Capítulo 10: Desarrollo de células B

Millones de linfocitos B son generados en la médula ósea cada día y exportados hacia la periferia. La generación rápida e incesante de nuevas células B ocurre en una secuencia de eventos regulada con sumo cuidado. Experimentos de transferencia celular, en los cuales células madre (stem) hematopoyéticas (hsc) de donante marcadas genéticamente se inyectan en un receptor no marcado, han indicado que el desarrollo de células B desde hsc hasta células B maduras tarda de una a dos semanas; pueden detectarse en el receptor células B maduras derivadas del donante hacia las dos semanas después de transferencia de hsc hacia ratones receptores.

El desarrollo de células B empieza en la médula ósea con la división asimétrica de una hsc, y continúa por una serie de etapas de progenitor progresivamente más diferenciado hasta la producción de progenitores linfoides comunes (clp) que pueden dar lugar a células B o células T (figura 10-1, Perspectiva general). Las células progenitoras destinadas a convertirse en células T migran hacia el timo, donde completan su maduración (capítulo 9); casi todas las que permanecen en la médula ósea se convierten en células B. Conforme procede la diferenciación, la célula B en desarrollo expresa sobre su superficie celular una secuencia calibrada con precisión de receptor de superficie celular y moléculas de adhesión. Algunas de las señales recibidas desde estos receptores inducen la diferenciación de la célula B en desarrollo; otras desencadenan su proliferación en etapas particulares del desarrollo, y aun otras dirigen sus movimientos dentro del ambiente de la médula ósea. Estas señales permiten en conjunto la diferenciación del clp por las etapas de célula B temprana para formar la célula B inmadura que sale de la médula ósea para completar su diferenciación en el bazo. Para el investigador, la expresión de diferentes moléculas de superficie celular en cada etapa de maduración de la célula B proporciona una herramienta experimental inestimable con la cual reconocer y aislar células B preparadas en puntos separados en su desarrollo.

La función primaria de las células B maduras es secretar anticuerpos que protegen al huésped contra agentes patógenos; así, un enfoque importante de quienes estudian la diferenciación de células B es el análisis de la cronología y el orden de reordenamiento y expresión de genes que codifican para cadenas pesada y ligera de receptor de inmunoglobulina. Recuerde (del capítulo 7) que los reordenamientos del gen que codifica para inmunoglobulina empiezan con un reordenamiento del segmento de gen que codifica para D a J_H de cadena pesada, seguido por unión de los segmentos vh y dj_h que codifican para cadena pesada μ. Estos reordenamientos culminan en la expresión en la superficie celular del receptor de célula pre-B durante la etapa de célula pre-B, en la cual la cadena pesada reordenada es expresada en combinación con la cadena ligera sustituto. El reordenamiento de la cadena ligera es iniciado después de varias rondas de división de células que portan el pre-bcr.

Al igual que las células T, las células B en desarrollo deben resolver el problema de crear un repertorio de receptores capaces de reconocer una extensa gama de antígenos, mientras que aseguran que las células B autorreactivas sean eliminadas mediante apoptosis o hechas funcionalmente no reactivas, o anérgicas. Sin embargo, a diferencia de los receptores de célula T, los receptores de célula B no están constreñidos por la necesidad de estar restringidos a mhc. De nuevo, a diferencia de la maduración de células T, el desarrollo de células B está casi completo para el momento en que la célula B sale de la médula ósea; en sistemas de mamíferos no hay equivalente tímico en el cual se logre desarrollo de células B. En lugar de eso, las células B inmaduras son liberadas hacia la periferia, donde completan su programa de desarrollo en el bazo.

En este capítulo se da seguimiento al desarrollo de células B desde las etapas más tempranas en los órganos linfoides primarios hasta la generación de células B por completo maduras en los tejidos linfoides secundarios. Al igual que para las células T, hay múltiples subgrupos de células B, y se aborda brevemente cómo el proceso de diferenciación de los subgrupos de células B B-1 y de la zona marginal (mz) minoritarios difiere del programa de desarrollo que sigue el subgrupo de células B B-2 predominante. Se concluye con una breve comparación de los procesos de maduración de linfocitos T y B.

En animales adultos, la hematopoyesis, la generación de células sanguíneas, ocurre en la médula ósea; las hsc en la médula ósea son la fuente de todas las células sanguíneas de las líneas eritroide, mieloide y linfoide (capítulo 2). Diversas células no hematopoyéticas en la médula ósea expresan moléculas de superficie celular y secretan hormonas que guían el desarrollo de células hematopoyéticas. Los linfocitos en desarrollo se mueven dentro de la médula ósea conforme maduran; así, interactúan con diferentes poblaciones de células y señales en diversas etapas de desarrollo. Empero, los fetos de animales encaran desafíos particulares para su sistema inmunitario en desarrollo; ¿cómo pueden generar células sanguíneas cuando sus huesos aún no están por completo desarrollados?

El sitio de generación de células B cambia durante la gestación

La hematopoyesis es un proceso complejo en el animal adulto y durante la maduración total deben satisfacerse desafíos adicionales. Los eritrocitos deben ser generados con rapidez de novo a fin de proporcionar al embrión suficiente oxígeno, y las hsc deben proliferar a una tasa suficiente para poblar al adulto, así como para satisfacer las necesidades de hematopoyesis del feto en maduración. Además, puesto que la médula ósea aparece en etapas relativamente avanzadas del desarrollo, todo el proceso de generación de células sanguíneas debe cambiar de sitio varias veces antes de mudarse a su hogar final.

En ratones el periodo de gestación es de 19 a 21 días. La hematopoyesis empieza, en el ratón, alrededor de siete días después de la fecundación (figura 10-2) cuando células precursoras en el saco vitelino empiezan a diferenciarse para formar células eritroides nucleadas primitivas que transportan el oxígeno que necesita el embrión para el desarrollo temprano. hsc fetales capaces de generar todos los tipos de células sanguíneas pueden detectarse en la región aorta-gónada-mesonefros (agm) temprana en el día 8, cuando el corazón fetal empieza a latir. En el día 10, pueden aislarse a partir de la agm hsc maduras capaces de repoblar por completo el sistema hematopoyético de ratones adultos irradiados, y hacia el día 11 pueden encontrarse en el saco vitelino, la placenta y el hígado fetal. Entre los días 11.5 y 12.5, hay una expansión rápida del fondo común de hsc en la placenta; al final de este tiempo la placenta tiene más hsc que la agm o el saco vitelino. Hacia el día 13.5, el número de hsc en la placenta empieza a disminuir, mientras que el fondo común de hsc en el hígado se sigue expandiendo.

Conforme el embrión de ratón completa su desarrollo, el sitio predominante de generación de hsc persiste dentro del hígado fetal, pero puede detectarse algo de hematopoyesis en el bazo durante el periodo perinatal (alrededor del momento del nacimiento). El número de hsc en el hígado fetal en ratones alcanza un máximo de aproximadamente 1 000 hacia los días 15.5 a 16.5 de desarrollo embrionario, después de lo cual empieza a declinar. Dentro del hígado fetal, las hsc se diferencian para formar células progenitoras. En las etapas más tempranas, la hematopoyesis en el hígado fetal está dominada por progenitores eritroides que dan lugar a los eritrocitos maduros enucleados verdaderos, a fin de asegurar un aporte constante de oxígeno al embrión en crecimiento, y gradualmente surgen progenitores mieloides y linfoides. Las células pre-B (células B precursoras), definidas como células que expresan inmunoglobulina en su citoplasma pero no en su superficie, se observan por vez primera en el día 13 de gestación, y células B positivas para IgM de superficie están presentes en números detectables hacia el día 17. Las hsc siembran por vez primera la médula ósea aproximadamente el día 15, y al cabo de algunas semanas, la médula ósea queda a cargo como el principal sitio de desarrollo de células B, y permanece así durante toda la vida posnatal.

La hematopoyesis en el hígado fetal difiere de la que se observa en la médula ósea de adulto

Las células B en desarrollo en el hígado fetal difieren en aspectos importantes de sus homólogos en la médula ósea del adulto. El hígado es el sitio primario de generación de células B en el feto, y proporciona al animal neonatal las células que necesita para poblar su sistema inmunitario naciente. Para lograr esto, las células madre hematopoyéticas y su progenie deben pasar por una fase de proliferación rápida, y las hsc del hígado fetal, así como sus células hijas, pasan por varias rondas de división celular durante un tiempo breve. En contraste, las hsc derivadas de la médula ósea de un animal adulto sano son relativamente quiescentes.

Las células B generadas a partir de precursores en el hígado fetal son predominantemente células B B-1 (se describirán más a fondo en el capítulo 12). En resumen, las células B B-1 están situadas principalmente en las cavidades del organismo (específicamente en las cavidades peritoneal y pleural). Por ende, se encuentran en una posición idónea para proteger el intestino y los pulmones, que son las principales puertas de entrada de microbios en el feto y el recién nacido. Los anticuerpos secretados por células B B-1 muestran reactividad cruzada amplia; muchos se unen a antígenos carbohidrato expresados por diversas especies microbianas. Puesto que la expresión de desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) es mínima en este punto de la ontogenia, y que en esta etapa del desarrollo embrionario las proteínas RAG1/2 recombinasa parecen no usar la gama completa de segmentos de gen que codifican para las regiones V, D y J, los receptores de inmunoglobulina de células B B-1 expresan diversidad de receptor mínima. Al expresar un repertorio oligoclonal (pocas clonas, en contraposición con muchas clonas) de receptores de célula B que se unen a un número limitado de antígenos carbohidrato compartidos entre muchos microbios, las células B B-1 ocupan un nicho funcional que tiende un puente entre los sistemas inmunitarios innato y adaptativo. Al final de este capítulo se abunda sobre el desarrollo de células B B-1.

Durante un periodo de dos a cuatro semanas después del nacimiento, el proceso de hematopoyesis en ratones cambia desde el hígado y el bazo fetales hacia la médula ósea, donde continúa durante toda la adultez. La población de células B B-1 representa una excepción a esta regla general, puesto que se autorrenueva en la periferia. Esto significa que nuevas células B B-1 hijas son generadas continuamente a partir de células B B-1 preexistentes en las cavidades peritoneal y pleural, y en aquellas otras partes del cuerpo en las cuales residen células B B-1. Estas células hijas usan los mismos receptores que sus padres, y no se requiere nueva actividad de V(D)J recombinasa.

