La citometría de flujo es el sine qua non (“sin el cual nada hay”) de la caja de herramientas del inmunólogo moderno. Fue desarrollada por Leonore Herzenberg y Leonard Herzenberg y colegas, y encontró algunas de sus aplicaciones más tempranas en el análisis de células provenientes de la sangre, entre las que destacan subpoblaciones de linfocitos. La citometría de flujo en sí es una técnica analítica que cuantifica las frecuencias de unión de células a anticuerpos fluorescentes y que dispersan luz de maneras características (véase más adelante). Cuando un citómetro de flujo es adaptado para clasificar poblaciones celulares con base en la fluorescencia y la dispersión de luz, se denomina clasificador (sorter) de células activadas por fluorescencia (facs). Las tecnologías de anticuerpos monoclonales y facs se desarrollaron aproximadamente al mismo tiempo, y los dos importantes avances tecnológicos resultaron ser sinérgicos: cuantos más anticuerpos estuvieron disponibles para tipificación y clasificación de células, más informativos se hicieron los experimentos de citometría de flujo.
Las aplicaciones de microscopia fluorescente descritas hasta ahora son instrumentos cualitativos en extremo valiosos, pero no proporcionan datos cuantitativos respecto a las frecuencias de células dentro de una población que se tiñe con anticuerpos específicos y que, por ende, pertenece a subpoblaciones experimentalmente definibles. Este defecto se abordó mediante la invención del citómetro de flujo, que se diseñó para automatizar el análisis y la separación de células teñidas con distintos anticuerpos fluorescentes.
En el citómetro de flujo se utilizan un haz láser y una serie de detectores para identificar tanto luz dispersa como señales fluorescentes de longitudes de onda particulares provenientes de células intactas únicas que fluyen en un chorro enfocado más allá del láser (figura 20-19a). Las células en suspensión son enfocadas de manera hidrodinámica hacia un chorro estrecho al ser introducidas dentro de una columna de líquido vaina que se mueve con rapidez. Cada vez que una célula pasa enfrente del haz láser, se dispersa luz, y se registra esta interrupción de la señal láser.
Un detector, llamado un fotodiodo, capta luz dispersa en la dirección frontal (esto es, dentro de algunos grados de la vía original del haz láser). La dispersión alta de luz hacia adelante (dentro de 5 a 10° de la trayectoria de la luz del haz láser) proporciona una indicación de que las células de las cuales depende esta dispersión de luz son grandes. Mientras mayor es la dispersión de luz hacia adelante, más grande es la célula; así, la cantidad de luz dispersa en la dirección frontal puede usarse como una medida aproximada del rango de tamaños de las células en el chorro. Un segundo detector de dispersión de luz se coloca a aproximadamente 90° respecto a la trayectoria del haz láser. La cantidad de luz dispersa en dirección lateral ofrece una indicación de la extensión de la complejidad intracelular de las células que producen dispersión. Cuanto mayor es el ángulo lateral de dispersión de luz, más estructuras membranosas intracelulares, como retículo endoplasmático (er) y mitocondrias, están presentes en la célula que produce dispersión. Dado que los detectores de dispersión de ángulo lateral detectan mucho menos luz que el detector de fotodiodo de dispersión hacia adelante, la luz dispersa lateralmente se mide mediante tubos fotomultiplicadores sensibles.
Anticuerpos marcados con fluorescencia unidos a los antígenos de superficie de células particulares pueden ser excitados por el láser. Después de la excitación, emiten luz que es registrada por una serie de tubos fotomultiplicadores ubicados a un ángulo recto respecto al haz láser. Cada detector de fluorescencia con tubo fotomultiplicador es colocado detrás de una serie de filtros y espejos dicroicos, de modo que sólo recibe y detecta luz dentro de un rango particular de longitudes de onda. Los citómetros de flujo cuentan cada célula conforme pasa por el haz láser y registran la magnitud de la fluorescencia emitida a diversas longitudes de onda, así como las cantidades de luz dispersa en dirección frontal y lateral para cada célula; una computadora adosada almacena todos los datos para cada célula, a los cuales puede recurrir el software de análisis según sea necesario. Esta tecnología está avanzando con mucha rapidez, y citómetros de flujo capaces de detectar 8 a 12 parámetros de fluorescencia y de dispersión de luz se utilizan de manera sistemática en laboratorios clínicos y de investigación.
