péptidos propios son presentados en el timo, y sólo en asociación con moléculas de mhc propias, estos dos procesos de selección aseguran que los timocitos sobrevivientes expresen tcr que tengan afinidad baja por péptidos propios en mhc propio. Por otro lado, los procesos no aseguran que las células T generadas portarán receptores con afinidad alta por cualquier combinación específica de mhc propio/péptido extraño. La capacidad del sistema inmunitario para mostrar respuesta a un antígeno extraño depende de la probabilidad de que una de los millones de células T que sobreviven a la selección se unirá a una de las muchas combinaciones de mhc/péptido expresadas por una célula presentadora de antígeno que ha procesado proteínas patógenas fuera del timo.
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Casi todos los timocitos dp (~ 98%) nunca satisfacen los criterios de selección, y mueren por apoptosis dentro del timo (figura de Perspectiva general 9-5). La mayor parte de las muertes de timocitos dp (~ 95%) ocurre entre timocitos que fracasan en la selección positiva porque sus receptores no reconocen de manera específica moléculas de mhc propias. Estas células no reciben señales de supervivencia por medio de sus tcr, y mueren mediante un proceso conocido como muerte por abandono. Un pequeño porcentaje de células (2 a 5%) es eliminado por medio de selección negativa. Sólo 2 a 5% de los timocitos dp en realidad sale del timo como células T maduras.
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A continuación se describe brevemente la evidencia experimental para la participación del timo en la restricción a mhc. También se describe lo que se sabe en la actualidad acerca de los procesos de selección positiva y negativa, así como los modelos que se han propuesto para explicar lo que se conoce como “la paradoja tímica”.
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Los timocitos “aprenden” restricción a mhc en el timo
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La evidencia temprana del papel del timo en la selección del repertorio de células T provino de experimentos en ratones quiméricos efectuados por R. M. Zinkernagel y colaboradores. Recuerde que Zinkernagel ganó el Premio Nobel por mostrar que las células T maduras están restringidas a mhc (esto es, para mostrar respuesta necesitan reconocer antígeno en el contexto del mhc de su huésped; véase el Experimento clásico en el capítulo 8). Empero, él y sus colegas tuvieron curiosidad de saber cómo las células T se hicieron tan “restringidas”. Consideraron dos posibilidades: la célula T y la apc simplemente tenían que tener tipos de mhc que coincidieran (esto es, una célula T cepa “A” tenía que ver una célula presentadora de antígeno cepa “A”) o las células T, independientemente de su tipo de mhc propio, “aprendían” el tipo de mhc de su huésped en algún momento durante el desarrollo. Zinkernagel y colegas creyeron que ese aprendizaje podría tener lugar en el timo, el cunero de células T. Para determinar si las células T podrían ser “enseñadas” a reconocer el mhc huésped, extirparon el timo (efectuaron timectomía) e irradiaron ratones (A × B) F1 de modo que no tuvieron sistema inmunitario funcional (figura 9-6). A continuación reconstituyeron las células hematopoyéticas con una administración por vía intravenosa de células F1 de la médula ósea, pero reemplazaron el timo con uno proveniente de un ratón tipo B. (Para estar seguros de que el injerto de timo no contenía células T maduras en absoluto, lo irradiaron antes del trasplante.)
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En este sistema experimental, los progenitores de células T provenientes de la médula ósea (A × B) F1 madurarían dentro de un timo que sólo expresó moléculas de mhc haplotipo B en sus células del estroma. ¿Estas células T (A × B) F1 ahora estarían restringidas a mhc al haplotipo B del timo en el cual se desarrollaron? O bien, puesto que expresaron mhc tanto A como B, ¿serían capaces de reconocer haplotipos de mhc tanto A como B? Para responder esta pregunta, los investigadores infectaron los ratones quiméricos con virus de la coriomeningitis linfocítica (lcmv, el antígeno) y extrajeron las células T esplénicas maduras inmunizadas para ver cuáles células blanco (apc) infectadas por lcmv ellos podían matar. Las probaron contra apc infectadas provenientes de ratones cepa A, cepa B y cepa A × B. Las células T de los ratones quiméricos sólo pudieron lisar células blanco infectadas por lcmv provenientes de ratones cepa B (figura 9-6). De este modo, el haplotipo de mhc del timo en el cual las células T se desarrollan determina su restricción a mhc. Las células T “aprendieron” a cuál haplotipo de mhc están restringidas durante sus primeros días en el timo. Si bien alguna vez se hizo referencia a este proceso como “educación de célula T”, ahora se sabe que es la consecuencia de un proceso de selección brutal.