En humanos, la secuencia de eventos es similar a la descrita para el ratón, pero el marco de tiempo es obviamente un poco más alargado. Los precursores de células sanguíneas aparecen por vez primera en el saco vitelino durante la tercera semana del desarrollo embrionario, pero estas células, al igual que sus análogos en el ratón, proporcionan principalmente progenitores eritroides, y son incapaces de generar todos los subgrupos de células sanguíneas. Las primeras células capaces de repoblar por completo un sistema hematopoyético de ser humano adulto surgen en la región agm del embrión y/o en el saco vitelino. Hacia el tercer mes del embarazo, estas hsc migran hacia el hígado fetal, que entonces se hace responsable de la mayor parte de la hematopoyesis en el feto. Hacia el cuarto mes del embarazo, las hsc migran hacia la médula ósea, que asume gradualmente el papel hematopoyético desde el hígado fetal hasta que, hacia el momento del nacimiento, es el órgano generativo primario para células sanguíneas. Antes de la pubertad en humanos, casi todos los huesos del esqueleto muestran actividad hematopoyética, pero hacia los 18 años de edad sólo las vértebras, las costillas, el esternón, cráneo, pelvis y partes del húmero y fémur retienen potencial hematopoyético.

Del mismo modo que el desarrollo de células B en el feto y recién nacido difiere del de un adulto, también lo hace la hematopoyesis de células B en el animal en envejecimiento. En el recuadro 10-1, Enfoque clínico, se describen algunos aspectos del desarrollo de células B que se alteran conforme el ser humano envejece.

En el capítulo 2 (figura 2-5) se presentó la estructura del hueso y de la médula ósea. El microambiente de la médula ósea es una compleja estructura tridimensional con nichos celulares distintivos que están especializados para influir sobre el desarrollo de las poblaciones de células que maduran ahí. Una red densa de vasos sanguíneos de pared delgada fenestrados (permeables) —los sinusoides de la médula ósea— penetra en la médula ósea, lo que permite el paso de células sanguíneas recién formadas hacia la periferia, y facilita la circulación de sangre por la médula ósea.

Además de servir como una fuente de células madre hematopoyéticas, la médula ósea también contiene células madre que pueden diferenciarse hacia adipocitos (células adiposas), condrocitos (células de cartílago), osteocitos (células óseas), miocitos (células musculares) y en potencia también otros tipos de células. Cada una de estas clases diferentes de células madre requiere grupos de factores específicos, secretados por células del estroma de la médula ósea particulares para permitir su diferenciación apropiada.

¿Qué son las células del estroma de la médula ósea? El término estroma se deriva del griego para colchón, y una célula del estroma es un término general que describe una célula adherente grande que apoya el crecimiento de otras células. Durante el desarrollo de células B, las células del estroma de la médula ósea satisfacen dos funciones. En primer lugar, al interactuar con moléculas de adhesión sobre la superficie de hsc y células progenitoras, las células del estroma retienen las poblaciones de células en desarrollo en los nichos de la médula ósea específicos, donde pueden recibir las señales moleculares apropiadas que se requieren para su diferenciación adicional. En segundo lugar, poblaciones diversas de células del estroma expresan diferentes citocinas. En diversos puntos en su desarrollo, las células B progenitoras y precursoras deben interactuar con células del estroma que secretan citocinas particulares y, así, las células B en desarrollo se mueven en una progresión ordenada de un sitio a otro dentro de la médula ósea; esta progresión es guiada por quimiocinas secretadas por poblaciones particulares de células del estroma. Por ejemplo, las hsc empiezan su vida en estrecho contacto con osteoblastos situados cerca del revestimiento de la cavidad endosteal (médula ósea). Una vez diferenciadas hacia la etapa de célula pre-pro-B, las células B en desarrollo requieren señales provenientes de la quimiocina CXCL12, que es secretada por un grupo especializado de células del estroma, para progresar a la etapa de pro-célula B. Las pro-células B a continuación requieren emisión de señales provenientes de la citocina IL-7, que es secretada por aun otro subgrupo de células del estroma (figura 10-3). Muchos de estos factores de células del estroma sirven para inducir la expresión de factores de transcripción especializados importantes en el desarrollo de células B.

Las etapas de la hematopoyesis son definidas por marcadores de superficie celular, expresión de factor de transcripción y reordenamientos de gen que codifica para inmunoglobulina

La caracterización completa de una vía de desarrollo requiere que los científicos entiendan las características fenotípicas y funcionales de cada tipo de célula en esa vía, así como las señales moleculares y los factores de transcripción que impulsan la diferenciación en cada etapa. Las células, en etapas de diferenciación particulares, pueden caracterizarse por sus moléculas de superficie, que incluyen antígenos de superficie celular, moléculas de adhesión, y receptores para quimiocinas y citocinas. También son definidas por la gama de factores de transcripción activos que determinan cuáles genes son expresados en cada paso en el proceso de desarrollo. Finalmente, en el caso de las células B, las etapas de desarrollo son definidas por el estado de los genes que codifican para cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina en reordenamiento. Todavía no se entiende por completo el desarrollo de células B; con todo, se han definido casi todos los intermediarios celulares importantes, e inmunólogos del desarrollo están llenando de manera gradual las brechas en el conocimiento.

Los investigadores que están delineando la vía de diferenciación de linfocitos B emplearon tres estrategias experimentales generales. En primer lugar, generaron anticuerpos contra moléculas (antígenos o marcadores) presentes sobre la superficie de células de la médula ósea. A continuación determinaron cuáles de estas moléculas estuvieron presentes al mismo tiempo que otros antígenos, y cuáles combinaciones de antígenos parecieron definir tipos de células singulares (figura 10-4a). Además, el cultivo de células in vitro que portan antígenos de superficie conocidos, seguido por análisis con citometría de flujo de las células hijas generadas en cultivo, les permitió describir la expansión secuencial de combinaciones particulares de moléculas de superficie celular (figura 10-4b).

En segundo lugar, al clasificar células que portan combinaciones particulares de marcadores de superficie celular, y analizar esas poblaciones de células respecto a reordenamientos de gen que codifica para inmunoglobulina, los científicos lograron confirmar la estadificación de la aparición de antígenos vinculados con el desarrollo particulares. Por ejemplo, un antígeno que aparece sobre una célula en la cual no ha tenido lugar reordenamiento del gen que codifica para la región variable, es claramente expresado a una etapa muy temprana en la diferenciación de célula B. De modo similar, un antígeno presente sobre la superficie de una célula que ha reordenado los genes que codifican para cadena pesada, no así los que codifican para cadena ligera, define una etapa en la diferenciación de célula B más avanzada que la definida por el marcador antes descrito, mientras que un antígeno presente sobre una célula que ha pasado por reordenamiento de los genes que codifican tanto para cadena pesada como para cadena ligera, caracteriza a una etapa muy avanzada en el desarrollo de célula B. De esta manera, se definieron marcadores de superficie celular que podían servir como indicadores de pasos particulares en la diferenciación de células B (figura 10-4c).

En tercer lugar, los investigadores usan el poder de la genética de deleción (knockout) para determinar los efectos sobre el desarrollo de células B de la eliminación de la expresión de genes particulares, como los que codifican para factores de transcripción particulares (figura 10-4d). Por ejemplo, la deleción (knockout) de un gen que codifica para un factor de transcripción particular elimina la capacidad de un animal para completar la recombinación V_H a DJ_H mientras que aún permite el reordenamiento D a J_H. Esto indica que el factor de transcripción particular en cuestión no es necesario para etapas de diferenciación de células B previas al reordenamiento D a J_H, pero que se requiere para una o más etapas, empezando con la recombinación V_H a DJ_H.

Aun así, una desventaja del método de deleción (knockout) es que sólo define la primera etapa en la diferenciación en la cual se requiere el factor de transcripción. En variaciones más recientes se ha explotado la genética de introducción (knockin) (figura 10-4e) para generar animales que expresan marcadores fluorescentes bajo el control de los promotores de factor de transcripción, de modo que puede delinearse cada punto en el cual el factor de transcripción es expresado. La estadificación de la expresión de factor de transcripción a continuación se correlaciona con la expresión tanto de marcadores de superficie celular como de reordenamiento de gen que codifica para inmunoglobulina. La secuencia de desarrollo de células B descrita en las secciones que siguen se ha elucidado usando una combinación de estas estrategias.

A últimas fechas se ha dirigido la atención a especies de miRNA de peso molecular pequeño, que tienen profundos efectos sobre la estabilidad del mRNA y, por ende, sobre la expresión de proteínas particulares. En el recuadro 10-2, Avances, se describen los efectos de algunos de los miRNA que recientemente se ha mostrado que influyen sobre la diferenciación de células B. En la actualidad ésta es un área de investigación en extremo activa.

Las etapas más tempranas en la diferenciación de linfocitos culminan en la generación de un progenitor linfoide común

En esta sección se describirá el proceso mediante el cual una hsc en la médula ósea se desarrolla hacia un clp. A menos que se especifique otra cosa, la vía de desarrollo que se describe se refiere a la seguida por la población de células B B-2 predominante. Los aspectos específicos del desarrollo que difieren entre los diversos subgrupos de célula B se abordan hacia el final de este capítulo.

HSC

Las hsc se renuevan por sí mismas (pueden dividirse para crear copias idénticas de la célula padre) y son multipotenciales (pueden dividirse para formar células hijas que están más diferenciadas que la célula padre, y que pueden desarrollarse a lo largo de distintas líneas de células sanguíneas), y pueden dar lugar a todas las células de la sangre. Las hsc mantienen un número relativamente grande de genes en un estado llamado “preparado”, y una hsc individual puede poseer genes preparados característicos de múltiples líneas celulares. La cromatina preparada se asocia con números de nucleosomas más bajos que lo habitual, es más accesible a la actividad de enzima que la mayor parte de la cromatina en la célula, y muestra patrones de metilación y acetilación de histona característicos de la cromatina activa. Dependiendo de los estímulos ambientales a los cuales cualquier hsc dada está expuesta, los factores de transcripción pueden impulsar a la célula por varias vías de desarrollo posibles. Durante el proceso de diferenciación que sigue, son desactivadas las regiones de cromatina preparadas que contienen genes que son innecesarios para la vía del desarrollo seleccionada.

En hsc destinadas a ser células B, los factores de transcripción Ikaros, factor de secuencia de purina 1 (PU.1) y E2A participan en las etapas más tempranas del desarrollo de la línea B. Ikaros recluta complejos de remodelación de cromatina a regiones particulares en el dna y asegura la accesibilidad de los genes necesarios para el desarrollo de células B. PU.1 preside una “ley de equilibrio” leucocítico; las cifras bajas de PU.1 favorecen la diferenciación linfoide, mientras que las células que expresan cifras más altas de PU.1 se desvían hacia un destino mieloide. La cifra de proteína PU.1 expresada está regulada a su vez por el represor transcripcional Gfi1, que regula en dirección descendente la expresión de PU.1 hasta las cifras necesarias para progresión por la vía de las células B. La expresión de E2A contribuye al mantenimiento del fondo común de hsc al participar en la regulación del control del ciclo celular en esta población.

