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En el capítulo 2 (figura 2-5) se presentó la estructura del hueso y de la médula ósea. El microambiente de la médula ósea es una compleja estructura tridimensional con nichos celulares distintivos que están especializados para influir sobre el desarrollo de las poblaciones de células que maduran ahí. Una red densa de vasos sanguíneos de pared delgada fenestrados (permeables) —los sinusoides de la médula ósea— penetra en la médula ósea, lo que permite el paso de células sanguíneas recién formadas hacia la periferia, y facilita la circulación de sangre por la médula ósea.
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Además de servir como una fuente de células madre hematopoyéticas, la médula ósea también contiene células madre que pueden diferenciarse hacia adipocitos (células adiposas), condrocitos (células de cartílago), osteocitos (células óseas), miocitos (células musculares) y en potencia también otros tipos de células. Cada una de estas clases diferentes de células madre requiere grupos de factores específicos, secretados por células del estroma de la médula ósea particulares para permitir su diferenciación apropiada.
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¿Qué son las células del estroma de la médula ósea? El término estroma se deriva del griego para colchón, y una célula del estroma es un término general que describe una célula adherente grande que apoya el crecimiento de otras células. Durante el desarrollo de células B, las células del estroma de la médula ósea satisfacen dos funciones. En primer lugar, al interactuar con moléculas de adhesión sobre la superficie de hsc y células progenitoras, las células del estroma retienen las poblaciones de células en desarrollo en los nichos de la médula ósea específicos, donde pueden recibir las señales moleculares apropiadas que se requieren para su diferenciación adicional. En segundo lugar, poblaciones diversas de células del estroma expresan diferentes citocinas. En diversos puntos en su desarrollo, las células B progenitoras y precursoras deben interactuar con células del estroma que secretan citocinas particulares y, así, las células B en desarrollo se mueven en una progresión ordenada de un sitio a otro dentro de la médula ósea; esta progresión es guiada por quimiocinas secretadas por poblaciones particulares de células del estroma. Por ejemplo, las hsc empiezan su vida en estrecho contacto con osteoblastos situados cerca del revestimiento de la cavidad endosteal (médula ósea). Una vez diferenciadas hacia la etapa de célula pre-pro-B, las células B en desarrollo requieren señales provenientes de la quimiocina CXCL12, que es secretada por un grupo especializado de células del estroma, para progresar a la etapa de pro-célula B. Las pro-células B a continuación requieren emisión de señales provenientes de la citocina IL-7, que es secretada por aun otro subgrupo de células del estroma (figura 10-3). Muchos de estos factores de células del estroma sirven para inducir la expresión de factores de transcripción especializados importantes en el desarrollo de células B.
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Las etapas de la hematopoyesis son definidas por marcadores de superficie celular, expresión de factor de transcripción y reordenamientos de gen que codifica para inmunoglobulina
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La caracterización completa de una vía de desarrollo requiere que los científicos entiendan las características fenotípicas y funcionales de cada tipo de célula en esa vía, así como las señales moleculares y los factores de transcripción que impulsan la diferenciación en cada etapa. Las células, en etapas de diferenciación particulares, pueden caracterizarse por sus moléculas de superficie, que incluyen antígenos de superficie celular, moléculas de adhesión, y receptores para quimiocinas y citocinas. También son definidas por la gama de factores de transcripción activos que determinan cuáles genes son expresados en cada paso en el proceso de desarrollo. Finalmente, en el caso de las células B, las etapas de desarrollo son definidas por el estado de los genes que codifican para cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina en reordenamiento. Todavía no se entiende por completo el desarrollo de células B; con todo, se han definido casi todos los intermediarios celulares importantes, e inmunólogos del desarrollo están llenando de manera gradual las brechas en el conocimiento.
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Los investigadores que están delineando la vía de diferenciación de linfocitos B emplearon tres estrategias experimentales generales. En primer lugar, generaron anticuerpos contra moléculas (antígenos o marcadores) presentes sobre la superficie de células de la médula ósea. A continuación determinaron cuáles de estas moléculas estuvieron presentes al mismo tiempo que otros antígenos, y cuáles combinaciones de antígenos parecieron definir tipos de células singulares (figura 10-4a). Además, el cultivo de células in vitro que portan antígenos de superficie conocidos, seguido por análisis con citometría de flujo de las células hijas generadas en cultivo, les permitió describir la expansión secuencial de combinaciones particulares de moléculas de superficie celular (figura 10-4b).
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En segundo lugar, al clasificar células que portan combinaciones particulares de marcadores de superficie celular, y analizar esas poblaciones de células respecto a reordenamientos de gen que codifica para inmunoglobulina, los científicos lograron confirmar la estadificación de la aparición de antígenos vinculados con el desarrollo particulares. Por ejemplo, un antígeno que aparece sobre una célula en la cual no ha tenido lugar reordenamiento del gen que codifica para la región variable, es claramente expresado a una etapa muy temprana en la diferenciación de célula B. De modo similar, un antígeno presente sobre la superficie de una célula que ha reordenado los genes que codifican para cadena pesada, no así los que codifican para cadena ligera, define una etapa en la diferenciación de célula B más avanzada que la definida por el marcador antes descrito, mientras que un antígeno presente sobre una célula que ha pasado por reordenamiento de los genes que codifican tanto para cadena pesada como para cadena ligera, caracteriza a una etapa muy avanzada en el desarrollo de célula B. De esta manera, se definieron marcadores de superficie celular que podían servir como indicadores de pasos particulares en la diferenciación de células B (figura 10-4c).
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En tercer lugar, los investigadores usan el poder de la genética de deleción (knockout) para determinar los efectos sobre el desarrollo de células B de la eliminación de la expresión de genes particulares, como los que codifican para factores de transcripción particulares (figura 10-4d). Por ejemplo, la deleción (knockout) de un gen que codifica para un factor de transcripción particular elimina la capacidad de un animal para completar la recombinación VH a DJH mientras que aún permite el reordenamiento D a JH. Esto indica que el factor de transcripción particular en cuestión no es necesario para etapas de diferenciación de células B previas al reordenamiento D a JH, pero que se requiere para una o más etapas, empezando con la recombinación VH a DJH.
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Aun así, una desventaja del método de deleción (knockout) es que sólo define la primera etapa en la diferenciación en la cual se requiere el factor de transcripción. En variaciones más recientes se ha explotado la genética de introducción (knockin) (figura 10-4e) para generar animales que expresan marcadores fluorescentes bajo el control de los promotores de factor de transcripción, de modo que puede delinearse cada punto en el cual el factor de transcripción es expresado. La estadificación de la expresión de factor de transcripción a continuación se correlaciona con la expresión tanto de marcadores de superficie celular como de reordenamiento de gen que codifica para inmunoglobulina. La secuencia de desarrollo de células B descrita en las secciones que siguen se ha elucidado usando una combinación de estas estrategias.
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A últimas fechas se ha dirigido la atención a especies de miRNA de peso molecular pequeño, que tienen profundos efectos sobre la estabilidad del mRNA y, por ende, sobre la expresión de proteínas particulares. En el recuadro 10-2, Avances, se describen los efectos de algunos de los miRNA que recientemente se ha mostrado que influyen sobre la diferenciación de células B. En la actualidad ésta es un área de investigación en extremo activa.
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RECUADRO 10-2
AVANCES: Función del miRNA en el control del desarrollo de células B
Desde hace mucho tiempo los genetistas han sabido que sólo una pequeña fracción del dna cromosómico especifica para secuencias de proteína, y en artículos iniciales los segmentos de dna que no codifican para proteína se relegaron al estatus descrito de modo algo despectivo de “dna basura”. Sin embargo, en 1993 científicos que estaban estudiando el genoma del nematodo C. elegans describieron investigaciones revolucionarias en algunas de las secuencias no codificadoras de proteína que habían identificado como haber sido transcritas pero no traducidas. Mostraron que estos transcritos primarios fueron procesados hacia fragmentos pequeños de rna, de 18 a 30 nucleótidos de longitud, que fueron capaces de ejercer control sobre la magnitud de expresión de mRNA.
