Capítulo 9: Desarrollo de células T

Las células T inician la respuesta inmunitaria adaptativa al interactuar, por medio de sus receptores de célula T, con complejos de mhc/péptido sobre células presentadoras de antígeno que han quedado expuestas a agentes patógenos. El rango de agentes patógenos a los cuales el ser humano queda expuesto es considerable, y los vertebrados han adquirido por evolución un extraordinario mecanismo para generar un rango comparable de especificidades de receptor de célula T (y de célula B) (capítulo 7). Cada uno de los varios millones de células T que circulan en el organismo expresa un receptor de célula T distinto. La generación de esta población diversa, con su repertorio de receptores diverso, tiene lugar en el timo, un órgano que se requiere para el desarrollo de células T, y que está dedicado a dicho desarrollo. Las células inmaduras que entran al timo provenientes de la médula ósea no expresan características de linfocito maduro, y no expresan receptores de antígeno; los que salen del timo son células T maduras que son diversas en sus especificidades de receptor, y son tolerantes a lo propio y están restringidas a mhc propio.

¿De qué modo el ser humano genera un grupo de células T autorrestringidas y autotolerantes tan diverso? Esta pregunta ha interesado a los inmunólogos durante décadas, y ha inspirado y requerido mucha ingeniosidad experimental. La innovación ha dado dividendos y, si bien el entendimiento no es integral, ahora se tiene una apreciación fundamental de las notorias estrategias que utiliza el timo, el cunero de células T inmaduras o timocitos, para producir un repertorio de células T funcional, seguro y útil.

En este capítulo se describen estas estrategias y se divide el desarrollo de células T en dos agrupaciones de eventos: desarrollo de timocitos temprano, durante el cual se genera una población sorprendentemente diversa de células T inmaduras tcr⁺, y eventos de selección que dependen de interacciones de tcr para conformar esta población de modo que sólo las células que estén restringidas a lo propio y que sean tolerantes a lo propio saldrán para poblar la periferia (figura 9-1, Perspectiva general). El desarrollo temprano de timocito es independiente de receptor de célula T, y lleva a células a través de etapas CD4^–CD8^– (doble negativo, dn) no comprometidas hasta la etapa CD4⁺CD8⁺ (doble positivo, dp) que expresa receptor de célula T. Los eventos específicos en esta etapa temprana comprenden:

1. compromiso de precursores hematopoyéticos a la línea de células T.

2. el inicio de reordenamientos de gen que codifica para receptor de antígeno, y

3. la selección y expansión de células que han reordenado exitosamente uno de sus genes que codifican para receptor de célula T (selección β).

La segunda fase del desarrollo de células T depende en su mayor parte de interacciones con receptor de células T, y conduce a las células a la madurez desde las etapas CD4⁺CD8⁺ hasta la etapa CD4⁺ o CD8⁺ positivo único (sp). Los eventos en esta última fase de desarrollo comprenden:

1. selección positiva, selección para las células cuyos receptores de célula T muestran respuesta a mhc propio,

2. selección negativa, selección contra las células cuyos receptores de célula T reaccionan fuertemente a combinaciones de péptido/mhc propio, y

3. compromiso de línea, compromiso de timocitos a líneas de células efectoras, entre ellas poblaciones auxiliares CD4⁺ o citotóxicas CD8⁺.

El entendimiento del desarrollo de células T ha sido un desafío para estudiantes e inmunólogos por igual, pero ayuda a tener en mente el propósito fundamental del proceso: generar una población grande de células T que expresen una gama diversa de especificidades de receptor que puedan interactuar con mhc propio, pero que no muestren respuesta a proteínas propias.

El desarrollo de célula T ocurre en el timo y empieza con la llegada de pequeños números de precursores linfoides que migran desde la médula ósea y la sangre hacia el timo, donde proliferan, se diferencian, y pasan por procesos de selección que dan lugar al desarrollo de células T maduras.

La identidad precisa del precursor celular de la médula ósea que da lugar a células T aún es motivo de debate. Sin embargo, está claro que este precursor, que es dirigido hacia el timo por medio de receptores de quimiocina, retiene el potencial para dar lugar a más de un tipo de célula, aun células asesinas naturales (nk), células dendríticas (dc), células B, e incluso células mieloides. Este precursor sólo queda por completo comprometido a la línea de células T al final de la etapa DN2 del desarrollo de células T (figura 9-1, Perspectiva general).

Diversos estudios revelaron que el compromiso hacia la línea de células T dependió de un receptor, Notch, que clásicamente se ha asociado con el desarrollo de células embrionarias. De hecho, Notch regula la decisión de un precursor linfoide de convertirse en un linfocito T en contraposición con uno B. Cuando una versión constitutivamente activa de Notch1, una de cuatro versiones de Notch, es sobreexpresada en células hematopoyéticas, se desarrollan células T más que células B en la médula ósea. De manera recíproca, cuando se efectúa deleción (knockout) del gen que codifica para Notch1 entre precursores hematopoyéticos, se desarrollan células B más que células T en el timo (!).

La importancia de Notch en el compromiso hacia célula T fue subrayada por un sistema in vitro para estudiar el desarrollo de células T. Hasta hace poco, se creía que el desarrollo de células T desde sus precursores hematopoyéticos requería la estructura intacta del timo. Mientras que el desarrollo de células B podía lograrse in vitro usando una preparación de células madre de la médula ósea crecidas sobre células del estroma en presencia de citocinas apropiadas, los estudios in vitro del desarrollo de células T alguna vez sólo podían efectuarse usando sistemas de cultivo de órgano tímico fetal intacto. En 2002, J. C. Zuniga-Pfluker y colaboradores demostraron que las células T podían ser inducidas para que se desarrollaran cuando células madre de la médula ósea se cultivaban en una línea de células del estroma que expresaba un ligando para Notch. El crecimiento de células madre hematopoyéticas (hsc) sobre células del estroma que expresan ligando Notch impulsa el desarrollo de estas células madre multipotentes hacia la línea de células T (figura 9-2). Este sistema de ensayo ha sido inestimable para definir interacciones que controlan el desarrollo temprano de células T, y ha ayudado a los investigadores a revelar, por ejemplo, que el factor de transcripción GATA-3 es un participante crucial en el compromiso hacia células T mediado por Notch.

Los timocitos progresan por cuatro etapas doble negativo

El desarrollo de células T está muy bien organizado desde los puntos de vista espacial y temporal. Diferentes etapas de desarrollo tienen lugar en distintos microambientes que proporcionan señales unidas a membrana y solubles que regulan la maduración. Después de llegar al timo provenientes de la médula ósea por medio de vasos sanguíneos en la frontera corticomedular, los precursores de célula T encuentran ligandos Notch, que son expresados en abundancia por el epitelio tímico. Recuerde que los precursores de célula T primero viajan a la corteza externa, donde proliferan lentamente, después pasan por la médula del timo antes de salir en la unión corticomedular (figura 2-6). Durante el tiempo que tardan las células en desarrollarse en el timo (una a tres semanas), los timocitos pasan por una serie de etapas definidas por cambios en su fenotipo de superficie (figura de Perspectiva general 9-1). Las células T más tempranas carecen de CD4 y CD8 detectable y, por ende, se denominan células doble negativo (dn). Las células T dn pueden subdividirse en cuatro subgrupos (DN1 a DN4) con base en la presencia o ausencia de otras moléculas de superficie celular, entre ellas c-kit (CD117), el receptor para factor de crecimiento de células madre; CD44, una molécula de adhesión, y CD25, la cadena α del receptor de IL-2 (cuadro 9-1).

Los timocitos DN1 son los primeros en entrar al timo, y aún son capaces de dar lugar a múltiples tipos de células. Sólo expresan c-kit y CD44 (c-kit⁺⁺CD44⁺CD25^–), pero una vez que encuentran el ambiente del timo y se hacen residentes en la corteza, proliferan y expresan CD25, con lo cual se convierten en timocitos DN2 (c-kit⁺⁺CD44⁺CD25⁺). Durante esta etapa crucial del desarrollo, los genes que codifican para las cadenas γ, δ y β de tcr empiezan a reordenarse; empero, el locus tcr α no se reordena, probablemente porque la región de dna que codifica para los genes que codifican para TCRα todavía no está accesible a la maquinaria de recombinasa. En la etapa de DN2 tardía, los precursores de célula T se comprometen por completo a la línea de células T y reducen la expresión tanto de c-kit como de CD44. Las células en la transición desde las etapas DN2 a DN3 (c-kit⁺CD44^–CD25⁺) continúan el reordenamiento de las cadenas TCRγ, TCRδ y TCRβ, y toman la primera decisión importante en el desarrollo de células T: si se unen a la línea de células T TCRγδ o TCRαβ. Las células T DN3 que reordenan exitosamente su cadena β y, por ende, se comprometen a la línea de células T TCRαβ, pierden la expresión de CD25, suspenden la proliferación, y entran a la fase final de su etapa de desarrollo dn, DN4 (c-kit^bajo/–CD44^–CD25^–), que maduran directamente hacia timocitos CD4⁺CD8⁺ dp.

Los timocitos pueden expresar receptores TCRαβ o TCRγδ

Los vertebrados generan dos categorías amplias de células T: las que expresan cadenas de receptor TCRα y β, y las que expresan cadenas de receptor TCRγ y δ. Las células TCRαβ son los participantes dominantes en la respuesta inmunitaria adaptativa en órganos linfoides secundarios; con todo, las células TCRγδ también desempeñan un papel importante, particularmente en la protección de los tejidos mucosos contra infección externa. Ambos tipos de células son generados en el timo, pero ¿de qué modo una célula toma la decisión de convertirse en una u otra? En gran parte, la elección de convertirse en una célula T γδ o αβ es dictada por cuándo y qué tan rápido los genes que codifican para cada una de las cuatro cadenas de receptor se reordenan exitosamente.

Recuérdese que los genes que codifican para tcr son generados por el barajado (reordenamiento) de los segmentos V y J (y a veces D), lo cual se encarga de la vasta diversidad de especificidades de receptor (capítulo 7). El reordenamiento de los locus β, γ y δ empieza durante la etapa DN2. Para convertirse en una célula T αβ, una célula debe generar una cadena TCRβ, lo que depende de un reordenamiento vdj dentro de marco, único. Aun así, para convertirse en una célula γδ, un timocito debe generar dos proteínas funcionales que dependen de dos eventos de reordenamiento dentro de marco, separados. Probablemente favorece el primer destino mencionado y, de hecho, las células T tienen al menos tres veces más probabilidades de convertirse en células TCRαβ que en células TCRγδ.

La generación de células T TCRγδ también está regulada por el desarrollo. Son las primeras células T que surgen durante el desarrollo fetal, y proporcionan una función protectora muy importante quizá incluso antes de nacer. Por ejemplo, los estudios muestran que las células T γδ se requieren para proteger ratones muy jóvenes contra el protozoo patógeno que causa la coccidiosis. De cualquier modo, la producción de células T γδ declina después del nacimiento, y la población de células T TCRγδ representa sólo 0.5% de los timocitos maduros en la periferia de un animal adulto (figura 9-3).

Casi todas las células T TCRγδ son bastante distintas en cuanto a fenotipo y función respecto a las células T TCRαβ convencionales. Casi ninguna pasa por la etapa dp de desarrollo de timocito, y casi todas salen del timo como células T dn maduras. Muchas salen del timo con la capacidad para secretar citocinas, capacidad obtenida por casi todas las células TCRαβ sólo después de que encuentran antígeno en tejidos linfoides secundarios. La población de células T TCRγδ también expresa receptores que no son tan diversos como las células T TCRαβ, y muchas parecen reconocer antígenos no convencionales, incluso lípidos asociados con moléculas de mhc no convencionales. Muchas residen a largo plazo en tejidos mucosos y la piel, y se unen a células inmunitarias innatas en el suministro de una primera línea de ataque contra microbios invasores, así como la respuesta a estrés celular.

El resto de este capítulo se centrará en el desarrollo de células T TCRαβ, que constituyen la mayoría de los linfocitos T en el organismo, y se están generando en forma continua, incluso después de la pubertad, cuando el timo disminuye considerablemente de tamaño (involuciona).