A la izquierda de la figura 20-19b se muestra un ejemplo de un gráfico de dispersión hacia adelante y lateral típico de leucocitos de ser humano. A la derecha de la figura 20-19b se presenta un gráfico de la intensidad de fluorescencia de células derivadas de la región que se muestra separada en rojo en el gráfico de dispersión, que representa células pequeñas que generan dispersión baja de luz, o linfocitos. Estas células han sido teñidas con un anticuerpo conjugado con fluoresceína contra CD8; por ende, las células T que portan CD8 emitirán fluorescencia en la parte verde del espectro. La fluorescencia verde es detectada en el canal FL1, o canal verde, del detector. De modo similar, las células T CD4+ se han teñido con un anticuerpo conjugado con un fluorocromo (p. ej., f icoeritrina [phycoerythrin], o pe) que es detectado en el canal FL2, o canal rojo. Por consiguiente, este gráfico muestra que, de las células que caen en la separación de linfocitos, 44% fueron células que portaban CD4 y que se teñían de rojo, y 23% fueron células que portaban CD8 y que se teñían de verde. En el recuadro 20-1, Avances, se presenta una exposición más matizada de cómo funciona un citómetro de flujo.
RECUADRO 20-1
AVANCES: Descripción detallada de la citometría de flujo
¿De qué modo el citómetro de flujo en realidad mide fluorescencia y qué datos proporcionan los histogramas, gráficos de puntos y gráficos de contorno?
El citómetro de flujo es un instrumento simple desde el punto de vista conceptual. Incluye un sistema de fluídica que envía células en fila india enfrente de una o más fuentes de luz láser que pueden excitar fluorocromos. La luz reflejada o emitida desde la célula a continuación es guiada por una red de espejos y filtros hacia detectores de luz (fotón), que registran la señal.
Los filtros usados para clasificar y guiar la luz que proviene de una célula caen en varias categorías amplias. Los filtros de pase de banda (bp) sólo permiten el paso de luz dentro de un cierto rango de longitudes de onda. Por ejemplo, un filtro bp podría sólo permitir el paso de longitudes de onda de 520 a 550 nm. Los filtros bp se describen de manera sistemática mediante un par de números, el primero de los cuales denota la longitud de onda central del filtro bp, en tanto que el segundo muestra el rango de longitudes de onda a ambos lados de esa longitud de onda central que se permitirá que pasen por el filtro (p. ej., 530/30). Los filtros de paso largo (long pass) (lp) permiten el paso de cualquier luz de longitudes de onda más largas que la especificación del filtro, pero reflejan (o detienen) luz de longitudes de onda más cortas. Un filtro lp 640, por ejemplo, permitiría el paso de cualesquier longitudes de onda de más de 640 nm, pero reflejaría luz de longitudes de onda más cortas que 640 nm. Los filtros de paso corto (short pass) (sp) operan de una manera opuesta, al permitir el paso de longitudes de onda más bajas que la especificación del filtro, pero reflejar longitudes de onda más altas. Los espejos dicroicos son muy útiles; reflejan luz de longitudes de onda específicas, lo cual permite que toda la otra luz pase, y puede también hacerse referencia a ellos como sp o lp, dependiendo de sus características. En el ejemplo que se muestra en la figura 1, el espejo dicroico está permitiendo que cualquier luz de longitudes de onda de más de 500 nm pase a través en la dirección de la luz incidente, pero está reflejando luz de longitudes de onda de menos de 500 nm en una dirección perpendicular a la luz incidente. Los espejos dicroicos a menudo se colocan a un ángulo de 45° y dividen la luz que llega a ellos de esta manera, de modo que puede dirigirse a diferentes detectores de fotón.