La biosíntesis de estos micro-RNA sigue una forma similar en eucariontes tan diversos como C. elegans y los seres humanos (figura 1). Los rna por completo cubiertos y poliadenilados (pri-microRNA) son sintetizados por la rna polimerasa II y después son divididos hacia un pre-microRNA de 70 a 100 nucleótidos en forma de horquilla por la RNAasa nuclear Drosha, que funciona en tándem con una segunda proteína de unión a rna bicatenario, DGCR8. El pre-micro-RNA dividido a continuación es exportado hacia el citoplasma, donde una segunda RNAasa, Dicer, que actúa en asociación con otras dos proteínas, lo procesa hacia un dúplex de miRNA de 18 a 30 nucleótidos, que consta del miRNA maduro y su cadena antisentido. En un paso final, el miRNA maduro, ahora monocatenario, se asocia con un complejo proteínico llamado complejo silenciador inducido por rna, o risc.
El miRNA maduro opera mediante unión complementaria de una llamada región “semilla” de seis a ocho nucleótidos en su extremo 5’ a una región sobre su mRNA blanco. Una vez que el miRNA se ha unido, pueden suceder tres cosas: el mRNA blanco puede ser directamente establecido como objetivo para división; el mRNA puede ser desestabilizado, o puede reprimirse la traducción desde el mRNA. Además, ahora se sabe que un miRNA único puede establecer como objetivo la síntesis de muchas proteínas, y cada mRNA puede ser el blanco de más de un miRNA, lo que contribuye tanto a la flexibilidad como a la complejidad de este modo de control sobre la expresión de gen.
Empero, ¿la regulación por miRNA opera durante el desarrollo de células B? Varias líneas de evidencia sugieren que la respuesta a esta pregunta es un inequívoco “sí”. Desde un punto de vista teórico, está claro que los cambios vinculados con el desarrollo que ocurren conforme las células B maduran requieren cambios rápidos de las concentraciones de proteínas tan importantes como los factores de transcripción y las moléculas proapoptóticas y antiapoptóticas, entre otras proteínas reguladoras. La necesidad de esas alteraciones rápidas de las concentraciones de proteína puede ser satisfecha con eficiencia por el tipo de mecanismos de control postranscripcional mediados por miRNA.
La pérdida condicional del gen que codifica para la nucleasa Dicer destruye toda la capacidad para sintetizar miRNA maduros. La ablación de Dicer en progenitoras de células B tempranas dio lugar a un bloqueo del desarrollo en la transición de célula pro-B a célula pre-B. En estos experimentos, la molécula proapoptótica Bim fue expresada a concentraciones más altas en progenitoras de células B con ablación de Dicer que en progenitoras de células B normales. Se encontró que secuencias en la región 3’ no traducidas del gen Bim son complementarias a miRNA de la familia 17~92, lo que sugiere que los miembros de esta familia en circunstancias normales regulan en dirección descendente Bim a esta etapa del desarrollo, lo que permite a las células B pasar por esta transición. También se mostró que la familia 17~92 de miRNA afecta la expresión de TdT y, por ende, la adición de secuencia N. Otras alteraciones en la expresión del gen que codifica para inmunoglobulina también se observaron en ausencia de miRNA 17~92, incluso un incremento de la expresión de transcriptos estériles. Estos datos demuestran en conjunto que los miRNA son importantes en el control de la transición de célula pro-B a célula pre-B, y afectan tanto la expresión de moléculas proapoptóticas como la naturaleza del repertorio de Ig. Como se predeciría a partir de estos resultados colectivos, los animales con expresión aumentada de miembros de la familia miR-17~92 expresan cifras más bajas de Bim, y sufren un trastorno linfoproliferativo y enfermedad autoinmunitaria.
También se encontró que los miembros de la familia de miRNA 17~92 controlan la concentración de la proteína Pten, que actúa como un inhibidor de la vía de emisión de señales de la PI3 cinasa y Akt prosupervivencia. Un incremento de las concentraciones de moléculas miR-17~92 permite mayor destrucción del mRNA que codifica para Pten, lo que da lugar a incremento de la supervivencia celular y un aumento correspondiente del número de linfocitos disponibles para proliferar.
Otros investigadores han abordado la pregunta de cuáles miRNA son expresados en diferentes etapas del desarrollo de célula B. Con una combinación de método genómico (análisis hechos por computadora) y métodos de biología molecular más clásicos se han identificado varias especies y/o familias de miRNA que están implicadas en el control del desarrollo de células B.
Quizá el miRNA mejor estudiado es el miR-150, que es altamente expresado en células B maduras y en reposo, pero no en sus progenitoras. Se ha mostrado que la molécula miR-150 deprime la expresión del factor de transcripción c-Myb, que se sabe que es esencial para el control del desarrollo de células B. Como podría haberse predicho, el patrón de expresión de c-Myb en el desarrollo de linfocitos es complementario al de miR-150, por cuanto c-Myb es altamente expresado en progenitoras linfoides, y es regulado en dirección descendente en el momento de su maduración; además, el análisis transcripcional confirmó que miR-150 es un factor importante en la regulación de las cifras del factor de transcripción c-Myb durante el desarrollo de células B.
MiR-150 también está implicado en la especificación de línea B-1/B-2. La deleción específica para célula B del gen c-myb suspende el desarrollo de célula B en la transición de pro-B a pre-B, y lleva también a la desaparición completa del subgrupo de células B B-1. Si miR-150 se encarga de modular en dirección descendente las cifras de c-Myb in vivo, podría predecirse que la deficiencia de miR-150 daría lugar a un fenotipo opuesto al expresado por un animal deficiente en c-Myb, y de hecho se encontró que es así. Se halló que la deficiencia de miR-150 da lugar a la expansión del fondo común de células B B-1, con un incremento resultante de la secreción de anticuerpos IgM.
El estudio del control de la expresión de genes de mamíferos y del desarrollo de linfocitos por miRNA aún se encuentra en sus inicios, pero la capacidad para manipular y aislar células a etapas separadas en la secuencia de desarrollo proporciona un sistema en particular manejable en el cual analizar el rango de acciones de diferentes familias de miRNA. Este campo sin duda es uno al que hay que dar seguimiento.
Referencias Baltimore et al., 2008. MicroRNAs: new regulators of immune cell development and function. Nature Immunology 9:839-845.
Koralov, S.B., et al. 2008. Dicer ablation affects antibody diversity and cell survival in the B lymphocyte lineage. Cell 132:860-874.
Vasilatou, D., S. Papageorgiou, V. Pappa, E. Papageorgious, y J. Dervenoulas. 2009. The role of microRNAs in normal and malignant hematopoiesis. European Journal of Haematology 84:1-16.
Xiao, C., y K. Rajewsky. 2009. MicroRNA control in the immune system: Basic principles. Cell 136:26-36.
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Las etapas más tempranas en la diferenciación de linfocitos culminan en la generación de un progenitor linfoide común
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En esta sección se describirá el proceso mediante el cual una hsc en la médula ósea se desarrolla hacia un clp. A menos que se especifique otra cosa, la vía de desarrollo que se describe se refiere a la seguida por la población de células B B-2 predominante. Los aspectos específicos del desarrollo que difieren entre los diversos subgrupos de célula B se abordan hacia el final de este capítulo.
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Las hsc se renuevan por sí mismas (pueden dividirse para crear copias idénticas de la célula padre) y son multipotenciales (pueden dividirse para formar células hijas que están más diferenciadas que la célula padre, y que pueden desarrollarse a lo largo de distintas líneas de células sanguíneas), y pueden dar lugar a todas las células de la sangre. Las hsc mantienen un número relativamente grande de genes en un estado llamado “preparado”, y una hsc individual puede poseer genes preparados característicos de múltiples líneas celulares. La cromatina preparada se asocia con números de nucleosomas más bajos que lo habitual, es más accesible a la actividad de enzima que la mayor parte de la cromatina en la célula, y muestra patrones de metilación y acetilación de histona característicos de la cromatina activa. Dependiendo de los estímulos ambientales a los cuales cualquier hsc dada está expuesta, los factores de transcripción pueden impulsar a la célula por varias vías de desarrollo posibles. Durante el proceso de diferenciación que sigue, son desactivadas las regiones de cromatina preparadas que contienen genes que son innecesarios para la vía del desarrollo seleccionada.