Como se hizo notar en el capítulo 9, las hsc expresan la molécula de superficie celular c-Kit (CD117), que es el receptor para el factor de células madre (stem) (scf). El scf es una citocina que existe en formas tanto unida a membrana como soluble, y la interacción SCF-c-Kit es crucial para el desarrollo, en animales adultos, de células progenitoras multipotenciales (mpp). El scf unido a membrana desempeña un papel en la retención de hsc y sus células progenitoras hijas en los nichos ambientales apropiados en la médula ósea. Las hsc también expresan el antígeno asociado a célula madre (stem)-1 (Sca-1). Tanto c-Kit como Sca-1 son expresados en paralelo sobre células progenitoras tempranas, y su expresión disminuye conforme las células se comprometen a una línea celular particular (figura 10-5). Las hsc a menudo se describen como Lin^–, designación que se refiere al hecho de que no tienen “marcadores de línea” característicos de una subpoblación de células sanguíneas particular.

MPP

Las mpp generadas en el momento en que se recibe la señal de SCF/c-Kit pierden la capacidad de autorrenovación extensa, pero retienen el potencial para diferenciarse hacia varias líneas hematopoyéticas diferentes. Las células mpp retienen la expresión de c-Kit y Sca-1, y expresan de manera transitoria la molécula CD34. De hecho, anticuerpos contra CD34 se usan en clínica para aislar células en esta etapa en la hematopoyesis. Las mpp también expresan el receptor de quimiocina CXCR4, que les permite unirse a la quimiocina derivada de células del estroma CXCL12. La interacción entre CXCL12 y CXCR4 es importante para asegurar que la célula progenitora ocupe el nicho correcto dentro de la médula ósea (figura 10-3).

LMPP

La célula progenitora en su camino a convertirse en una célula B a continuación empieza a expresar el receptor de tirosina cinasa relacionado con fms 3 (flt-3). El flt-3 se une al ligando de flt-3 unido a membrana sobre células del estroma de la médula ósea, y emite señales a la célula progenitora para que empiece a sintetizar el receptor de IL-7 (IL-7R, CD127). El flt-3 es expresado sobre progenitoras de célula B desde este punto hasta la etapa pro-B, y actúa de manera sinérgica con IL-7R para promover el crecimiento de células que portan flt-3 e IL-7R. La expresión de flt-3 sobre la superficie de la célula en desarrollo marca la pérdida del potencial de la célula mpp para desarrollarse hacia eritrocitos o megacariocitos y, por ende, caracteriza un nuevo nivel de compromiso celular; de cualquier modo, esta progenitora aún retiene la capacidad para desarrollarse a lo largo de la vía mieloide o de la linfoide.

Estas células, ahora c-Kit⁺, Sca-1⁺ y flt-3⁺, se denominan progenitores multipotenciales, preparados para linfoide (lmpp) (figura 10-5). Conforme quedan más comprometidas a la línea linfoide, las cifras de antígenos de célula madre c-Kit y Sca-1 disminuyen, y las células destinadas a convertirse en linfocitos empiezan a expresar RAG1/2 y desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) (capítulo 7). La expresión de los genes que codifican para RAG1/2, TdT, IL-7R y el factor de transcripción específico para célula B, EBF1, es regulada en dirección ascendente al final de esta etapa.

ELP

La expresión de RAG1/2 define a la célula como una célula progenitora linfoide temprana (early) (elp). Un subgrupo de elp migra hacia afuera de la médula ósea para sembrar el timo y servir como las progenitoras de células T (capítulo 9). El resto de las elp permanece en la médula ósea como progenitoras de células B. Sobre estas células, las cifras de los antígenos c-Kit y SCa-1 tempranos disminuyen conforme las cifras de IL-7R aumentan, y la elp ahora se desarrolla hacia una clp.

CLP

En la etapa de clp, la progenitora en camino a compromiso a célula B aún retiene el potencial para madurar a lo largo de la línea nk, dc convencional o de célula T. En este punto del desarrollo, señales recibidas por medio de IL-7R promueven la supervivencia de la célula y aumentan la producción de EBF-1 y otros factores de transcripción que se requieren para pasos más tardíos en la vía de diferenciación de célula B. La emisión de señales por medio del IL-7R ocurre mediante vías con las cuales el lector se familiarizó en el capítulo 4. De manera específica, una vía de jak-stat mediada por IL-7R induce la regulación ascendente de la molécula antiapoptótica Mcl1. La emisión de señales por medio de IL-7R también da lugar a la regulación ascendente de los genes C-myc y N-myc, que emiten señales para la proliferación celular característica de la etapa de célula pro-B más tardía.

Las clp son c-Kit^bajo, Sca-1^bajo e IL-7R⁺, y han perdido el potencial mieloide. No obstante, conforme madura una clp destinada a diferenciarse a lo largo de la vía de células B, la cromatina que contiene el locus de inmunoglobulina se hace cada vez más accesible, y el linfocito en desarrollo se aproxima al punto en el cual está comprometido de manera irrevocable a la línea de células B.

Los pasos más tardíos del desarrollo de célula B dan lugar a compromiso al fenotipo de célula B

La figura 10-6 ilustra la expresión de marcadores de superficie celular, y los patrones de reordenamiento de genes que codifican para cadena pesada y para cadena ligera de inmunoglobulinas, empezando en la etapa de desarrollo de célula pre-pro-B. Las etapas de diferenciación de las células B han sido definidas por más de un grupo de científicos y, como resultado, dos sistemas de nomenclatura están en uso común. El primero, y más ampliamente usado, es la nomenclatura de Basel (pre-pro, pro, pre-B, B inmadura), ideada por Melchers y colegas. El segundo (A, B, C, C′, D, E) es el definido por Hardy y colaboradores y el proceso mediante el cual se estableció este sistema de clasificación del desarrollo de células B se describe con detalle en el recuadro 10-3, Experimento clásico.

Células pre-pro-B

Con la adquisición del nuevo marcador específico para línea de células B, B220 (CD45R), y la expresión de cifras crecientes del factor de transcripción EBF1, la célula en desarrollo entra a la etapa de célula pre-pro-B. El EBF1 es un factor de transcripción importante en el desarrollo linfoide y, por ende, la transcripción del gen Ebf1 está en sí bajo el control de múltiples factores de transcripción (figura 10-7). Cada uno de éstos se une en regiones promotoras distintas y, por ende, la magnitud de transcripción del gen Ebf1 puede variar considerablemente dependiendo de la combinación de factores controladores presentes en cualquier etapa de desarrollo particular. En la etapa de célula pre-pro-B, el EBF-1, junto con E2A, se une al gen que codifica para inmunoglobulina, lo cual promueve la accesibilidad del locus D-J_H y prepara a las células para el primer paso de la recombinación del gen que codifica para Ig. El EBF-1 también es esencial para la expresión completa de muchas proteínas de célula B, incluso Igα, Igβ (CD79α,β), y los genes que codifican para el receptor de célula pre-B, que se expresarán cuando la recombinación vdj de cadena pesada esté completa.

Las células pre-pro-B permanecen en contacto con células del estroma que secretan CXCL-12 en la médula ósea. Sin embargo, el inicio de la recombinación del gen D a J_H clasifica a la célula como una célula pro-B temprana, y en esta etapa la célula en desarrollo se mueve dentro de la médula ósea, y busca contacto con células del estroma que secretan IL-7.

Células pro-B

En la etapa de célula pro-B temprana, se completa la recombinación de D a J_H, y la célula empieza a prepararse para la unión de V a DJ_H. Empero, este evento de recombinación final espera la expresión del factor de transcripción de célula B prototípico, PAX5.

El gen Pax5 figura entre los blancos de transcripción de EBF-1 (figura 10-7), y la transcripción de genes controlados por el factor de transcripción PAX5 denota el paso a la etapa de desarrollo de célula pro-B, momento en el cual la expresión de genes que no codifican para la línea B es bloqueada permanentemente. PAX5 puede actuar como un represor transcripcional, y como un activador transcripcional, y bloquea la expresión del gen Notch-1, lo que termina cualquier potencial residual de la célula pro-B a desarrollarse a lo largo de la línea de células T. Muchos genes de células B importantes son activados en esta etapa, bajo el control de PAX5 y otros factores de transcripción. Entre éstos figura el gen que codifica para CD19, que se mencionó por vez primera en el capítulo 3, como uno de los componentes del correceptor de célula B. CD19 se considera un marcador de célula B prototípico, y a menudo se usa como tal en experimentos de citometría de flujo.

Una vez que la proteína PAX5 es expresada, ocurre un reforzamiento mutuo entre la expresión de PAX5 y la de EBF-1 (figura 10-7); cada factor de transcripción sirve para aumentar la expresión del otro. La proteína PAX5 sigue siendo expresada en células B maduras en tanto la célula B no se compromete a un destino de célula plasmática después de estimulación antigénica (capítulo 12). La expresión más alta de EBF1 inducida por PAX5 también permite un incremento de la expresión de IL-7R.

PAX5 promueve la recombinación de V_H a D al contraer el locus de Ig_H, lo que acerca los segmentos de gen V_H distantes a la región D-J_H. Las células B deficientes en PAX5 permiten el reordenamiento del gen Ig de D a J_H, pero no permiten la recombinación del segmento de gen Ig de V_H a D, lo que indica que PAX5 es esencial para el segundo paso de reordenamiento del gen que codifica para Ig.

La expresión de los componentes de emisión de señales del receptor de célula B, Igα e Igβ, también empieza en la etapa de célula pro-B, y el complejo de emisión de señales Igα,Igβ es colocado brevemente sobre la superficie celular en complejo con la proteína chaperón calnexina. Si bien este complejo Igα,Igβ se ha denominado un “pro-BCR”, aún no se ha establecido un ligando para él; tampoco se entiende todavía la importancia de cualquier emisión de señales que pueda emanar desde él.

Asimismo, durante la etapa de célula pro-B, c-Kit es activado brevemente una vez más, lo que permite a la célula recibir señales provenientes del factor de células madre. Al inicio de la etapa de desarrollo de célula pre-B, la expresión de c-Kit es vuelta a desactivar de manera irreversible. Hacia la etapa de célula pro-B tardía, casi todas las células han iniciado recombinación del segmento de gen Ig de V_H a DJ_H, lo cual se completa hacia el inicio de la etapa de célula pre-B temprana.

