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Las células efectoras citotóxicas incluyen las células T citotóxicas CD8+ del sistema inmunitario adaptativo, linfocitos nkt, que constituyen un puente entre los sistemas inmunitarios innato y adaptativo, y células nk, que alguna vez se asociaron estrictamente con el sistema inmunitario innato pero que comparten características funcionales interesantes con sus parientes linfocitos de la inmunidad adaptativa. Los efectores ctl, nkt y nk inducen muerte celular al desencadenar apoptosis en sus células blanco. Estas células citotóxicas no sólo eliminan blancos infectados con agentes patógenos intracelulares (virus y bacterias), sino que también desempeñan una función crucial en la eliminación de células tumorales y células que han sido sometidas a estrés por temperaturas extremas o traumatismo (cuadro 13-4). Asimismo, las células nk desempeñan un papel menos deseable en el rechazo de células de trasplantes de órganos alogénicos. En esencia, la respuesta inmunitaria mediada por células está preparada para reconocer y atacar a cualquier célula que muestre características “no propias” o “propias alteradas”.
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Los linfocitos T citotóxicos reconocen y matan células infectadas o tumorales por medio de activación de receptor de célula T
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La importancia de linfocitos T citotóxicos en la respuesta inmunitaria mediada por células a agentes patógenos es subrayada por las enfermedades que afectan a quienes tienen defectos en la generación de células T. Los niños con síndrome de DiGeorge nacen sin timo y, por ende, carecen del componente de células T del sistema inmunitario mediado por células. Por lo general son capaces de afrontar infecciones bacterianas extracelulares, pero no pueden eliminar con eficacia agentes patógenos intracelulares, como virus, bacterias intracelulares y hongos. La gravedad de la deficiencia de la inmunidad mediada por células en estos niños es tal que incluso los virus atenuados presentes en una vacuna, que sólo tienen capacidad de crecimiento limitado en individuos normales, pueden producir infecciones que ponen en peligro la vida.
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Las respuestas inmunitarias mediadas por células T pueden dividirse en dos categorías principales de acuerdo a las diferentes poblaciones efectoras que son movilizadas: células T citotóxicas y células T auxiliares. La diferenciación y actividad de subgrupos de células T auxiliares se comentaron con detalle en el capítulo 11. La presente sección se centra en la respuesta inmunitaria mediada por linfocitos T citotóxicos (células TC o ctl), que puede dividirse en dos fases. En la primera fase, células TC vírgenes pasan por activación y diferenciación hacia ctl efectores funcionales dentro de tejido linfoide secundario. En la segunda fase, los ctl efectores reconocen complejos de mhc clase I-antígeno sobre células blanco específicas en la periferia, evento que finalmente induce la destrucción de las células blanco. Los ctl son predominantemente CD8+ y, por ende, están restringidos a mhc clase I. Puesto que casi todas las células nucleadas en el organismo expresan moléculas de mhc clase I, un ctl puede reconocer y eliminar casi cualquier célula en el cuerpo que muestre el antígeno específico reconocido por ese ctl en el contexto de una molécula de mhc clase I.
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La diferenciación de una célula T CD8+ virgen hacia una célula T citotóxica efectora involucra interacción con complejos de mhc clase I-péptido sobre célula dendrítica activada, así como ayuda por parte de células T CD4+ efectoras TH1 o TH17 (capítulo 11). Esta ayuda es proporcionada tanto de manera indirecta, mediante la capacidad de células T CD4+ para aumentar la función de células dendríticas, como directamente, por medio de la liberación de citocinas por células T CD4+ auxiliares.
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Generación de ctl efectores a partir de precursores de ctl
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Las células TC vírgenes son incapaces de matar células blanco y, por ende, se denominan también precursoras de ctl (ctl-p) para denotar su estado funcionalmente inmaduro. Sólo después de que un ctl-p ha sido activado las células se diferencian hacia un ctl funcional con actividad citotóxica. El umbral para activar ctl a partir de ctl-p es alto en comparación con el de otras células T efectoras, y parece requerir al menos tres señales (figura 13-5):
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Una señal específica para antígeno transmitida por el complejo de tcr en el momento de reconocimiento de un complejo de mhc clase I-péptido sobre una apc “que cuenta con licencia” (la emisión de licencia se explica más adelante)
Una señal coestimuladora transmitida por la interacción de CD28-CD80/86 (B7) del ctl-p y la apc que cuenta con licencia
Una señal inducida por la interacción de IL-2 con el receptor de IL-2 de alta afinidad, lo que da lugar a proliferación y diferenciación del ctl-p activado por antígeno hacia ctl efectores (la IL-2 puede ser generada por células T auxiliares, así como por la célula T CD8+ misma).
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La diferenciación de un ctl-p es iniciada por su reconocimiento de antígeno sobre una apc presentado en el contexto de una molécula de mhc clase I, pero también se requieren otros factores. Para que los ctl-p maduren hacia células citotóxicas necesitan interactuar con una apc que cuente con licencia. Una apc puede recibir licencia de varias maneras: mediante una célula T auxiliar CD4+ (TH) del subtipo TH1 o TH17, o por unión con productos microbianos, que activan receptores tipo Toll. No hay un requerimiento absoluto de ayuda de célula T CD4+ a este intervalo.
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En contraste, la ayuda por parte de la célula T CD4+ se requiere absolutamente para el desarrollo de memoria de célula T CD8+ eficaz, y para un brote proliferativo óptimo de células T funcionales. Esto se demostró al examinar la conducta de ctl en ratones con deficiencia de mhc clase II que no podían generar células T CD4+. Estos ratones generaron ctl funcionales en respuesta a una infección primaria, e incluso desarrollaron células con fenotipos de memoria. De cualquier modo, los ctl fueron incapaces de montar una respuesta secundaria, lo que demuestra que en ausencia de ayuda por parte de célula T CD4+, no se desarrollaron ctl de memoria funcionales.
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¿Qué proporciona una célula T CD4+ que es tan importante para la activación óptima de una célula T CD8+? Las células T auxiliares generan citocinas (p. ej., IFN-γ) que activan células presentadoras de antígeno (capítulo 11). No obstante, las células T auxiliares activadas también expresan ligando CD40 (CD40L, también conocido como CD154), un miembro de la familia de proteínas del tnf, que proporciona una señal coestimuladora de suma importancia a la apc. El CD40L interactúa con CD40, un miembro de la familia de receptor de tnf expresado por apc profesionales activadas. Cuando está unido, CD40 inicia una cascada de emisión de señales dentro de la apc que incrementa la expresión de ligandos coestimuladores (CD80 y CD86), quimiocinas y citocinas, lo que aumenta de manera significativa la capacidad de apc para activar la célula T CD8+ (figura 13-5).
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Los investigadores imaginan una interacción entre tres células que da lugar a activación de célula T CD8+: la célula TH, que interactúa con, y activa más, una apc que, a su vez, interactúa con, y activa, la célula ctl-p (figura 13-5a). De hecho, estudios de imágenes fluorescentes han proporcionado evidencia directa para la formación de complejos de célula dendrítica/célula T CD4+/célula T CD8+ durante la respuesta de células T a antígeno viral (figura 13-5b y capítulo 14).
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Sin embargo, es importante percatarse de que las interacciones entre la célula dendrítica y las dos células T diferentes pueden no tener que ser concurrentes; más bien, una célula dendrítica “que cuenta con licencia” por una célula TH podría retener su capacidad para activar ctl-p durante cierto periodo después de que la célula TH se separa. En este caso, células TH específicas podrían seguir adelante para activar otras células dendríticas, lo cual amplificaría la respuesta de activación.