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En hsc destinadas a ser células B, los factores de transcripción Ikaros, factor de secuencia de purina 1 (PU.1) y E2A participan en las etapas más tempranas del desarrollo de la línea B. Ikaros recluta complejos de remodelación de cromatina a regiones particulares en el dna y asegura la accesibilidad de los genes necesarios para el desarrollo de células B. PU.1 preside una “ley de equilibrio” leucocítico; las cifras bajas de PU.1 favorecen la diferenciación linfoide, mientras que las células que expresan cifras más altas de PU.1 se desvían hacia un destino mieloide. La cifra de proteína PU.1 expresada está regulada a su vez por el represor transcripcional Gfi1, que regula en dirección descendente la expresión de PU.1 hasta las cifras necesarias para progresión por la vía de las células B. La expresión de E2A contribuye al mantenimiento del fondo común de hsc al participar en la regulación del control del ciclo celular en esta población.
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Como se hizo notar en el capítulo 9, las hsc expresan la molécula de superficie celular c-Kit (CD117), que es el receptor para el factor de células madre (stem) (scf). El scf es una citocina que existe en formas tanto unida a membrana como soluble, y la interacción SCF-c-Kit es crucial para el desarrollo, en animales adultos, de células progenitoras multipotenciales (mpp). El scf unido a membrana desempeña un papel en la retención de hsc y sus células progenitoras hijas en los nichos ambientales apropiados en la médula ósea. Las hsc también expresan el antígeno asociado a célula madre (stem)-1 (Sca-1). Tanto c-Kit como Sca-1 son expresados en paralelo sobre células progenitoras tempranas, y su expresión disminuye conforme las células se comprometen a una línea celular particular (figura 10-5). Las hsc a menudo se describen como Lin–, designación que se refiere al hecho de que no tienen “marcadores de línea” característicos de una subpoblación de células sanguíneas particular.
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Las mpp generadas en el momento en que se recibe la señal de SCF/c-Kit pierden la capacidad de autorrenovación extensa, pero retienen el potencial para diferenciarse hacia varias líneas hematopoyéticas diferentes. Las células mpp retienen la expresión de c-Kit y Sca-1, y expresan de manera transitoria la molécula CD34. De hecho, anticuerpos contra CD34 se usan en clínica para aislar células en esta etapa en la hematopoyesis. Las mpp también expresan el receptor de quimiocina CXCR4, que les permite unirse a la quimiocina derivada de células del estroma CXCL12. La interacción entre CXCL12 y CXCR4 es importante para asegurar que la célula progenitora ocupe el nicho correcto dentro de la médula ósea (figura 10-3).
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La célula progenitora en su camino a convertirse en una célula B a continuación empieza a expresar el receptor de tirosina cinasa relacionado con fms 3 (flt-3). El flt-3 se une al ligando de flt-3 unido a membrana sobre células del estroma de la médula ósea, y emite señales a la célula progenitora para que empiece a sintetizar el receptor de IL-7 (IL-7R, CD127). El flt-3 es expresado sobre progenitoras de célula B desde este punto hasta la etapa pro-B, y actúa de manera sinérgica con IL-7R para promover el crecimiento de células que portan flt-3 e IL-7R. La expresión de flt-3 sobre la superficie de la célula en desarrollo marca la pérdida del potencial de la célula mpp para desarrollarse hacia eritrocitos o megacariocitos y, por ende, caracteriza un nuevo nivel de compromiso celular; de cualquier modo, esta progenitora aún retiene la capacidad para desarrollarse a lo largo de la vía mieloide o de la linfoide.
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Estas células, ahora c-Kit+, Sca-1+ y flt-3+, se denominan progenitores multipotenciales, preparados para linfoide (lmpp) (figura 10-5). Conforme quedan más comprometidas a la línea linfoide, las cifras de antígenos de célula madre c-Kit y Sca-1 disminuyen, y las células destinadas a convertirse en linfocitos empiezan a expresar RAG1/2 y desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) (capítulo 7). La expresión de los genes que codifican para RAG1/2, TdT, IL-7R y el factor de transcripción específico para célula B, EBF1, es regulada en dirección ascendente al final de esta etapa.
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La expresión de RAG1/2 define a la célula como una célula progenitora linfoide temprana (early) (elp). Un subgrupo de elp migra hacia afuera de la médula ósea para sembrar el timo y servir como las progenitoras de células T (capítulo 9). El resto de las elp permanece en la médula ósea como progenitoras de células B. Sobre estas células, las cifras de los antígenos c-Kit y SCa-1 tempranos disminuyen conforme las cifras de IL-7R aumentan, y la elp ahora se desarrolla hacia una clp.
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En la etapa de clp, la progenitora en camino a compromiso a célula B aún retiene el potencial para madurar a lo largo de la línea nk, dc convencional o de célula T. En este punto del desarrollo, señales recibidas por medio de IL-7R promueven la supervivencia de la célula y aumentan la producción de EBF-1 y otros factores de transcripción que se requieren para pasos más tardíos en la vía de diferenciación de célula B. La emisión de señales por medio del IL-7R ocurre mediante vías con las cuales el lector se familiarizó en el capítulo 4. De manera específica, una vía de jak-stat mediada por IL-7R induce la regulación ascendente de la molécula antiapoptótica Mcl1. La emisión de señales por medio de IL-7R también da lugar a la regulación ascendente de los genes C-myc y N-myc, que emiten señales para la proliferación celular característica de la etapa de célula pro-B más tardía.
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Las clp son c-Kitbajo, Sca-1bajo e IL-7R+, y han perdido el potencial mieloide. No obstante, conforme madura una clp destinada a diferenciarse a lo largo de la vía de células B, la cromatina que contiene el locus de inmunoglobulina se hace cada vez más accesible, y el linfocito en desarrollo se aproxima al punto en el cual está comprometido de manera irrevocable a la línea de células B.
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Los pasos más tardíos del desarrollo de célula B dan lugar a compromiso al fenotipo de célula B
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La figura 10-6 ilustra la expresión de marcadores de superficie celular, y los patrones de reordenamiento de genes que codifican para cadena pesada y para cadena ligera de inmunoglobulinas, empezando en la etapa de desarrollo de célula pre-pro-B. Las etapas de diferenciación de las células B han sido definidas por más de un grupo de científicos y, como resultado, dos sistemas de nomenclatura están en uso común. El primero, y más ampliamente usado, es la nomenclatura de Basel (pre-pro, pro, pre-B, B inmadura), ideada por Melchers y colegas. El segundo (A, B, C, C′, D, E) es el definido por Hardy y colaboradores y el proceso mediante el cual se estableció este sistema de clasificación del desarrollo de células B se describe con detalle en el recuadro 10-3, Experimento clásico.
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RECUADRO 10-3
EXPERIMENTO CLÁSICO: Las etapas de desarrollo de célula B: caracterización de las fracciones de Hardy
El laboratorio de Richard Hardy fue uno de los primeros en combinar la citometría de flujo y la biología molecular en experimentos diseñados para analizar la maduración de linfocitos. En este contexto, se describe lo que esos investigadores hicieron, y cómo generaron un modelo de secuenciación de las etapas del desarrollo de célula B a partir de sus datos.