Células pre-B

Durante la etapa de célula pre-B, la célula expresa un receptor de célula pre-B compuesto de la cadena pesada reordenada, en complejo con los componentes VpreB y λ5 de la cadena ligera sustituto (figura 7-10). La aparición de este receptor de célula pre-B señala la entrada de la célula B en desarrollo hacia la fase de célula pre-B grande o temprana. La expresión de la cadena pesada en la superficie de la célula es necesaria para la terminación de reordenamiento adicional de cadena pesada, y asegura la exclusión alélica de los genes que codifican para cadena pesada de Ig (capítulo 7). Los animales que muestran deficiencia de la expresión del receptor de célula pre-B o de los componentes de emisión de señales Igα,Igβ, no progresan a la etapa de célula pre-B.

La emisión de señales por medio del receptor de célula pre-B induce algunas rondas de proliferación en la célula pre-B. Esta fase proliferativa se correlaciona en el tiempo con la expresión sobre la superficie de la célula pre-B de CD25, la cadena α del receptor de IL-2 de afinidad alta (figura 4-8), que aparece por vez primera sobre células B en la etapa de célula pro-B. Puesto que el proceso proliferativo de célula pre-B parece ser impulsado principalmente por IL-7, no está clara la importancia funcional de CD25 en este punto. Con todo, su aparición suele usarse como un marcador de la etapa de desarrollo de célula pro-B tardía a la de célula pre-B temprana.

La recombinación del gen V_H es costosa desde el punto de vista energético para el organismo, puesto que no todas las células B en desarrollo tienen éxito en el paso por reordenamientos productivos del gen V_H y las que no lo hacen se pierden por apoptosis. Por ende, suena lógico que debe permitirse que las células B que han alcanzado expresión productiva de cadena pesada proliferen. Cada célula hija individual derivada de este proceso proliferativo a continuación está libre para participar en un evento de reordenamiento de cadena ligera diferente. Por ende, la mayoría de los individuos tendrá múltiples células B que expresan precisamente el mismo reordenamiento de cadena pesada, pero cada una con una cadena ligera distinta y, así, a partir de cada reordenamiento de cadena pesada exitoso pueden generarse muchas especificidades de receptor diferentes. Recuerde que en células T ocurre un proceso análogo de reordenamiento de cadena β, seguido por proliferación antes de reordenamiento α (capítulo 9).

Si el receptor de célula pre-B no puede desplegarse sobre la superficie celular debido a reordenamientos no productivos de gen V_HDJ_H, el desarrollo de célula B se suspende, y la célula se pierde por apoptosis. Por ende, esta etapa en el desarrollo de célula B se denomina el primer punto de control de célula pre-B (figura 10-6). El progreso por este punto de control depende de algún tipo de eventos de emisión de señales por medio del receptor de célula pre-B, y evidencia reciente sugiere que esto está mediado por interacciones entre regiones ricas en arginina en la porción no inmunoglobulina del componente λ5 de la cadena ligera sustituto, o en las regiones CDR3 de algunas cadenas pesadas, con moléculas que tienen carga negativa sobre la superficie de las células del estroma.

La emisión de señales de receptor de célula pre-B induce la regulación descendente transitoria de RAG1/2 y la pérdida de la actividad de TdT. Juntos, estos eventos aseguran que, tan pronto como un gen que codifica para cadena pesada se ha reordenado exitosamente, es imposible la recombinación adicional de cadena pesada. Esto da lugar al fenómeno de exclusión alélica, por el cual los genes de sólo uno de los dos alelos de cadena pesada pueden expresarse en una célula B única. Como resultado de esta emisión de señales de receptor de célula pre-B, la cromatina en el locus de cadena pesada no usado pasa por varios cambios físicos que la hacen incapaz de participar en eventos de reordenamiento adicionales. Recuerde que la IL-7 proporcionó una de las señales que llevaron a los loci V_H, D y J_H hacia aposición estrecha uno con otro al principio de la recombinación V_HDJ_H. Ahora, una reducción de la emisión de señales de IL-7 en la etapa de célula pre-B revierte esa contracción inicial del locus, lo que da lugar a la separación física de los segmentos de gen V_H, D y J_H en el locus de cadena pesada no reordenado. Esta descontracción a continuación va seguida por eventos de desacetilación que desactivan el locus de cadena pesada no usado, y lo devuelven a una configuración heterocromática (inactiva, cerrada).

La expresión de cadena ligera sustituto también es terminada por una ronda de emisión de señales de retroacción negativa por medio del receptor de célula pre-B. Al final de la proliferación celular por emisión de señales pre-bcr, el receptor de célula pre-B se pierde de la superficie, y esto emite una señal para la entrada hacia la etapa de célula pre-B pequeña o tardía. En este punto se inicia el reordenamiento de cadena ligera con la reexpresión de los genes Rag1/2. En esta etapa persiste muy poca actividad de TdT y, por ende, la adición de la región N ocurre menos frecuentemente en cadenas ligeras que en cadenas pesadas. En el ratón, el reordenamiento de cadena ligera empieza en uno de los cromosomas que codifican para cadena κ, seguido por el otro. Si ni uno ni otro reordenamiento de cadena κ es exitoso, el reordenamiento a continuación se intenta de manera exitosa en cada uno de los cromosomas que codifican para la cadena λ. En seres humanos, el reordenamiento es iniciado al azar en los loci de κ o de λ.

Una vez que se ha completado exitosamente el reordenamiento del gen que codifica para cadena ligera, el receptor de IgM es expresado sobre la superficie celular, lo cual es una señal de la entrada hacia la etapa de célula B inmadura. Si los intentos de reordenamiento del gen que codifica para cadena ligera de inmunoglobulina fracasan, la célula naciente finalmente se pierde en el segundo punto de control de célula B inmadura (figura 10-6). Aun así, dada la disponibilidad de cuatro cromosomas separados en los cuales intentar reordenamiento, y la oportunidad para editar cadena ligera en el caso de reordenamiento no productivo, casi todas las células pre-B que han reordenado exitosamente sus cadenas pesadas progresarán hacia la formación de una célula B inmadura.

Las células B inmaduras en la médula ósea son en extremo sensibles a la inducción de tolerancia

Las células B inmaduras portan un receptor funcional en la forma de IgM de membrana, pero todavía no han empezado a expresar cualquier otra clase de inmunoglobulina. Siguen expresando B220, CD25, IL-7R y CD19.

Una vez que el bcr funcional es montado sobre la membrana de la célula B, el receptor debe probarse respecto a su capacidad para unirse a antígenos propios, a fin de asegurar que tan pocas células B autorreactivas como sea posible salgan desde la médula ósea. Las células B inmaduras que se encuentra que portan receptores autorreactivos tienen uno de tres destinos; algunas se pierden del repertorio antes de salir de la médula ósea, mediante el proceso apoptótico de deleción clonal mediado por bcr. La pérdida de células B que portan receptores autorreactivos dentro de la médula ósea se denomina tolerancia central. Otras células B autorreactivas reactivan sus genes que codifican para rag a fin de iniciar el proceso de edición de receptor de cadena ligera (capítulo 7). Algunas células B autorreactivas que reconocen antígenos propios solubles dentro de la médula ósea pueden sobrevivir hasta escapar del ambiente de la médula ósea, pero se hacen anérgicas, o sin capacidad de respuesta, a cualesquier estímulos antigénicos adicionales.

Con base en la exposición sobre tolerancia de células T en el capítulo 9, el lector debe estar familiarizado con el concepto de selección negativa de linfocitos que portan receptores autorreactivos. De cualquier modo, las diferencias funcionales entre las células T y las células B significan que los procesos de selección contra células B autorreactivas son diferentes de los que protegen contra el surgimiento de células T autorreactivas, y de hecho pueden ser un poco menos estrictos. Puesto que la estimulación de células B B-2 requiere la ayuda de células T, una célula B autorreactiva no puede mostrar respuesta a antígeno con producción de anticuerpo a menos que también haya una célula T autorreactiva que pueda proporcionar las citocinas y la coestimulación necesarias (capítulo 12). Así, es bastante posible que la mayoría de los individuos porte números importantes de células B autorreactivas dentro de su repertorio de células B maduras, que nunca son activadas.

También hay diferencias mecánicas entre los modos de selección negativa entre células B y T. No se ha mostrado que exista un equivalente de la proteína aire para la selección de células B y, así, la selección negativa de células B dentro de la médula ósea es más limitada respecto a las especificidades antigénicas tolerogénicas disponibles que la selección negativa de células T en el timo.

Muchas células B autorreactivas, mas no todas, son eliminadas dentro de la médula ósea

El entendimiento de cómo el sistema inmunitario elimina o neutraliza amenazas autorreactivas ha sido facilitado por el desarrollo de animales transgénicos que expresan tanto autoantígenos introducidos deliberadamente como los receptores que los reconocen. Desde hace mucho tiempo se ha establecido que el enlace covalente de receptores IgM de células B inmaduras in vitro (efectuado experimentalmente al tratar las células con anticuerpos contra la cadena μ del receptor) da lugar a muerte por apoptosis. En contraste, la práctica de los mismos experimentos con células B maduras, que portan receptores tanto IgM como IgD, da lugar a activación. David Nemazee y colegas tuvieron la intención de probar si la respuesta apoptótica de células B inmaduras in vitro reflejó lo que sucede en la médula ósea in vivo cuando una célula B inmadura se reúne con un antígeno propio.

El método que utilizaron Nemazee y colaboradores fue conceptualmente simple, aunque complejo desde el punto de vista experimental, en particular por el periodo en el cual se efectuó la investigación (1989). Generaron ratones transgénicos tanto para una cadena pesada como para una cadena ligera específica para la molécula de mhc H-2K^k. Por ende, todas las células B en este ratón sólo sintetizaron anticuerpos anti-H-2K^k. Si células B inmaduras pasan por selección para prevenir autoinmunidad, estas células serían seleccionadas en contra en un ratón que expresa el gen que codifica para H-2K^k para mhc. Mediante reproducción apropiada, introdujeron los transgenes específicos para H-2K^k de inmunoglobulina hacia ratones que portaron dos genotipos de mhc diferentes.

En el primer grupo de ratones (figura 10-8a), que portó antígenos H-2K^d, pero no H-2K^k, lograron detectar el anticuerpo transgénico a frecuencia alta sobre la superficie de células B, y a concentración alta en el suero (cuadro 10-1). Esto tiene sentido, porque el anticuerpo transgénico sería incapaz de unirse a las moléculas de H-2K^d y, así, las células B que lo producen serían seleccionadas de manera negativa. No obstante, cuando cruzaron estos animales con ratones del tipo H-2K^k (figura 10-8b), fue imposible detectar anticuerpos anti-H-2K^k unidos a membrana o secretados, lo que sugiere que todas las células B inmaduras que portaban el receptor en potencia autoinmunitario habían sido eliminadas en la médula ósea. Esa deleción ocurrió por medio de inducción de apoptosis en las células autoinmunes.