Los timocitos DN pasan por selección β, que da lugar a proliferación y diferenciación

Los timocitos doble negativo (dn) que han reordenado exitosamente sus cadenas TCRβ son valiosos, y son identificados y expandidos por un proceso que se conoce como selección β (figura 9-1, Perspectiva general). Este proceso involucra una proteína que es expresada de manera singular a esta etapa del desarrollo, una glucoproteína invariante de 33 kDa conocida como la cadena pre-Tα. Pre-Tα actúa como un sustituto para la cadena TCRα real, que todavía tiene que reordenarse, y se monta con una cadena β reordenada y traducida exitosamente, así como proteínas del complejo CD3. Este complejo TCR/CD3 precursor se conoce como el pre-TCR (figura 9-4a) y actúa como un detector para iniciar una vía de transducción de señal. La señalización que el complejo pre-TCR inicia es dependiente de muchas de las mismas cinasas específicas para célula T usadas por un tcr maduro (capítulo 3), pero no parece ser dependiente de unión a ligando. De hecho, poco del complejo se expresa sobre la superficie celular, si es que se expresa algo; más bien, el montaje exitoso del complejo puede ser suficiente para activar los eventos de señalización. Las células B también expresan un complejo receptor inmaduro (el pre-BCR) que es codificado por genes separados, pero que es por completo análogo al pre-TCR (capítulo 10).

La emisión de señales de pre-TCR da lugar a la cascada de eventos que siguen:

1. Maduración a la etapa DN4 (c-kit^bajo/–CD44^–CD25^–)

2. Proliferación rápida en la corteza subcapsular

3. Supresión de reordenamiento adicional de genes que codifican para cadena β de tcr, lo que da lugar a exclusión alélica del locus de la cadena β

4. Desarrollo hacia la etapa CD4⁺CD8⁺ doble positivo (dp)

5. Cese de la proliferación

6. Inicio del reordenamiento de cadena TCRα

Tiene importancia notar que la fase proliferativa antes de reordenamiento de la cadena α aumenta considerablemente la diversidad de receptor al generar clonas de células con el mismo reordenamiento de cadena β de tcr. Cada una de las células dentro de una clona a continuación puede reordenar un gen que codifica para cadena α diferente, lo que genera así una población aún más diversa que si la célula original hubiera pasado por reordenamiento en los loci de la cadena β y de la cadena α antes de proliferación. El reordenamiento del gen que codifica para cadena α de tcr no empieza sino hasta que timocitos doble positivo dejan de proliferar.

Casi todas las células T reordenan por completo y expresan una cadena TCRβ proveniente de sólo uno de sus dos alelos de tcr, fenómeno conocido como exclusión alélica. La exclusión alélica es el resultado de inhibición del reordenamiento adicional en el otro alelo de TCRβ (que debe estar por completo reordenado para que sea expresado). Esto puede lograrse al reducir la expresión de rag de modo que no pueda ocurrir más reordenamiento, así como al hacer al locus inaccesible a interacción adicional con rag por medio de cambios más permanentes en el empaque de cromatina. Aún se están investigando los detalles de los mecanismos de los cuales depende esta desactivación. No obstante, está claro que tienen una influencia importante las señales de retroacción negativa provenientes de un complejo pre-TCRβ/pre-Tα exitosamente montado durante la selección β. Otros eventos, incluso el estallido proliferativo que sigue a la selección β, que diluye las cifras de proteína rag, quizá también estén implicados.

Las cifras de rag siguen cambiando luego de selección β. Son restituidas después del estallido proliferativo, y permiten que ocurra reordenamiento de TCRα. Disminuyen de nuevo después de expresión de un dímero TCRαβ exitosamente ensamblado.*

Una vez que un timocito doble positivo (dp) joven reordena y expresa exitosamente una cadena TCRα, esta cadena se asociará con la cadena TCRβ ya producida, y tomará el lugar de la cadena pre-TCRα sustituto, que ya no es expresada de manera activa (figura 9-4b). En este punto, el timo ha alcanzado varias “metas”: los precursores de células hematopoyéticas se han expandido en la corteza subcapsular, se han comprometido a la línea de células T, y reordenado un grupo de genes que codifican para tcr. También han “elegido” convertirse en una célula T TCRαβ o TCRγδ. Esta población TCRαβ ahora expresa tanto CD4 como CD8, y está lista para la segunda etapa del desarrollo de célula T: la selección.

Los timocitos CD4⁺CD8⁺ (dp), células pequeñas que no proliferan y que residen en la corteza del timo, son la subpoblación más abundante en el timo; comprende más de 80% de las células. Lo que es más importante, son la primera subpoblación de timocitos que expresan un complejo TCRαβ/CD3 de superficie por completo maduro y, por ende, son los blancos primarios de la selección tímica (figura 9-1). La selección tímica conforma el repertorio de tcr de timocitos dp con base en la afinidad de sus receptores de célula T por los mhc/péptidos que encuentran conforme recorren la corteza tímica.

¿Por qué es necesaria la selección tímica? La propiedad más distintiva de las células T maduras es que sólo reconocen antígeno extraño combinado con moléculas de mhc propias; sin embargo, tcr generados al azar ciertamente no tendrán afinidad inherente por “antígeno extraño más moléculas de mhc propias”. Podrían simplemente también reconocer combinaciones de mhc/péptido extrañas, lo cual no sería útil, o combinaciones de mhc propio/péptido propio, lo cual podría ser peligroso.

Se requieren dos procesos de selección distintos:

• Selección positiva, que selecciona para aquellos timocitos que portan receptores capaces de unirse a moléculas de mhc propias, lo que da lugar a restricción a mhc.

• Selección negativa, que selecciona contra timocitos que portan receptores de alta afinidad para complejos de mhc/péptido propios, lo que da lugar a autotolerancia.

Dado que sólo péptidos propios son presentados en el timo, y sólo en asociación con moléculas de mhc propias, estos dos procesos de selección aseguran que los timocitos sobrevivientes expresen tcr que tengan afinidad baja por péptidos propios en mhc propio. Por otro lado, los procesos no aseguran que las células T generadas portarán receptores con afinidad alta por cualquier combinación específica de mhc propio/péptido extraño. La capacidad del sistema inmunitario para mostrar respuesta a un antígeno extraño depende de la probabilidad de que una de los millones de células T que sobreviven a la selección se unirá a una de las muchas combinaciones de mhc/péptido expresadas por una célula presentadora de antígeno que ha procesado proteínas patógenas fuera del timo.

Casi todos los timocitos dp (~ 98%) nunca satisfacen los criterios de selección, y mueren por apoptosis dentro del timo (figura de Perspectiva general 9-5). La mayor parte de las muertes de timocitos dp (~ 95%) ocurre entre timocitos que fracasan en la selección positiva porque sus receptores no reconocen de manera específica moléculas de mhc propias. Estas células no reciben señales de supervivencia por medio de sus tcr, y mueren mediante un proceso conocido como muerte por abandono. Un pequeño porcentaje de células (2 a 5%) es eliminado por medio de selección negativa. Sólo 2 a 5% de los timocitos dp en realidad sale del timo como células T maduras.

A continuación se describe brevemente la evidencia experimental para la participación del timo en la restricción a mhc. También se describe lo que se sabe en la actualidad acerca de los procesos de selección positiva y negativa, así como los modelos que se han propuesto para explicar lo que se conoce como “la paradoja tímica”.

Los timocitos “aprenden” restricción a mhc en el timo

La evidencia temprana del papel del timo en la selección del repertorio de células T provino de experimentos en ratones quiméricos efectuados por R. M. Zinkernagel y colaboradores. Recuerde que Zinkernagel ganó el Premio Nobel por mostrar que las células T maduras están restringidas a mhc (esto es, para mostrar respuesta necesitan reconocer antígeno en el contexto del mhc de su huésped; véase el Experimento clásico en el capítulo 8). Empero, él y sus colegas tuvieron curiosidad de saber cómo las células T se hicieron tan “restringidas”. Consideraron dos posibilidades: la célula T y la apc simplemente tenían que tener tipos de mhc que coincidieran (esto es, una célula T cepa “A” tenía que ver una célula presentadora de antígeno cepa “A”) o las células T, independientemente de su tipo de mhc propio, “aprendían” el tipo de mhc de su huésped en algún momento durante el desarrollo. Zinkernagel y colegas creyeron que ese aprendizaje podría tener lugar en el timo, el cunero de células T. Para determinar si las células T podrían ser “enseñadas” a reconocer el mhc huésped, extirparon el timo (efectuaron timectomía) e irradiaron ratones (A × B) F₁ de modo que no tuvieron sistema inmunitario funcional (figura 9-6). A continuación reconstituyeron las células hematopoyéticas con una administración por vía intravenosa de células F₁ de la médula ósea, pero reemplazaron el timo con uno proveniente de un ratón tipo B. (Para estar seguros de que el injerto de timo no contenía células T maduras en absoluto, lo irradiaron antes del trasplante.)

En este sistema experimental, los progenitores de células T provenientes de la médula ósea (A × B) F₁ madurarían dentro de un timo que sólo expresó moléculas de mhc haplotipo B en sus células del estroma. ¿Estas células T (A × B) F₁ ahora estarían restringidas a mhc al haplotipo B del timo en el cual se desarrollaron? O bien, puesto que expresaron mhc tanto A como B, ¿serían capaces de reconocer haplotipos de mhc tanto A como B? Para responder esta pregunta, los investigadores infectaron los ratones quiméricos con virus de la coriomeningitis linfocítica (lcmv, el antígeno) y extrajeron las células T esplénicas maduras inmunizadas para ver cuáles células blanco (apc) infectadas por lcmv ellos podían matar. Las probaron contra apc infectadas provenientes de ratones cepa A, cepa B y cepa A × B. Las células T de los ratones quiméricos sólo pudieron lisar células blanco infectadas por lcmv provenientes de ratones cepa B (figura 9-6). De este modo, el haplotipo de mhc del timo en el cual las células T se desarrollan determina su restricción a mhc. Las células T “aprendieron” a cuál haplotipo de mhc están restringidas durante sus primeros días en el timo. Si bien alguna vez se hizo referencia a este proceso como “educación de célula T”, ahora se sabe que es la consecuencia de un proceso de selección brutal.

Las células T pasan por selecciones positiva y negativa

En el timo, los timocitos entran en contacto con células epiteliales tímicas que expresan sobre su superficie cifras altas de moléculas de mhc clase I y clase II. Estas moléculas de mhc propias presentan péptidos propios, que típicamente se derivan de proteínas intracelulares o extracelulares que son degradadas en el curso normal del metabolismo celular. Los timocitos dp pasan por selecciones positiva y negativa, dependiendo de las señales que reciben cuando encuentran combinaciones de mhc propio/péptido propio con sus tcr.

Mientras se trabaja para entender las selecciones negativa y positiva, ayuda imaginarse un modelo temprano que fue propuesto por varios inmunólogos influyentes (figura de Perspectiva general 9-5). Aunque ahora se sabe que algunos aspectos de este modelo son demasiado simplistas, sus principios fundamentales aún son importantes, y proporcionan un marco muy útil para entender la selección tímica. En resumen, puede considerarse que los timocitos dp tienen uno de tres destinos, dependiendo de la afinidad de sus nuevos receptores de célula T para las combinaciones de mhc/péptido propio que encuentran: si sus tcr recién generados no se unen a cualquiera de los mhc/péptidos propios que encuentran sobre células del estroma, morirán por abandono. Si se unen demasiado fuertemente a complejos de mhc/péptido propio que encuentran, serán seleccionados de manera negativa. Si se unen con una afinidad baja, “justo la correcta”, a complejos de mhc/péptido propio, serán seleccionados de manera positiva y madurarán a la etapa de desarrollo positiva única. (También se verá que las células que son seleccionadas de manera positiva en la corteza pasan por una segunda ronda muy importante de selección negativa en la médula, después de compromiso de línea a células CD4⁺ o CD8⁺.) Los autores revisan los orígenes del modelo y comentan algunas de las modificaciones que han sido sugeridas por los datos recientes que se muestran a continuación. Véase en el recuadro de Experimento clásico 9-1 la evidencia experimental que apoya este modelo proveniente de los primeros ratones transgénicos tcr.