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Las células T pasan por selecciones positiva y negativa
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En el timo, los timocitos entran en contacto con células epiteliales tímicas que expresan sobre su superficie cifras altas de moléculas de mhc clase I y clase II. Estas moléculas de mhc propias presentan péptidos propios, que típicamente se derivan de proteínas intracelulares o extracelulares que son degradadas en el curso normal del metabolismo celular. Los timocitos dp pasan por selecciones positiva y negativa, dependiendo de las señales que reciben cuando encuentran combinaciones de mhc propio/péptido propio con sus tcr.
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Mientras se trabaja para entender las selecciones negativa y positiva, ayuda imaginarse un modelo temprano que fue propuesto por varios inmunólogos influyentes (figura de Perspectiva general 9-5). Aunque ahora se sabe que algunos aspectos de este modelo son demasiado simplistas, sus principios fundamentales aún son importantes, y proporcionan un marco muy útil para entender la selección tímica. En resumen, puede considerarse que los timocitos dp tienen uno de tres destinos, dependiendo de la afinidad de sus nuevos receptores de célula T para las combinaciones de mhc/péptido propio que encuentran: si sus tcr recién generados no se unen a cualquiera de los mhc/péptidos propios que encuentran sobre células del estroma, morirán por abandono. Si se unen demasiado fuertemente a complejos de mhc/péptido propio que encuentran, serán seleccionados de manera negativa. Si se unen con una afinidad baja, “justo la correcta”, a complejos de mhc/péptido propio, serán seleccionados de manera positiva y madurarán a la etapa de desarrollo positiva única. (También se verá que las células que son seleccionadas de manera positiva en la corteza pasan por una segunda ronda muy importante de selección negativa en la médula, después de compromiso de línea a células CD4+ o CD8+.) Los autores revisan los orígenes del modelo y comentan algunas de las modificaciones que han sido sugeridas por los datos recientes que se muestran a continuación. Véase en el recuadro de Experimento clásico 9-1 la evidencia experimental que apoya este modelo proveniente de los primeros ratones transgénicos tcr.
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Las células del estroma tímico, incluso células epiteliales, macrófagos y células dendríticas, desempeñan funciones esenciales en las selecciones positiva y negativa, y deben formar parte de la visualización de eventos de selección tímica. Los timocitos dp jóvenes se encuentran en íntimo contacto con estas células y “recorren” los mhc/péptidos propios desplegados sobre sus superficies. Cada uno de estos tipos de células tiene la capacidad de expresar cifras altas de proteínas de mhc clase I y clase II, y típicamente tienen prolongaciones extendidas que hacen contacto con muchos timocitos en desarrollo. Algunos también expresan ligandos coestimulatorios, incluso CD80 (B7-1) y CD86 (B7-2). Conforme los timocitos migran por el timo, encuentran múltiples superficies de células del estroma diferentes, y tienen la oportunidad de unirse a muchas combinaciones de mhc/péptido distintas.
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La selección positiva asegura restricción a mhc
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Si un timocito CD4+CD8+ reconoce un complejo de mhc/péptido propio sobre las células epiteliales corticales que recorre, pasará por selección positiva, proceso que induce tanto supervivencia como diferenciación de timocitos dp. Notoriamente, casi ningún timocito recién generado se une exitosamente a los mhc/péptidos que encuentra con sus tcr. No ha generado una combinación TCRαβ funcional, o la combinación no se une con suficiente afinidad a complejos de mhc/péptido. Estas células han “fracasado” en la prueba de selección positiva, y mueren por apoptosis en el transcurso de tres a cuatro días. Se cree que las interacciones de tcr/mhc/péptido propio que inician selección positiva son de intensidad al menos tres veces menor que las interacciones que inician señales de selección negativa (figura 9-7).
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La cascada de señales generada mediante selección positiva de interacciones de tcr todavía no se ha caracterizado por completo. Se sabe que muchas de las moléculas emisoras de señales requeridas para selección positiva también están involucradas en la activación de células T maduras mediada por receptor de célula T (capítulo 3), un evento que, con todo, requiere interacciones de tcr de afinidad más alta. Aún no se entiende por completo cómo las señales de afinidad baja que seleccionan de manera positiva inician maduración a la etapa positivo único, o cómo difieren de las señales que seleccionan de manera negativa, proapoptóticas, que también están mediadas por tcr.