Despierta interés que, en el ratón H-2K^k/d, no todas las células B que portaban los transgenes autoinmunes fueron eliminadas, aun cuando todas las células B en este ratón deben portar el receptor anti-H-2K^k (figura 10-8c). El examen más de cerca reveló que algunas de las células B que expresaron transgén residual en la médula ósea habían pasado por edición de receptor de cadena ligera (capítulo 7), lo cual cambió su especificidad de antígeno de modo que ya no se unieron al antígeno H-2K^k. Experimentos recientes sugieren que in vivo, una fracción importante de células B en potencia autoinmunes pasa por edición de receptor (o incluso reemplazo del gen V_H) (capítulo 7), y genera exitosamente bcr aceptables antes de liberación desde la médula ósea.

Sin embargo, en animales normales, no todas las células B en potencia autoinmunes se pierden a deleción clonal o son alteradas por medio de edición de receptor o de reemplazo del gen V_H dentro de la médula ósea; algunas son liberadas hacia la periferia y quedan sujetas a rondas de selección adicionales.

Las células B exportadas desde la médula ósea aún son funcionalmente inmaduras

Una vez que la célula B expresa IgM sobre su membrana (mIgM), se denomina célula B inmadura. Esta célula B está lista para exportación hacia el bazo, donde completa su programa de desarrollo. Las células B inmaduras tienen una vida media breve, en parte como resultado de la expresión de cifras bajas de las moléculas antiapoptóticas Bcl-2 y Bcl-xl. También expresan cifras altas de la molécula de superficie celular, Fas, que es capaz de transmitir una señal de muerte cuando es unida por su ligando (capítulos 4 y 9). Las células B inmaduras muestran susceptibilidad extrema a inducción de tolerancia, y si encuentran un antígeno propio en esta etapa del desarrollo, las células B volverán a expresar los genes que codifican para RAG1 y RAG2, y editarán sus genes que codifican para cadena ligera. Si la edición de receptor no da lugar a un receptor idóneo, la célula sufre apoptosis.

El estudio del desarrollo de células B en la periferia, al igual que en la médula ósea, se ha beneficiado de manera importante a partir de la aplicación ingeniosa de citometría de flujo, que ha permitido la clasificación de células B inmaduras hacia dos subpoblaciones de células B transicionales (T1, T2). Estas células B transicionales actúan de modo secuencial como los precursores de la célula B por completo madura.

Células B transicionales T1 y T2

Las células B transicionales T1 y T2 se caracterizaron inicialmente con base en su expresión de receptores de inmunoglobulina y marcadores de membrana en la superficie celular (cuadro 10-2). Las células T1 son mIgM^alta, mIgD^–/baja, CD21^–, CD23^–, CD24⁺, y CD93⁺. Las células T2 difieren de las células T1 en que tienen cifras más altas de mIgD, y en la expresión de CD21 (el receptor de complemento y correceptor de célula B; figura 3-7) y CD23. Las células T2 también expresan baff-r, el receptor para el factor de supervivencia de célula B baff, cuya expresión depende de señales recibidas por medio del bcr. Conforme las células B se diferencian desde el estado de T2 transicional hasta la madurez completa, aumentan aún más sus cifras de mIgD, mientras que reducen la expresión de mIgM. También dejan de expresar CD24 y CD93.

Las células T1 que han sido marcadas y transferidas hacia ratones receptores se desarrollan hacia células T2. De modo similar, se ha demostrado que ambas subpoblaciones de células B transicionales tienen la capacidad para diferenciarse hacia células B maduras. Por ende, estos experimentos han probado que el orden de la secuencia de desarrollo progresa desde T1 hacia T2, y hacia célula B madura. Se ha medido el tiempo en tránsito de una célula T1 a una célula B madura, y es de aproximadamente tres a cuatro días. Casi todas las células B T1 se diferencian hacia células T2 dentro del bazo, pero una minoría de alrededor de 25% de las células B transicionales surge de la médula ósea ya en el estado T2. La madurez aumentada de células T2 se correlaciona con cambios de la expresión de receptores de quimiocina y citocina, de modo que las células T2, pero no las células T1, son capaces de recircular entre la sangre, los ganglios linfáticos y el bazo, y las células T2, no así las T1, pueden entrar en folículos de células B.

La figura 10-9 muestra la trayectoria de la célula B transicional en desarrollo conforme sale de la médula ósea y entra al bazo a través de la arteriola central, que la deposita en los senos marginales, justo dentro de la zona marginal externa. (En humanos las características anatómicas del bazo son un poco distintas y las células llegan al bazo en una zona perifolicular.) Desde ahí, la célula B T1 se filtra a través de la zona de células T, donde cierta fracción de células T1 madurará hacia el estado T2. A continuación, las células B T2 son capaces de entrar a los folículos o a la zona marginal, donde completan su programa de desarrollo hacia linfocitos B recirculantes por completo maduros.

Ya se mencionó que las células B maduras portan sobre su superficie dos clases de inmunoglobulinas unidas a membrana —IgM e IgD— y que la expresión de mIgD junto con mIgM requiere de eventos de empalme de mRNA regulados cuidadosamente (capítulo 7). Es en el punto de tránsito entre las etapas de desarrollo T1 y T2 donde se observa el inicio de estas capacidades de empalme. Las células B maduras portan casi 10 veces más mIgD que mIgM y, así, la expresión de mIgD da lugar a regulación ascendente importante del número de receptores de inmunoglobulina de célula B.

El efecto de unión de bcr fuerte con un antígeno multivalente, o unido a membrana, depende del estado de maduración de la célula B transicional (figura 10-10 y cuadro 10-3). Las células B T1 autorreactivas son eliminadas mediante apoptosis en respuesta a una señal antigénica fuerte, en un proceso que recuerda la selección negativa de timocitos, lo cual lleva a tolerancia periférica; experimentos recientes han sugerido que en adultos sanos, por lo menos 55 a 75% de las células B inmaduras se pierde por este proceso. En contraste, una vez que la célula B ha madurado hacia una célula B transicional T2, se hace resistente a apoptosis inducida por antígeno, lo que recuerda los timocitos que han alcanzado la etapa de desarrollo positivo único. Esta resistencia a muerte celular inducida por receptor depende en parte del hecho de que las células B T2 han aumentado su expresión de la molécula antiapoptótica Bcl-xl.

Al usar técnicas genéticas de deleción (knockout) condicional (capítulo 20), es posible generar animales que carecen de expresión de receptor de Ig en etapas diferentes del desarrollo de célula B. Los animales que no expresan un bcr durante la etapa de célula B inmadura pierden la capacidad para hacer células B maduras. Esto indica que se requiere cierto nivel bajo de emisión de señales tónicas por medio del bcr, análogo a la señal de selección positiva que necesitan los timocitos en desarrollo, para generación y supervivencia continuas de células B inmaduras. Las células B incapaces de recibir esta señal mueren en la etapa T2 (figura 10-10). Las células B T2 capaces de recibir la señal folicular regulan en dirección ascendente la expresión del receptor para el factor de supervivencia de células B baff.

Dados los resultados diferentes de la emisión de señales por medio del bcr para células B T1 en contraposición con T2, está claro que debe haber diferencias en las vías de emisión de señales torrente abajo del bcr en los dos tipos de célula B transicionales. De manera específica, la emisión de señales mediadas por bcr de células B T1 da lugar a liberación de calcio sin producción importante de diacilglicerol y proporciona una señal apoptótica. En contraste, la recepción de señales de bcr por células B T2 induce tanto un aumento de la concentración intracitoplasmática de calcio como de la producción de diacilglicerol. Esta combinación de segundos mensajeros intracelulares suministra a la célula señales tanto de maduración como de supervivencia, y sugiere la participación de una proteína cinasa activada por diacilglicerol en la emisión de señales de supervivencia (capítulo 3).

Empero, ¿qué causa esta diferencia en las vías de transducción de señal entre células T1 y T2? Una respuesta parcial a esta pregunta parece hallarse en las diferencias en la composición de las membranas lipídicas de los dos tipos de células. Las células B T1 inmaduras contienen aproximadamente la mitad de colesterol que sus homólogas más maduras, y esta reducción de las cifras de colesterol parece evitar la agrupación eficiente del receptor de célula B hacia balsas de lípido en el momento de estimulación por bcr. Esto tal vez causa una reducción de la fuerza de la emisión de señales de bcr en células B inmaduras T1 en contraposición con T2.

El desarrollo de células B por la fase transicional es absolutamente dependiente de emisión de señales por medio del receptor de baff (baff-r). La expresión de baff-r es detectada por vez primera en células B T1, y aumenta de manera constante a partir de entonces. A continuación, el baff se requiere de manera constitutiva durante toda la vida de células B maduras. La emisión de señales por medio del eje de baff/baff-r promueve la supervivencia de células B transicionales al inducir la síntesis de factores antiapoptóticos como Bcl-2, Bcl-xl y Mcl-1, así como al interferir con la función de la molécula proapoptótica Bim (figura 9-12).

El descubrimiento de una señal de supervivencia de células B mediada por interacciones baff/baff-r, y distinta de las señales de supervivencia que emanan del bcr, extiende el pensamiento acerca de cómo las células B son seleccionadas para supervivencia en la periferia. En presencia de cifras altas de baff, las células B que por lo demás no pueden recibir cantidades suficientes de señales de supervivencia por medio del bcr pueden sobrevivir a un proceso de selección que de otro modo las eliminaría. De esta manera, baff puede proporcionar elasticidad y flexibilidad en el proceso de deleción de células B. Con todo, esto quizá se logre a costa de mantener células en potencia autorreactivas.

Las células B T3 son principalmente autorreactivas y anérgicas

Las células B T3 transicionales se caracterizaron por vez primera en la sangre y en órganos linfoides mediante citometría de flujo, y se describieron como CD93⁺mIgM^bajaCD23⁺. La función de CD93 se desconoce hasta el momento; CD23 es un receptor de baja afinidad para algunas clases de inmunoglobulina, y los dos marcadores sólo se usaron en estos experimentos para identificar las poblaciones celulares, y no debido a cualesquier razones particulares importantes para su funcionalidad. Experimentos recientes han sugerido que la población T3 tal vez represente células B que se han hecho anérgicas por contacto con antígeno propio soluble, pero que todavía no han sido eliminadas del repertorio de células B.