Las células del estroma tímico, incluso células epiteliales, macrófagos y células dendríticas, desempeñan funciones esenciales en las selecciones positiva y negativa, y deben formar parte de la visualización de eventos de selección tímica. Los timocitos dp jóvenes se encuentran en íntimo contacto con estas células y “recorren” los mhc/péptidos propios desplegados sobre sus superficies. Cada uno de estos tipos de células tiene la capacidad de expresar cifras altas de proteínas de mhc clase I y clase II, y típicamente tienen prolongaciones extendidas que hacen contacto con muchos timocitos en desarrollo. Algunos también expresan ligandos coestimulatorios, incluso CD80 (B7-1) y CD86 (B7-2). Conforme los timocitos migran por el timo, encuentran múltiples superficies de células del estroma diferentes, y tienen la oportunidad de unirse a muchas combinaciones de mhc/péptido distintas.

La selección positiva asegura restricción a mhc

Si un timocito CD4⁺CD8⁺ reconoce un complejo de mhc/péptido propio sobre las células epiteliales corticales que recorre, pasará por selección positiva, proceso que induce tanto supervivencia como diferenciación de timocitos dp. Notoriamente, casi ningún timocito recién generado se une exitosamente a los mhc/péptidos que encuentra con sus tcr. No ha generado una combinación TCRαβ funcional, o la combinación no se une con suficiente afinidad a complejos de mhc/péptido. Estas células han “fracasado” en la prueba de selección positiva, y mueren por apoptosis en el transcurso de tres a cuatro días. Se cree que las interacciones de tcr/mhc/péptido propio que inician selección positiva son de intensidad al menos tres veces menor que las interacciones que inician señales de selección negativa (figura 9-7).

La cascada de señales generada mediante selección positiva de interacciones de tcr todavía no se ha caracterizado por completo. Se sabe que muchas de las moléculas emisoras de señales requeridas para selección positiva también están involucradas en la activación de células T maduras mediada por receptor de célula T (capítulo 3), un evento que, con todo, requiere interacciones de tcr de afinidad más alta. Aún no se entiende por completo cómo las señales de afinidad baja que seleccionan de manera positiva inician maduración a la etapa positivo único, o cómo difieren de las señales que seleccionan de manera negativa, proapoptóticas, que también están mediadas por tcr.

¿Cuál es el valor adaptativo de la selección positiva? ¿Por qué el humano no adquirió por evolución un sistema que seleccione de manera negativa pero que deje el repertorio de receptores de célula T por lo demás intacto? Algunos han sugerido que la reducción del repertorio es importante para aumentar la eficiencia de la selección negativa, así como para incrementar la eficiencia de las respuestas de células T periféricas. Sin selección positiva, el sistema sería abarrotado con muchas células que tienen pocas probabilidades de reconocer algo, y reduciría la probabilidad de que una célula T encuentre “su” antígeno en un periodo razonable. Ésta es una especulación razonable; aun así, la selección positiva también ofrece ventajas más sutiles que a menudo han inspirado debates en el campo.

La selección negativa (tolerancia central) asegura la autotolerancia

Los timocitos CD4⁺CD8⁺ autorreactivos con receptores de afinidad alta por combinaciones de mhc propio/péptido propio son en potencia peligrosos para un organismo, y muchos son muertos mediante selección negativa en el timo. De hecho, los errores en el proceso de selección negativa son la causa de muchos trastornos autoinmunitarios, entre ellos diabetes tipo 1 (véase Enfoque clínico). La selección negativa es definida ampliamente como cualquier proceso que se deshace de un repertorio de clonas autorreactivas y del cual depende la tolerancia central. Es probable que casi toda la selección negativa ocurra por medio de un proceso conocido como deleción clonal, en el cual interacciones de tcr de alta afinidad inducen de manera directa señales apoptóticas.

La deleción clonal de timocitos dp parece estar mediada de manera óptima por las mismas células (apc) y las mismas interacciones (unión de tcr de alta afinidad junto con señales coestimuladoras) que activan células T maduras. La razón por la cual señales de tcr fuertes dan lugar a muerte de células T inmaduras, pero proliferación y diferenciación de células T maduras (figura 9-4c) persiste como un área activa de investigación.

Las células dendríticas y los macrófagos tímicos, que se encuentran en múltiples áreas del timo, claramente tienen las características ideales para mediar selección negativa, pero es interesante que también las tienen las células epiteliales medulares, que expresan cifras altas de los ligandos coestimuladores CD80 y CD86, así como un factor de transcripción único que les permite presentar antígenos específicos para tejido (véase más adelante). Por ende, tanto la corteza como la médula tienen el potencial de inducir selección negativa.

¿El ser humano elimina timocitos reactivos a antígenos específicos para tejido?

Ya se comentó que las moléculas de mhc pueden presentar péptidos derivados de proteínas tanto endógenas como exógenas sobre la superficie de células presentadoras de antígeno (capítulo 8). De cualquier modo, sólo una fracción de tipos de célula —timocitos, células del estroma, macrófagos y otras células presentadoras de antígeno— reside en el timo, de modo que se esperaría que estas células sólo produjeran un subgrupo de las proteínas codificadas en el genoma. Entonces, ¿cómo puede el timo posiblemente deshacerse de células T en desarrollo que son autorreactivas a antígenos específicos para tejido, por ejemplo, proteínas específicas para el cerebro, el hígado, los riñones o el páncreas?

Esta pregunta tuvo en jaque a los inmunólogos durante mucho tiempo. Durante un periodo, los inmunólogos supusieron que otros mecanismos de tolerancia en la periferia se encargaban de la autorreactividad a proteínas específicas para tejido, pero investigaciones realizadas al final de la década de 1990-1999 sorprendieron a todos, y revelaron que el timo tenía una extraordinaria capacidad para expresar proteínas de todo el cuerpo y presentarlas. Bruno Kyewski y colegas mostraron que esta capacidad era una característica singular de células epiteliales de la médula del timo. Diane Mathis, Cristoph Benoist y sus colegas mostraron que algunas células epiteliales medulares expresan una proteína singular, aire, que permite a las células expresar, procesar y presentar proteínas que en circunstancias ordinarias sólo se encuentran en órganos específicos. Este grupo descubrió la aire mientras estaba estudiando la base molecular para la autoinmunidad al examinar enfermedad humana. Rastrearon al gen que codifica para aire una mutación que causó síndrome de poliendocrinopatía autoinmunitaria 1 (APS1, de otro modo conocido como apeced; capítulo 18), y lo llamaron aire, que significa “regulador autoinmunitario”. El título del artículo que anunció su descubrimiento, “Proyección de una sombra propia inmunológica dentro del timo por la proteína aire” (“Projection of an Immunological Self Shadow within the Thymus by the AIRE Protein”), describe muy bien la función poderosa de la aire.

El mecanismo de acción de la aire aún se está investigando. Tiene características clásicas de un factor de transcripción, y tal vez forme parte de un complejo transcripcional que facilita la expresión de genes específicos para tejido al regular no sólo la traducción, sino también el empaque de cromatina. Así, permite que células epiteliales medulares expresen proteínas que en circunstancias ordinarias no se encuentran en el timo, las procesen, y las presenten en moléculas de mhc. Esto es en particular útil para la presentación de péptidos de mhc clase I y la selección negativa de timocitos CD8⁺. No obstante, también se cree que células dendríticas y macrófagos vecinos fagocitan células epiteliales medulares y, así, después pueden presentar su contenido proteínico en moléculas de mhc clase II, y mediar selección negativa de timocitos CD4⁺ (figura de Perspectiva general 9-5).

Otros mecanismos de tolerancia central

Se han propuesto otros mecanismos de selección negativa tímica (tolerancia central) que no necesariamente involucran muerte celular; comprenden: paro clonal, en el cual se evita la maduración de los timocitos que expresan receptores de célula T autorreactivos; anergia clonal, en la cual las células autorreactivas son desactivadas, más que eliminadas, y edición clonal, en la cual se da a células autorreactivas una segunda o tercera oportunidad para reordenar un gen que codifica para TCRα. Cada uno de estos mecanismos tiene cierto apoyo experimental, pero la deleción clonal probablemente es el mecanismo más común del cual depende la selección negativa tímica. La generación de células T reguladoras a partir de timocitos autorreactivos ciertamente puede considerarse importante entre los mecanismos de tolerancia central (véase más adelante).

Superantígenos

Los superantígenos, proteínas virales o bacterianas que se unen de manera simultánea al dominio Vβ de un receptor de célula T, y a la cadena α de una molécula de mhc clase II (fuera del surco de unión a péptido), pueden inducir activación de todas las células T que expresan esa familia particular de cadenas Vβ (figura 11-5). Los superantígenos también son expresados en el timo de ratones y seres humanos, e influyen sobre la maduración de timocitos. Puesto que imitan interacciones con tcr de alta afinidad, los superantígenos inducirán la selección negativa de todos los timocitos dp cuyos receptores posean dominios Vβ establecidos como objetivo por el superantígeno. Sin embargo, dado que el ser humano genera continuamente células T con un amplio rango de especificidades de receptor de célula T, esta pérdida no parece tener consecuencias clínicas importantes.

La paradoja de la selección: ¿por qué el humano no elimina todas las células que selecciona de manera positiva?

El entendimiento completo del proceso de selecciones positiva y negativa requiere una apreciación de la paradoja que sigue: si la selección positiva permite que sólo timocitos reactivos con moléculas de mhc propias sobrevivan, y la selección negativa elimina timocitos reactivos con mhc propio, ¿por qué se permite a cualesquier células T que maduren? Otros factores deben operar para evitar que estos dos procesos dependientes de mhc eliminen el repertorio completo de células T restringidas a mhc.

El modelo más sencillo propuesto para explicar la paradoja de las selecciones positiva y negativa dependientes de mhc es la hipótesis de la afinidad,* que afirma que diferencias de la fuerza de señales mediadas por tcr recibidas por timocitos que están pasando por selecciones positiva y negativa determinan el resultado de la interacción. Los timocitos doble positivo que reciben señales de afinidad baja se seleccionarían de manera positiva, los que recibieron señales de afinidad alta (autorreactivos) serían seleccionados de modo negativo, y los que no recibieron señal en absoluto morirían por abandono (figura 9-7 y figura de Perspectiva general 9-5).

El ratón transgénico tcr B OT-I, desarrollado por Kristin Hogquist y colaboradores, es un excelente modelo para el estudio de la selección tímica usando tcr y mhc/péptidos con afinidades conocidas. No sólo su especificidad de péptido/mhc se conoce con precisión (se une a un péptido de ovoalbúmina de pollo en el contexto de la molécula de mhc clase I H-2K^b), sino que también se ha definido su afinidad por un rango de péptidos que varían en secuencia. Para determinar la influencia de la afinidad sobre el desarrollo de células T, los investigadores también aprovecharon otras dos herramientas inmunológicas: 1) el sistema de cultivo de órgano tímico fetal (ftoc), en el cual es posible dar seguimiento al desarrollo del timo in vitro (figura 9-8a), y 2) ratones con defectos en el procesamiento de antígeno por mhc clase I. Hay varias mutaciones que llevan a presentación defectuosa por mhc clase I. En la figura 9-8b se describe un esquema experimental en que se usa el ratón con deleción (knockout) de TAP-1 (TAP-1^–), un ratón mutante en el cual los péptidos recién generados no pueden tener acceso a moléculas de mhc clase I recién generadas (capítulo 8). Estos ratones no pueden cargar sus mhc clase I con péptidos endógenos; son expresados sobre la superficie celular, pero están “vacíos” y no mantienen su forma. Empero, pueden ser cargados con péptidos exógenos, que estabilizan su conformación. En consecuencia, al incubar con péptidos de elección órganos tímicos fetales provenientes de estos ratones mutantes, los investigadores lograron controlar el tipo de péptido presentado por el mhc clase I.