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El desarrollo de ctl se acompaña de varios cambios. Los ctl precursores no expresan la cadena α del receptor de IL-2 de alta afinidad (CD25), ni producen mucha IL-2. No proliferan, y no muestran actividad citotóxica. Un ctl exitosamente activado empieza a expresar granzima B y perforina, las proteínas que son empacadas hacia gránulos líticos e induce muerte de la célula blanco. También regulan en dirección ascendente el receptor de IL-2, y empiezan a producir IL-2, la principal citocina requerida para la proliferación y diferenciación completas de ctl efectores. La importancia de la IL-2 en la función de ctl es subrayada en ratones con deleción (knockout; ko) de IL-2, que muestran deficiencia notoria de la citotoxicidad mediada por ctl.
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Los ctl en potencia son muy peligrosos para un organismo, y los requerimientos estrictos para activación ayudan a prevenir destrucción no deseada. Así, el requisito de que tanto las células TH como las células TC reconozcan antígeno antes de que la célula TC sea activada de manera óptima proporciona una salvaguarda contra autorreactividad inapropiada por células citotóxicas. El hecho de que el receptor de IL-2 no se expresa sino hasta después de que una célula T CD8+ virgen ha sido activada por unión a receptor de célula T también asegura que sólo los ctl-p específicos para antígeno proliferen y se hagan citotóxicos.
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La importancia de la presentación cruzada en la activación de ctl
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Independientemente de si la activación de una célula T CD8+ ocurre por medio de interacciones celulares secuenciales o simultáneas, la apc involucrada debe ser capaz de presentar antígenos provenientes del agente patógeno infectante tanto a células TH CD4+ restringidas a mhc clase II como a células TC restringidas a mhc clase I. Esta capacidad inicialmente desconcertó a los inmunólogos. Estrictamente hablando, ¿los antígenos que provienen de agentes patógenos intracelulares (el blanco principal de ctl) no deben ser presentados sólo por mhc clase I? Aún más importante, ¿qué pasa si el virus patógeno no infecta alguna vez células dendríticas (seguramente, muchas de ellas no serán infectadas)? ¿Cómo puede procesar y presentar antígenos provenientes de microbios que no infectan naturalmente células presentadoras de antígeno? El fenómeno de presentación cruzada de antígeno (capítulo 8), así como la capacidad de células dendríticas para producir endocitosis de antígeno ayudaron a responder estas preguntas.
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Recuerde que la presentación cruzada es la capacidad de las células dendríticas para procesar y presentar antígenos exógenos en moléculas de mhc tanto clase I como clase II. Así, incluso si las células dendríticas no quedaron infectadas por un agente patógeno, podrían fagocitarlo, procesarlo, y presentar antígenos tanto en mhc clase II (mediante las rutas tradicionales) como en mhc clase I (por medio de presentación cruzada). Las que quedaron infectadas tendrían, por supuesto, la capacidad para procesar y presentar antígenos en mhc clase I por medio de las rutas tanto tradicional como de presentación cruzada.
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TC1 y TC2: dos tipos de ctl efectores
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Las células auxiliares T efectoras CD4+ pueden diferenciarse hacia varios subtipos, cada uno de los cuales muestra respuesta a, y secreta, un panel distinto de citocinas (capítulo 11). Las células citotóxicas CD8+ efectoras no son tan diversas, pero pueden desarrollarse hacia dos subtipos separados: TC1 y TC2. Estos subtipos semejan en términos generales células TH1 y TH2 en lo que se refiere a las citocinas que generan (figura 11-9), así como a las citocinas que promueven su desarrollo. Los ctl están sesgados hacia la producción de células TC1, que secretan IFN-γ, pero no IL-4. En presencia de IL-4, los ctl se desarrollan hacia células TC2, que secretan mucho más IL-4 e IL-5 que IFN-γ. Ambos subtipos son potentes asesinos, aunque las células TC1 pueden usar estrategias mediadas tanto por perforina como por fas (véase más adelante), mientras que las células TC2 parecen sólo usar perforina. Los estudios sugieren que estos dos subtipos desempeñan papeles diferentes en el manejo (y en la exacerbación) de enfermedad, pero los resultados todavía no son definitivos para generar suficiente confianza en un modelo particular.
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Rastreo de ctl CD8+ con tecnología de tetrámero de mhc
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A fin de entender por completo la base para una respuesta inmunitaria exitosa (y fallida), los inmunólogos se percataron de que necesitarían ser capaces de rastrear la conducta de linfocitos específicos para antígeno en un organismo. Esto inicialmente fue muy difícil porque la frecuencia de linfocitos específicos para antígeno es bastante baja y los métodos para identificar células con especificidad conocida eran rudimentarios en el mejor de los casos. Aun cuando células específicas para antígeno proliferaron en respuesta a antígeno, aún representaron una minoría de todos los linfocitos en la circulación, y sus actividades eran muy difíciles de separar de las actividades de linfocitos inespecíficos. La identificación de las raras células de memoria específicas para antígeno era en esencia imposible. Una tecnología nueva e ingeniosa, basada en el uso de tetrámeros de mhc, se desarrolló durante la década de 1990-1999, e hizo posible identificar, aislar y dar seguimiento a la conducta de linfocitos específicos para un antígeno de elección. Ahora utilizada de manera sistemática, la tinción de tetrámero de mhc ha sido una inestimable herramienta en los esfuerzos de los inmunólogos por entender las complejidades de la conducta de los linfocitos en el espacio y el tiempo.
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Los tetrámeros de mhc son complejos de cuatro moléculas de mhc idénticas unidas a cuatro péptidos y enlazadas a una molécula fluorescente, generados en el laboratorio (figura 13-6). Primero se generaron tetrámeros de mhc clase I, pero ahora también se dispone de tetrámeros de mhc clase II. La combinación de mhc-péptido usada para generar estos complejos depende del antígeno de interés. Por ejemplo, en un laboratorio se han desarrollado tetrámeros que incluyen cuatro moléculas de HLA-A2 (mhc clase I de humano) que forman un complejo con un péptido del hiv que se sabe que estimula una respuesta de ctl. Un complejo de tetrámero de mhc clase I-péptido dado sólo se unirá a las células T CD8+ con tcr específicos para ese complejo de péptido-mhc particular. Así, cuando un tetrámero de mhc-péptido particular es añadido a una población de células T diversa, las células que portan tcr específicos para el tetrámero se unirán y quedarán marcadas con fluorescencia. Estas células a continuación pueden rastrearse usando microscopia de fluorescencia y citometría de flujo. Con estas tecnologías, ahora es posible determinar el número, la ubicación y el fenotipo de células en una población que tiene tcr específicos para ese antígeno particular (esa combinación de mhc-péptido particular) antes, durante y después de una infección. La citometría de flujo es suficientemente sensible como para detectar células T específicas para antígeno aun cuando su frecuencia en la población CD8+ es tan baja como de 0.1 por ciento.