Un sistema transgénico desarrollado por Goodnow y colegas colocó por vez primera el concepto de anergia, o de falta de capacidad de respuesta, de célula B sobre una base experimental firme. Está claro que los linfocitos anérgicos reconocen sus antígenos, como se muestra por la identificación de cifras bajas de señales moleculares generadas dentro de las células después de unión a antígeno. Aun así, en lugar de ser activadas por contacto con antígeno, las células B anérgicas no se dividen, diferencian ni secretan anticuerpos después de estimulación, y muchas mueren poco tiempo después de recibir la señal antigénica.

Goodnow y colaboradores desarrollaron dos grupos de ratones transgénicos (figura 10-11a). Un grupo de ratones portó un transgén que codifica para lisozima de clara de huevo (egg) de gallina (hen) (hel) enlazado a un promotor de metalotionina, que colocó la transcripción del gen hel bajo el control de las cifras de cinc en la dieta de los animales. Lo anterior permitió a los investigadores alterar las cifras de hel soluble expresado en los animales experimentales al cambiar la concentración de cinc en su sangre. En estas condiciones experimentales, el hel fue expresado en la periferia del animal, no así en la médula ósea. El otro grupo de ratones transgénicos portó transgenes que codificaban para cadena pesada y para cadena ligera de inmunoglobulina reordenados, que codificaban para anticuerpo anti-hel; en estos ratones transgénicos, el transgén que codifica para anti-hel reordenado es expresado por 60 a 90% de las células B periféricas maduras. Goodnow a continuación apareó los dos grupos de ratones transgénicos para producir descendencia “transgénica doble” que portaba los transgenes que codificaban tanto para hel como para anti-hel (figura 10-11b), y se preguntaron qué efecto tendría la expresión de hel periférico sobre la expresión de anticuerpos por células B que portaban los anticuerpos anti-hel. Encontraron que los ratones transgénicos dobles siguieron generando células B periféricas maduras que portaban inmunoglobulina de membrana anti-hel de las clases tanto IgM como IgD, lo que indicó que las células B habían madurado por completo. De cualquier modo, estas células B carecieron de capacidad de respuesta funcional, es decir, fueron anérgicas.

El análisis de células B con citometría de flujo de los ratones transgénicos dobles mostró que, si bien hubo grandes números de células anti-hel anérgicas, expresaron IgM de membrana a cifras alrededor de 20 veces más bajas que los ratones transgénicos únicos anti-hel (figura 10-11b). Cuando se dio a estos ratones una dosis inmunizante de hel, pocas células plasmáticas anti-hel fueron inducidas, y el título sérico de anti-hel fue muy bajo (cuadro 10-4). Además, cuando se presentó antígeno a estas células B anérgicas en presencia de ayuda de células T, muchas de las células B anérgicas mostraron respuesta al pasar por apoptosis. El análisis adicional de las células B anérgicas demostró que tuvieron una vida media más corta que las células B normales, y parecieron estar excluidas de los folículos de célula B en los ganglios linfáticos y el bazo. Estas propiedades dependieron de la presencia continua de antígeno, puesto que la vida media de células B se restituyó a duraciones normales en el momento de la transferencia adoptiva de células B que portaban el transgén hacia un animal que no estaba expresando hel. La respuesta anérgica parece ser generada in vivo cuando células B inmaduras encuentran un antígeno propio soluble.

Experimentos más recientes se han enfocado en definir las diferencias entre los eventos de transducción de señal que llevan a anergia en contraposición con activación. Las células B anérgicas muestran mucho menos fosforilación de tirosina (inducida por antígeno) de moléculas emisoras de señales, en comparación con sus homólogos no anérgicos, y la liberación de calcio a partir de vesículas de almacenamiento estimulada por antígeno hacia el citoplasma de las células B anérgicas también estuvo notoriamente reducida. Asimismo, las células B anérgicas requieren cifras más altas de la citocina baff para supervivencia continua, y es probable que su vida media reducida dependa de competencia no exitosa con células B normales por cantidades limitantes de esta molécula de supervivencia. Uno de los resultados de la emisión de señales de baff es una reducción de las cifras citoplasmáticas de la molécula proapoptótica bim; como podría esperarse, las células B anérgicas muestran cifras de bim más altas que lo normal, y un incremento correspondiente de la susceptibilidad a apoptosis.

La conclusión a partir de estos experimentos es que hay mecanismos, incluso después de que las células B han salido de la médula ósea y entrado a la periferia, que minimizan el riesgo de que las células B sinteticen anticuerpos contra proteínas propias solubles expresadas fuera de la médula ósea. Las células B reactivas a esas proteínas muestran respuesta a estimulación de receptor en ausencia de ayuda apropiada de células T mediante anergia y apoptosis final.

¿Cuál podría ser la función de estas células anérgicas? Una posibilidad es que sirven para absorber antígenos propios excesivos que de otro modo podrían ser capaces de emitir señales activadoras a células B de alta afinidad y, así, llevar a reacciones autoinmunitarias. Otra es que representen células destinadas a apoptosis que todavía no muestran los datos microanatómicos característicos de las células apoptóticas. Una más es que estas células finalmente se desarrollarán hacia células reguladoras B (capítulo 12). Como sucede tan a menudo en el sistema inmunitario, es más que posible que todas estas funciones sean incorporadas dentro de esta interesante población de células, que sigue siendo el tema de investigación actual intensiva.

Las células B B-2 primarias maduras migran hacia los folículos linfoides

Las células B por completo maduras expresan cifras altas de IgD y cifras intermedias de IgM sobre su superficie celular (cuadro 10-2). Las células B maduras recirculan entre la sangre y los órganos linfoides; entran a los folículos de células B en los ganglios linfáticos y el bazo, y muestran respuesta a encuentro con antígeno en presencia de ayuda de células T, con producción de anticuerpo (capítulo 12). La médula ósea de ratón produce aproximadamente 10 a 20 millones de células B cada día, pero sólo alrededor de 10% de este número alguna vez llega a residir en la periferia, y sólo 1 a 3% entrará al fondo común de células B B-2 foliculares recirculantes. Algunas de estas células se pierden hacia el proceso de deleción clonal, pero otras son células B perfectamente inocuas que, sin embargo, no medran. El agotamiento experimental de la población de células B maduras, sea por medios químicos o por irradiación, seguido por reconstitución in vitro, da lugar a reabastecimiento rápido del fondo común folicular de células B. Esto sugiere que los nichos de células B foliculares tienen una capacidad designada, y que una vez que están llenos no admiten células B adicionales. Lo más probable es que el mecanismo de este control homeostático del número de células B se fundamente en competencia por factores de supervivencia, en particular baff y sus proteínas relacionadas.

Experimentos en los que se usaron animales con deleción (knockout) de RAG2 condicional, en los cuales todo el desarrollo de células B nuevas se evitó en animales adultos por lo demás sanos, indican que las células B B-2 foliculares tienen una vida media de aproximadamente 4.5 meses. En contraste, puesto que las células B B-1 pueden autorrenovarse en la periferia, sus números no están afectados en este animal con deleción (knockout) experimental.

Hasta ahora, este capítulo se ha centrado en el desarrollo de las células B que pertenecen a la subpoblación de células B mejor caracterizada, las células B B-2 (o células B foliculares). Las células B B-2 maduras recirculan entre la sangre y los órganos linfoides, y pueden encontrarse en grandes números en los folículos de células B de los ganglios linfáticos y el bazo. No obstante, se han reconocido otros subgrupos de células B que desempeñan funciones distintas, ocupan ubicaciones anatómicas distintas, y siguen programas de desarrollo diferentes. Por ende, en esta sección del capítulo se aborda el desarrollo y la función de células B B-1, y de células B de la zona marginal (véase en la figura 10-12 una comparación de las propiedades de estos tres tipos de células).

Las células B B-1 generan anticuerpos contra antígenos compartidos por muchas especies de bacterias y pueden hacerlo incluso en ausencia de estimulación antigénica (capítulo 12). Son la fuente de los llamados anticuerpos naturales: anticuerpos IgM séricos que proporcionan la primera línea de protección contra invasión por muchos tipos de microorganismos. Las células B de la zona marginal adoptan su nombre a partir de su ubicación en las zonas externas de la pulpa blanca del bazo. Son las primeras células B encontradas por antígenos transportados por la sangre que entran al bazo y, al igual que las células B B-1, producen principalmente (aunque no de manera exclusiva) anticuerpos de la clase IgM que muestran reactividad cruzada amplia. Las células B tanto B-1 como de la zona marginal pueden generar anticuerpos en ausencia de ayuda de células T, aunque la adición de células T auxiliares aumenta la secreción de anticuerpos y permite que haya cierto grado de cambio de clase de cadena pesada.

Las células B B-1 se derivan de una línea de desarrollo separada

Las células B B-1 difieren desde los puntos de vista fenotípico y funcional de las células B B-2 de varias maneras importantes. Ocupan nichos anatómicos diferentes de los que ocupan las células B B-2, constituyen 30 a 50% de las células B en las cavidades pleural y peritoneal de ratones, y representan alrededor de un millón de células en cada espacio. Un número similar de células B B-1 también puede encontrarse en el bazo, pero representan una fracción mucho más pequeña (alrededor de 2%) de la población de células B esplénicas. Las células B B-1 sólo tienen un repertorio de receptor relativamente limitado, y sus receptores tienden a ser dirigidos hacia el reconocimiento de antígenos carbohidrato microbianos expresados comúnmente. Estos receptores de antígeno de baja afinidad, que muestran reactividad cruzada amplia, y que expresan diversidad de repertorio mínima, recuerdan los receptores de patrones moleculares asociados con agente patógeno (pamp) del sistema inmunitario innato (capítulo 5) y, así, se considera que las células B B-1 desempeñan un papel que tiende un puente entre los sistemas inmunitarios innato y adaptativo.

En contraste con las células B B-2 transicionales T-1, que pasan por apoptosis en el momento de exposición a antígeno, las células B-1 transicionales pasan por apoptosis a menos que interactúen con antígenos propios. La investigación en varios sistemas transgénicos diferentes ha sugerido que la unión relativamente fuerte de bcr por antígenos propios proporciona una selección positiva más que una señal de supervivencia de selección negativa para células B B-1. En contraste con las células B-2 y las células de la zona marginal (véase más adelante), las células B B-1 no requieren interacción con baff durante la etapa de desarrollo transicional.