¿Qué encontraron los investigadores? Como era de esperarse, los cultivos de órgano tímico fetal OT-I⁺/TAP-1⁺ produjeron más células CD8⁺ que el ftoc natural. Esto se debe a que casi todos sus timocitos expresaron un receptor que se unió a la diversidad de complejos de mhc clase I (H-2K^b)/péptido propio expresados por el estroma normal con afinidad intermedia, lo que genera una señal que da lugar a selección positiva (recuadro 9-1, Experimento clásico). Asimismo, como era de esperarse, las células T maduras CD8⁺ no se desarrollaron en cultivos de órgano tímico OT-I⁺/TAP-1^– porque no hubo mhc clase I normal y, por ende, no hubo señal de tcr —una falla de selección positiva, que da lugar a muerte por abandono (figura 9-8b, hilera superior)—. Con todo, cuando se añadió un péptido de baja afinidad al cultivo de OT-I⁺/TAP-1^–, el mhc clase I pudo cargarse a sí mismo con péptido y adoptó una conformación normal (figura 9-8b, hilera de en medio). Ocurrió selección positiva, y las células T CD8⁺ se desarrollaron exitosamente. La adición de péptidos de alta afinidad indujo una fuerte señal de tcr y selección negativa, lo que dio lugar a la deleción de células dp en cultivos de órgano tímico OT-I⁺/TAP-1^– (figura 9-8b, hilera inferior). Despierta interés que concentraciones bajas de péptido de alta afinidad también indujeron selección positiva, aunque las células que se desarrollaron no fueron por completo funcionales. Estos resultados y muchos otros proporcionaron apoyo claro para el modelo de afinidad, al mostrar que la fuerza de la interacción TCR/MHC/péptido de hecho influye sobre el destino de la célula.

El sistema OT-I también se ha usado para estimar el rango de afinidades de tcr que definen resultados de la selección positiva en contraposición con negativa. Pareciera ser que ocurre selección negativa a afinidades que son tres veces más altas que las que inducen selección positiva.

Un modelo alternativo puede explicar la paradoja de la selección tímica

Philippa Marrack, John Kappler y sus colegas ofrecieron inteligentemente una posibilidad alternativa para explicar la “paradoja tímica”, es decir, por qué no se seleccionan de manera negativa todas las células que se seleccionan de manera positiva. Estos investigadores propusieron el modelo del péptido alterado, una sugerencia de que el epitelio cortical, que induce selección positiva, sintetiza péptidos que son singulares y distintos de péptidos sintetizados por todas las otras células, incluso las células tímicas que inducen selección negativa. Así, los timocitos seleccionados con base en estos complejos de péptido/mhc singulares no serían seleccionados de manera negativa cuando pasan por la médula y por otras células que efectúan selección negativa.

Experimentos iniciales no apoyaron este modelo; aun así, avances en la capacidad para analizar con detalle péptidos presentados sobre superficies celulares sugieren que el modelo tiene mérito. Las células epiteliales corticales de hecho pueden procesar péptidos de manera diferente, y es probable que presenten una gama distinta de péptidos a células T en desarrollo. Recuérdese que los péptidos son procesados dentro de la célula mediante varios mecanismos, entre ellos la actividad del proteosoma (figura 8-16). Parece ser que los componentes del proteosoma expresados por células epiteliales corticales (el “timoproteasoma”) son singulares. El epitelio tímico también puede expresar versiones singulares de proteasas (p. ej., catepsinas).

Los modelos del péptido alterado y de la afinidad de ningún modo son mutuamente excluyentes. Las investigaciones establecen con firmeza que la afinidad desempeña un papel importante en la distinción entre selecciones positiva y negativa. El hecho de que la corteza también puede generar péptidos nuevos simplemente subraya la posibilidad de que el timo ha adquirido por evolución múltiples maneras de asegurar que el ser humano sería capaz de generar un fondo común suficientemente grande de células T con especificidades diversas.

¿Las selecciones positiva y negativa ocurren en la misma etapa de desarrollo, o en secuencia?

Estrictamente interpretado, el modelo de la afinidad supone que las selecciones positiva y negativa operan sobre exactamente la misma población blanco (timocitos dp) y en el mismo microambiente del timo (la corteza tímica). Si bien está claro que los timocitos pasan por selección positiva en la corteza, como se mencionó, la médula es el sitio de selección negativa para antígenos específicos para tejido. Esta compartimentación de la función sugiere que algunos timocitos son seleccionados de manera positiva e inician un programa de maduración antes de la selección negativa. El hecho de que esto puede suceder es apoyado por observaciones que muestran que timocitos “semimaduros” —los que han sido seleccionados de manera positiva y están en transición desde las etapas dp a sp— son excelentes blancos para selección negativa.

Lo más probable es que los timocitos puedan ser seleccionados de manera negativa en más de un punto del desarrollo (lo que se ilustra en la figura de Perspectiva general 9-5). Los timocitos que se unen con alta afinidad conforme pasan por complejos de mhc/péptido en la corteza son seleccionados de manera negativa, y los que reciben señales de selección positiva reciben autorización no sólo para madurar, sino para migrar al límite entre la médula y la corteza, y finalmente hacia la médula. En la médula, los timocitos semimaduros pueden quedar sujetos de nuevo a selección negativa si interactúan con afinidad alta a antígenos específicos para tejido.

Ahora se sabe que la migración a la médula de timocitos seleccionados de manera positiva es dependiente de la expresión del receptor de quimiocina CCR7: los timocitos con deficiencia de CCR7 no entran a la médula. Despierta interés que aún maduran y son exportados a la periferia, pero ahí causan autoinmunidad —una observación que, de nuevo, subraya la importancia fundamental de la médula en la eliminación de células autorreactivas del repertorio de células T—.

A medida que los timocitos están siendo tamizados con base en su afinidad de tcr por antígenos propios, también están siendo guiados en sus decisiones de línea. De manera específica, un timocito doble positivo seleccionado de manera positiva debe decidir si va a unirse a la línea de células T citotóxicas CD8⁺ o a la línea de células T auxiliares CD4⁺. El compromiso de línea requiere cambios de la organización genómica y la expresión de gen que dan por resultado 1) silenciamiento de un gen que codifica para correceptor (CD4 o CD8), así como 2) expresión de genes asociados con una función de línea específica. Los mecanismos celular y molecular de los cuales depende el compromiso de línea aún son un tema de debate entre inmunólogos. Se revisarán las perspectivas más actuales.

Se han propuesto varios modelos para explicar el compromiso de línea

Cuando estudios tempranos con ratones transgénicos tcr revelaron que la afinidad por mhc clase I en contraposición con preferencia por clase II dictó el destino CD8⁺ en contraposición con CD4⁺ de timocitos en desarrollo (recuadro de Experimento clásico 9-1), los investigadores propusieron dos modelos sencillos, que pueden probarse, para explicar cómo las células T en desarrollo “hicieron coincidir” su preferencia de tcr con su expresión de correceptor.

En el modelo instructivo, la co-unión TCR/CD4 y TCR/CD8 genera señales singulares que inician de manera directa programas de desarrollo distintos (figura 9-9a). Por ejemplo, si un timocito generó al azar un tcr con una afinidad para mhc clase I, el tcr y el CD8 se unirían a mhc clase I juntos, y generarían una señal que inició de manera específica un programa que silenció la expresión de CD4 e indujo la expresión de genes específicos para la función de la línea de células T citotóxicas. De igual modo, la co-unión TCR/CD4 generaría una señal singular que inició silenciamiento de CD8 y el programa de desarrollo de célula T auxiliar.

En el modelo estocástico, un timocito seleccionado de manera positiva regula en dirección descendente al azar CD4 o CD8 (figura 9-9b). Sólo las células que expresan el correceptor “correcto” —las que pueden co-unir el mhc con el tcr— generan una señal de tcr suficientemente fuerte para sobrevivir hasta la maduración. En este modelo, la co-unión TCR/CD4 y TCR/CD8 no necesariamente genera señales separadas. Por desgracia, los estudios que dieron seguimiento a las consecuencias de esas desproporciones desorientaron a los investigadores ¡al proporcionar evidencia en apoyo de ambos modelos! Claramente fueron demasiado simplistas.

Experimentos adicionales pusieron en duda algunas de las suposiciones en las cuales se basaron estos esfuerzos tempranos, e indicaron que la fuerza y la duración de la señal de receptor/correceptor de célula T experimentadas por un timocito desempeñan un papel de mayor importancia en dictar el destino de la célula, que su especificidad para mhc clase I o clase II. De hecho, timocitos cuyo tcr tuvo una preferencia conocida de mhc clase II podían ser coaccionados hacia el destino de célula T CD8⁺ simplemente al debilitar la interacción CD4/clase II (p. ej., al mutar cinasas torrente abajo de la señalización de tcr de modo que emitieron señales con mayor o menor eficacia). Al inhibir la emisión de señales de tcr, los investigadores pudieron coaccionar células que normalmente se comprometen a la línea CD4 para que se convirtieran en células CD8⁺. Al aumentar la señalización de tcr, los investigadores pudieron coaccionar a células restringidas a mhc clase I para que se convirtieran en CD4⁺. Estos datos sugirieron que las señales de tcr que seleccionan de manera positiva más fuertes dieron lugar a compromiso hacia línea CD4, y las señales de tcr que seleccionan de manera positiva más débiles dieron lugar a compromiso hacia la línea CD8. Fueron congruentes con la observación de que la cola intracelular de CD4 interactúa más eficazmente con la tirosina cinasa lck que la cola intracelular de CD8. Por ende, es probable que una co-unión de TCR/CD4 genere señales más fuertes que TCR/CD8 y dé lugar a compromiso hacia células T CD4⁺.

El modelo de la fuerza de señal representó un avance en el entendimiento, pero probablemente también es demasiado simplista. Alfred Singer y colegas han propuesto el modelo de la señalización cinética, que incorpora datos históricos, el entendimiento mejorado de cambios de la expresión de CD8 durante selección positiva, así como avances recientes en el entendimiento de la complejidad del silenciamiento de gen que codifica para correceptor (figura 9-9c). En resumen, proponen que los timocitos se comprometen hacia la línea de células T CD4⁺ si reciben una señal continua en respuesta a unión de TCR/correceptor, pero que se comprometen a la línea CD8 si se interrumpe la señal de tcr. Ahora se sabe que todos los timocitos CD4⁺CD8⁺ regulan en dirección descendente las cifras de CD8 en la superficie en respuesta a selección positiva. Dada esta respuesta, sólo las células T restringidas a mhc clase II mantendrán interacción TCR/CD4/MHC clase II continua y, por ende, se desarrollarán hacia la línea CD4. De cualquier modo, con la pérdida de la expresión de CD8, las células T restringidas a mhc clase I perderán la capacidad para mantener interacciones TCR/CD8/MHC clase I. Singer y colaboradores proporcionan evidencia de que estos timocitos, interrumpidos de su unión a tcr/correceptor, después son rescatados por IL-7, lo cual facilita su compromiso hacia la línea CD8⁺.

A últimas fechas se han identificado factores de transcripción que regulan de manera específica el desarrollo hacia la línea CD4 y CD8. En la actualidad, Pok and Runx3 están desempeñando un papel protagónico como factores transcripcionales requeridos para el compromiso CD4 y CD8, respectivamente, aunque otros también participan. Tanto ThPok como Runx3 actúan, al menos en parte, al suprimir genes involucrados en la diferenciación hacia la otra línea. ThPok inhibe la expresión de genes que regulan la diferenciación CD8, incluso Runx3. Este último inhibe la expresión de CD4, por sí mismo, así como de ThPok. Esto apenas es el principio del entendimiento de las redes transcripcionales que regulan los programas de desarrollo CD4 y CD8. Los miRNA probablemente también desempeñan un papel; algunos ya han quedado implicados en la diferenciación de células T positivo único CD8. Está claro que hay más por venir.

Los timocitos doble positivo pueden comprometerse hacia otros tipos de linfocitos

Poblaciones pequeñas de timocitos dp también se comprometen hacia otros tipos de célula T, incluso las líneas de célula T nk, célula T reguladora, y linfocito epitelial (iel). Las células nkt (que incluyen células maduras que expresan sólo CD4 y células que han perdido tanto CD4 como CD8) desempeñan un papel en la inmunidad innata (capítulo 5) y expresan un tcr que incluye una cadena TCRα invariante (Vα14). Por esta razón, las células nkt a veces se denominan células iNKT (la i significa invariante). Su tcr invariante no interactúa con mhc clásico, sino con la molécula relacionada CD1, que presenta glucolípidos, no péptidos (capítulo 8). Los linfocitos intraepiteliales (iel), la mayor parte de los cuales es CD8⁺, también tienen características de células de la inmunidad innata y recorren superficies mucosas. Las células T reguladoras (T_REG), otro subgrupo CD4⁺ (véase más adelante), sofocan respuestas inmunitarias adaptativas. Se cree que las tres subpoblaciones se desarrollan a partir de timocitos dp en respuesta a interacciones de tcr de alta afinidad, autorreactivas —las mismas interacciones, de hecho, que median la selección negativa—. Qué determina si un timocito pasa por selección negativa o por una vía de desarrollo alternativa persiste como un tema de mucho interés.