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RECUADRO 9-1
EXPERIMENTO CLÁSICO: La información acerca de selección tímica proveniente de los primeros ratones transgénicos tcr ha pasado la prueba del tiempo
A finales de la década de 1980-1989, Harald von Boehmer y colaboradores publicaron una serie de experimentos trascendentales que proporcionaron evidencia directa y convincente de la influencia de interacciones de receptor de célula T sobre selección positiva y negativa. Reconocieron que para entender cómo funcionaban las selecciones positiva y negativa necesitarían ser capaces de rastrear y comparar el destino de timocitos con especificidades de receptor de célula T definidas. Empero, ¿cómo podría hacerse eso si cada uno de los cientos de millones de timocitos normales expresa un receptor diferente? Los investigadores decidieron desarrollar un sistema en el cual todos los timocitos expresaban un receptor de célula T de especificidad conocida y, así, generaron uno de los primeros ratones transgénicos tcr.
Los animales transgénicos se hacen al inyectar un gen bajo el control de un promotor definido hacia un huevo fecundado (cigoto) (capítulo 20). El gen —de hecho, a menudo muchas copias del gen— será incorporado al azar en el genoma del cigoto. Por ende, el gen estará presente en todas las células del ratón que se desarrollen a partir de ese cigoto; con todo, sólo las células que pueden activar el promotor expresarán el gen.
El equipo de Von Boehmer y colaboradores desarrolló los primeros animales transgénicos tcr al aislar genes que codifican para TCRα y TCRβ por completo reordenados de una línea de células T CD8+ maduras que se sabía que era específica para un antígeno expresado sólo en ratones macho (el antígeno “H-Y”) en el contexto de moléculas de mhc clase I H-2Db (figura 1). Generaron una construcción genética que incluyó ambos genes reordenados bajo el control de un promotor específico para célula T, e inyectaron esto en un cigoto de ratón. Puesto que los transgenes que codifican para receptor ya estaban reordenados, otros reordenamientos de gen que codifica para tcr se suprimieron en los ratones transgénicos (el fenómeno de exclusión alélica; véanse el texto y el capítulo 7). Por ende, un porcentaje muy alto de los timocitos en los ratones transgénicos expresó la combinación TCRαβ específica para el H-Y/H-2Db. (Resulta ser que no todos los timocitos expresaron esta combinación de tcr. ¿Por qué no? Recuerde que la exclusión alélica no opera bien para el locus TCRα en particular.)
La elección de especificidades hecha por el equipo fue muy inteligente. Dado que todos los timocitos expresaron una especificidad de tcr de antígeno anti-macho, los investigadores pudieron comparar directamente el fenotipo de timocitos autorreactivos y timocitos no autorreactivos simplemente al comparar ratones machos y hembras en la misma camada. Dado que la restricción a mhc del tcr se conocía, también pudieron observar la influencia del haplotipo de mhc sobre el desarrollo de timocitos simplemente al cruzar los ratones a otras cepas endogámicas.
En la figura 1 se muestran los resultados de una comparación de fenotipo CD4+ en contraposición con CD8+ entre timocitos en ratones machos en contraposición con hembras H-2Db. Los datos primarios provenientes de una de las primeras publicaciones se muestran en la figura 2, y describen datos de citometría de flujo de la expresión de CD4 y CD8 de timocitos. En la figura 2a se muestra el perfil de citometría de flujo (capítulo 20) de un timo natural típico, y puede usarse para comparación. En este perfil, el estado de expresión de CD8 de una célula se muestra en el eje X, y el estado de expresión de CD4 en el eje Y. Los datos están cuantificados en la esquina superior derecha del perfil. Como puede observarse, más de 80% de los timocitos normales son dp, 10 a 15% son CD4 positivo único, 3 a 5% son células CD8 positivo único, y sólo un pequeño porcentaje de células es dn. ¿En qué difieren los fenotipos CD4 en contraposición con CD8 de ratones transgénicos TCR H-Y machos y hembras (figura 2b), y qué dice esto al lector?
Los timocitos en ratones hembra se encuentran en todas las etapas de desarrollo: dn, dp y sp. De hecho, parecen tener una abundancia de timocitos sp CD8+ maduros. Más adelante se retomará esto. Aun así, los ratones machos tienen pocos timocitos dp transgénicos tcr anti-H-Y, si es que tienen alguno. Estos datos muestran que en un ambiente donde los timocitos dp son expuestos al antígeno para el cual son específicos (en este caso el antígeno H-Y de macho), son eliminados. Este resultado fue por completo congruente con el concepto de selección negativa, y mostró que las células autorreactivas fueron eliminadas del repertorio en desarrollo, quizá en la etapa dp. De cualquier modo, los ratones ofrecieron información acerca de muchos más aspectos de la selección tímica.