Cuando Hardy y colegas empezaron su caracterización del desarrollo de la línea de células B a principios del decenio de 1990-1999, la investigación previa con el uso de análisis molecular de líneas de células de la médula ósea a largo plazo ya había establecido el reordenamiento secuencial de los genes que codifican para cadena pesada y cadena ligera de inmunoglobulina. Además, se había medido la expresión de varios marcadores de superficie celular sobre células de la médula ósea, y se había mostrado que varios de estos antígenos se coexpresan con B220 (CD45R), que ya se había establecido como un antígeno de diferenciación de célula B. El método de Hardy fue caracterizar la secuencia de expresión de los marcadores antigénicos que se encontraron sobre las mismas células que B220. La hipótesis fue que algunos de estos marcadores pueden ser expresados sobre progenitoras de células B tempranas y, por ende, podrían ayudar a generar un esquema de desarrollo de células B. Para colocar células que expresan diferentes combinaciones de marcadores en una línea de desarrollo, Hardy a continuación distribuyó células que portaban cada combinación de sus marcadores seleccionados, y las colocó en cocultivos con una línea de células del estroma de la médula ósea. Luego de tiempos definidos en cultivo, recolectó las células hematopoyéticas y volvió a caracterizar su expresión de marcador de superficie.
Los marcadores usados en estos experimentos incluyeron B220 (CD45R) y CD43 (leucosialina), que previamente se había mostrado que son expresados sobre granulocitos y todas las células T, pero que no estuvo presente sobre células B maduras, con la excepción de las células plasmáticas. Además, en sus experimentos se emplearon anticuerpos dirigidos contra el antígeno estable (stable) ante el calor (heat), o hsa (CD24), y BP-1, un antígeno sobre células de la médula ósea. Previamente se había mostrado que tanto el hsa como el BP-1 son expresados de manera diferencial a etapas variables de la diferenciación linfoide.
En el primer grupo de experimentos se analizaron las células que portan tanto B220 como CD43 respecto a la magnitud de su expresión de hsa y BP-1 (figuras 1 y 2). Gráficos de citometría de flujo demostraron que las células B220+CD43+ se resolvieron con claridad hacia tres subpoblaciones separadas. La primera, marcada A en la figura 1, no expresó hsa ni BP-1. La segunda, marcada B, expresó hsa, pero no BP-1, y la tercera expresó estos dos antígenos. El análisis de reordenamientos del gen que codifica para Ig en estas poblaciones reveló que no ocurrieron reordenamientos de gen en la fracción A, pero que habían empezado reordenamientos del segmento de gen que codifica para D a JH en la fracción B. Investigación subsiguiente ha mostrado que en la fracción C ocurren reordenamientos de VH a DJH (aunque en esa época el método de análisis que Hardy y colegas usaron no reveló este segundo tipo de reordenamiento).
Así, en este punto, se sabe que tres tipos distintos de precursores de célula B expresan tanto B220 como CD43, y pueden distinguirse con base en sus cifras de los dos antígenos adicionales, hsa y BP-1. La fracción A corresponde a lo que ahora se conoce como células pre-pro-B, la fracción B a las células pro-B tempranas, y la fracción C a las células pro-B tardías.
El cultivo de células de la fracción C dio células que expresaron IgM de membrana (m); de modo similar, el cultivo de células de la fracción B también dio células hijas que expresaron mIgM, pero a una frecuencia más baja que las células de la fracción C, lo que sugiere que las células en la fracción C estuvieron más allá a lo largo de la vía de diferenciación a células B mIgM+. Además, las tres fracciones diferentes desplegaron dependencia diferencial de la necesidad de adherirse a la capa de células del estroma. Las células de la fracción A requirieron contacto con células del estroma para sobrevivir. Las células de la fracción B sobrevivieron mejor en contacto con las células del estroma, pero fueron capaces de sobrevivir en un cultivo en el cual estuvieron separadas de las células del estroma por una membrana semipermeable. En estas condiciones, aún pudieron recibir factores solubles generados por las células del estroma, pero se evitó que generaran interacciones adhesivas con factores de crecimiento unidos a superficie de células del estroma. Las células de la fracción C sobrevivieron y proliferaron en ausencia de contacto con células del estroma. El análisis de los factores secretados por las células del estroma que fueron necesarias para la supervivencia y la proliferación de las células de las fracciones B y C reveló que uno de ellos es la interleucina-7.
Por ende, al usar los criterios de reordenamientos de gen que codifica para Ig y análisis fenotípico de poblaciones de células cultivadas, Hardy y colegas lograron colocar las tres fracciones en secuencia; las células de la fracción A dieron lugar a células de la fracción B, que a su vez maduran hacia células de la fracción C.
El análisis cuidadoso del gráfico de contorno de la fracción C revela que, a su vez, puede subdividirse con base en las cifras de expresión de hsa. La población de células que portan cifras más altas de hsa, así como BP-1, ahora se define como la fracción C’, que corresponde a células pre-B tempranas o grandes.
Hardy y colegas a continuación dirigieron su atención a las células que expresaron B220, pero que habían perdido CD43, y midieron su expresión de mIgM de superficie celular (figura 3). De nuevo, fueron evidentes tres poblaciones de células, que marcaron D, E y F (figura 4). Las células pertenecientes a la fracción D expresaron cifras de cero a bajas de mIgM, mostraron reordenamiento completo de cadena pesada, y algo de reordenamiento de cadena ligera, y corresponden a las células pre-B pequeñas. Las células pertenecientes a la fracción E desplegaron cifras altas de mIgM, así como de B220, reordenamiento completo de cadena pesada, y casi todas las células en esa fracción también desplegaron reordenamiento del gen que codifica para cadena ligera. Así, las células de la fracción E son células B inmaduras listas para salir de la médula ósea. La caracterización adicional subsiguiente de células de la fracción F mostró que, además de IgM de superficie, estas células también portan IgD de superficie y, por ende, representan células B por completo maduras, que probablemente recirculan por la médula ósea.
De este modo, los experimentos de Hardy revelaron que el fondo común de células B progenitoras y precursoras en la médula ósea representa una mezcla compleja de células a diferentes etapas de desarrollo, con requerimientos variables de contacto con células del estroma y apoyo de interleucina.
Estos experimentos muy bien realizados aún tenían una historia más que contar, que no apareció en el artículo original, pero que surgió en publicaciones posteriores. El análisis con pcr de célula única de células de la fracción C mostró que muchas de ellas tuvieron reordenamientos no productivos en ambos cromosomas que codifican para la cadena pesada (figura 2). En contraste, todas las células de la fracción C’ demostraron reordenamientos productivos en uno de los cromosomas que codifican para cadena pesada. Por ende, las células de la fracción C representan células B que habían sido incapaces de reordenar de manera productiva uno de sus genes que codifican para cadena pesada, y que por ende, finalmente morirán por apoptosis. La fracción C’ también incluyó la proporción más alta de células en ciclo de cualquiera de las etapas de célula B B220+ en la médula ósea. Esto es congruente con la noción de que la cadena pesada nueva se está asociando con la cadena ligera sustituto en la etapa C’, y de que el complejo de receptor de célula pre-B es expresado sobre la superficie celular, lo que desencadena el periodo de expansión clonal de células B descrito en este capítulo.
Referencias Hardy, R.R., et al. 1991. Resolution and characterization of pro-B and pre-pro-B cell stages in normal mouse bone marrow. Journal of Experimental Medicine 173:1213-1225.
Hardy, R. R., P. W. Kincade, y K. Dorshkind. 2007. The protean nature of cells in the B lymphocyte lineage. Immunity 26:703-714.
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Con la adquisición del nuevo marcador específico para línea de células B, B220 (CD45R), y la expresión de cifras crecientes del factor de transcripción EBF1, la célula en desarrollo entra a la etapa de célula pre-pro-B. El EBF1 es un factor de transcripción importante en el desarrollo linfoide y, por ende, la transcripción del gen Ebf1 está en sí bajo el control de múltiples factores de transcripción (figura 10-7). Cada uno de éstos se une en regiones promotoras distintas y, por ende, la magnitud de transcripción del gen Ebf1 puede variar considerablemente dependiendo de la combinación de factores controladores presentes en cualquier etapa de desarrollo particular. En la etapa de célula pre-pro-B, el EBF-1, junto con E2A, se une al gen que codifica para inmunoglobulina, lo cual promueve la accesibilidad del locus D-JH y prepara a las células para el primer paso de la recombinación del gen que codifica para Ig. El EBF-1 también es esencial para la expresión completa de muchas proteínas de célula B, incluso Igα, Igβ (CD79α,β), y los genes que codifican para el receptor de célula pre-B, que se expresarán cuando la recombinación vdj de cadena pesada esté completa.