Una vez que un timocito pasa exitosamente por selección y toma una decisión de línea, entra a un estado quiescente y sale del timo. Las bases celular y molecular para el egreso de timocito se desconocieron hasta que se entendieron mejor los receptores y ligandos que regulan la migración celular. Como se mencionó, un grupo de investigadores descubrió que los timocitos no entraron en la médula si tuvieron deficiencia del receptor de quimiocina CCR7. No obstante, estas células aún fueron capaces de salir del timo, lo que indica que otros receptores controlan la salida desde el timo. La identidad de este receptor se descubrió cuando investigadores encontraron que pocas células T lograban salir del timo, si es que alguna lograba hacerlo, en un ratón con deleción (knockout) de un receptor de esfingosina-1-fosfato (sipr).

Observaciones actuales sugieren que una cascada de eventos controla estas etapas finales de la maduración: las señales de tcr que seleccionan de manera positiva regulan en dirección ascendente Foxo1, un factor de transcripción que controla la expresión de varios genes relacionados con la función de célula T. Foxo1 regula la expresión de Klf2, que, a su vez, regula en dirección ascendente sipr. Foxo1 también regula tanto el IL-7R, que ayuda a mantener la supervivencia de células T maduras, como CCR7, el receptor de quimiocina que dirige el tráfico de células T maduras hacia los ganglios linfáticos.

Las células T maduras que salen del timo se denominan emigrantes tímicos recientes (rte). Ahora está claro que los emigrantes tímicos recientes no son tan funcionalmente maduros como casi todas las células T vírgenes en la periferia: no proliferan o secretan citocinas de modo tan vigoroso en respuesta a estimulación de receptor de célula T. Los rte también pueden distinguirse de casi todas las células T vírgenes periféricas porque sus cifras de expresión de varias proteínas de superficie (p. ej., los marcadores de maduración hsa y Qa-2, así como el receptor de IL-7) son más similares a las de sus ancestros timocitos inmaduros que sus descendentes células T por completo maduras. Los investigadores están en particular interesados por los rte porque son una importante fuente de células T maduras en individuos que presentan linfopenia (es decir, que tienen un fondo reducido de linfocitos funcionales), incluso personas que han recibido quimioterapia, recién nacidos, y los ancianos. Si bien la investigación se encuentra en proceso, los estudios sugieren que la maduración final de estas células está influida por sus interacciones con ligandos tanto mhc como no mhc en órganos linfoides secundarios.

Como se ha observado, la selección negativa de timocitos puede deshacerse de un repertorio de células T en desarrollo que expresan una afinidad alta tanto por antígenos propios omnipresentes como, gracias a la actividad de aire, por antígenos específicos para tejido. Sin embargo, la selección negativa en el timo es imperfecta. Células T autorreactivas escapan, sea porque tienen afinidad demasiado baja por lo propio como para inducir lesión clonal, o sucede que no han recorrido la combinación correcta de antígeno/mhc específico para tejido. El organismo ha adquirido por evolución varios otros mecanismos para evitar la autoinmunidad, incluso el que se ha convertido en un importante foco de interés para inmunólogos: el desarrollo tanto en el timo como en la periferia de un fascinante grupo de células ahora conocido como células T reguladoras.

Las células T_REG regulan de manera negativa respuestas inmunitarias

Las células T reguladoras (células T REG) pueden inhibir la proliferación de otras poblaciones de células T in vitro, lo que suprime con eficacia respuestas inmunitarias autorreactivas. Expresan sobre su superficie CD4, así como CD25, la cadena α del receptor de IL-2. Empero, las células T_REG son identificadas de manera más definitiva por su expresión de un regulador transcripcional maestro, FoxP3, cuya expresión es necesaria y suficiente para inducir diferenciación hacia la línea T_REG.

Las células T_REG pueden desarrollarse en el timo, y parecen representar un destino alternativo para células T autorreactivas. Como se ha observado, casi todos los timocitos que expresan receptores con afinidad alta por antígeno propio mueren por selección negativa. Con todo, una pequeña fracción parece comprometerse a la línea de células T reguladoras, y sale del timo para recorrer el organismo e impedir reacciones autoinmunitarias. Qué determina si un timocito autorreactivo muere o se diferencia hacia una célula T_REG aún es una pregunta abierta. Los investigadores están tratando de entender si la elección se hace con base en diferencias sutiles de la afinidad por lo propio, o en diferencias en su estado de maduración cuando reciben una señal de alta afinidad. Investigación reciente sugiere que las T_REG se desarrollan en un nicho microambiental singular dentro del timo, y que el espacio disponible para células en desarrollo en este nicho es limitado. Estos datos sugieren que los timocitos que se comprometen hacia la línea de células T reguladoras tienen probabilidades de recibir señales estimuladoras únicas. Estas T_REG naturales comparten la periferia con T_REG inducidas que pueden desarrollarse a partir de células T maduras convencionales que son expuestas a citocinas TGF-β e IL-10 (capítulo 11).

Estudios en animales muestran que miembros de la población T_REG FoxP3⁺ inhiben el desarrollo de enfermedades autoinmunitarias, como enfermedad inflamatoria intestinal inducida experimentalmente, encefalitis alérgica experimental y diabetes autoinmunitaria. La supresión por estas células reguladoras es específica para antígeno porque depende de activación por medio del receptor de célula T. La manera exacta en la cual las T_REG sofocan respuestas aún es motivo de debate, aunque probablemente lo hacen mediante diversos medios: inhibición directa de la capacidad de células presentadoras de antígeno para activar células T, muerte directa de células T, inhibición indirecta de la actividad de células T al secretar las citocinas inhibidoras IL-10 y TGF-β, y/o al agotar el ambiente local de citocinas estimuladoras como IL-2 (figura 9-10).

La existencia de células T reguladoras que suprimen de manera específica respuestas inmunitarias tiene implicaciones clínicas. El agotamiento o la inhibición de células T_REG antes de inmunización puede aumentar respuestas inmunitarias a vacunas convencionales. La eliminación de células T que suprimen respuestas a antígenos tumorales también puede facilitar el desarrollo de inmunidad antitumor. Por el contrario, el incremento de la actividad supresora de poblaciones de células T reguladoras podría ser útil en el tratamiento de enfermedades alérgicas o autoinmunitarias. La capacidad para incrementar la actividad de poblaciones de células T reguladoras también podría ser útil en la supresión de rechazo de órgano y tejido. Los investigadores que estén trabajando en el futuro sobre esta población de células reguladoras buscarán conocimientos más profundos acerca de los mecanismos mediante los cuales los miembros de las poblaciones de células T FoxP3⁺ regulan respuestas inmunitarias. También harán esfuerzos determinados por descubrir maneras en que las actividades de estas poblaciones puedan aumentarse a fin de disminuir respuestas inmunitarias no deseadas, y disminuirse para promover las deseables.

Los mecanismos periféricos de tolerancia también protegen contra timocitos autorreactivos

El cuerpo ha adquirido por evolución varios otros mecanismos para manejar las células autorreactivas que han escapado hacia la periferia. En resumen, muchos antígenos están “ocultos” de células T autorreactivas porque sólo un subgrupo de células (apc profesionales) expresan las moléculas coestimuladoras necesarias para iniciar la respuesta inmunitaria. Las células T vírgenes autorreactivas que pueden ver una combinación de mhc/péptido propio sobre una célula presentadora de antígeno no profesional no recibirán las señales coestimuladoras correctas, y no se dividirán ni se diferenciarán. Por ejemplo, si un timocito específico para un péptido sintetizado por una célula renal escapó desde el timo, no será activado a menos que ese péptido sea presentado sobre una célula presentadora de antígeno profesional. Las células renales no expresan los ligandos coestimuladores requeridos para activar una célula T CD4⁺ o una CD8⁺. De hecho, una interacción de afinidad alta con combinaciones de mhc/péptido sobre la superficie de la célula renal, en ausencia de ligandos coestimuladores, podría dar lugar a anergia de célula T —otro mecanismo de tolerancia periférica (capítulo 11)—. Las consecuencias clínicas de los fracasos de las tolerancias central y periférica se comentarán en el capítulo 16.

Como se ha visto en el presente capítulo, y como se verá en el capítulo 10, la apoptosis tiene un papel prominente durante el desarrollo de linfocitos T y B. El desarrollo de células T es un proceso en particular costoso para el huésped. Se estima que 95 a 98% de los timocitos no madura —casi todos mueren por apoptosis dentro del timo, sea porque no hacen un reordenamiento productivo de gen que codifica para tcr, o porque no interactúan con mhc propio—. Algunos (2 a 5%) mueren, también por medio de apoptosis, porque son seleccionados de manera negativa.

La apoptosis no sólo conforma el repertorio de linfocitos en desarrollo; también regula la homeostasis de células inmunitarias al devolver poblaciones mieloides, de células T y de células B a sus cifras apropiadas después de periodos de proliferación intensa desencadenados por infección, y es el medio por el cual una célula muere después de ser establecida como objetivo por células T citotóxicas o células nk. Comprender sus características biológicas fundamentales es una parte importante de un entendimiento general de la función de las células inmunitarias. Dado que la apoptosis es una parte tan crucial del desarrollo de linfocitos, en este capítulo se describirá brevemente el proceso apoptótico y cómo está regulado.

La apoptosis permite que las células mueran sin desencadenar una respuesta inflamatoria

La apoptosis, o muerte celular programada, es un proceso dependiente de energía mediante el cual una célula desencadena su propia muerte. Se contrasta más a menudo con la necrosis, una forma de muerte celular que surge por lesión o toxicidad (figura 9-11a). En la necrosis, las células lesionadas muestran tumefacción y estallan, lo cual libera su contenido y posiblemente desencadena una respuesta inflamatoria perjudicial. En contraste, las células apoptóticas desmantelan su contenido sin alterar su membrana, e inducen a las células vecinas a fagocitarlas antes de que puedan liberar cualquier material inflamatorio. Los cambios morfológicos asociados con apoptosis comprenden un decremento pronunciado del volumen celular; modificación del citoesqueleto, que da lugar a formación de ampollas de membrana; una condensación de la cromatina, y degradación del dna hacia fragmentos (figura 9-11b).

Diferentes estímulos inician la apoptosis, pero todos activan caspasas

Si bien las señales para que un linfocito muera pueden ser emitidas de varias maneras, todas las señales apoptóticas finalmente activan una clase de proteasas llamadas caspasas. La activación de caspasa es común a todas las vías de muerte conocidas tanto en vertebrados como en invertebrados, lo que demuestra que la apoptosis es un proceso antiguo. Muchas de las moléculas que participan en la apoptosis se han conservado durante la evolución (cuadro 9-2).

El papel de las caspasas fue revelado por vez primera por estudios de muerte celular programada vinculada con el desarrollo en el nematodo Caenorhabditis elegans, en el cual se mostró que la muerte de células depende por completo de la actividad de un gen que codificó para una cisteína proteasa con especificidad por residuos de ácido aspártico. Se sabe que los mamíferos tienen al menos 14 cisteína-aspártico proteasas, o caspasas, y todas las muertes celulares apoptóticas requieren la actividad de al menos un subgrupo de estas moléculas.

¿De qué modo las caspasas desencadenan muerte celular? Las vías apoptóticas típicamente comprenden dos clases de caspasas, ambas de las cuales son mantenidas en un estado inactivo en tanto no se inicia apoptosis. Las caspasas iniciadoras son activadas por un estímulo de muerte y, a su vez, activan caspasas efectoras, que ejecutan el programa de muerte al 1) dividir blancos cruciales necesarios para la supervivencia celular (p. ej., proteínas del citoesqueleto), así como 2) activar otras enzimas que llevan a cabo el desmantelamiento de la célula. Finalmente, la cascada catalítica iniciada por las caspasas induce muerte por medio de un desmontaje ordenado de moléculas intracelulares. También da lugar al empaque del contenido celular hacia vesículas que finalmente son fagocitadas.

Los estímulos que llevan apoptosis pueden dividirse en dos categorías con base en cómo activan las caspasas efectoras. Señales como radiación, estrés y supresión de factor de crecimiento inducen la activación de caspasa y la apoptosis por medio de la vía intrínseca que está mediada por moléculas mitocondriales, mientras que los ligandos unidos a membrana o solubles que se unen a receptores de membrana estimulan la activación de caspasa, y la apoptosis, por medio de la vía extrínseca.