La evidencia para el papel de interacciones de tcr en la selección positiva, por ejemplo, provino de un experimento diferente en el cual los investigadores preguntaron qué sucedería si el elemento que produce restricción “correcto”, H-2Db, no estuvo presente en el ratón. Para hacer esto efectuaron retrocruzamientos de sus ratones transgénicos tcr con ratones que expresaron un haplotipo H-2 diferente, un ratón H-2Dd (los lectores que deseen repasar sus conocimientos sobre genética, pueden determinar cuáles cruzamientos habrían hecho para hacer esto, e incluir un plan para evaluar el genotipo de los ratones.) En la figura 2c se muestra que el fenotipo CD4 en contraposición con CD8 de timocitos transgénicos tcr H-Y provenientes de ratones H-2Db/d hembra y ratones H-2Dd. ¿Qué encontraron?
Las hembras H-2Dd no tuvieron células T maduras, lo que indica que en ausencia del haplotipo de mhc al cual el tcr fue restringido, los timocitos no pudieron madurar más allá de la etapa dp. Estos datos proporcionaron evidencia directa para la necesidad de una interacción tcr/mhc propio para que ocurra maduración de timocitos (selección positiva).
Estos experimentos “simples” también revelaron una tercera característica del desarrollo tímico, e iniciaron una controversia que continúa hasta la actualidad. Es necesario volver a la figura 2b y echar un vistazo a los datos sobre los ratones hembra. A diferencia de los timocitos naturales, que típicamente incluyen 3 a 5% de células T CD8+, 46% de los timocitos en desarrollo en los ratones transgénicos tcr contra H-Y fueron células CD8+ maduras. ¿Qué significó esto? Recuerde que la línea de células T de la cual provinieron los genes que codifican para tcr originalmente fue una línea de células T CD8+, restringida a mhc clase I (H-2Db). Estos datos mostraron que la especificidad de restricción a mhc del tcr (en este caso, una restricción para clase I) influyó sobre su elección de línea CD4 en contraposición con CD8. En otras palabras, los resultados sugirieron que los timocitos con tcr nuevos que se unieron de preferencia a clase II se convertirían en células T maduras sp CD4+, y que los timocitos con tcr que se unieron de preferencia a clase I se desarrollarían hacia células T maduras sp CD8+.
Las conclusiones fundamentales de este ahora clásico grupo de experimentos han resistido la prueba del tiempo, y han sido apoyadas por muchos experimentos diferentes, igual de ingeniosos: 1) La selección negativa de células autorreactivas da lugar a su eliminación en la etapa dp y más allá. (Tiene importancia notar que más tarde quedó claro que el promotor que impulsa estos primeros transgenes que codifican para tcr H-Y permitió expresión del tcr más temprana que lo normal, lo que dio lugar a la eliminación de células autorreactivas a un punto en el desarrollo más temprano que el habitual. Los experimentos ahora indican que la selección negativa por deleción clonal típicamente ocurre después de selección positiva conforme las células transitan entre las etapas de desarrollo dp y sp.) 2) La selección positiva involucra una interacción de baja afinidad entre interacciones entre el tcr de timocitos y mhc/péptido propios. 3) El compromiso hacia la línea CD4 en contraposición con CD8 está determinado por la preferencia del tcr por mhc clase I en contraposición con clase II. La manera en que sucede este último evento persiste como un tema de intensa controversia (véase el texto).
Von Boehmer, H., H. Teh, y P. Kisielow. 1989. The thymus selects the useful, neglects the useless and destroys the harmful. Immunology Today 10:57-61.
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¿Cuál es el valor adaptativo de la selección positiva? ¿Por qué el humano no adquirió por evolución un sistema que seleccione de manera negativa pero que deje el repertorio de receptores de célula T por lo demás intacto? Algunos han sugerido que la reducción del repertorio es importante para aumentar la eficiencia de la selección negativa, así como para incrementar la eficiencia de las respuestas de células T periféricas. Sin selección positiva, el sistema sería abarrotado con muchas células que tienen pocas probabilidades de reconocer algo, y reduciría la probabilidad de que una célula T encuentre “su” antígeno en un periodo razonable. Ésta es una especulación razonable; aun así, la selección positiva también ofrece ventajas más sutiles que a menudo han inspirado debates en el campo.
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La selección negativa (tolerancia central) asegura la autotolerancia
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Los timocitos CD4+CD8+ autorreactivos con receptores de afinidad alta por combinaciones de mhc propio/péptido propio son en potencia peligrosos para un organismo, y muchos son muertos mediante selección negativa en el timo. De hecho, los errores en el proceso de selección negativa son la causa de muchos trastornos autoinmunitarios, entre ellos diabetes tipo 1 (véase Enfoque clínico). La selección negativa es definida ampliamente como cualquier proceso que se deshace de un repertorio de clonas autorreactivas y del cual depende la tolerancia central. Es probable que casi toda la selección negativa ocurra por medio de un proceso conocido como deleción clonal, en el cual interacciones de tcr de alta afinidad inducen de manera directa señales apoptóticas.