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Las células pre-pro-B permanecen en contacto con células del estroma que secretan CXCL-12 en la médula ósea. Sin embargo, el inicio de la recombinación del gen D a JH clasifica a la célula como una célula pro-B temprana, y en esta etapa la célula en desarrollo se mueve dentro de la médula ósea, y busca contacto con células del estroma que secretan IL-7.
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En la etapa de célula pro-B temprana, se completa la recombinación de D a JH, y la célula empieza a prepararse para la unión de V a DJH. Empero, este evento de recombinación final espera la expresión del factor de transcripción de célula B prototípico, PAX5.
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El gen Pax5 figura entre los blancos de transcripción de EBF-1 (figura 10-7), y la transcripción de genes controlados por el factor de transcripción PAX5 denota el paso a la etapa de desarrollo de célula pro-B, momento en el cual la expresión de genes que no codifican para la línea B es bloqueada permanentemente. PAX5 puede actuar como un represor transcripcional, y como un activador transcripcional, y bloquea la expresión del gen Notch-1, lo que termina cualquier potencial residual de la célula pro-B a desarrollarse a lo largo de la línea de células T. Muchos genes de células B importantes son activados en esta etapa, bajo el control de PAX5 y otros factores de transcripción. Entre éstos figura el gen que codifica para CD19, que se mencionó por vez primera en el capítulo 3, como uno de los componentes del correceptor de célula B. CD19 se considera un marcador de célula B prototípico, y a menudo se usa como tal en experimentos de citometría de flujo.
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Una vez que la proteína PAX5 es expresada, ocurre un reforzamiento mutuo entre la expresión de PAX5 y la de EBF-1 (figura 10-7); cada factor de transcripción sirve para aumentar la expresión del otro. La proteína PAX5 sigue siendo expresada en células B maduras en tanto la célula B no se compromete a un destino de célula plasmática después de estimulación antigénica (capítulo 12). La expresión más alta de EBF1 inducida por PAX5 también permite un incremento de la expresión de IL-7R.
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PAX5 promueve la recombinación de VH a D al contraer el locus de IgH, lo que acerca los segmentos de gen VH distantes a la región D-JH. Las células B deficientes en PAX5 permiten el reordenamiento del gen Ig de D a JH, pero no permiten la recombinación del segmento de gen Ig de VH a D, lo que indica que PAX5 es esencial para el segundo paso de reordenamiento del gen que codifica para Ig.
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La expresión de los componentes de emisión de señales del receptor de célula B, Igα e Igβ, también empieza en la etapa de célula pro-B, y el complejo de emisión de señales Igα,Igβ es colocado brevemente sobre la superficie celular en complejo con la proteína chaperón calnexina. Si bien este complejo Igα,Igβ se ha denominado un “pro-BCR”, aún no se ha establecido un ligando para él; tampoco se entiende todavía la importancia de cualquier emisión de señales que pueda emanar desde él.
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Asimismo, durante la etapa de célula pro-B, c-Kit es activado brevemente una vez más, lo que permite a la célula recibir señales provenientes del factor de células madre. Al inicio de la etapa de desarrollo de célula pre-B, la expresión de c-Kit es vuelta a desactivar de manera irreversible. Hacia la etapa de célula pro-B tardía, casi todas las células han iniciado recombinación del segmento de gen Ig de VH a DJH, lo cual se completa hacia el inicio de la etapa de célula pre-B temprana.
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Durante la etapa de célula pre-B, la célula expresa un receptor de célula pre-B compuesto de la cadena pesada reordenada, en complejo con los componentes VpreB y λ5 de la cadena ligera sustituto (figura 7-10). La aparición de este receptor de célula pre-B señala la entrada de la célula B en desarrollo hacia la fase de célula pre-B grande o temprana. La expresión de la cadena pesada en la superficie de la célula es necesaria para la terminación de reordenamiento adicional de cadena pesada, y asegura la exclusión alélica de los genes que codifican para cadena pesada de Ig (capítulo 7). Los animales que muestran deficiencia de la expresión del receptor de célula pre-B o de los componentes de emisión de señales Igα,Igβ, no progresan a la etapa de célula pre-B.
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La emisión de señales por medio del receptor de célula pre-B induce algunas rondas de proliferación en la célula pre-B. Esta fase proliferativa se correlaciona en el tiempo con la expresión sobre la superficie de la célula pre-B de CD25, la cadena α del receptor de IL-2 de afinidad alta (figura 4-8), que aparece por vez primera sobre células B en la etapa de célula pro-B. Puesto que el proceso proliferativo de célula pre-B parece ser impulsado principalmente por IL-7, no está clara la importancia funcional de CD25 en este punto. Con todo, su aparición suele usarse como un marcador de la etapa de desarrollo de célula pro-B tardía a la de célula pre-B temprana.
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La recombinación del gen VH es costosa desde el punto de vista energético para el organismo, puesto que no todas las células B en desarrollo tienen éxito en el paso por reordenamientos productivos del gen VH y las que no lo hacen se pierden por apoptosis. Por ende, suena lógico que debe permitirse que las células B que han alcanzado expresión productiva de cadena pesada proliferen. Cada célula hija individual derivada de este proceso proliferativo a continuación está libre para participar en un evento de reordenamiento de cadena ligera diferente. Por ende, la mayoría de los individuos tendrá múltiples células B que expresan precisamente el mismo reordenamiento de cadena pesada, pero cada una con una cadena ligera distinta y, así, a partir de cada reordenamiento de cadena pesada exitoso pueden generarse muchas especificidades de receptor diferentes. Recuerde que en células T ocurre un proceso análogo de reordenamiento de cadena β, seguido por proliferación antes de reordenamiento α (capítulo 9).
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Si el receptor de célula pre-B no puede desplegarse sobre la superficie celular debido a reordenamientos no productivos de gen VHDJH, el desarrollo de célula B se suspende, y la célula se pierde por apoptosis. Por ende, esta etapa en el desarrollo de célula B se denomina el primer punto de control de célula pre-B (figura 10-6). El progreso por este punto de control depende de algún tipo de eventos de emisión de señales por medio del receptor de célula pre-B, y evidencia reciente sugiere que esto está mediado por interacciones entre regiones ricas en arginina en la porción no inmunoglobulina del componente λ5 de la cadena ligera sustituto, o en las regiones CDR3 de algunas cadenas pesadas, con moléculas que tienen carga negativa sobre la superficie de las células del estroma.
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La emisión de señales de receptor de célula pre-B induce la regulación descendente transitoria de RAG1/2 y la pérdida de la actividad de TdT. Juntos, estos eventos aseguran que, tan pronto como un gen que codifica para cadena pesada se ha reordenado exitosamente, es imposible la recombinación adicional de cadena pesada. Esto da lugar al fenómeno de exclusión alélica, por el cual los genes de sólo uno de los dos alelos de cadena pesada pueden expresarse en una célula B única. Como resultado de esta emisión de señales de receptor de célula pre-B, la cromatina en el locus de cadena pesada no usado pasa por varios cambios físicos que la hacen incapaz de participar en eventos de reordenamiento adicionales. Recuerde que la IL-7 proporcionó una de las señales que llevaron a los loci VH, D y JH hacia aposición estrecha uno con otro al principio de la recombinación VHDJH. Ahora, una reducción de la emisión de señales de IL-7 en la etapa de célula pre-B revierte esa contracción inicial del locus, lo que da lugar a la separación física de los segmentos de gen VH, D y JH en el locus de cadena pesada no reordenado. Esta descontracción a continuación va seguida por eventos de desacetilación que desactivan el locus de cadena pesada no usado, y lo devuelven a una configuración heterocromática (inactiva, cerrada).