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Con esta poderosa herramienta es posible medir directamente el incremento de células T CD8+ específicas para antígeno en respuesta a exposición a agentes patógenos como virus o antígenos asociados con cáncer, y rastrear su distribución en los tejidos. Por ejemplo, investigadores infectaron ratones con virus de la estomatitis (stomatitis) vesicular (vsv) y, usando tecnología de tetrámero, examinaron todos los órganos para buscar células CD8+ específicas para un complejo de péptido derivado de vsv-mhc. Este estudio demostró que durante infección aguda por vsv, células CD8+ específicas para vsv migran del sistema linfoide y son distribuidas ampliamente; se encuentran grandes números en el hígado y los riñones, pero las células específicas para antígeno están distribuidas casi en todas partes (figura 13-7). Estudios de seguimiento muestran que, independientemente del sitio de infección original, las células T CD8+ efectoras se distribuyen por sí mismas en todo el organismo.
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Estudios basados en tetrámero han sido excepcionalmente útiles para rastrear el fenotipo y el destino de no sólo células T específicas para agente patógeno, sino también de células T autorreactivas. Por ejemplo, diferentes tetrámeros de mhc/péptido insulina se usaron para identificar células T CD8+ reactivas a insulina en pacientes diabéticos. Aunque estos estudios se encuentran en proceso, algunos han mostrado que las células T CD8+ en las etapas más tempranas de la enfermedad muestran respuesta a un péptido de insulina diferente que las células T CD8+ a etapas más tardías de la enfermedad. Los investigadores especulan que la terapia con insulina misma puede influir sobre cuáles células T CD8+ autorreactivas se hacen dominantes en la enfermedad.
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Cómo los ctl matan células
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Un ctl puede matar una célula blanco de dos maneras principales: por medio de la liberación direccional de contenido de gránulos, o mediante una interacción de señalización de membrana de Fas-FasL. En lugar de inducir lisis celular, estos dos procesos inducen a la célula blanco a pasar por apoptosis, típicamente en el transcurso de algunas horas luego del contacto con la célula citotóxica.
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Independientemente del método que se emplee, la muerte por ctl involucra una secuencia cuidadosamente dirigida de eventos que empieza cuando la célula atacante se une a la célula blanco (figura 13-8) y forma un conjugado de célula-célula, un evento tan íntimo que a veces se denomina el “beso de la muerte”. La formación de un conjugado de ctl-célula blanco va seguida en el transcurso de varios minutos por un paso dependiente de Ca2+, que requiere energía, en el cual, finalmente, el ctl induce muerte de la célula blanco. El ctl a continuación se disocia de la célula blanco y sigue adelante para unirse a otra célula blanco.
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Los eventos de señalización específicos involucrados en el establecimiento de la interacción ctl-célula blanco son muy similares a los asociados con una interacción activadora de célula t-apc. El complejo de membrana TCR-CD3 sobre un ctl reconoce antígeno en asociación con moléculas de mhc clase I sobre una célula blanco, un evento que desencadena el desarrollo de una sinapsis inmunológica altamente organizada (capítulo 10) que se caracteriza por un anillo central de moléculas de tcr, rodeado por un anillo periférico de moléculas de adhesión, formadas principalmente por interacciones entre el receptor de integrina LFA-1 sobre la membrana del ctl, y las moléculas de adhesión intracelular (icam) sobre la membrana de la célula blanco.
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Las señales de tcr aumentan de manera directa la adhesión entre la célula asesina y la célula blanco al convertir LFA-1 desde un estado plegado, de baja afinidad, hacia un estado extendido, de alta afinidad (figura 13-9a). Este cambio es una consecuencia de “emisión de señales desde dentro hacia afuera” donde una cascada de señales (generada por el tcr, pero también por algunos receptores de citocina y quimiocina) actúan sobre la porción intracelular del LFA-1, lo cual induce un cambio conformacional que endereza la región extracelular del lfa, de modo que su cara de alta afinidad es accesible a icam. El LFA-1 persiste en su estado de alta afinidad sólo 5 a 10 min después de activación mediada por antígeno, y a continuación vuelve al estado de baja afinidad. Esta reducción de la afinidad de LFA-1 tal vez facilite la disociación del ctl desde la célula blanco.
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La importancia de señales de tcr en la promoción de la adhesión de ctl se demostró mediante un experimento en el cual se cubrió un plástico con proteína icam purificada, y se midió la capacidad para adherirse de los ctl en reposo en contraposición con ctl estimulados con tcr. Más de 10 veces el número de ctl estimulados por tcr (en contraposición con ctl no estimulados) se unió al plástico cubierto con icam (figura 13-9b). Los anticuerpos que pudieron bloquear la interacción entre LFA-1 e icam suprimieron el efecto de estimulación de tcr, lo que muestra que la adhesión fue, de hecho, específica para LFA-1/ICAM.
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Citólisis mediada por granzima y perforina Muchos ctl inician la muerte de sus células blanco por medio del suministro de moléculas proapoptóticas. Estas moléculas están empacadas dentro de gránulos que pueden visualizarse mediante microscopia (figura 13-10). Los investigadores en un inicio aislaron gránulos de ctl mediante fraccionamiento subcelular y mostraron que pueden inducir directamente daño de célula blanco. El análisis de su contenido reveló monómeros de 65 kDa de una proteína formadora de poro llamada perforina y varias serina proteasas llamadas granzimas (fragmentinas). Los ctl-p carecen de gránulos citoplasmáticos y de perforina; empero, una vez activados, empiezan a formar gránulos citoplasmáticos que incluyen monómeros de perforina y moléculas de granzima.
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Casi inmediatamente después de la formación de conjugados, los gránulos de ctl que contienen granzima y perforina son llevados al sitio de interacción entre una célula asesina y una célula blanco (figura 13-10) por medio de la actividad del centro organizador de microtúbulos (mtoc), que se polariza hacia estas sinapsis en respuesta a estimulación de tcr. Las vesículas se fusionan con la membrana externa y liberan monómeros de perforina y proteasas granzima hacia el espacio en la unión entre las dos células.
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Conforme los monómeros de perforina establecen contacto con la membrana de la célula blanco, pasan por un cambio conformacional, lo cual expone un dominio anfipático que se inserta en la membrana de la célula blanco; los monómeros a continuación se polimerizan (en presencia de Ca2+) para formar poros cilíndricos con un diámetro interno de 5 a 20 nm (figura 13-11a). Gran número de poros de perforina son visibles en la membrana de la célula blanco en la región de la formación de conjugado (figura 13-11b). Tal vez no sorprende que la perforina muestre cierta homología de secuencia con el componente C9 terminal del sistema de complemento, y los poros de membrana formados por perforina son similares a los que se observan en lisis mediada por complemento. La importancia de la perforina para la muerte mediada por ctl se demuestra en ratones con deleción (knockout [ko]) deficientes en perforina, que son incapaces de eliminar el virus de la coriomeningitis linfocítica (lcmv) del organismo aun cuando montan una respuesta inmunitaria CD8+ importante contra células infectadas por virus.
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Si bien alguna vez se creyó que la granzima B entra a la célula blanco por medio de poros de perforina de superficie, ahora se cree que entra por medio de procesos endocíticos. Muchas células blanco tienen sobre su superficie una molécula conocida como el receptor de manosa 6-fosfato, que también se une a granzima B. Los complejos de granzima B-receptor de manosa 6-fosfato son internalizados y aparecen dentro de vesículas. Perforina internalizada al mismo tiempo a continuación forma poros que liberan granzima B desde la vesícula hacia el citoplasma de la célula blanco.