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La deleción clonal de timocitos dp parece estar mediada de manera óptima por las mismas células (apc) y las mismas interacciones (unión de tcr de alta afinidad junto con señales coestimuladoras) que activan células T maduras. La razón por la cual señales de tcr fuertes dan lugar a muerte de células T inmaduras, pero proliferación y diferenciación de células T maduras (figura 9-4c) persiste como un área activa de investigación.
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Las células dendríticas y los macrófagos tímicos, que se encuentran en múltiples áreas del timo, claramente tienen las características ideales para mediar selección negativa, pero es interesante que también las tienen las células epiteliales medulares, que expresan cifras altas de los ligandos coestimuladores CD80 y CD86, así como un factor de transcripción único que les permite presentar antígenos específicos para tejido (véase más adelante). Por ende, tanto la corteza como la médula tienen el potencial de inducir selección negativa.
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¿El ser humano elimina timocitos reactivos a antígenos específicos para tejido?
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Ya se comentó que las moléculas de mhc pueden presentar péptidos derivados de proteínas tanto endógenas como exógenas sobre la superficie de células presentadoras de antígeno (capítulo 8). De cualquier modo, sólo una fracción de tipos de célula —timocitos, células del estroma, macrófagos y otras células presentadoras de antígeno— reside en el timo, de modo que se esperaría que estas células sólo produjeran un subgrupo de las proteínas codificadas en el genoma. Entonces, ¿cómo puede el timo posiblemente deshacerse de células T en desarrollo que son autorreactivas a antígenos específicos para tejido, por ejemplo, proteínas específicas para el cerebro, el hígado, los riñones o el páncreas?
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Esta pregunta tuvo en jaque a los inmunólogos durante mucho tiempo. Durante un periodo, los inmunólogos supusieron que otros mecanismos de tolerancia en la periferia se encargaban de la autorreactividad a proteínas específicas para tejido, pero investigaciones realizadas al final de la década de 1990-1999 sorprendieron a todos, y revelaron que el timo tenía una extraordinaria capacidad para expresar proteínas de todo el cuerpo y presentarlas. Bruno Kyewski y colegas mostraron que esta capacidad era una característica singular de células epiteliales de la médula del timo. Diane Mathis, Cristoph Benoist y sus colegas mostraron que algunas células epiteliales medulares expresan una proteína singular, aire, que permite a las células expresar, procesar y presentar proteínas que en circunstancias ordinarias sólo se encuentran en órganos específicos. Este grupo descubrió la aire mientras estaba estudiando la base molecular para la autoinmunidad al examinar enfermedad humana. Rastrearon al gen que codifica para aire una mutación que causó síndrome de poliendocrinopatía autoinmunitaria 1 (APS1, de otro modo conocido como apeced; capítulo 18), y lo llamaron aire, que significa “regulador autoinmunitario”. El título del artículo que anunció su descubrimiento, “Proyección de una sombra propia inmunológica dentro del timo por la proteína aire” (“Projection of an Immunological Self Shadow within the Thymus by the AIRE Protein”), describe muy bien la función poderosa de la aire.
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RECUADRO 9-2
ENFOQUE CLÍNICO: ¿De qué modo las células T que causan diabetes tipo 1 escapan a la selección negativa?
Se tiene una apreciación extensa del dolor causado por enfermedad autoinmunitaria y su progresión clínica, pero si bien también se ha logrado entender más a fondo los mecanismos que están detrás de la tolerancia inmunitaria, aún se sabe poco acerca de los orígenes precisos de trastornos autoinmunitarios. Indiscutiblemente, la causa primaria de la enfermedad autoinmunitaria es el escape de linfocitos autorreactivos —células B, células T, o ambas— de la selección negativa. Sorprende lo poco que se sabe acerca de las razones de este escape, o la especificidad y el fenotipo de las células que escapan, que causan incluso los trastornos mejor caracterizados, entre ellos la diabetes tipo 1 (T1D), esclerosis múltiple (ms), artritis reumatoide (ra) y lupus eritematoso sistémico (sle).