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La expresión de cadena ligera sustituto también es terminada por una ronda de emisión de señales de retroacción negativa por medio del receptor de célula pre-B. Al final de la proliferación celular por emisión de señales pre-bcr, el receptor de célula pre-B se pierde de la superficie, y esto emite una señal para la entrada hacia la etapa de célula pre-B pequeña o tardía. En este punto se inicia el reordenamiento de cadena ligera con la reexpresión de los genes Rag1/2. En esta etapa persiste muy poca actividad de TdT y, por ende, la adición de la región N ocurre menos frecuentemente en cadenas ligeras que en cadenas pesadas. En el ratón, el reordenamiento de cadena ligera empieza en uno de los cromosomas que codifican para cadena κ, seguido por el otro. Si ni uno ni otro reordenamiento de cadena κ es exitoso, el reordenamiento a continuación se intenta de manera exitosa en cada uno de los cromosomas que codifican para la cadena λ. En seres humanos, el reordenamiento es iniciado al azar en los loci de κ o de λ.
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Una vez que se ha completado exitosamente el reordenamiento del gen que codifica para cadena ligera, el receptor de IgM es expresado sobre la superficie celular, lo cual es una señal de la entrada hacia la etapa de célula B inmadura. Si los intentos de reordenamiento del gen que codifica para cadena ligera de inmunoglobulina fracasan, la célula naciente finalmente se pierde en el segundo punto de control de célula B inmadura (figura 10-6). Aun así, dada la disponibilidad de cuatro cromosomas separados en los cuales intentar reordenamiento, y la oportunidad para editar cadena ligera en el caso de reordenamiento no productivo, casi todas las células pre-B que han reordenado exitosamente sus cadenas pesadas progresarán hacia la formación de una célula B inmadura.
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Las células B inmaduras en la médula ósea son en extremo sensibles a la inducción de tolerancia
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Las células B inmaduras portan un receptor funcional en la forma de IgM de membrana, pero todavía no han empezado a expresar cualquier otra clase de inmunoglobulina. Siguen expresando B220, CD25, IL-7R y CD19.
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Una vez que el bcr funcional es montado sobre la membrana de la célula B, el receptor debe probarse respecto a su capacidad para unirse a antígenos propios, a fin de asegurar que tan pocas células B autorreactivas como sea posible salgan desde la médula ósea. Las células B inmaduras que se encuentra que portan receptores autorreactivos tienen uno de tres destinos; algunas se pierden del repertorio antes de salir de la médula ósea, mediante el proceso apoptótico de deleción clonal mediado por bcr. La pérdida de células B que portan receptores autorreactivos dentro de la médula ósea se denomina tolerancia central. Otras células B autorreactivas reactivan sus genes que codifican para rag a fin de iniciar el proceso de edición de receptor de cadena ligera (capítulo 7). Algunas células B autorreactivas que reconocen antígenos propios solubles dentro de la médula ósea pueden sobrevivir hasta escapar del ambiente de la médula ósea, pero se hacen anérgicas, o sin capacidad de respuesta, a cualesquier estímulos antigénicos adicionales.
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Con base en la exposición sobre tolerancia de células T en el capítulo 9, el lector debe estar familiarizado con el concepto de selección negativa de linfocitos que portan receptores autorreactivos. De cualquier modo, las diferencias funcionales entre las células T y las células B significan que los procesos de selección contra células B autorreactivas son diferentes de los que protegen contra el surgimiento de células T autorreactivas, y de hecho pueden ser un poco menos estrictos. Puesto que la estimulación de células B B-2 requiere la ayuda de células T, una célula B autorreactiva no puede mostrar respuesta a antígeno con producción de anticuerpo a menos que también haya una célula T autorreactiva que pueda proporcionar las citocinas y la coestimulación necesarias (capítulo 12). Así, es bastante posible que la mayoría de los individuos porte números importantes de células B autorreactivas dentro de su repertorio de células B maduras, que nunca son activadas.
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También hay diferencias mecánicas entre los modos de selección negativa entre células B y T. No se ha mostrado que exista un equivalente de la proteína aire para la selección de células B y, así, la selección negativa de células B dentro de la médula ósea es más limitada respecto a las especificidades antigénicas tolerogénicas disponibles que la selección negativa de células T en el timo.
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Muchas células B autorreactivas, mas no todas, son eliminadas dentro de la médula ósea
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El entendimiento de cómo el sistema inmunitario elimina o neutraliza amenazas autorreactivas ha sido facilitado por el desarrollo de animales transgénicos que expresan tanto autoantígenos introducidos deliberadamente como los receptores que los reconocen. Desde hace mucho tiempo se ha establecido que el enlace covalente de receptores IgM de células B inmaduras in vitro (efectuado experimentalmente al tratar las células con anticuerpos contra la cadena μ del receptor) da lugar a muerte por apoptosis. En contraste, la práctica de los mismos experimentos con células B maduras, que portan receptores tanto IgM como IgD, da lugar a activación. David Nemazee y colegas tuvieron la intención de probar si la respuesta apoptótica de células B inmaduras in vitro reflejó lo que sucede en la médula ósea in vivo cuando una célula B inmadura se reúne con un antígeno propio.
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El método que utilizaron Nemazee y colaboradores fue conceptualmente simple, aunque complejo desde el punto de vista experimental, en particular por el periodo en el cual se efectuó la investigación (1989). Generaron ratones transgénicos tanto para una cadena pesada como para una cadena ligera específica para la molécula de mhc H-2Kk. Por ende, todas las células B en este ratón sólo sintetizaron anticuerpos anti-H-2Kk. Si células B inmaduras pasan por selección para prevenir autoinmunidad, estas células serían seleccionadas en contra en un ratón que expresa el gen que codifica para H-2Kk para mhc. Mediante reproducción apropiada, introdujeron los transgenes específicos para H-2Kk de inmunoglobulina hacia ratones que portaron dos genotipos de mhc diferentes.
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En el primer grupo de ratones (figura 10-8a), que portó antígenos H-2Kd, pero no H-2Kk, lograron detectar el anticuerpo transgénico a frecuencia alta sobre la superficie de células B, y a concentración alta en el suero (cuadro 10-1). Esto tiene sentido, porque el anticuerpo transgénico sería incapaz de unirse a las moléculas de H-2Kd y, así, las células B que lo producen serían seleccionadas de manera negativa. No obstante, cuando cruzaron estos animales con ratones del tipo H-2Kk (figura 10-8b), fue imposible detectar anticuerpos anti-H-2Kk unidos a membrana o secretados, lo que sugiere que todas las células B inmaduras que portaban el receptor en potencia autoinmunitario habían sido eliminadas en la médula ósea. Esa deleción ocurrió por medio de inducción de apoptosis en las células autoinmunes.
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Despierta interés que, en el ratón H-2Kk/d, no todas las células B que portaban los transgenes autoinmunes fueron eliminadas, aun cuando todas las células B en este ratón deben portar el receptor anti-H-2Kk (figura 10-8c). El examen más de cerca reveló que algunas de las células B que expresaron transgén residual en la médula ósea habían pasado por edición de receptor de cadena ligera (capítulo 7), lo cual cambió su especificidad de antígeno de modo que ya no se unieron al antígeno H-2Kk. Experimentos recientes sugieren que in vivo, una fracción importante de células B en potencia autoinmunes pasa por edición de receptor (o incluso reemplazo del gen VH) (capítulo 7), y genera exitosamente bcr aceptables antes de liberación desde la médula ósea.
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Sin embargo, en animales normales, no todas las células B en potencia autoinmunes se pierden a deleción clonal o son alteradas por medio de edición de receptor o de reemplazo del gen VH dentro de la médula ósea; algunas son liberadas hacia la periferia y quedan sujetas a rondas de selección adicionales.