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Al margen del mecanismo de entrada, una vez que se encuentra en el citoplasma, la granzima inicia una cascada de reacciones que dan lugar a la fragmentación del dna de la célula blanco hacia oligómeros de 200 pares de bases (bp); este tipo de fragmentación del dna es típico de la apoptosis. Las proteasas granzima no median de manera directa fragmentación de dna. Más bien, activan una vía apoptótica dentro de la célula blanco. Este proceso apoptótico no requiere síntesis de mRNA ni de proteína en el ctl ni en la célula blanco. En el transcurso de 5 min luego del contacto con el ctl, las células blanco empiezan a mostrar fragmentación de dna. Despierta interés que se ha mostrado que el dna viral dentro de células blanco infectadas también es fragmentado durante este proceso. Esta observación muestra que la muerte mediada por ctl no sólo mata células infectadas por virus, sino que también puede destruir el dna viral en esas células de manera directa. El inicio rápido de fragmentación de dna después de contacto con ctl quizá evite la replicación y el montaje virales continuos durante el periodo previo a la destrucción de la célula blanco.
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¿De qué modo los ctl se protegen a sí mismos contra su propia actividad de perforina y granzima? Estudios muestran que los ctl son más resistentes a las actividades de la granzima y la perforina que sus blancos. No se entienden por completo las estrategias que usan, pero investigadores han encontrado que los ctl expresan cifras altas de inhibidores de serina proteasa (serpinas), que los protegen contra la actividad de granzima B. En apoyo del papel de las serpinas en la protección de ctl contra sus propias funciones proapoptóticas, los ctl no sobreviven en ratones que muestran deficiencia de una de las serpinas más comunes expresadas por células T CD8+, Spi-1.
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Citólisis mediada por Fas-FasL Se ha mostrado que algunas líneas de ctl potentes carecen de perforina y granzimas. En estos casos, la citotoxicidad está mediada por Fas (CD95). Esta proteína transmembrana, que es un miembro de la familia del receptor de tnf, puede suministrar una señal de muerte cuando es unida por medio de un enlace covalente por su ligando natural, un miembro de la familia del factor de necrosis tumoral llamado ligando de Fas (FasL) (capítulo 3). El FasL se encuentra sobre la membrana de ctl, y la interacción de FasL con Fas sobre una célula blanco desencadena apoptosis.
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Las mutaciones de Fas llevan a múltiples trastornos tanto en ratones como en humanos. Los ratones que son homocigóticos para la mutación lpr expresan poco Fas o ninguno sobre sus células, y tienen ganglios linfáticos notoriamente grandes. En términos más rigurosos, son afectados por una enfermedad linfoproliferativa que se caracteriza por la acumulación de linfocitos T y B activados, maduros, en sus ganglios linfáticos. Los ctl en ratones mutantes de lpr pueden ser inducidos para que expresen FasL; con todo, estos ctl no pueden matar blancos que no expresan Fas. Estos ratones también presentan enfermedades autoinmunitarias, probablemente porque matan linfocitos autorreactivos que son activados durante una respuesta inmunitaria. Un trastorno muy similar, ahora conocido como síndrome linfoproliferativo autoinmunitario (alps o síndrome de Canale-Smith), se ha identificado en pacientes humanos que tienen defectos genéticos en Fas, el ligando de Fas, o vías de señalización de Fas.
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La importancia crucial de los sistemas tanto de perforina como de Fas-FasL en la citólisis mediada por ctl fue revelada por experimentos con dos tipos de ratones mutantes: ratones con deleción (knockout) de perforina y la cepa lpr que muestra deficiencia de Fas (figura 13-12). Los investigadores quisieron determinar la importancia relativa de cada una de estas moléculas, y desarrollaron un sistema en el cual generaron ctl al cocultivar células T provenientes de ratones H-2b con células blanco muertas provenientes de ratones H-2k. Los ctl generados en esas reacciones de linfocitos mixtas (véase más adelante) mostraron fuerte reacción contra mhc alogénico, y pudieron matar células que expresaban H-2k. Con este sistema, los investigadores primero se preguntaron si los ctl podían matar células blanco generadas a partir de ratones lpr (que no expresaban Fas). De hecho, pudieron matarlas, lo que demuestra que no había un requerimiento absoluto de interacciones Fas-FasL para la actividad de ctl. A continuación se preguntaron si se requería perforina y generaron ctl a partir de ratones con deleción (knockout) de perforina. Encontraron que estas células también podían matar células blanco, lo que demostró que no había un requerimiento absoluto de perforina. Por último, se preguntaron si ocurría muerte en ausencia tanto de perforina como de interacciones Fas-FasL. Generaron células ctl provenientes de ratones con deleción (knockout) de perforina, y determinaron su capacidad para matar células blanco provenientes de los ratones con deficiencia de Fas. No se observó muerte. Estas observaciones y otras indican que las ctl emplean estos dos métodos, y sólo estos dos métodos —apoptosis mediada por perforina y apoptosis mediada por Fas— para matar a sus blancos.
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Las estrategias de muerte tanto con perforina como con Fas-FasL activan una vía de señalización en la célula blanco que induce apoptosis (figura 13-13). Una característica fundamental de la muerte celular por apoptosis es la participación de la familia de cisteína proteasas, caspasa, que dividen después de un residuo de ácido aspártico. El término caspasa incorpora cada uno de estos elementos (cisteína, aspartato, proteasa). En circunstancias normales, las caspasas están presentes en la célula como proenzimas inactivas —procaspasas— que requieren división proteolítica para conversión en las formas activas. La división de una procaspasa produce una caspasa activa, que divide otras procaspasas, lo que activa su actividad proteolítica, que da lugar a una cascada de eventos que desmonta sistemáticamente la célula —el dato característico de la apoptosis—. Se han encontrado más de una docena de caspasas diferentes, cada una con su especificidad propia. Típicamente se dividen en dos categorías: las que inician la cascada de caspasa (caspasas iniciadoras), y las que inician de manera directa apoptosis (caspasas efectoras). En el capítulo 9 se presenta una exposición más a fondo del proceso apoptótico.
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¿Qué estrategias usan los ctl para iniciar la activación de caspasa? La unión de Fas sobre una célula blanco por ligando de Fas sobre un ctl induce primero la activación de una caspasa iniciadora en la célula blanco. El Fas se asocia con una proteína conocida como proteína asociada a Fas con dominio de muerte (death) (fadd), que a su vez se asocia con la procaspasa-8 (figura 13-13a). En el momento de formación de enlace covalente con Fas, la procaspasa-8 es convertida en caspasa-8 e inicia una cascada de caspasa apoptótica.
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Las granzimas introducidas en la célula blanco por un ctl son proteolíticas y tienen varios blancos (figura 13-13b). Pueden dividir de manera directa la procaspasa-3, un evento que al parecer sólo activa parcialmente esta caspasa efectora. También pueden dividir bid, que induce liberación mitocondrial de citocromo c y, finalmente, la activación de caspasa-9. Ambas actividades parecen requerirse para actividad proapoptótica óptima.
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El resultado final de las vías tanto mediada por perforina-granzima como mediada por Fas es, por ende, la activación de vías de muerte latentes que se encuentran en la célula blanco. Como un inmunólogo lo expuso de manera muy acertada, no es precisamente que las ctl maten células blanco, sino que las persuaden a que se suiciden.