Durante muchos años, el tema preeminente debatido por quienes estaban interesados por el desarrollo de células B B-1 fue si constituían una línea de desarrollo separada, o si se derivaban de los mismos progenitores que las células B B-2. Desde entonces, esta controversia se ha resuelto a favor de la afirmación de que las células B B-1 y B-2 se derivan de líneas de células progenitoras distintas. Varias líneas de evidencia apoyan esta conjetura:

• Las células B B-1 aparecen antes que las células B B-2 durante el desarrollo ontogénico. Las células B generadas a partir de la región agm y el hígado en el feto tienen un fenotipo de superficie celular característico de células B B-1, y secretan anticuerpos IgM naturales sin la necesidad de inmunización deliberada. Las células B B-1 pueden ser generadas en etapas tempranas del desarrollo para proteger al feto contra bacterias patógenas comúnmente encontradas.

• Las células B B-1 muestran diversidad de región V mucho más limitada que las células B B-2. Generadas en un punto en la ontogenia antes de que TdT pueda ser activado de manera eficiente, muchas células B-1 carecen de evidencia alguna de adición de región N.

• Las células B B-1 pueblan diferentes nichos anatómicos en el ratón que las células B B-2 que surgen más tarde, de manera muy semejante a la que se ha descrito para las células T γδ derivadas del feto (capítulo 9).

• Progenitoras de células B del fenotipo CD19⁺CD45R^bajo/– transferidas hacia un ratón inmunodeficiente pudieron repoblar el compartimento de células B B-1, pero no el compartimento de células B B-2. Por el contrario, las progenitoras de células B CD19⁺CD45R^alto dieron lugar a células hijas B-2, no así a células hijas B-1, en un ratón receptor inmunodeficiente, lo que apoya la noción de que las dos subclases se derivan de diferentes líneas de células progenitoras.

• Mientras que las células B B-2 deben ser reabastecidas constantemente por el surgimiento de células recién generadas desde la médula ósea, las células B B-1 son regeneradas constantemente en la periferia del animal. Por ende, la ablación de la médula ósea deja al individuo con un fondo común de B-2 agotado, pero con una población de células B-1 por completo funcionales.

Hay muy pocos absolutos en biología y, así, debe quedar claro que es probable que no todas las células B B-1 en un animal adulto se deriven de precursores en el hígado fetal, y que en la médula ósea de adulto ocurre algo de reabastecimiento de precursores B-1. No todas las células B B-1 están restringidas a producción de IgM, y la producción de anticuerpos de algunas células B B-1 se beneficia a partir del suministro de ayuda de células T. Empero, independientemente de estas variaciones de los temas que se han detallado, no es menos cierto que la evidencia claramente apoya la noción de que las células B B-1 se derivan de una línea de células progenitoras diferente de las células B B-2.

Las células de la zona marginal comparten características fenotípicas y funcionales con células B B-1, y surgen en la etapa T2

El término zona marginal se refiere al hecho de que las células B de la zona marginal (mz) están situadas en las regiones externas de la pulpa blanca del bazo (figura 10-13). El ensanchamiento del flujo arterial de movimiento rápido hacia los senos marginales da lugar a un decremento de la tasa de flujo sanguíneo, y permite que antígenos transportados por la sangre interactúen con células que residen dentro de la zona marginal. De hecho, las células B mz parecen estar especializadas en el reconocimiento de antígenos transportados por la sangre. Son capaces de mostrar respuesta a antígenos tanto proteínicos como carbohidrato, y la evidencia sugiere que algunas células B mz, pero quizá no todas, pueden hacer esto sin la necesidad de ayuda por parte de células T.

Las células mz se caracterizan por cifras relativamente altas de IgM de membrana, y el receptor de complemento/correceptor de célula B CD21 (capítulos 3 y 6), pero cifras bajas de IgD de membrana y del receptor Fc CD23. También muestran receptores de fosfolípido y moléculas de adhesión que les permiten hacer interacciones adhesivas con otras células dentro de la zona marginal que las mantienen en su sitio. Las células mz son de vida prolongada, y pueden autorrenovarse en la periferia.

¿Qué impulsa a una célula B inmadura por la vía mz? La caracterización fenotípica de poblaciones de células B inmaduras en la médula ósea y periféricas, combinada con estudios de marcado que definen las relaciones precursor/célula hija, han sugerido que las células B B-2 mz y foliculares se derivan de la población transicional T2 (figura 10-9). Las células mz, al igual que las células B B-2, también dependen del factor de supervivencia de células B baff, que se une a las células B mz por medio del receptor BR3. Al igual que las células B B-1 en desarrollo, las células mz parecen requerir emisión de señales relativamente fuertes por medio del bcr para sobrevivir. Sorprendentemente, a diferencia de cualquier otro subgrupo de células B descrito hasta ahora, la diferenciación de células B mz también requiere emisión de señales por medio de ligandos de la vía Notch (capítulo 9). La pérdida del receptor Notch 2 o la deleción del ligando Notch 2, tipo delta 1 (Dl-1), da lugar a la deleción selectiva de células B mz. Las poblaciones de células B tanto mz como B-1 están enriquecidas en células que expresan receptores específicos para antígeno propio y, así, para la diferenciación de células B mz también se necesita emisión de señales relativamente fuertes de células T2 mediante unión de antígenos propios por medio del bcr.

Para cerrar este capítulo, es instructivo considerar los muchos puntos de comparación entre el desarrollo de los dos extremos del sistema inmunitario adaptativo, las células B y las células T (cuadro 10-5). Ambas líneas de células tienen sus inicios en el feto y el recién nacido. En este último, las células T γδ y las células B B-1 son enviadas hacia sus nichos periféricos particulares propios, para funcionar ahí como poblaciones que se autorrenuevan hasta la muerte del huésped. En el animal adulto, el desarrollo de células B y de células T continúa en la médula ósea, empezando con células madre hematopoyéticas. Las células B y las células T comparten las fases tempranas de sus programas de desarrollo, puesto que pasan por etapas progresivamente más diferenciadas como mpp, lmpp y elp. En las etapas de elp y clp, las progenitoras de células T salen de la médula ósea y migran hacia el timo para completar su desarrollo, y dejan atrás las progenitoras de células B. En mamíferos, las células B no tienen un órgano análogo al timo en el cual desarrollarse hacia células maduras, funcionantes, aunque las aves poseen un órgano de ese tipo, la bolsa de Fabricio. (Muchos estudiantes sajones desconocen que la “B” en las células B es la inicial de este órgano, y no de médula ósea [bone marrow].)

Con el inicio de la recombinación V(D)J, la célula B se compromete de manera irreversible a su línea, y empieza el proceso de reordenamiento de receptor, seguido por selección, y diferenciación, de célula B, que culminarán en la formación de un repertorio completo de células B periféricas funcionantes.

Tanto las células B como las células T deben pasar por etapas de selección positiva, en las cuales las células capaces de recibir señales de supervivencia son retenidas a expensas de las que no pueden hacerlo. También deben sobrevivir al proceso de selección negativa, en el cual los linfocitos que tienen afinidad alta por antígenos propios son eliminados. El proceso de selección positiva en células B —su mecanismo, y los ligandos bcr involucrados— persiste como uno de los procesos menos caracterizados en el desarrollo de células B. Aun así, a diferencia de las células T, las células B no pasan por selección en lo que se refiere a su capacidad para unirse a antígenos de mhc propios.

Con la expresión de cifras altas de IgD sobre la superficie celular y las moléculas de adhesión necesarias para dirigir su recirculación, el desarrollo de la célula B-2 folicular madura está completo y, durante algunas semanas a meses, recirculará, lista para tener contacto con antígeno en el contexto de ayuda de células T y diferenciación subsiguiente hacia la producción de anticuerpos. Las etapas finales de diferenciación de células B, estimuladas por antígeno, se describen en el capítulo 12.

• La hematopoyesis en el embrión genera células madre hematopoyéticas que se dividen con rapidez y pueblan el sistema sanguíneo del animal, con lo cual proporcionan eritrocitos que satisfacen las necesidades de oxígeno del feto, y generan los precursores tempranos de otras líneas de células sanguíneas. Los sitios tempranos de desarrollo de células sanguíneas son el saco vitelino y la placenta, así como la región aorta-gónadas-metanefros (agm) y el hígado fetal.

• Las progenitoras de células B más tempranas en el hígado fetal proporcionan células B B-1 que migran hacia las cavidades pleural y peritoneal y permanecen renovándose por sí mismas durante toda la vida del animal.

• En animales adultos, la hematopoyesis ocurre en la médula ósea.

• Las etapas de progenitor del subgrupo B-2 convencional son definidas por la presencia de marcadores de superficie celular particulares, que incluyen receptores de quimiocina y linfocina, y proteínas involucradas en interacciones adhesivas.

• Las etapas de progenitor también son definidas por el estatus de reordenamientos del gen que codifica para la región V de la inmunoglobulina. Los genes que codifican para V de cadena pesada se reordenan primero; inicialmente ocurre recombinación de D a J_H, seguida por recombinación de V_H a DJ_H.

• A continuación la cadena pesada es expresada sobre la superficie celular en combinación con la cadena ligera sustituto, que está constituida de VpreB y λ5. Juntas forman el receptor de célula pre-B que es expresado sobre la superficie celular junto con el complejo de emisión de señales Igα,Igβ.

• La emisión de señales por medio del receptor de célula B suspende el reordenamiento del gen que codifica para V_H, y desencadena algunas rondas de división celular. Esto permite que múltiples células B usen la misma cadena pesada reordenada exitosamente en combinación con muchas cadenas ligeras distintas.

• Después del reordenamiento de cadena ligera, y la expresión del receptor de inmunoglobulina completado sobre la superficie celular, las células B inmaduras específicas para antígenos propios presentes en la médula ósea son eliminadas mediante apoptosis.

• Las células B inmaduras surgen de la médula ósea como células B transicionales 1 (T1) y circulan hacia el bazo. La interacción con antígenos propios en el bazo puede dar lugar a apoptosis.

• A continuación, las células B B-2 T1 entran a los folículos, donde aumenta la magnitud de expresión de IgD, se convierten en células T2, y después maduran hacia una célula B-2 folicular (una célula B convencional) o una célula B de la zona marginal (mz).

• Los tres subgrupos principales de células B difieren de acuerdo con su sitio de generación, sus sitios de maduración, sus nichos anatómicos en el adulto, los antígenos a los cuales muestran respuesta, su necesidad de ayuda de células T en la producción de anticuerpos, la diversidad de sus repertorios de inmunoglobulina, y sus capacidades para pasar por hipermutación somática y generación de memoria después de estimulación antigénica.

• Al igual que las células T, las células B en desarrollo deben pasar por selecciones tanto positiva como negativa. A diferencia de las células T, las células B no necesitan ser seleccionadas respecto a su capacidad para reconocer antígenos en el contexto de antígenos del mhc, ni hay un órgano inmunitario primario además de la médula ósea especializado para su maduración. No hay equivalente de la proteína aire que se haya descubierto hasta ahora que proporcione expresión ectópica de antígenos en la médula ósea para facilitar deleción clonal de células B específicas para antígeno propio.