Investigación reciente en una cepa de ratón, el ratón diabético no obeso o nod, que es notoriamente susceptible a diabetes tipo 1, ha aclarado las características de las células T autorreactivas que causan la enfermedad, y revelado algunas razones interesantes para su escape desde tolerancia central. La T1D es una enfermedad autoinmunitaria mediada por células T, causada por células T que matan células β de los islotes productores de insulina en el páncreas. Muchas de las células T autorreactivas en realidad reconocen un péptido específico de la proteína insulina misma.
Cuando Emil Unanue y colegas examinaron la especificidad fina de células T que habían infiltrado las células de los islotes en ratones propensos a diabetes, encontraron dos tipos de células: células T que podían mostrar respuesta al péptido insulina que se generó por medio de vías de procesamiento de mhc clase II intracelulares por células dendríticas (células T “tipo A”), y una población inesperada de células T que mostró respuesta al péptido insulina sólo si fue añadido de manera exógena a las moléculas de mhc clase II sobre células dendríticas (células T “tipo B”). Los investigadores especulan que la combinación de mhc/péptido insulina procesado de manera endógena y el complejo de mhc/péptido insulina formado de modo exógeno difieren en cuanto a conformación y, por ende, activan diferentes especificidades de receptor de célula T.
Lo que tal vez es más importante, estas observaciones sugieren una razón simple y precisa para el escape de células T autorreactivas desde el timo. Las células dendríticas en el páncreas, pero no en otros tejidos, parecen tener capacidad singular para formar mhc clase II/péptido insulina a partir de fuentes exógenas, probablemente porque están en un ambiente repleto de insulina extracelular secretada por las células β de los islotes. Las células epiteliales o las células dendríticas de la médula del timo carecerían de esta capacidad y, por ende, las células T “tipo B” se escurrirían por el proceso de selección negativa en el timo.
La razón por la cual células T “tipo A” también escapan es menos clara. Son autorreactivas a complejos de insulina/mhc clase II procesados de manera más convencional, que está claro que se encuentran presentes sobre células medulares del timo. ¿Quizá las células tipo A expresaron demasiado poca afinidad por péptidos insulina/mhc clase II en el timo, pero fueron inspiradas por las cifras altas de insulina y señales inflamatorias en un islote diabético? ¿Tal vez escaparon a la selección negativa porque la magnitud de expresión de péptido insulina sobre el epitelio medular fue demasiado baja en la cepa de ratón nod? De hecho, datos recientes que provienen tanto de ratones como de humanos sugieren que la magnitud de expresión de insulina influye de manera significativa sobre la progresión de la enfermedad y la eficiencia de la selección negativa en el timo.
Como es de entenderse, casi todas las terapias actuales para enfermedad autoinmunitaria se enfocan en inhibir la causa secundaria pero más proximal de dicha enfermedad: la activación periférica de células T y B autorreactivas que escaparon a la selección negativa. No obstante, al definir las razones moleculares para el escape de linfocitos autorreactivos, quizá finalmente se encuentre una manera de crear métodos terapéuticos para corregir también defectos de selección negativa.
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El mecanismo de acción de la aire aún se está investigando. Tiene características clásicas de un factor de transcripción, y tal vez forme parte de un complejo transcripcional que facilita la expresión de genes específicos para tejido al regular no sólo la traducción, sino también el empaque de cromatina. Así, permite que células epiteliales medulares expresen proteínas que en circunstancias ordinarias no se encuentran en el timo, las procesen, y las presenten en moléculas de mhc. Esto es en particular útil para la presentación de péptidos de mhc clase I y la selección negativa de timocitos CD8+. No obstante, también se cree que células dendríticas y macrófagos vecinos fagocitan células epiteliales medulares y, así, después pueden presentar su contenido proteínico en moléculas de mhc clase II, y mediar selección negativa de timocitos CD4+ (figura de Perspectiva general 9-5).
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Otros mecanismos de tolerancia central
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Se han propuesto otros mecanismos de selección negativa tímica (tolerancia central) que no necesariamente involucran muerte celular; comprenden: paro clonal, en el cual se evita la maduración de los timocitos que expresan receptores de célula T autorreactivos; anergia clonal, en la cual las células autorreactivas son desactivadas, más que eliminadas, y edición clonal, en la cual se da a células autorreactivas una segunda o tercera oportunidad para reordenar un gen que codifica para TCRα. Cada uno de estos mecanismos tiene cierto apoyo experimental, pero la deleción clonal probablemente es el mecanismo más común del cual depende la selección negativa tímica. La generación de células T reguladoras a partir de timocitos autorreactivos ciertamente puede considerarse importante entre los mecanismos de tolerancia central (véase más adelante).