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Las células asesinas naturales reconocen y matan células infectadas y células tumorales por su ausencia de mhc clase I
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Otro isotipo de célula inmunitaria, las células nk, inician vías apoptóticas en células blanco usando mecanismos muy similares pero receptores muy diferentes. Las células nk fueron descubiertas en esencia por accidente cuando diversos inmunólogos estuvieron midiendo la capacidad citolítica de linfocitos aislados a partir de ratones que presentaban tumores. Originalmente predijeron que estos linfocitos mostrarían una capacidad específica para matar las células tumorales a las cuales habían quedado expuestos. Para efectuar sus experimentos incluyeron múltiples controles, y compararon la actividad de estos linfocitos de interés con la de linfocitos tomados de ratones que no tenían tumores, así como de ratones que tenían tumores no relacionados. Para su gran sorpresa, los investigadores descubrieron que incluso los linfocitos testigo, que no habían quedado expuestos a tumor alguno o que habían quedado expuestos a un tipo de tumor muy diferente, pudieron matar las células tumorales del primer ratón. De hecho, la muerte que estuvieron observando no pareció estar siguiendo las reglas de especificidad que son el dato característico de una respuesta de linfocitos a antígenos y agentes patógenos convencionales.
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El estudio adicional de esta muerte de células tumorales inespecífica reveló que, de hecho, ni linfocitos T ni linfocitos B estuvieron involucrados en absoluto. En lugar de esto, la causa fue una población de linfocitos de mayor tamaño y más granulares.
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Las células, llamadas células “asesinas naturales” por su citotoxicidad inespecífica, constituyen 5 a 10% de la población de linfocitos circulantes. Pese a la ausencia de receptores de antígeno específicos (esto es, anticuerpos, receptores de células T), desempeñan un papel importante en las defensas inmunitarias contra células infectadas, células sometidas a estrés, y células tumorales. También pueden contribuir a autoinmunidad cuando quedan desreguladas. Más versátiles que lo que originalmente se anticipó, las células nk también desempeñan un papel regulador en las respuestas inmunitarias tanto innata como adaptativa a antígenos convencionales al secretar citocinas que alteran la respuesta inmunitaria. Recientemente también se ha mostrado que tienen importancia crucial para el desarrollo de una placenta normal, no por medio de su actividad citotóxica, sino mediante su capacidad para reconocer la presencia de un mhc diferente (paterno) e iniciar el remodelado de vasos sanguíneos.
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La importancia de las células nk en la defensa contra infecciones es ilustrada de manera convincente por el caso de una mujer joven que padecía un trastorno que dio lugar a falta completa de estas células. Aun cuando esta paciente tuvo recuentos normales de células T y B, sufrió infecciones graves por virus de la varicela, y una infección por citomegalovirus que puso en peligro su vida. Ahora se sabe que las células nk son una primera línea de defensa crucial contra infección por agentes patógenos intracelulares (virus y algunas bacterias) al matar células infectadas en etapas tempranas y, así, controlar la replicación de agentes patógenos durante los siete días que tardan los precursores de linfocitos citolíticos CD8+ en desarrollarse hacia ctl funcionales. La actividad de nk es estimulada por las citocinas de la inmunidad innata IFN-α, IFN-β e IL-12, que aumentan con rapidez durante etapas tempranas de la evolución de una infección viral. La onda de actividad de células nk alcanza un máximo luego de este incremento, unos tres días después de infección (figura 13-14).
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Como se señaló, las células nk también producen en abundancia citocinas importantes desde el punto de vista inmunitario que pueden influir de modo indirecto pero con potencia sobre las respuestas inmunitarias tanto innata como adaptativa. La producción de IFN-γ por células nk aumenta las actividades fagocítica y microbicida de los macrófagos. El IFN-γ derivado de células nk también influye sobre la diferenciación de subgrupos auxiliares T CD4+, al inhibir (por ejemplo) la proliferación TH2 y estimular el desarrollo TH1 por medio de la inducción de IL-12 por macrófagos y células dendríticas (capítulo 11).
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Las células nk son suficientemente potentes como para que, conjuntamente con otros mecanismos protectores proporcionados por el sistema inmunitario innato, puedan proteger a los animales que carecen por completo de inmunidad adaptativa. Esto es muy bien ilustrado por los ratones con deleción (knockout) de RAG-1 que carecen de linfocitos B o T específicos para antígeno, pero que son saludables, están activos y son capaces de repeler muchas infecciones. Estos animales están muy lejos de ese estado de bienestar cuando el desarrollo de células nk también se encuentra alterado. Despierta interés que los humanos parecen depender más de los sistemas inmunitarios adaptativos y sufren más en su ausencia que sus parientes murinos.
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Fenotipo de células nk
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¿De dónde provienen las células nk, y qué aspecto tienen? Las células nk son células linfoides derivadas del progenitor linfoide común (clp) en la médula ósea. Aunque algunas células nk se desarrollan en el timo, este órgano no se requiere para la maduración de células nk. Los ratones desnudos, que carecen de un timo y tienen pocas células T o ninguna, tienen poblaciones de células nk funcionales. A diferencia de las células T y B, las células nk no pasan por reordenamiento de genes que codifican para receptor; aún se desarrollan células nk en ratones en los cuales se ha efectuado deleción (knockout) de los genes que codifican para recombinasa RAG-1 o RAG-2. Congruente con esta observación, también se encuentran células nk en ratones que padecen inmunodeficiencia combinada grave (severe) (scid), que no tienen células T ni B debido a un defecto en la actividad enzimática requerida para el reordenamiento de receptor.
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Las células nk son bastante heterogéneas. Pueden distinguirse distintas subpoblaciones con base en diferencias de la expresión y secreción de moléculas importantes desde el punto de vista inmunitario. Aún no está claro si esta heterogeneidad refleja diferentes etapas en su activación o maduración o en verdad subpoblaciones separadas.
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Casi todas las células nk murinas expresan CD122 (la subunidad β de 75 kDa del receptor de IL-2), NK1.1 (un miembro de la familia NKR-P1) y CD49b (una integrina). Las células nk típicamente también expresan CD2 y FcγRIII. De hecho, el agotamiento celular con anticuerpo monoclonal anti-FcγRIII elimina de la circulación casi todas las células nk. Las células nk de humano también expresan receptores de IL-2, y FcγRIII, pero no expresan NK1.1. Más bien, se distinguen de otros linfocitos por la expresión de CD56, lo cual varía de intensidad dependiendo del estado de maduración y de actividad de una célula nk (las células que expresan CD56 alto tienden a producir citocinas, y pueden diferenciarse hacia células que expresan poco CD56, que muestran más actividad citolítica).
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Quizá la característica fenotípica más distintiva de las células nk es su expresión de un grupo de receptores nk (nkr) activadores e inhibidores singulares. Estos receptores se encargan de determinar cuáles blancos matarán las células nk. Despierta interés que las células nk de ratones y de humanos usan receptores sorprendentemente distintos para lograr lo mismo; aun así, los principios que impulsan la activación de nk permanecen igual. Además, el número y el tipo de receptores activadores e inhibidores expresados por células nk varían ampliamente, y el equilibrio de señales recibidas por medio de estos receptores determina si las células nk inducen muerte de sus blancos.
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Cómo reconocen blancos las células nk: el modelo de lo propio faltante
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Dado que las células nk no expresan receptores específicos para antígeno, el mecanismo mediante el cual estas células reconocen células tumorales o infectadas y las distinguen de células corporales normales desconcertó a los inmunólogos durante años. Klas Karre emitió una interesante hipótesis que formó los cimientos para la comprensión de cómo las células nk distinguen lo propio de lo no propio (o de lo propio alterado). Propuso que las células nk matan cuando no perciben la presencia de proteínas propias normales sobre una célula, el modelo de lo propio faltante. El corolario implícito para la propuesta es que el reconocimiento de lo propio inhibe la capacidad para matar.