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Las células B exportadas desde la médula ósea aún son funcionalmente inmaduras
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Una vez que la célula B expresa IgM sobre su membrana (mIgM), se denomina célula B inmadura. Esta célula B está lista para exportación hacia el bazo, donde completa su programa de desarrollo. Las células B inmaduras tienen una vida media breve, en parte como resultado de la expresión de cifras bajas de las moléculas antiapoptóticas Bcl-2 y Bcl-xl. También expresan cifras altas de la molécula de superficie celular, Fas, que es capaz de transmitir una señal de muerte cuando es unida por su ligando (capítulos 4 y 9). Las células B inmaduras muestran susceptibilidad extrema a inducción de tolerancia, y si encuentran un antígeno propio en esta etapa del desarrollo, las células B volverán a expresar los genes que codifican para RAG1 y RAG2, y editarán sus genes que codifican para cadena ligera. Si la edición de receptor no da lugar a un receptor idóneo, la célula sufre apoptosis.
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El estudio del desarrollo de células B en la periferia, al igual que en la médula ósea, se ha beneficiado de manera importante a partir de la aplicación ingeniosa de citometría de flujo, que ha permitido la clasificación de células B inmaduras hacia dos subpoblaciones de células B transicionales (T1, T2). Estas células B transicionales actúan de modo secuencial como los precursores de la célula B por completo madura.
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Células B transicionales T1 y T2
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Las células B transicionales T1 y T2 se caracterizaron inicialmente con base en su expresión de receptores de inmunoglobulina y marcadores de membrana en la superficie celular (cuadro 10-2). Las células T1 son mIgMalta, mIgD–/baja, CD21–, CD23–, CD24+, y CD93+. Las células T2 difieren de las células T1 en que tienen cifras más altas de mIgD, y en la expresión de CD21 (el receptor de complemento y correceptor de célula B; figura 3-7) y CD23. Las células T2 también expresan baff-r, el receptor para el factor de supervivencia de célula B baff, cuya expresión depende de señales recibidas por medio del bcr. Conforme las células B se diferencian desde el estado de T2 transicional hasta la madurez completa, aumentan aún más sus cifras de mIgD, mientras que reducen la expresión de mIgM. También dejan de expresar CD24 y CD93.
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Las células T1 que han sido marcadas y transferidas hacia ratones receptores se desarrollan hacia células T2. De modo similar, se ha demostrado que ambas subpoblaciones de células B transicionales tienen la capacidad para diferenciarse hacia células B maduras. Por ende, estos experimentos han probado que el orden de la secuencia de desarrollo progresa desde T1 hacia T2, y hacia célula B madura. Se ha medido el tiempo en tránsito de una célula T1 a una célula B madura, y es de aproximadamente tres a cuatro días. Casi todas las células B T1 se diferencian hacia células T2 dentro del bazo, pero una minoría de alrededor de 25% de las células B transicionales surge de la médula ósea ya en el estado T2. La madurez aumentada de células T2 se correlaciona con cambios de la expresión de receptores de quimiocina y citocina, de modo que las células T2, pero no las células T1, son capaces de recircular entre la sangre, los ganglios linfáticos y el bazo, y las células T2, no así las T1, pueden entrar en folículos de células B.
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La figura 10-9 muestra la trayectoria de la célula B transicional en desarrollo conforme sale de la médula ósea y entra al bazo a través de la arteriola central, que la deposita en los senos marginales, justo dentro de la zona marginal externa. (En humanos las características anatómicas del bazo son un poco distintas y las células llegan al bazo en una zona perifolicular.) Desde ahí, la célula B T1 se filtra a través de la zona de células T, donde cierta fracción de células T1 madurará hacia el estado T2. A continuación, las células B T2 son capaces de entrar a los folículos o a la zona marginal, donde completan su programa de desarrollo hacia linfocitos B recirculantes por completo maduros.
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Ya se mencionó que las células B maduras portan sobre su superficie dos clases de inmunoglobulinas unidas a membrana —IgM e IgD— y que la expresión de mIgD junto con mIgM requiere de eventos de empalme de mRNA regulados cuidadosamente (capítulo 7). Es en el punto de tránsito entre las etapas de desarrollo T1 y T2 donde se observa el inicio de estas capacidades de empalme. Las células B maduras portan casi 10 veces más mIgD que mIgM y, así, la expresión de mIgD da lugar a regulación ascendente importante del número de receptores de inmunoglobulina de célula B.
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El efecto de unión de bcr fuerte con un antígeno multivalente, o unido a membrana, depende del estado de maduración de la célula B transicional (figura 10-10 y cuadro 10-3). Las células B T1 autorreactivas son eliminadas mediante apoptosis en respuesta a una señal antigénica fuerte, en un proceso que recuerda la selección negativa de timocitos, lo cual lleva a tolerancia periférica; experimentos recientes han sugerido que en adultos sanos, por lo menos 55 a 75% de las células B inmaduras se pierde por este proceso. En contraste, una vez que la célula B ha madurado hacia una célula B transicional T2, se hace resistente a apoptosis inducida por antígeno, lo que recuerda los timocitos que han alcanzado la etapa de desarrollo positivo único. Esta resistencia a muerte celular inducida por receptor depende en parte del hecho de que las células B T2 han aumentado su expresión de la molécula antiapoptótica Bcl-xl.
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Al usar técnicas genéticas de deleción (knockout) condicional (capítulo 20), es posible generar animales que carecen de expresión de receptor de Ig en etapas diferentes del desarrollo de célula B. Los animales que no expresan un bcr durante la etapa de célula B inmadura pierden la capacidad para hacer células B maduras. Esto indica que se requiere cierto nivel bajo de emisión de señales tónicas por medio del bcr, análogo a la señal de selección positiva que necesitan los timocitos en desarrollo, para generación y supervivencia continuas de células B inmaduras. Las células B incapaces de recibir esta señal mueren en la etapa T2 (figura 10-10). Las células B T2 capaces de recibir la señal folicular regulan en dirección ascendente la expresión del receptor para el factor de supervivencia de células B baff.
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Dados los resultados diferentes de la emisión de señales por medio del bcr para células B T1 en contraposición con T2, está claro que debe haber diferencias en las vías de emisión de señales torrente abajo del bcr en los dos tipos de célula B transicionales. De manera específica, la emisión de señales mediadas por bcr de células B T1 da lugar a liberación de calcio sin producción importante de diacilglicerol y proporciona una señal apoptótica. En contraste, la recepción de señales de bcr por células B T2 induce tanto un aumento de la concentración intracitoplasmática de calcio como de la producción de diacilglicerol. Esta combinación de segundos mensajeros intracelulares suministra a la célula señales tanto de maduración como de supervivencia, y sugiere la participación de una proteína cinasa activada por diacilglicerol en la emisión de señales de supervivencia (capítulo 3).
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Empero, ¿qué causa esta diferencia en las vías de transducción de señal entre células T1 y T2? Una respuesta parcial a esta pregunta parece hallarse en las diferencias en la composición de las membranas lipídicas de los dos tipos de células. Las células B T1 inmaduras contienen aproximadamente la mitad de colesterol que sus homólogas más maduras, y esta reducción de las cifras de colesterol parece evitar la agrupación eficiente del receptor de célula B hacia balsas de lípido en el momento de estimulación por bcr. Esto tal vez causa una reducción de la fuerza de la emisión de señales de bcr en células B inmaduras T1 en contraposición con T2.
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El desarrollo de células B por la fase transicional es absolutamente dependiente de emisión de señales por medio del receptor de baff (baff-r). La expresión de baff-r es detectada por vez primera en células B T1, y aumenta de manera constante a partir de entonces. A continuación, el baff se requiere de manera constitutiva durante toda la vida de células B maduras. La emisión de señales por medio del eje de baff/baff-r promueve la supervivencia de células B transicionales al inducir la síntesis de factores antiapoptóticos como Bcl-2, Bcl-xl y Mcl-1, así como al interferir con la función de la molécula proapoptótica Bim (figura 9-12).
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El descubrimiento de una señal de supervivencia de células B mediada por interacciones baff/baff-r, y distinta de las señales de supervivencia que emanan del bcr, extiende el pensamiento acerca de cómo las células B son seleccionadas para supervivencia en la periferia. En presencia de cifras altas de baff, las células B que por lo demás no pueden recibir cantidades suficientes de señales de supervivencia por medio del bcr pueden sobrevivir a un proceso de selección que de otro modo las eliminaría. De esta manera, baff puede proporcionar elasticidad y flexibilidad en el proceso de deleción de células B. Con todo, esto quizá se logre a costa de mantener células en potencia autorreactivas.