La apoptosis de células T periféricas está mediada por la vía extrínseca (Fas)

Fuera del timo, la mayor parte de la apoptosis mediada por tcr de células T maduras es inducida por medio de la vía extrínseca mediante receptores de muerte asociados a membrana, incluso Fas (CD95). La estimulación repetida o persistente de células T periféricas por medio de sus receptores de célula T da lugar a la coexpresión tanto de Fas como de ligando Fas (FasL) sobre células T, lo que finalmente da pie a muerte mediada por Fas/FasL. La apoptosis inducida por activación de receptor de antígeno se llama muerte celular inducida por activación (aicd) y es un importante mecanismo homeostático, que ayuda a reducir el fondo común de células T activadas después de que se elimina el antígeno, y ayuda a eliminar células T autorreactivas solitarias que son estimuladas por antígenos propios.

La cascada de señalización iniciada por Fas (y por todos los receptores de muerte) lleva directamente a la activación de la caspasa iniciadora, la caspasa-8. Cuando FasL se une a Fas, la procaspasa-8, una forma inactiva de caspasa-8, es reclutada a la cola intracelular de Fas por una molécula adaptadora llamada fadd (proteína asociada a Fas con un dominio de muerte [death]) (figura 9-12a). La agregación de procaspasa-8 da lugar a su división y conversión en caspasa-8 activa, que a continuación activa la caspasa-3 efectora, que a su vez inicia la cascada proteolítica que lleva a la muerte de la célula.

La importancia de Fas y FasL en la eliminación de células T activadas maduras es subrayada por anormalidades en ratones lpr/lpr, una mutación de pérdida de función en Fas que ocurre de manera natural. Cuando las células T quedan activadas en estos ratones, la vía de Fas/FasL no es operativa, y las células T estimuladas siguen proliferando. Estos ratones desarrollan de manera espontánea ganglios linfáticos notoriamente grandes que están llenos de números excesivos de linfocitos. Finalmente, presentan enfermedad autoinmunitaria, lo que demuestra con claridad las consecuencias de un fracaso para eliminar células T activadas. Un mutante espontáneo adicional, gld/gld, tiene la pérdida de función complementaria. Estos ratones carecen de FasL funcional, y muestran anormalidades muy similares a las que se encuentran en los ratones lpr/lpr. A últimas fechas se han informado defectos de Fas en humanos. Como es de esperarse, estos individuos muestran características de enfermedad autoinmunitaria (recuadro de Enfoque clínico 9-3).

Fas y FasL son miembros de una familia de receptor/ligandos relacionados, incluso factor de necrosis tumoral (tnf) y su ligando, tnfr (receptor de factor de necrosis tumoral), que también pueden inducir apoptosis por medio de la activación de caspasa-8 seguida por la activación de caspasas efectoras como la caspasa-3 (figura 4-14).

La selección negativa mediada por tcr en el timo induce la vía apoptótica intrínseca (mediada por mitocondrias)

Las interacciones Fas/FasL no parecen desempeñar un papel fundamental en la selección negativa en el timo. En lugar de eso, las señales que seleccionan de manera negativa mediadas por tcr en el timo inducen una ruta para apoptosis en la cual las mitocondrias desempeñan un papel fundamental (figura 9-12b). En vías apoptóticas dependientes de mitocondrias (intrínsecas), el citocromo c, que normalmente reside entre las membranas mitocondriales interna y externa, escapa hacia el citosol. La liberación de citocromo c está regulada por varias familias de proteínas. En los timocitos, tanto Bim, un miembro de la familia Bcl-2, como Nur77, un receptor nuclear huérfano, desempeñan un papel.

En el citosol, el citocromo c se une a una proteína conocida como Apaf-1 (factor activador de proteasa apoptótica 1), que a continuación se oligomeriza. La unión de Apaf-1 oligomérica a procaspasa-9 da lugar a su transformación en caspasa-9 activa, una caspasa iniciadora. El complejo de citocromo c/Apaf-1/caspasa-9, llamado el apoptosoma, divide de manera proteolítica la procaspasa-3, lo que genera caspasa-3 activa, que inicia la cascada de reacciones que matan la célula.

Despierta interés que si bien más de 95% de los timocitos muere durante el desarrollo, es muy difícil encontrar timocitos apoptóticos en un timo normal. Investigadores mostraron que si se inhibe la actividad de macrófagos tímicos, los timocitos apoptóticos son abundantemente evidentes. Este experimento subrayó de modo notorio tanto la importancia como la eficiencia de los fagocitos en la eliminación del timo de células que están muriendo.

La muerte celular inducida por Fas/FasL es veloz, con activación rápida de la cascada de la caspasa que conduce a muerte celular en 2 a 4 h. Por otro lado, la selección negativa inducida por tcr parece involucrar una vía con más circuitos, que requiere la activación de varios procesos, incluso falla de la membrana mitocondrial, la liberación de citocromo c, y la formación del apoptosoma antes de que las caspasas queden involucradas. En consecuencia, la selección negativa mediada por tcr puede requerir hasta 8 a 10 h.

Miembros de la familia Bcl-2 pueden inhibir apoptosis o inducirla

La familia de genes Bcl-2 (linfoma de células B 2), que regulan la liberación de citocromo c, desempeña un papel prominente en los aspectos fisiológicos de células inmunitarias. Incluyen proteínas tanto antiapoptóticas como proapoptóticas que pueden insertarse en la membrana mitocondrial. Si bien su mecanismo de acción preciso aún es controvertido, el equilibrio de miembros de la familia proapoptóticos y antiapoptóticos influye sobre la respuesta de una célula al estrés. La familia Bcl-2 también incluye un importante tercer grupo de proteínas, la familia BH3, todas las cuales no se insertan en la membrana mitocondrial, sino que inhiben miembros de la familia Bcl-2 antiapoptóticos y, así, finalmente son proapoptóticos.

Los estímulos apoptóticos intrínsecos actúan, en parte, al activar miembros de la familia BH3, que a menudo están secuestrados desde las mitocondrias en una célula sana. Por ejemplo, la selección negativa mediada por tcr activa Bim, una proteína de la familia BH3 que facilita la liberación de citocromo c (figura 9-12b). Aun así, incluso la vía extrínseca puede activar miembros de la familia BH3. Por ejemplo, la caspasa-8 generada mediante la vía Fas divide el miembro de la familia BH3, Bid, lo cual lo libera del secuestro, y le permite activar la vía de muerte mitocondrial.

El miembro característico de esta familia de genes, bcl-2, se descubrió cerca del punto de rotura de una translocación cromosómica en un cáncer conocido como linfoma de células B humano. La translocación movió el gen bcl-2 hacia el locus de cadena pesada de inmunoglobulina, lo que dio lugar a la transcripción de bcl-2 junto con el gen que codifica para inmunoglobulina, con sobreproducción consiguiente de la proteína Bcl-2 codificada por las células de linfoma. Las cifras altas resultantes de Bcl-2 dieron lugar a la acumulación de células B de vida prolongada, y contribuyeron a su transformación hacia células de linfoma cancerosas.

Las cifras de Bcl-2 desempeñan un papel importante en la regulación del lapso de vida normal de diversas líneas de células hematopoyéticas, incluso linfocitos. Un adulto normal tiene alrededor de 5 L de sangre, con aproximadamente 2 000 linfocitos/mm³, para un total de alrededor de 10¹¹ linfocitos circulantes. Durante la infección aguda, el recuento de linfocitos aumenta cuatro veces o más. El sistema inmunitario no puede sostener un incremento masivo del número de células durante un periodo prolongado, de modo que el sistema debe eliminar linfocitos activados innecesarios una vez que la amenaza antigénica ha pasado. Se ha encontrado que los linfocitos activados expresan cifras más bajas de Bcl-2 y, por ende, son más susceptibles a la inducción de muerte apoptótica que los linfocitos vírgenes o las células de memoria. De cualquier modo, si los linfocitos siguen siendo activados por antígeno, las señales recibidas durante activación bloquean la señal apoptótica. A medida que las cifras de antígeno disminuyen, se reduce la magnitud de las señales que bloquean la apoptosis, y los linfocitos empiezan a morir por apoptosis.

• Los progenitores de leucocitos no comprometidos entran al timo desde la médula ósea. Se requieren interacciones de Notch/ligando Notch para el compromiso hacia célula T.

• Las células T inmaduras se llaman timocitos, y las etapas de desarrollo pueden definirse ampliamente por la expresión de los correceptores CD4 y CD8. Los timocitos más inmaduros no expresan ni uno ni otro correceptor, y se denominan células CD4^–CD8^– o doble negativo (dn). Éstas progresan a la etapa de CD4⁺CD8⁺ (doble positivo o dp), que a su vez maduran hacia las etapas CD4⁺CD8^– o CD4^–CD8⁺ (positivo único o sp).

• Los timocitos dn progresan por cuatro etapas de desarrollo (DN1 a DN4) definidas por la expresión de CD44, CD25 y c-Kit. Durante estas etapas proliferan y reordenan los genes que codifican para receptor de antígeno TCRβ, δ y γ.

• Los timocitos que reordenan genes que codifican para receptor γ y δ maduran exitosamente a la línea TCRγδ.

• Los linfocitos que reordenan con éxito la cadena de receptor β son detectados mediante un proceso que se llama selección β. La selección β es iniciada por montaje de la proteína TCRβ con una cadena TCRα sustituto, invariante y proteínas del complejo CD3. El montaje de este pre-tcr da lugar a compromiso hacia la línea TCRαβ, otro brote de proliferación, maduración hacia la etapa de desarrollo dp, e inicio de reordenamiento de TCRα.

• Los timocitos dp son la subpoblación más abundante en el timo, y son las primeras células que expresan un receptor TCRαβ maduro. Son los blancos de selecciones positiva y negativa, de las cuales dependen la autotolerancia y la restricción a mhc propio, respectivamente.

• Las selecciones positiva y negativa están reguladas por la afinidad de un tcr de timocitos dp por complejos de mhc/péptido propio expresados por el epitelio tímico.

• Las interacciones de tcr/mhc/péptido de alta afinidad dan lugar a selección negativa, típicamente al iniciar apoptosis (de lesión clonal).

• Las señales de afinidad baja/intermedia dan lugar a selección positiva, e inician un programa de maduración a las líneas positivo único CD4⁺ auxiliar o CD8⁺ citotóxica.

• Casi todos los timocitos (95%) no interactúan con cualesquiera mhc/péptidos propios expresados por el epitelio tímico, y mueren por abandono.

• La distinción entre cascadas de señalización de tcr que activan selección positiva en contraposición con negativa no se entiende por completo, pero tal vez involucre diferencias en la emisión de señales por mapk y Ca²⁺.

• Los timocitos dp seleccionados de manera positiva tienen que decidir si van a convertirse en células T CD4⁺ auxiliares o CD8⁺ citotóxicas. Este proceso, llamado compromiso de línea, parece depender de la continuidad de las señales que los linfocitos dp seleccionados de manera positiva reciben por medio de su tcr.

• Los timocitos cuyo tcr interactúa de preferencia con mhc clase II generan una señal continua que inicia un programa de desarrollo de célula T auxiliar CD4⁺.

• Los timocitos cuyos tcr interactúan de preferencia con mhc clase I no pueden generar una señal continua porque las cifras de superficie de CD8 son reguladas en dirección descendente en respuesta a selección positiva. La interrupción de la emisión de señales, seguida por estimulación adicional, inicia un programa de desarrollo CD8.

• Los factores de transcripción Th-Pok y Runx3 desempeñan papeles importantes en el compromiso de célula auxiliar CD4⁺ y célula citotóxica CD8⁺. Funcionan en parte al regularse de manera recíproca uno a otro.

• Los timocitos seleccionados de manera positiva migran desde la corteza hacia la médula del timo por medio de interacciones con el receptor de quimiocina CCR7. Estas células, en transición desde la etapa de desarrollo dp hacia la sp, son seleccionadas de manera negativa para antígenos específicos para tejido en la médula. Ésta es la segunda oportunidad para eliminar células T autorreactivas del repertorio que se está desarrollando.

• La corteza y la médula tímicas desempeñan funciones distintas en el timo. Las células epiteliales medulares, no así las células epiteliales corticales, expresan el factor de transcripción aire, del cual depende su capacidad singular para expresar antígenos específicos para tejido.