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Los indicios respecto a los orígenes de esas señales inhibidoras provinieron de estudios tempranos en los que se analizó a cuáles blancos tumorales las células nk mataron mejor. Los investigadores examinaron múltiples variables asociadas con las preferencias de nk, y descubrieron que la muerte se correlacionó mejor con las cifras de moléculas de mhc clase I expresadas sobre las células tumorales. En un estudio, examinaron la capacidad de ctl y células nk para matar células B que fueron transformadas en células tumorales por infección con el virus de Epstein-Barr (ebv). Los ctl fueron incapaces de reconocer estas células B y de producir lisis de las mismas. De cualquier modo, las células nk fueron asesinos muy eficaces de estas células tumorales. Finalmente, los investigadores se percataron de que la infección por ebv reguló en dirección descendente el mhc clase I, lo que permitió a las células evadir el reconocimiento por células T CD8+. No obstante, esta falta de clase I hizo de ellas blancos perfectos para células nk, que mostraron respuesta a lo “propio faltante”. Los investigadores “resolvieron” un papel de mhc clase I al efectuar transfección de los tumores de células B con genes que codifican para mhc clase I de humano. Las células nk ya no pudieron matar las células. El descubrimiento subsiguiente de receptores sobre células nk que producen señales inhibidoras cuando reconocen moléculas de mhc sobre células blanco potenciales proporcionó apoyo directo para este modelo. Se mostró que estos receptores inhibidores evitan la muerte por células nk, la proliferación de células nk, y la liberación de citocinas por las mismas.
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Dado que muchas células infectadas por virus y tumorales disminuyen la expresión de mhc, el modelo de lo propio faltante (esto es, fundamentar la decisión de matar en el hecho de si una célula blanco expresa suficiente mhc clase I, una proteína propia omnipresente) tiene buen sentido fisiológico. Si bien el paradigma fundamental ha pasado la prueba del tiempo, no sorprende que la situación real sea más complicada (figura 13-15). Como se indicó, resulta ser que las células nk expresan dos categorías de receptores: una que suministra señales que inhiben la actividad citotóxica de células nk (las que reconocen productos mhc clase I) y otra que suministra señales que aumentan la actividad citotóxica. Las células nk distinguen entre células sanas y células infectadas o cancerosas al vigilar e integrar ambos grupos de señales; el hecho de si una célula blanco es matada o no depende del equilibrio entre activadores e inhibidores. Las señales inhibidoras, en general, pueden sobrepasar señales activadoras; de este modo, las células que expresan cifras normales de moléculas de mhc clase I no alteradas tienden a escapar de todas las formas de muerte mediada por células nk.
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Receptores de células nk
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Los receptores nk caen dentro de dos categorías funcionales: moléculas inhibidoras que se unen a mhc clase I y bloquean la muerte por células nk, y moléculas activadoras que desencadenan citotoxicidad por células nk si un receptor inhibidor no está ocupado. Estos dos grupos también caen dentro de dos categorías estructurales: miembros con regiones extracelulares tipo lectina, y miembros con regiones extracelulares tipo inmunoglobulina (cuadro 13-5). Note que si bien las lectinas típicamente se unen a carbohidratos, la mayor parte de los receptores de células nk tipo lectina se une a proteínas más que a carbohidratos.
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La estructura extracelular del receptor de célula nk no se identifica de inmediato como un inhibidor o activador. Los receptores nk con sus estructuras extracelulares idénticas pueden tener dominios intracelulares diferentes y, por ende, distintas propiedades de señalización. Al igual que con los FcR (véase antes), las secuencias intracelulares de los receptores nk activadores por lo general contienen itam (capítulo 3), y las secuencias intracelulares de receptores nk inhibidores contienen itim. (Despierta interés que, al igual que los receptores nk, los receptores Fc también caen dentro de dos familias estructurales: tipo lectina y tipo inmunoglobulina.)
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Receptores y ligandos nk inhibidores Los receptores inhibidores, que se unen a moléculas de mhc clase I, son el determinante de mayor importancia de la decisión de matar tomada por una célula nk. En humanos, son miembros de una familia tipo inmunoglobulina diversa conocida como receptores tipo inmunoglobulina de célula asesina (killer) (kir). Sorprende que la familia kir parece haber evolucionado con rapidez extrema. Los receptores kir funcionales que se encuentran en primates no existen en roedores. Los ratones usan una familia de receptores distinta, la familia Ly49 tipo lectina, para lograr la misma función que la de los kir, a saber, inhibición de la actividad citolítica de célula nk por medio de unión a moléculas de mhc clase I sobre células sanas. En humanos no hay receptores Ly49 funcionales.
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Miembros de las familias tanto kir como Ly49 son altamente diversos y polimorfos. Estos receptores inhibidores por lo general son específicos para regiones polimorfas de moléculas de mhc clase I (H-2k o H-2d en el ratón; hla-a, hla-b o hla-c en el humano). Sólo se ha identificado una fracción de ligandos de mhc clase I y tipo clase I para estos receptores diversos. Dado el polimorfismo genético tanto de los receptores kir como de sus ligandos mhc clase I, no sorprende que los individuos puedan heredar combinaciones de kir-mhc clase I que no son ideales y que podrían aumentar sus susceptibilidades a enfermedad.
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Una excepción para la regla general de que los receptores inhibidores de nk de humano son moléculas tipo Ig es el receptor inhibidor tipo lectina CD94-NKG2A, un heterodímero con enlace disulfuro constituido de dos glucoproteínas: CD94 y un miembro de la familia NKG2. Mientras que los receptores kir típicamente reconocen polimorfismos de HLA-B o HLA-C, los receptores CD94-NKG2A reconocen HLA-E sobre células blanco potenciales. Esta excepción también tiene sentido biológico. Dado que el HLA-E no es transportado a la superficie de una célula a menos que tenga unido un péptido derivado de las proteínas HLA-A, HLA-B o HLA-C, la cantidad de HLA-E sobre la superficie sirve como un indicador de la magnitud general de biosíntesis de mhc clase I en las células. Estos receptores CD94-NKG2A inhibidores reconocen HLA-E de superficie y envían señales inhibidoras a la célula nk, con el resultado neto de que la muerte de células blanco potenciales es inhibida si están expresando cifras adecuadas de clase I.
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A diferencia de los receptores de antígeno expresados por células B y células T, las células receptoras nk no están sujetas a exclusión alélica, y las células nk pueden expresar varios receptores kir o Ly49 diferentes, cada uno específico para una molécula de mhc diferente o para un grupo de moléculas de mhc estrechamente relacionadas. Se han encontrado clonas individuales de células nk de humano que expresan un receptor CD94-NKG2A y hasta seis receptores kir diferentes. La capacidad de cada célula nk para expresar múltiples receptores kir o NKG2A mejora sus probabilidades de reconocer las variantes de mhc clase I polimorfas expresadas por las células de un individuo y, por ende, evita que las células nk maten células sanas simplemente porque sucedió que una variante de kir que expresó no se unió a la variante de mhc clase I expresada por esa célula normal.