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Las células B T3 son principalmente autorreactivas y anérgicas
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Las células B T3 transicionales se caracterizaron por vez primera en la sangre y en órganos linfoides mediante citometría de flujo, y se describieron como CD93+mIgMbajaCD23+. La función de CD93 se desconoce hasta el momento; CD23 es un receptor de baja afinidad para algunas clases de inmunoglobulina, y los dos marcadores sólo se usaron en estos experimentos para identificar las poblaciones celulares, y no debido a cualesquier razones particulares importantes para su funcionalidad. Experimentos recientes han sugerido que la población T3 tal vez represente células B que se han hecho anérgicas por contacto con antígeno propio soluble, pero que todavía no han sido eliminadas del repertorio de células B.
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Un sistema transgénico desarrollado por Goodnow y colegas colocó por vez primera el concepto de anergia, o de falta de capacidad de respuesta, de célula B sobre una base experimental firme. Está claro que los linfocitos anérgicos reconocen sus antígenos, como se muestra por la identificación de cifras bajas de señales moleculares generadas dentro de las células después de unión a antígeno. Aun así, en lugar de ser activadas por contacto con antígeno, las células B anérgicas no se dividen, diferencian ni secretan anticuerpos después de estimulación, y muchas mueren poco tiempo después de recibir la señal antigénica.
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Goodnow y colaboradores desarrollaron dos grupos de ratones transgénicos (figura 10-11a). Un grupo de ratones portó un transgén que codifica para lisozima de clara de huevo (egg) de gallina (hen) (hel) enlazado a un promotor de metalotionina, que colocó la transcripción del gen hel bajo el control de las cifras de cinc en la dieta de los animales. Lo anterior permitió a los investigadores alterar las cifras de hel soluble expresado en los animales experimentales al cambiar la concentración de cinc en su sangre. En estas condiciones experimentales, el hel fue expresado en la periferia del animal, no así en la médula ósea. El otro grupo de ratones transgénicos portó transgenes que codificaban para cadena pesada y para cadena ligera de inmunoglobulina reordenados, que codificaban para anticuerpo anti-hel; en estos ratones transgénicos, el transgén que codifica para anti-hel reordenado es expresado por 60 a 90% de las células B periféricas maduras. Goodnow a continuación apareó los dos grupos de ratones transgénicos para producir descendencia “transgénica doble” que portaba los transgenes que codificaban tanto para hel como para anti-hel (figura 10-11b), y se preguntaron qué efecto tendría la expresión de hel periférico sobre la expresión de anticuerpos por células B que portaban los anticuerpos anti-hel. Encontraron que los ratones transgénicos dobles siguieron generando células B periféricas maduras que portaban inmunoglobulina de membrana anti-hel de las clases tanto IgM como IgD, lo que indicó que las células B habían madurado por completo. De cualquier modo, estas células B carecieron de capacidad de respuesta funcional, es decir, fueron anérgicas.
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El análisis de células B con citometría de flujo de los ratones transgénicos dobles mostró que, si bien hubo grandes números de células anti-hel anérgicas, expresaron IgM de membrana a cifras alrededor de 20 veces más bajas que los ratones transgénicos únicos anti-hel (figura 10-11b). Cuando se dio a estos ratones una dosis inmunizante de hel, pocas células plasmáticas anti-hel fueron inducidas, y el título sérico de anti-hel fue muy bajo (cuadro 10-4). Además, cuando se presentó antígeno a estas células B anérgicas en presencia de ayuda de células T, muchas de las células B anérgicas mostraron respuesta al pasar por apoptosis. El análisis adicional de las células B anérgicas demostró que tuvieron una vida media más corta que las células B normales, y parecieron estar excluidas de los folículos de célula B en los ganglios linfáticos y el bazo. Estas propiedades dependieron de la presencia continua de antígeno, puesto que la vida media de células B se restituyó a duraciones normales en el momento de la transferencia adoptiva de células B que portaban el transgén hacia un animal que no estaba expresando hel. La respuesta anérgica parece ser generada in vivo cuando células B inmaduras encuentran un antígeno propio soluble.
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Experimentos más recientes se han enfocado en definir las diferencias entre los eventos de transducción de señal que llevan a anergia en contraposición con activación. Las células B anérgicas muestran mucho menos fosforilación de tirosina (inducida por antígeno) de moléculas emisoras de señales, en comparación con sus homólogos no anérgicos, y la liberación de calcio a partir de vesículas de almacenamiento estimulada por antígeno hacia el citoplasma de las células B anérgicas también estuvo notoriamente reducida. Asimismo, las células B anérgicas requieren cifras más altas de la citocina baff para supervivencia continua, y es probable que su vida media reducida dependa de competencia no exitosa con células B normales por cantidades limitantes de esta molécula de supervivencia. Uno de los resultados de la emisión de señales de baff es una reducción de las cifras citoplasmáticas de la molécula proapoptótica bim; como podría esperarse, las células B anérgicas muestran cifras de bim más altas que lo normal, y un incremento correspondiente de la susceptibilidad a apoptosis.
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La conclusión a partir de estos experimentos es que hay mecanismos, incluso después de que las células B han salido de la médula ósea y entrado a la periferia, que minimizan el riesgo de que las células B sinteticen anticuerpos contra proteínas propias solubles expresadas fuera de la médula ósea. Las células B reactivas a esas proteínas muestran respuesta a estimulación de receptor en ausencia de ayuda apropiada de células T mediante anergia y apoptosis final.
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¿Cuál podría ser la función de estas células anérgicas? Una posibilidad es que sirven para absorber antígenos propios excesivos que de otro modo podrían ser capaces de emitir señales activadoras a células B de alta afinidad y, así, llevar a reacciones autoinmunitarias. Otra es que representen células destinadas a apoptosis que todavía no muestran los datos microanatómicos característicos de las células apoptóticas. Una más es que estas células finalmente se desarrollarán hacia células reguladoras B (capítulo 12). Como sucede tan a menudo en el sistema inmunitario, es más que posible que todas estas funciones sean incorporadas dentro de esta interesante población de células, que sigue siendo el tema de investigación actual intensiva.
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Las células B B-2 primarias maduras migran hacia los folículos linfoides
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Las células B por completo maduras expresan cifras altas de IgD y cifras intermedias de IgM sobre su superficie celular (cuadro 10-2). Las células B maduras recirculan entre la sangre y los órganos linfoides; entran a los folículos de células B en los ganglios linfáticos y el bazo, y muestran respuesta a encuentro con antígeno en presencia de ayuda de células T, con producción de anticuerpo (capítulo 12). La médula ósea de ratón produce aproximadamente 10 a 20 millones de células B cada día, pero sólo alrededor de 10% de este número alguna vez llega a residir en la periferia, y sólo 1 a 3% entrará al fondo común de células B B-2 foliculares recirculantes. Algunas de estas células se pierden hacia el proceso de deleción clonal, pero otras son células B perfectamente inocuas que, sin embargo, no medran. El agotamiento experimental de la población de células B maduras, sea por medios químicos o por irradiación, seguido por reconstitución in vitro, da lugar a reabastecimiento rápido del fondo común folicular de células B. Esto sugiere que los nichos de células B foliculares tienen una capacidad designada, y que una vez que están llenos no admiten células B adicionales. Lo más probable es que el mecanismo de este control homeostático del número de células B se fundamente en competencia por factores de supervivencia, en particular baff y sus proteínas relacionadas.
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Experimentos en los que se usaron animales con deleción (knockout) de RAG2 condicional, en los cuales todo el desarrollo de células B nuevas se evitó en animales adultos por lo demás sanos, indican que las células B B-2 foliculares tienen una vida media de aproximadamente 4.5 meses. En contraste, puesto que las células B B-1 pueden autorrenovarse en la periferia, sus números no están afectados en este animal con deleción (knockout) experimental.