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Los superantígenos, proteínas virales o bacterianas que se unen de manera simultánea al dominio Vβ de un receptor de célula T, y a la cadena α de una molécula de mhc clase II (fuera del surco de unión a péptido), pueden inducir activación de todas las células T que expresan esa familia particular de cadenas Vβ (figura 11-5). Los superantígenos también son expresados en el timo de ratones y seres humanos, e influyen sobre la maduración de timocitos. Puesto que imitan interacciones con tcr de alta afinidad, los superantígenos inducirán la selección negativa de todos los timocitos dp cuyos receptores posean dominios Vβ establecidos como objetivo por el superantígeno. Sin embargo, dado que el ser humano genera continuamente células T con un amplio rango de especificidades de receptor de célula T, esta pérdida no parece tener consecuencias clínicas importantes.
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La paradoja de la selección: ¿por qué el humano no elimina todas las células que selecciona de manera positiva?
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El entendimiento completo del proceso de selecciones positiva y negativa requiere una apreciación de la paradoja que sigue: si la selección positiva permite que sólo timocitos reactivos con moléculas de mhc propias sobrevivan, y la selección negativa elimina timocitos reactivos con mhc propio, ¿por qué se permite a cualesquier células T que maduren? Otros factores deben operar para evitar que estos dos procesos dependientes de mhc eliminen el repertorio completo de células T restringidas a mhc.
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El modelo más sencillo propuesto para explicar la paradoja de las selecciones positiva y negativa dependientes de mhc es la hipótesis de la afinidad,* que afirma que diferencias de la fuerza de señales mediadas por tcr recibidas por timocitos que están pasando por selecciones positiva y negativa determinan el resultado de la interacción. Los timocitos doble positivo que reciben señales de afinidad baja se seleccionarían de manera positiva, los que recibieron señales de afinidad alta (autorreactivos) serían seleccionados de modo negativo, y los que no recibieron señal en absoluto morirían por abandono (figura 9-7 y figura de Perspectiva general 9-5).
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El ratón transgénico tcr B OT-I, desarrollado por Kristin Hogquist y colaboradores, es un excelente modelo para el estudio de la selección tímica usando tcr y mhc/péptidos con afinidades conocidas. No sólo su especificidad de péptido/mhc se conoce con precisión (se une a un péptido de ovoalbúmina de pollo en el contexto de la molécula de mhc clase I H-2Kb), sino que también se ha definido su afinidad por un rango de péptidos que varían en secuencia. Para determinar la influencia de la afinidad sobre el desarrollo de células T, los investigadores también aprovecharon otras dos herramientas inmunológicas: 1) el sistema de cultivo de órgano tímico fetal (ftoc), en el cual es posible dar seguimiento al desarrollo del timo in vitro (figura 9-8a), y 2) ratones con defectos en el procesamiento de antígeno por mhc clase I. Hay varias mutaciones que llevan a presentación defectuosa por mhc clase I. En la figura 9-8b se describe un esquema experimental en que se usa el ratón con deleción (knockout) de TAP-1 (TAP-1–), un ratón mutante en el cual los péptidos recién generados no pueden tener acceso a moléculas de mhc clase I recién generadas (capítulo 8). Estos ratones no pueden cargar sus mhc clase I con péptidos endógenos; son expresados sobre la superficie celular, pero están “vacíos” y no mantienen su forma. Empero, pueden ser cargados con péptidos exógenos, que estabilizan su conformación. En consecuencia, al incubar con péptidos de elección órganos tímicos fetales provenientes de estos ratones mutantes, los investigadores lograron controlar el tipo de péptido presentado por el mhc clase I.
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¿Qué encontraron los investigadores? Como era de esperarse, los cultivos de órgano tímico fetal OT-I+/TAP-1+ produjeron más células CD8+ que el ftoc natural. Esto se debe a que casi todos sus timocitos expresaron un receptor que se unió a la diversidad de complejos de mhc clase I (H-2Kb)/péptido propio expresados por el estroma normal con afinidad intermedia, lo que genera una señal que da lugar a selección positiva (recuadro 9-1, Experimento clásico). Asimismo, como era de esperarse, las células T maduras CD8+ no se desarrollaron en cultivos de órgano tímico OT-I+/TAP-1– porque no hubo mhc clase I normal y, por ende, no hubo señal de tcr —una falla de selección positiva, que da lugar a muerte por abandono (figura 9-8b, hilera superior)—. Con todo, cuando se añadió un péptido de baja afinidad al cultivo de OT-I+/TAP-1–, el mhc clase I pudo cargarse a sí mismo con péptido y adoptó una conformación normal (figura 9-8b, hilera de en medio). Ocurrió selección positiva, y las células T CD8+ se desarrollaron exitosamente. La adición de péptidos de alta afinidad indujo una fuerte señal de tcr y selección negativa, lo que dio lugar a la deleción de células dp en cultivos de órgano tímico OT-I+/TAP-1– (figura 9-8b, hilera inferior). Despierta interés que concentraciones bajas de péptido de alta afinidad también indujeron selección positiva, aunque las células que se desarrollaron no fueron por completo funcionales. Estos resultados y muchos otros proporcionaron apoyo claro para el modelo de afinidad, al mostrar que la fuerza de la interacción TCR/MHC/péptido de hecho influye sobre el destino de la célula.