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Activación de receptores y ligandos nk Casi todos los receptores activadores expresados por células nk murinas y de humano son estructuralmente similares, y muchos son tipo lectina C —así llamados porque tienen dominios de reconocimiento de carbohidrato dependientes de calcio—. El NKG2D ha surgido como uno de los receptores activadores más importantes, y actúa por medio de una cascada de señalización similar a la iniciada por CD28 en células T. Los ligandos para NKG2D son moléculas tipo mhc clase I no polimorfas que no se asocian con β2-microglobulina. A menudo son inducidas sobre células sujetas a estrés, como daño de dna o infección. Así, ayudan a centrar la actividad de células nk sobre células y situaciones donde su actividad lítica sería más adaptativa. Un ejemplo interesante de un receptor nk tipo lectina activador es Ly49H, un receptor de ratón que interactúa con una proteína tipo mhc clase I codificada no por el cuerpo sino por un virus murino, mcmv. En ausencia de este receptor, los ratones están poco protegidos contra este virus común.
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Muchas moléculas que no son expresadas de manera exclusiva por células nk también aumentan la actividad nk. Incluyen CD2 (el receptor para la molécula de adhesión LFA-3), CD244 (el receptor para CD48), así como receptores para citocinas inflamatorias. La participación de cada una de estas proteínas, de nuevo, tiene sentido biológico, al enfocar la atención de las células nk sobre ambientes que están sufriendo fenómenos adversos inflamatorios.
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Por último, es importante recordar que casi todas las células nk de humano y murinas expresan el receptor FcγIII (CD16) del cual depende casi todo el reconocimiento mediado por anticuerpos y la muerte de células blanco por células nk (adcc). Como se describió, la adcc es una potente adición a la respuesta a infección y a enfermedad maligna. Las células infectadas por virus, por ejemplo, a menudo expresan proteínas de envoltura viral sobre su superficie. Los anticuerpos producidos por células B que respondieron a estas proteínas se unirán a la superficie celular y reclutarán células nk, que producirán lisis de la célula infectada.
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Cómo las células nk inducen apoptosis en sus blancos
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Al margen de cuáles receptores están involucrados en la regulación de la actividad lítica de células nk, las células nk matarán blancos mediante procesos similares a los empleados por ctl. Las células nk expresan FasL y lo secretan, e inducen fácilmente muerte en células blanco que portan Fas. El citoplasma de células nk también tiene muchos gránulos que contienen perforina y granzimas. Al igual que los ctl, las células nk desarrollan una sinapsis inmunológica organizada en el sitio de contacto con una célula blanco, después de lo cual ocurre desgranulación, con liberación de perforina y granzimas en la unión entre las células que están interactuando. Se cree que la perforina y las granzimas desempeñan las mismas funciones en la muerte de células blanco mediada por nk por medio de apoptosis que las que desempeñan en el proceso de muerte mediada por ctl.
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“Emisión de licencia” y regulación de la actividad nk
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Incluso las células nk recién formadas tienen gránulos grandes en su citoplasma y tradicionalmente se creía que las células nk eran capaces de matar desde el momento en que maduraban. Ahora se cree que casi todas las células nk necesitan obtener licencia antes de que puedan usar su maquinaria citotóxica sobre cualquier blanco (incluso con la emisión de señales de receptor activador e inhibidor apropiada). Se cree que la emisión de licencia para una célula nk ocurre por medio de una primera unión de sus receptores inhibitorios, unión a mhc clase I. Este evento puede considerarse una manera en que el sistema inmunitario prueba la capacidad de una célula nk para restringir su actividad asesina y una importante estrategia para mantener la tolerancia a lo propio en este subgrupo de células. De manera específica, la emisión de licencia permite que sólo sean armadas las células que tienen la capacidad de ser desarmadas por medio de interacciones inhibitorias.
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Una vez que obtienen licencia, se cree que las células nk exploran continuamente tejidos y células blanco por medio de sus receptores inhibidores y activadores múltiples. La unión de ligandos activadores sobre la superficie de una célula tumoral, célula infectada por virus, o una célula por lo demás estresada, emite señales a células nk para que maten la célula blanco. Si los receptores inhibidores de células nk detectan cifras normales de mhc clase I sobre células blanco potenciales, estas señales inhibidoras superan las señales de activación. Esto no sólo evitaría la muerte de la célula blanco, sino que también suprimiría la proliferación de células nk y la producción de citocinas (p. ej., IFN-γ y TNF-α). La consecuencia general de esta estrategia es preservar células que expresan indicadores cruciales de lo propio normal, las moléculas de mhc clase I, y la muerte de células que carecen de indicadores de lo propio y que no expresan cifras normales de mhc clase I. Se requieren más estudios para entender por completo el papel de la emisión de licencia y el requerimiento de la misma.
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Memoria de células nk
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La línea entre células nk y linfocitos T y B se sigue difuminando. Alguna vez se consideró que los linfocitos B y T eran las únicas células del sistema inmunitario que podían generar respuestas de memoria. Sin embargo, datos recientes indican que algunas células nk también pueden generar una respuesta de memoria a antígeno. La evidencia de esta notoria propiedad provino de experimentos que mostraron que células nk que expresaban un receptor que se unía a una proteína viral podían transferir memoria de esta exposición a antígeno a animales vírgenes que no habían quedado expuestos o infectados previamente (recuadro 13-2, Experimento clásico).
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RECUADRO 13-2
EXPERIMENTO CLÁSICO: Reconsideración de la memoria inmunológica: las células nk se juntan a los linfocitos como células capaces de memoria
La memoria tiene una mística en círculos inmunitarios debido en parte a que es la base fundamental para el éxito de la vacunación, que fortaleció a las sociedades al cambiar radicalmente la relación del humano con la enfermedad, y en parte porque su base molecular aún es esquiva. Como uno de los datos característicos del sistema inmunitario adaptativo, la memoria siempre se ha considerado una característica exclusiva de células B y células T.
Las células nk, los parientes de linfocitos no apreciados como es debido, carecen de receptores específicos para antígeno, y hasta hace poco tiempo se asumía que carecían de capacidad para memoria. Conforme ha crecido el reconocimiento de su importancia en la respuesta a infección, la muerte de células tumorales y la conformación de sistemas inmunitarios adaptativos, las suposiciones respecto a sus actividades se han vuelto a examinar. Para sorpresa de los inmunólogos, los resultados de varios experimentos ingeniosos han revelado que las células nk, de hecho, comparten una capacidad para memoria específica para antígeno con células B y T. O’Leary y colaboradores mostraron en 2006 que la memoria de un antígeno que causa hipersensibilidad puede ser transferida por células nk hepáticas hacia un ratón que nunca había estado en contacto con este antígeno. Sun y colaboradores mostraron en 2009 que la memoria de infección por citomegalovirus murino (mcmv) podía transferirse por medio de células nk. A continuación se comentan los aspectos de este último estudio.
Para indagar si las células nk tenían capacidad de memoria alguna, los investigadores inteligentemente eligieron examinar la respuesta de nk a mcmv. Se sabe que las células nk son un importante componente de la protección contra infección por mcmv, y una fracción grande de células nk (hasta 50%) expresa un receptor activador específico para mcmv (Ly49H). La figura 1 presenta un esquema de su método experimental y sus resultados, mientras que en la figura 2 se muestran dos piezas clave de los datos originales de Sun y colaboradores.