• Los timocitos por completo maduros salen del timo por medio de interacciones mediante el receptor de esfingosina-1-fosfato (S1PR) y pasan por maduración funcional final en tejidos linfoides periféricos.

• Un pequeño porcentaje de células también se desarrolla dentro del timo hacia otras líneas de células, entre ellas células T nk, iel y células T reguladoras.

• Las células T reguladoras que se desarrollan en el timo se llaman T_REG naturales. Comparten la periferia con células T reguladoras que se desarrollan a partir de células T convencionales (T_REG inducidas) y desempeñan un papel importante en la inhibición de respuestas autoinmunitarias.

• La apoptosis, un proceso de muerte celular que es iniciado internamente y está muy regulado, tiene una influencia importante sobre la forma del repertorio de células T. Los timocitos que no pasan la selección β (y que no expresan exitosamente un complejo TCRγδ) mueren por apoptosis; 95% de los timocitos dp en desarrollo también muere por apoptosis, casi todos porque no reciben suficiente señalización de tcr (muerte por abandono), y una población más pequeña porque recibe una cifra muy alta de emisión de señales de tcr (selección negativa).

• El proceso por el cual una célula sufre señalización de apoptosis está conservado desde el punto de vista evolutivo, y es inspirado por muchas interacciones de receptor diferentes en casi todos los tipos de células en el organismo, si no es que en todos.

• Los estímulos apoptóticos activan receptores de muerte (vía extrínseca) o liberación de citocromo c mitocondrial (vía intrínseca). Ambas vías finalmente activan caspasas efectoras, que finalizan eventos de muerte celular.

• Las células apoptóticas son fagocitadas rápidamente por fagocitos vecinos y, por esta razón, son difíciles de detectar en tejidos vivos.

• Los miembros de la familia Bcl-2 incluyen miembros de la familia tanto antiapoptóticos como proapoptóticos que residen en la membrana mitocondrial y regulan la liberación de citocromo c. Un tercer grupo de miembros de la familia, las proteínas BH3 proapoptóticas, puede ser activado por estímulos apoptóticos, que favorecen un cambio del equilibrio de la actividad de miembros de la familia Bcl-2 en la membrana mitocondrial hacia liberación de citocromo c.

Sitios web útiles

http://www.bio.davidson.edu/courses/immunology/Flash/Main.htm Una animación generada por el doctor Víctor Lemas de eventos de selección positiva y de selección negativa en el timo, usada en el Davidson College.

http://www.bio.davidson.edu/courses/movies.html Una lista completa de animaciones montadas por individuos asociados con el Davidson College, y en muchos casos generadas por ellos.

http://bmc.med.utoronto.ca/student_video_gallery.php?title=images/stories/videos/Janice_Yau&h=360&w=640&m4v=1 Otra animación del desarrollo de célula T generada como parte de un proyecto de maestría por Janice Yau. Ésta es de un sitio impresionante que presenta múltiples proyectos de video generados por estudiantes de maestría en la Universidad de Toronto en el Mississauga’s Biomedical Communications Graduate Program.

http://bio-alive.com/categories/apoptosis.htm Videos de células que están sufriendo apoptosis.

www.celldeath.de/encyclo/aporev/aporev.htm Revisión en línea detallada de los aspectos biológicos de la apoptosis.

www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2008650 Acceso al artículo original de Kerr, Wyllie y Currie en el British Journal of Cancer, publicado en 1972, donde se acuñó el término apoptosis.

PREGUNTAS DE ENFOQUE CLÍNICO

1. La susceptibilidad a enfermedades autoinmunitarias a menudo tiene una base genética, y se ha enlazado con muchos loci de genes diferentes. Identifique tres genes posibles que no sean los genes que codifican para Fas y aire (cuya conexión con la autoinmunidad se ha descrito de manera explícita en este capítulo) que podrían estar involucrados en un incremento de la susceptibilidad a enfermedad autoinmunitaria. Explique su razonamiento.

2. La susceptibilidad a muchas enfermedades autoinmunitarias se ha enlazado a variantes de gen que codifica para mhc. Uno de los mejores ejemplos de ese enlace es proporcionado por la esclerosis múltiple (ms), una enfermedad autoinmunitaria causada por células T autorreactivas cuya actividad finalmente daña las vainas de mielina alrededor de neuronas. La susceptibilidad a ms se ha asociado constantemente con variantes en el gen que codifica para HLA-DR2. Si bien este enlace se reconoció por vez primera en 1972, aún no se entiende por completo la base de esta susceptibilidad. En un artículo de revisión reciente se ofreció una perspectiva sobre las razones para el enlace entre variaciones del mhc y enfermedad autoinmunitaria. Los autores señalan que “no se entienden claramente los mecanismos que fundamentan la asociación del mhc con enfermedad autoinmunitaria. Una opinión sostenida desde hace mucho tiempo sugiere un rompimiento de la tolerancia inmunológica a antígenos propios por medio de presentación aberrante por clase II de péptidos propios o extraños a linfocitos T autorreactivos. Así, parece probable que alelos de mhc clase II específicos determinen el establecimiento de autoantígenos particulares como objetivos, lo que da por resultado asociaciones específicas para enfermedad”. (Fernando, M.M.A., et al. 2008 Defining the role of the MHC in autoimmunity: A review and pooled analysis. PLoS Genet 4:4:e1000024. doi:10.1371/journal.pgen.1000024.)

   1. Parafrasee esta perspectiva usando sus propias palabras. ¿A qué, específicamente, podrían referirse los autores con “presentación aberrante por clase II… a linfocitos T autorreactivos”?

   2. (Pregunta avanzada.) Si bien esta especulación tiene cierto mérito, no resuelve todas las preguntas. ¿Por qué? Haga una pregunta que esta explicación inspire o que no responda.

   3. (Pregunta muy avanzada.) Ofrezca una adición a la explicación (o una alternativa) que ayude a resolver la pregunta que usted planteó arriba.

3. Durante un periodo de varios años, un grupo de niños y adolescentes reciben con regularidad dosis del compuesto X, un fármaco que salva vidas. No obstante, además de sus efectos beneficiosos, se encontró que este fármaco interfiere con la señalización mediada por Fas.

   1. ¿Qué manifestaciones clínicas de este efecto secundario del compuesto X podrían observarse en estos pacientes?

   2. Si leucocitos provenientes de un paciente afectado son teñidos con anticuerpo anti-CD4 marcado con fluoresceína y un anticuerpo anti-CD8 marcado con ficoeritrina, ¿qué podría observarse en el análisis de estas células con citometría de flujo? ¿Qué patrón se esperaría si el mismo procedimiento se efectuara en leucocitos provenientes de un testigo sano?

PREGUNTAS DE ESTUDIO

1. Cada una de las afirmaciones que siguen es falsa. Corríjalas (y explique su[s] corrección[es]).

   Los ratones con deleción (knockout) que carecen de moléculas de mhc clase I no producen timocitos CD4⁺ maduros.

   La selección β inicia selección negativa.

   La selección negativa a antígenos específicos para tejido ocurre en la corteza del timo.

   Casi todos los timocitos mueren en el timo porque son autorreactivos.

   La vía extrínseca de apoptosis nunca activa la vía intrínseca.

   El citocromo c es una importante molécula torrente abajo en la vía apoptótica extrínseca.

   Bcl-2 aumenta la actividad de Bax y, por ende, inhibe la apoptosis.

2. Mientras que casi todas las células T en el organismo del ser humano expresan un tcr αβ, hasta 5% de las células T expresa en lugar de eso tcr γδ. Explique la diferencia en el reconocimiento de antígeno entre estos dos tipos de células.

3. Usted ha marcado con fluoresceína anticuerpos anti-CD4 y con ficoeritrina anticuerpos anti-CD8. Use estos anticuerpos para teñir timocitos y células de ganglio linfático provenientes de ratones normales y de ratones con deleción (knockout) de RAG-1. En las formas que aparecen a continuación, dibuje los gráficos de facs que esperaría.

   

4. ¿Qué etapas del desarrollo de célula T (DN1, DN2, DN3, DN4, dp, sp CD4, o sp CD8) estarían afectadas en ratones con las modificaciones genéticas que siguen? Justifique sus respuestas.

   1. Ratones que no expresan mhc clase II.

   2. Ratones que no expresan aire.

   3. Ratones que no expresan la cadena TCRα.

5. Usted tiñe timocitos con anticuerpos anti-CD3 conjugados con pe y anticuerpos anti-TCRβ conjugados con fitc. Casi todas las células se tiñen con ambos. Sin embargo, encuentra una proporción de células que no se tiñen con uno ni otro anticuerpo. También encuentra una pequeña población que se tiñe con anticuerpos anti-CD3, pero no con anticuerpos anti-TCRβ. ¿Qué poblaciones de timocito podrían representar cada una de estas poblaciones?

6. Usted inmuniza un ratón H-2^k con ovoalbúmina de pollo (una proteína contra la cual el ratón generará una respuesta inmunitaria) y aísla una célula T madura CD4⁺ específica para un péptido de la ovoalbúmina. Usted clona los genes TCR αβ de esta línea celular y los usa para preparar ratones transgénicos con el haplotipo H-2^k o H-2^d.

   1. ¿Qué método puede usar para distinguir entre timocitos y maduros y timocitos CD4⁺ maduros en los ratones transgénicos?

   2. ¿Los timocitos provenientes de un ratón transgénico tcr del trasfondo H-2^k tendrían una proporción de timocitos CD4⁺ que es más alta, más baja, o igual que la de un ratón salvaje?

   3. ¿Los timocitos de un ratón transgénico tcr del trasfondo H-2^d tendrían una proporción de timocitos CD4⁺ que es más alta, más baja, o igual, que la de un ratón salvaje?

      Especule y explique su respuesta.

   4. Usted encuentra una manera de “hacer” que el epitelio medular de un ratón transgénico tcr H-2^k exprese y presente el péptido ovoalbúmina para el cual su célula T es específica. ¿Cómo se vería el perfil CD4 en contraposición con CD8 de un timo transgénico tcr en estos ratones?

      Usted también encuentra una manera de “hacer” que el epitelio cortical exprese este péptido de ovoalbúmina en su dímero de mhc clase II. ¿Cómo se vería el perfil CD4 en contraposición con CD8 de este timo transgénico tcr?

7. En sus experimentos clásicos en ratón quimérico, Zinkernagel tomó médula ósea de un ratón de un haplotipo de mhc (ratón 1) y un timo de un ratón de otro haplotipo de mhc (ratón 2) y los trasplantó hacia un tercer ratón, que fue objeto de timectomía e irradiación letal. A continuación inmunizó este ratón reconstituido con el virus de la coriomeningitis linfocítica (lcmv) y examinó la actividad de las células T maduras aisladas a partir del bazo y los ganglios linfáticos del ratón.

   Estuvo específicamente interesado en ver si las células T CD8⁺ maduras de estos ratones podían matar células blanco infectadas por lcmv con el haplotipo de mhc del ratón 1, 2 o 3. Los resultados de dos de esos experimentos usando ratones C57BL/6 cepa H-2^b y ratones BALB/c cepa H-2^d como donantes de médula ósea y del timo, respectivamente, se muestran en el cuadro que sigue.

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   				Lisis de células blanco infectadas por LCMV
   Experimento	Donante de médula ósea	Donante de timo	Receptor timectomi zado e irradiado con rayos X	H-2d	H-2k	H-2b
   A	C57BL/6 (H-2b)	BALB/c (H-2d)	C57BL/6 × BALB/c	+	–	–
   B	BALB/c (H-2d)	C57BL/6 (H-2b)	C57BL/6 × BALB/c	–	–	+

   1. ¿Por qué las células blanco H-2^b no mostraron lisis en el experimento A, pero la mostraron en el experimento B?

   2. ¿Por qué las células blanco H-2^k no mostraron lisis en ninguno de los experimentos?

8. Usted tiene una clona de CTL CD8⁺ (de un ratón H-2^k) que tiene un receptor de célula T específico para el antígeno H-Y. Usted clona los genes que codifican para tcr αβ de esta línea de células clonada y los usa para preparar ratones transgénicos con el haplotipo H-2^k o H-2^d.

   1. ¿Cómo puede distinguir entre los timocitos inmaduros y los timocitos CD8⁺ maduros en los ratones transgénicos?