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El sistema OT-I también se ha usado para estimar el rango de afinidades de tcr que definen resultados de la selección positiva en contraposición con negativa. Pareciera ser que ocurre selección negativa a afinidades que son tres veces más altas que las que inducen selección positiva.
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Un modelo alternativo puede explicar la paradoja de la selección tímica
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Philippa Marrack, John Kappler y sus colegas ofrecieron inteligentemente una posibilidad alternativa para explicar la “paradoja tímica”, es decir, por qué no se seleccionan de manera negativa todas las células que se seleccionan de manera positiva. Estos investigadores propusieron el modelo del péptido alterado, una sugerencia de que el epitelio cortical, que induce selección positiva, sintetiza péptidos que son singulares y distintos de péptidos sintetizados por todas las otras células, incluso las células tímicas que inducen selección negativa. Así, los timocitos seleccionados con base en estos complejos de péptido/mhc singulares no serían seleccionados de manera negativa cuando pasan por la médula y por otras células que efectúan selección negativa.
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Experimentos iniciales no apoyaron este modelo; aun así, avances en la capacidad para analizar con detalle péptidos presentados sobre superficies celulares sugieren que el modelo tiene mérito. Las células epiteliales corticales de hecho pueden procesar péptidos de manera diferente, y es probable que presenten una gama distinta de péptidos a células T en desarrollo. Recuérdese que los péptidos son procesados dentro de la célula mediante varios mecanismos, entre ellos la actividad del proteosoma (figura 8-16). Parece ser que los componentes del proteosoma expresados por células epiteliales corticales (el “timoproteasoma”) son singulares. El epitelio tímico también puede expresar versiones singulares de proteasas (p. ej., catepsinas).
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Los modelos del péptido alterado y de la afinidad de ningún modo son mutuamente excluyentes. Las investigaciones establecen con firmeza que la afinidad desempeña un papel importante en la distinción entre selecciones positiva y negativa. El hecho de que la corteza también puede generar péptidos nuevos simplemente subraya la posibilidad de que el timo ha adquirido por evolución múltiples maneras de asegurar que el ser humano sería capaz de generar un fondo común suficientemente grande de células T con especificidades diversas.
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¿Las selecciones positiva y negativa ocurren en la misma etapa de desarrollo, o en secuencia?
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Estrictamente interpretado, el modelo de la afinidad supone que las selecciones positiva y negativa operan sobre exactamente la misma población blanco (timocitos dp) y en el mismo microambiente del timo (la corteza tímica). Si bien está claro que los timocitos pasan por selección positiva en la corteza, como se mencionó, la médula es el sitio de selección negativa para antígenos específicos para tejido. Esta compartimentación de la función sugiere que algunos timocitos son seleccionados de manera positiva e inician un programa de maduración antes de la selección negativa. El hecho de que esto puede suceder es apoyado por observaciones que muestran que timocitos “semimaduros” —los que han sido seleccionados de manera positiva y están en transición desde las etapas dp a sp— son excelentes blancos para selección negativa.
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Lo más probable es que los timocitos puedan ser seleccionados de manera negativa en más de un punto del desarrollo (lo que se ilustra en la figura de Perspectiva general 9-5). Los timocitos que se unen con alta afinidad conforme pasan por complejos de mhc/péptido en la corteza son seleccionados de manera negativa, y los que reciben señales de selección positiva reciben autorización no sólo para madurar, sino para migrar al límite entre la médula y la corteza, y finalmente hacia la médula. En la médula, los timocitos semimaduros pueden quedar sujetos de nuevo a selección negativa si interactúan con afinidad alta a antígenos específicos para tejido.
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Ahora se sabe que la migración a la médula de timocitos seleccionados de manera positiva es dependiente de la expresión del receptor de quimiocina CCR7: los timocitos con deficiencia de CCR7 no entran a la médula. Despierta interés que aún maduran y son exportados a la periferia, pero ahí causan autoinmunidad —una observación que, de nuevo, subraya la importancia fundamental de la médula en la eliminación de células autorreactivas del repertorio de células T—.