Los investigadores idearon un sistema rigurosamente controlado en el cual pudieron rastrear células nk específicas para mcmv. Específicamente, transfirieron de manera adoptiva (introdujeron una población de células de un ratón a otro), células nk purificadas desde ratones naturales hacia ratones cuyas células nk eran incapaces de expresar Ly49H o de emitir señales por medio del mismo. (Estos ratones son deficientes en una molécula emisora de señales, DAP12, que envía señales desde receptores Ly49.) Las células nk de donantes también difirieron de las células nk del huésped por la expresión de CD45.1, una variante alélica de CD45 que puede ser identificada fácilmente por medio de citometría de flujo (capítulo 20). De esta manera, los investigadores pudieron controlar el número de células nk Ly49H en el ratón, y pudieron rastrear específicamente las que introdujeron.
Primero encontraron que la población de células nk que eran específicas para mcmv (Ly49+CD45.1+) proliferaron durante los siete días después de infección, y después declinaron en el transcurso de semanas después de infección viral (figura 2b). Esta expansión y contracción corrieron parejas con exactitud con la conducta de células T específicas para antígeno convencionales (específicamente, células T CD4+) en una respuesta primaria.
A continuación se hicieron una pregunta crucial. ¿Esta respuesta de células nk específicas para antígeno da lugar a memoria? De manera específica, ¿las células nk mcmv persistieron con el tiempo? Y si persistieron, ¿mostrarían una respuesta más robusta si volvieran a quedar expuestas a mcmv? Los investigadores muestran que incluso 70 días después de la infección, podía detectarse una población de Ly49H+ (específica para mcmv), CD45.1+ (células derivadas del donante). Cuando la actividad de estas células se comparó con la de células de ratones que no habían quedado infectados, los investigadores encontraron que, de hecho, fueron más activas: dos veces más células nk de ratones infectados (“células nk de memoria”) podían sintetizar IFN-γ que las células nk de ratones no infectados.
Sin embargo, para mostrar en definitiva que esta memoria era relevante desde el punto de vista fisiológico, los investigadores se preguntaron si las células nk de memoria podían rescatar a ratones desde infección. Aislaron y transfirieron células nk vírgenes y “de memoria” en números variables hacia ratones neonatales, que son naturalmente inmunodeficientes y mueren si quedan infectados por mcmv. Se preguntaron si las células nk de memoria aumentarían la supervivencia de ratones neonatales infectados. En la figura 2c se muestran sus resultados como una curva de supervivencia, que señala la frecuencia de ratones que permanecieron vivos en contraposición con el tiempo (en días) después de la infección. En ausencia de células nk específicas para antígeno (control pbs), 100% de los ratones mueren en el transcurso de dos semanas de una infección primaria por mcmv. Empero, cuando se transfieren células nk Ly49H+, los prospectos de supervivencia aumentan. De hecho, en presencia de células nk Ly49H+ provenientes de ratones previamente infectados (nk de memoria), 75% de los ratones vivieron. La introducción de células Ly49H+ desde ratones que previamente no habían quedado infectados (nk vírgenes) también mejoró la supervivencia, pero se requirieron al menos 10 veces más de estas células nk vírgenes para proporcionar igual protección.
Estos y otros estudios muestran que los linfocitos deben compartir el escenario inmunitario con al menos algunas células nk como actores con excelente memoria. Los hechos de si esa memoria se aplica a otros subgrupos nk específicos para antígeno —de hecho a otras células inmunitarias— y si tiene las mismas características moleculares que la memoria de linfocitos, persisten como preguntas abiertas y que vale la pena responder.
O’Leary, J.G., M. Goodarzi, D.L. Drayton, y U.H. von Andrian. 2006. T cell- and B cell-independent adaptive immunity mediated by natural killer cells. Nature Immunology 7:507-516.
Sun, J.C., et al. 2009. Adaptive immune features of natural killer cells. Nature 457:557-561.
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Estas observaciones muestran que al menos algunas células nk poseen la maquinaria vinculada con el desarrollo para convertirse en células de memoria; en otras palabras, para aumentar su longevidad (aunque quizá no tanto como los linfocitos B y T) y mejorar sus tiempos de respuesta. Quedan muchas preguntas por responder: ¿todas las células nk tienen la capacidad para desarrollarse hacia células de memoria? Y, dado que las células nk no expresan receptores específicos para antígeno convencionales, ¿contra cuáles antígenos pueden desarrollar memoria?
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Las células nkt tienden un puente entre los sistemas inmunitarios innato y adaptativo
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Las exposiciones anteriores de la inmunidad mediada por células cubrieron el ctl, un componente importante de la inmunidad adaptativa que expresa un tcr específico para antígeno, y la célula nk, una célula con propiedades tanto innatas como adaptativas, que porta receptores que reconocen lo propio y lo propio “faltante” sobre superficies celulares. Se ha identificado un tercer tipo de linfocito citolítico con características compartidas tanto por el ctl como por la célula nk. Este tipo de célula, designado la célula nkt para reflejar su cualidad híbrida, se desarrolla en el timo y, estrictamente hablando, es un miembro del sistema inmunitario adaptativo. Pasa por reordenamientos de gen que codifica para receptor de antígeno, y expresa un complejo de tcr sobre su superficie. Empero, también muestra características de células en el sistema inmunitario innato:
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El receptor de célula T sobre la célula nkt de humano es invariante; las cadenas TCRα y TCRβ son codificadas por segmentos de gen específicos (Vα24-Jα18 y Vβ11, respectivamente) dentro del dna de la línea germinal; por ende, las células que expresan esta combinación de tcr αβ a veces se denominan células nkt invariantes (iNKT).
El tcr sobre células nkt no reconoce péptidos unidos a mhc, sino más bien un glucolípido presentado por la molécula CD1d no polimorfa (figura 13-16).
Las células nkt pueden actuar como células auxiliares (al secretar citocinas que conforman respuestas) y como células citotóxicas (al matar células blanco).
Las células nkt comprenden subpoblaciones tanto CD4+ como CD4–, que también pueden diferir por la producción de citocina.
La muerte por células nkt parece depender de modo predominante de interacciones FasL-Fas.
Las células nkt no forman células de memoria.
Las células nkt no expresan varios de los marcadores característicos de los linfocitos T, sino que expresan múltiples proteínas características de células nk.
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Queda por definir el papel exacto de las células nkt en la inmunidad. Con todo, diversos experimentos muestran que los ratones que carecen de células nkt montan una respuesta deficiente a ciertas infecciones en dosis bajas por bacterias que expresan glucolípidos que pueden ser reconocidos por receptores de célula nkt (p. ej., Sphingomonas y Ehrlichia). Despierta interés que la infección por Sphingomonas en dosis altas lleva a sepsis y muerte en ratones naturales, pero los que carecen de células nkt sobreviven a esta exposición, lo que sugiere que las células nkt también contribuyen a enfermedad al secretar en exceso citocinas inflamatorias. (En el capítulo 15 se describe la función de las citocinas proinflamatorias en el inicio de sepsis y la exacerbación de enfermedad.)
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Otros datos implican a las células nkt en la inmunidad a tumores, y sugieren que las células nkt reconocen antígenos lipídicos específicos para células tumorales. Por último, las células nkt también parecen contribuir a la inmunidad viral, pese al hecho de que los virus típicamente no expresan glucolípidos. Quizá desempeñen una función indirecta en la conformación de las respuestas inmunitarias a virus por medio de la producción de citocinas, incluso IFN-γ, IL-2, TNF-α e IL-4.