   2. Para cada uno de los ratones transgénicos que siguen, indique con (1) o (2) si el ratón tendría timocitos doble positivo inmaduros y timocitos CD8⁺ maduros que porten el receptor de célula T transgénico: hembra H-2^k, macho H-2^k, hembra H-2^d, macho H-2^d.

   3. Explique sus respuestas para los ratones transgénicos H-2^k.

   4. Explique sus respuestas para los ratones transgénicos H-2^d.

9. Para demostrar experimentalmente selección tímica positiva, investigadores analizaron los timocitos de ratones H-2^b normales, que tienen una deleción del gen ie clase II, y de ratones H-2^b en los cuales se había efectuado deleción (knockout) del gen ia clase II.

   1. ¿Qué moléculas de mhc encontraría usted sobre células presentadoras de antígeno provenientes de los ratones H-2^b normales?

   2. ¿Cuáles moléculas de mhc encontraría usted sobre células presentadoras de antígeno provenientes de los ratones H-2^b con deleción (knockout) de ia?

   3. ¿Esperaría encontrar células T CD4⁺, células T CD8⁺, o ambas, en cada tipo de ratón? ¿Por qué?

10. Usted desea determinar el porcentaje de diversos tipos de timocitos en una muestra de células provenientes de timos de ratón usando el método de inmunofluorescencia indirecta.

    1. Primero tiñe la muestra con anticuerpo anti-CD3 de cabra (anticuerpo primario) y después con anticuerpo Ig anti-cabra marcado con fitc de conejo (anticuerpo secundario), que emite un color verde. El análisis mediante citometría de flujo de la muestra teñida indica que 70% de las células están teñidas. Con base en este resultado, ¿cuántas de las células del timo en su muestra están expresando receptores de unión a antígeno sobre su superficie? ¿Todas estarían expresando el mismo tipo de receptor? Explique su respuesta. ¿Cómo es probable que sean las células no teñidas restantes?

    2. A continuación usted separa las células CD3⁺ con el clasificador de células activadas por fluorescencia (facs) y las vuelve a teñir. En este caso, el anticuerpo primario es anticuerpo anti-CD4 de hámster, y el anticuerpo secundario es Ig anti-hámster marcada con pe de conejo, que emite un color rojo. El análisis de las células CD3⁺ teñidas muestra que 80% de ellas está teñido. A partir de este resultado, ¿puede usted determinar cuántas células T_C están presentes en esta muestra? Si puede hacerlo, ¿cuántas células T_C hay? Si no puede hacerlo, ¿qué experimento adicional realizaría para determinar el número de células T_C que están presentes?

Respuestas de enfoque clínico

1. FoxP3 (involucrado en el desarrollo de células T_REG), cualesquier moléculas emisoras de señales de tcr (que regulan la fuerza de la señal de tcr y, por ende, el resultado de la selección tímica), mhc (que presenta péptidos propios), cualquier cosa que evita que las células T lleguen a la médula (p. ej., CCR7) y, finalmente, Nur77 y Bim, que son moléculas emisoras de señales que regulan la selección negativa.

2. a) Los autores parecen estar diciendo que la variante de mhc, que sería expresada por células epiteliales medulares y células dendríticas en el timo, puede ser incapaz de presentar (unirse a) ciertos péptidos propios específicos para el cerebro (o lo hace de manera ineficiente). Por ende, algunas células T CD4⁺ autorreactivas en el timo pueden no ser eliminadas. (Note que hla-dr es una molécula de mhc clase II.) b) No hay una respuesta correcta. Hay dos posibilidades. 1) Si esto fuera así, ¿esto no significaría también que las células dendríticas periféricas serían incapaces de presentar el péptido y, por ende, no activarían las células T autorreactivas que han escapado? 2) Si usted permite que una célula T auxiliar autorreactiva escape, ¿no necesitará que también escape una célula T citotóxica autorreactiva? (Esta pregunta depende de su conocimiento de que las enfermedades autoinmunitarias como la esclerosis múltiple son causadas en parte por daño mediado por células T CD8⁺.) c) Dado que los inmunólogos aún están reflexionando sobre el tema, ésta es una pregunta desafiante. Sin embargo, hay un par de posibilidades. 1) Se acepta la posibilidad de que éste es un problema con la selección negativa. Empero, para entender cómo esto lleva a enfermedad autoinmunitaria, es posible proponer, por ejemplo, que hay una diferencia entre la presentación de antígeno en el timo y en la periferia. La presentación de péptidos propios cerebrales por esta variante de mhc puede ser ineficiente y permitir que células T CD4⁺ autorreactivas escapen. Con todo, en la periferia esta ineficiencia puede ser superada por aumentos de la expresión de molécula coestimuladora, la magnitud de expresión de mhc, y otros por el estilo, entre células presentadoras de antígeno que han sido estimuladas por agente patógeno o daño celular. 2) Además (o de modo alternativo), es posible proponer que esta variante de mhc compromete el desarrollo de células T reguladoras, no sólo la deleción de células T CD4⁺ autorreactivas. De manera específica, si la variante de mhc clase II es incapaz de presentar los péptidos propios, no mediará de lesión de células T CD4⁺ autorreactivas ni seleccionará para células T reguladoras autorreactivas supresivas. Note que es necesario suponer, en todos los casos, la existencia de células T CD8⁺ autorreactivas que escaparon; ésa no es una suposición radical. Como ahora sabe el lector, la selección negativa en el timo nunca es perfecta, y la capacidad para mantener tolerancia depende en gran medida de mecanismos periféricos.

3. a) La señalización mediada por Fas es importante para la regulación de poblaciones de linfocitos mediada por muerte en la homeostasis de linfocitos. Esta regulación es esencial porque la respuesta inmunitaria genera un incremento repentino y a menudo grande en poblaciones de linfocitos que muestran respuesta. La inhibición de muerte celular mediada por Fas podría dar lugar a incremento progresivo de las cifras de linfocitos, y finalmente cifras de linfocitos insostenibles. El síndrome de Canale-Smith demuestra que sin la eliminación de linfocitos mediante apoptosis, puede sobrevenir enfermedad grave y que pone en peligro la vida. b) El análisis de las células T del paciente revela un gran número de células T doble negativo (CD4⁻, CD8⁻), y números casi iguales de células CD4⁺ y CD8⁺. Un sujeto normal tendría muy pocas, ~ 5%, células doble negativo, y más células CD4⁺ que CD8⁺. Véase la figura 1, en el recuadro 9-3, Enfoque clínico (página 322).

Respuestas a las preguntas de estudio

1. Los ratones con deleción (knockout) que carecen de moléculas de mhc clase II no producen timocitos maduros CD4⁺, o los que carecen de moléculas de mhc clase I no producen timocitos maduros CD8⁺, porque en algún nivel el compromiso a línea requiere unión entre el mhc y el receptor cd 4/8 apropiado.

   La selección β inicia la maduración a la etapa DN4, proliferación, exclusión alélica, maduración a la etapa dp, y reordenamiento del locus TCRα.

   La selección negativa para antígenos específicos para tejido ocurre en la médula del timo, por mTEC y dc.

   Casi todos los linfocitos mueren por abandono en el timo porque no produjeron tcr viable, o porque no se unen a mhc propio.

   La vía extrínseca de apoptosis puede activar la vía intrínseca por medio de truncamiento de la proteína de la familia Bcl-2, Bid.

   El citocromo c es una importante molécula torrente abajo en la vía apoptótica intrínseca.

   Bcl-2 reside en la membrana mitocondrial e inhibe la apoptosis al evitar la liberación de citocromo c.

2. Las células T γδ no tienen un requerimiento de que el antígeno sea presentado por mhc. Así, no se limitan a reconocimiento de antígenos proteínicos. El proceso de reconocimiento parece estar más cerca del de receptores de reconocimiento de patrones que se encuentran sobre células del sistema inmunitario innato.

3. 

4. a) No habría SP CD4, pero todas las otras etapas estarían presentes. La ausencia de mhc clase II evitaría selección positiva y compromiso a línea de células T CD4⁺. b) Todas las etapas estarían presentes, pero algunas de las células maduras serían reactivas a antígenos específicos para tejido. (Esto sólo sería revelado por medio de experimentos funcionales.) aire regula la expresión de antígenos específicos para tejido propio por células epiteliales medulares. c) Todas las células dn y dp estarían presentes (la selección β procedería sin obstáculo). Aun así, ninguna de las células dp expresaría dímeros TCRαβ normales, y no podría ser seleccionada de manera positiva. (Para el avanzado, el desarrollo de célula TCRγδ procedería normalmente —muchas de éstas son de fenotipo dn, pero algunas son sp CD4 y CD8.)

5. Los primeros son timocitos CD3⁻TCRβ⁻, y podrían simplemente ser timocitos dn inmaduros. El segundo grupo son CD3⁺TCRβ⁻, ¡y podrían ser células T TCRγδ!

6. a) Citometría de flujo. b) Más alto. c) Más bajo.

   La selección positiva ocurriría en el trasfondo H-2^k pero no en el H-2^d (mhc clase II). Casi todas las células en el transgénico tcr tendrían el receptor específico para este haplotipo de mhc, de modo que se obtendrían más que números normales de células sp CD4 cuando ocurre selección positiva.

   d) No hay células positivo único maduras; puede tener número reducido de células dp (va a ocurrir selección negativa).

   Es necesario especular con esta pregunta —no hay una respuesta absolutamente clara—. El epitelio cortical puede ser incapaz de mediar deleción clonal porque no expresa las moléculas coestimuladoras correctas. De cualquier modo, los investigadores que han efectuado experimentos como éste encuentran evidencia para selección negativa de un tipo. Sin embargo, se desarrollan células T sp, pero parecen no ser activadas fácilmente.

7. a) Los timocitos en A se desarrollaron en un timo cuyas células epiteliales corticales expresaron moléculas de mhc H-2^d y, por ende, quedaron restringidos a ese mhc (por medio de selección positiva). No están restringidos a H-2^d, de modo que hacen caso omiso de blancos que expresan este mhc. b) Mismo razonamiento que el anterior.

8. a) Los timocitos inmaduros expresan tanto CD4 como CD8, mientras que los timocitos CD8⁺ maduros no expresan CD4. Para distinguir estas células, se efectúa tinción doble de timocitos con anti-CD4 y anti-CD8 marcados con fluorocromo, y se analizan en un facs. b) Véase el cuadro que sigue.

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   Ratón transgénico TCR H-Y	Timocitos inmaduros	Timocitos CD8+ maduros
   Hembra H-2k	+	+
   Macho H-2k	+	−
   Hembra H-2d	+	−
   Macho H-2d	+	−

   c) Dado que el gen que codifica para el antígeno H-Y está en el cromosoma Y, este antígeno no está presente en mujeres. Los timocitos que portan el receptor de célula T transgénico, que está restringido a H-2^k, pasarían por selección positiva en transgénicos H-2^k tanto machos como hembras. Sin embargo, la selección negativa subsiguiente eliminaría timocitos que portan el receptor transgénico, que es específico para antígeno H-Y, en los transgénicos H-2^k machos. b) Dado que los transgénicos H-2^d no expresarían las moléculas de mhc apropiadas, las células T que portan el receptor de célula T transgénico no pasarían por selección positiva.

9. a) Moléculas clase I K, D y L, y moléculas clase II IA. b) Sólo moléculas clase I. c) Los ratones H-2^b normales deben tener células T tanto CD4⁺ como CD8⁺ porque estarían presentes moléculas de mhc tanto clase I como clase II sobre células del estroma tímicas durante selección positiva. Los ratones H-2^b con deleción del gen IA no expresarían moléculas clase II; así, estos ratones sólo tendrían células CD8⁺.

10. a) Dado que el receptor de célula pre-T, que no se une a antígeno, está asociado con CD3, las células que expresan el pre-tcr, así como el receptor de célula T de unión a antígeno se teñirían con anti-CD3. A partir de este resultado es imposible determinar cuántas de las células que se tiñen con CD3 están expresando receptores de célula T completos. Las células restantes son timocitos aún más inmaduros que no expresan CD3. b) No. Dado que algunas de las células que se tiñen con CD3 expresan el pre-tcr o el tcr αβ en lugar del tcr γδ completo, es imposible calcular el número de células T_C mediante sustracción simple. Para determinar el número de células T_C, se necesitan anticuerpos anti-CD8 fluorescentes, que sólo teñirán las células T_C CD8⁺.