Sitios web útiles

www.bio.davidson.edu/courses/immunology/Flash/Bcellmat.html Una animación poco común del desarrollo de células B.

1. Usted desea estudiar el desarrollo de células B B-1 en ausencia de los otros dos subgrupos principales de células B. Usted tiene un ratón Rag1^–/– receptor que ya ha repoblado con células T. ¿Cuál elegiría para ser su fuente de progenitoras B-1, y por qué? ¿A partir de cuáles sitios anatómicos esperaría usted cosechar las células B B-1?

2. Describa las diferencias fenotípicas y funcionales entre células B T1 y T2 inmaduras.

3. Después de expresión del receptor de célula pre-B sobre la superficie de células B progenitoras, la célula B pasa por algunas rondas de división celular. ¿Qué propósito desempeña esta ronda de división en el desarrollo del repertorio de células B?

4. Las células B inmaduras que portan receptores en potencia autoinmunitarios pueden ser manejadas de tres maneras a fin de minimizar la probabilidad de enfermedad. Describa estas tres estrategias, y mencione si son compartidas por progenitoras de células T.

5. Usted sospecha que un nuevo factor de transcripción es expresado en la etapa de desarrollo de célula pre-pro-B. ¿Cómo probaría su hipótesis? ¿Cuál es el estado de reordenamiento de cadenas pesada y ligera en esta etapa del desarrollo, y cómo lo probaría usted?

6. ¿Cómo determinaría si una etapa particular del desarrollo de células B ocurre en asociación con una célula del estroma que expresa CXCL12?

7. Describa el orden en el cual los genes que codifican para el receptor de célula B pasan por reordenamiento, indicando en qué etapas esperaría usted ver que la célula B expresa una o ambas cadenas sobre la superficie celular. ¿En qué sentido(s) este proceso de reordenamiento de gen imita la progresión análoga en células T αβ, y en qué difieren los dos procesos?

ANALICE LOS DATOS Las dos columnas de datos que se presentan en la figura que aparece a continuación son gráficos de citometría de flujo que describen las cifras de los antígenos denotados en los ejes x y y. La columna de la izquierda representa los antígenos presentes en el bazo (parte A) y la médula ósea (partes B) de animales naturales (genéticamente normales). Los gráficos representan todos los linfocitos en el bazo (parte A) o las células progenitoras y precursoras de células B en la médula ósea (parte B). La columna de la derecha muestra los mismos gráficos a partir de animales en los cuales se ha efectuado deleción (knockout) del gen Dicer. Como recordará el lector, el gen Dicer se requiere para la maduración de miRNA controladores.

1. Para cada par de gráficos, describa las diferencias en las poblaciones celulares, indicando si las diferencias reflejan pérdidas o ganancias en poblaciones de células B en desarrollo particulares.

2. ¿En qué punto(s) del desarrollo de células B cree que los miRNA están funcionando?

ANALICE LOS DATOS La figura que sigue se deriva del mismo documento que las anteriores. En este caso los datos son expresados como histogramas, en los cuales el eje y representa el número de células que se unen a la molécula mostrada en el eje x, anexina V. La anexina V se une a fosfatidil serina sobre la capa externa de membranas celulares. La fosfatidil serina se encuentra en la capa externa sólo en células que están a punto de sufrir apoptosis. Los dos paneles superiores representan células de un animal natural, y los dos paneles inferiores representan células de animales en los cuales se ha efectuado deleción del gen Dicer.

1. ¿La presencia de Dicer tiene un efecto sobre la fracción de células pro-B que pasan por apoptosis? Explique su razonamiento.

2. ¿La presencia de Dicer tiene un efecto sobre la fracción de células pre-B que pasan por apoptosis? De nuevo explique su razonamiento.

3. Describa una función que usted ahora cree que los miRNA desempeñan en el desarrollo de células B.

1. Células hepáticas fetales; los progenitores de célula B B-1 están altamente enriquecidos en el hígado fetal, y son las primeras células B que pueblan la periferia. Las cavidades peritoneal y pleural, así como el bazo.

2. Las células T2 tienen cifras intermedias de IgD, mientras que las células T1 no tienen IgD o tienen cantidades bajas de la misma. Las células T2 portan tanto CD21 como CD23, mientras que ni uno ni otro antígeno es expresado sobre células T1. Las células T2 tienen cifras más altas del receptor para el factor de supervivencia de células B baff que las células T1. La interacción de antígeno con células T1 da lugar a apoptosis; la interacción de antígeno con células T2 envía señales de supervivencia y maduración.

3. La división celular a esta etapa permite que el repertorio maximice su uso de células B en las cuales una cadena pesada ha sido reordenada de manera productiva. Cada célula hija puede entonces reordenar un grupo diferente de segmentos de gen que codifica para cadena ligera, lo que da lugar a múltiples clonas de células B que portan los mismos genes que codifican para cadena pesada, pero genes que codifican para cadena ligera diferentes.

4. Pueden sufrir apoptosis, en un proceso llamado selección negativa. Esto ocurre para células B en la médula ósea y para células T en el timo.

   Pueden hacerse anérgicas —resistentes a estimulación adicional— y finalmente morir. Esto ocurre tanto para células T como para células B.

   Sus receptores pueden pasar por edición de receptor. Esto ocurre con bastante frecuencia en células B. En células T, el grado al cual ocurre edición de receptor varía de acuerdo con la naturaleza del animal (la naturaleza del transgén usado para estudiar edición) y, por ende, hasta ahora no está claro si es un mecanismo significativo en el desarrollo de receptor de célula T y selección del mismo.

5. En primer lugar, se efectúa deleción (knockout) de la capacidad del animal para expresar ese factor de transcripción, y a continuación se analiza la médula ósea respecto a la aparición de progenitores de célula B en cada etapa de desarrollo usando citometría de flujo. No se esperaría ver progenitor alguno después de la etapa de célula pre-pro-B si el factor de transcripción es expresado, entonces y es necesario para el desarrollo adicional de células B.

   En segundo lugar, se sintetiza una proteína de fusión en la cual el promotor del factor de transcripción es fusionado a una proteína fluorescente, como la verde o la amarilla. Se correlaciona la expresión de las proteínas fluorescentes con los marcadores de superficie celular. Se esperaría ver la proteína fluorescente aparecer primero en células que portan marcadores característicos de la etapa de célula pre-pro-B.

   El reordenamiento ha empezado; ocurre reordenamiento D a J_H sobre la cadena pesada. Se prueba al usar pcr, con preparadores complementarios a secuencias torrente arriba de las regiones D y torrente abajo de las regiones J, seguido por secuenciación, si es necesario.

6. Se crea un animal en el cual el promotor CXCL12 es fusionado a una proteína fluorescente marcadora, como gfp. Se preparan laminillas de médula ósea, teniendo cuidado de que las condiciones no rompan las fijaciones celulares, y se marcan las células con marcadores característicos de la etapa blanco de desarrollo. Se busca formación de pares de células entre las células marcadas con CXCL12 y células progenitoras marcadas con los marcadores característicos de la etapa de desarrollo blanco.

7. El reordenamiento empieza primero en el locus de cadena pesada; comienza con D a J_H y procede con V_H a D. Si los reordenamientos en el primer alelo no son productivos, el reordenamiento empieza de nuevo sobre el segundo locus de cadena pesada, y procede en el mismo orden. El reordenamiento exitoso en un locus de cadena pesada da lugar a la expresión de una cadena pesada en la superficie del progenitor de célula B en combinación con la cadena ligera sustituto, para formar el receptor de célula pre-B. Esto ocurre al principio de la etapa de célula pre-B grande. La expresión de la cadena pesada en la superficie celular emite señales para el cese del reordenamiento adicional de cadena pesada.

   En el locus de cadena ligera en ratones, el reordenamiento empieza en uno de los loci κ y, de nuevo, si no es productivo, empieza nuevamente en el otro locus κ. Si éste tampoco es productivo, el proceso se repite en los loci λ. En seres humanos el proceso es similar, pero el reordenamiento puede empezar en los loci κ o λ. El reordenamiento de cadena ligera es completado al final de la etapa de célula pre-B pequeña, y la expresión del receptor de Ig completo sobre la superficie de la célula emite señales para el inicio de la etapa de célula B inmadura.

   En las células T, el reordenamiento empieza sobre loci de cadena β sucesivos. En posesión de segmentos V, D y J, el locus de la cadena β es análogo al locus de Ig de cadena pesada. El reordenamiento exitoso de la cadena β da lugar a la expresión de un pre-tcr sobre la superficie celular, del mismo modo que para el pre-bcr sobre células B, junto con el cese de recombinación adicional del segmento de gen que codifica para cadena β. A continuación hay reordenamiento en el locus de cadena α. Una diferencia importante entre los procesos de reordenamiento en células T y B es que la exclusión alélica en el locus de la cadena α de célula T es incompleta.

• Analice los datos a) En el bazo, el animal con deleción (knockout) de Dicer no muestra células B maduras, lo cual es indicado por la pérdida de la población B220^hi CD19⁺.

  En la población de la médula ósea superior, en ausencia de Dicer, no hay células B220^hi que porten sIgM.

  El segundo panel de médula ósea muestra retención del marcador de célula progenitora, c-kit, en la deleción (knockout) de Dicer.

  El tercer panel muestra que en ausencia de Dicer hay una pérdida de CD25, un marcador característico del punto en el desarrollo en el cual el pre-bcr es expresado sobre la superficie celular. Esto sugiere que las células no pueden pasar más allá de este punto de control.

  b) Dado que no se expresa IgM sobre la superficie celular de animales con deleción (knockout) de Dicer, deben requerirse miRNA para la progresión a la etapa de célula pre-B, en la cual la IgM es expresada primero sobre la superficie celular. La presencia de c-Kit y de cantidades bajas de CD25 sugiere que los miRNA pueden estar actuando en el punto de control pre-bcr.

• Analice los datos a) No. La fracción de células marcadas con anexina V y, por ende, en el estado preapoptótico, es idéntica en las poblaciones testigo y con deleción (knockout) de Dicer. b) Sí. La fracción de células marcada con anexina V aumenta desde 9.2% en el control hasta 65% en la población con deleción (knockout) de Dicer. c) Al reunir los datos de las dos últimas preguntas, yo emitiría la hipótesis de que los miRNA ayudan en el control de la expresión del pre-bcr sobre la superficie celular, lo que permite que las células pasen por el primer punto de control en el desarrollo. Las células que no pueden expresar pre-bcr mueren por apoptosis, y ése es el proceso descrito en el segundo grupo de láminas.