Dado que la mayor parte de la luz detectada por un citómetro de flujo es dispersa hacia adelante en la dirección del haz láser incidente, esta luz es captada y detectada por un fotodiodo. Los fotodiodos no son en particular sensibles y, por ende, se usan para detectar esta luz dispersa (scattered) hacia adelante (forward) (fsc). En contraste, casi todos los detectores de luz en citómetros de flujo son los detectores más sensibles llamados tubos fotomultiplicadores (photomultiplier) (pmt). En los términos más simplistas, estos detectores convierten energía de fotón en energía eléctrica. De manera más específica, aprovechan el efecto fotoeléctrico y registran (y amplifican) electrones que son liberados cuando los fotones son absorbidos. Cada célula que pasa enfrente de un láser genera un pulso de electrones dentro de pmt que reciben señales de luz. El pulso de electrones registrado durante el tiempo que tarda la célula en pasar a través del láser se llama un pulso de voltaje. Cada pulso tiene una altura (height) (H), ancho (width) (W) y área (A), que se miden, digitalizan y grafican en los gráficos que se han llegado a asociar con datos de citometría de flujo. En la figura 2 se ilustra la naturaleza del pulso generado conforme una célula pasa verticalmente hacia arriba a través del haz láser.
Para entender mejor la información obtenida a partir de un pulso de voltaje, considérese el sistema de citómetro de flujo simple representado en la figura 3. En esta preparación, un láser genera luz azul (488 nm), y cuatro pmt posicionados detrás de diferentes juegos de filtros y espejos sólo permiten que pase luz de longitudes de onda específicas.
Ahora considere un grupo de linfocitos de un ratón que han sido teñidos con anticuerpos fluorescentes verdes específicos para CD4 (p. ej., isotiocianato de fluoresceína, o fitc anti-CD4) y anticuerpos fluorescentes rojos específicos para CD8 (p. ej., ficoeritrina [phycoerythrin], o pe anti-CD8). Son pasados, en fila india, enfrente del láser azul que es enfocado sobre la cámara de flujo, que se muestra en púrpura en la figura 3.
Una célula T CD4+ pasa primero. Es probable que algo de luz de 488 nm no fluorescente proveniente del láser sea reflejada hacia el lado, quizá por el material nuclear, las mitocondrias o los gránulos. Esta luz dispersa (scattered) en dirección lateral (side) (ssc) pasará por el primer espejo dicroico, que permite el paso de luz de longitudes de onda más cortas que 560 nm. Un divisor de haz a continuación envía parte de esta luz de longitud de onda relativamente baja al pmt ssc por medio de un filtro bp que está ajustado para permitir el paso de luz de la misma longitud de onda que el láser iluminador original. Ese filtro bp está marcado 488/10 en el Recuadro 20-1, figura 3. Se generará un pulso de voltaje en el pmt ssc conforme la célula pasa. El software del citómetro registrará la magnitud del pulso de voltaje, y la almacenará.
De modo similar, la luz dispersa en una dirección frontal será detectada por el fotodiodo colocado para detectar luz dispersa dentro de cinco a 10 grados de la dirección del láser, y la magnitud de la señal dispersa hacia adelante también se registrará y almacenará. No mostrado en el Recuadro 20-1, la figura 3 es un bloque de filtro que es colocado en la trayectoria del haz láser que evita que cualquier luz directa proveniente del láser incida sobre el fotodiodo fsc. Casi todas las aplicaciones de citometría de flujo requerirán un gráfico o “gráfico de puntos” de dispersión frontal en contraposición con dispersión lateral de la población de células bajo estudio. (En la figura 20-19 se presenta un ejemplo de un gráfico de fsc en contraposición con ssc de una población de células sanguíneas humanas.) Cada uno de estos gráficos representa un “evento” único, que por lo general implica una sola célula pasando enfrente del haz láser.
Recuerde que la célula que ha dispersado esta luz es una célula que porta CD4. Dado que esta célula CD4+ está unida por anticuerpos marcados con fitc que serán activados por el láser de 488 nm, también emitirán luz verde con una longitud de onda máxima de aproximadamente 525 a 530 nm. Esta luz verde, que es emitida en todas direcciones, se permitirá que pase a través del primer espejo dicroico y después a través del filtro bp enfrente del pmt verde, lo que genera otro pulso de voltaje en el pmt verde. La forma de este pulso estará determinada por la forma de la estructura que está emitiendo la fluorescencia. Por ejemplo, un fluorocromo que sólo marca los núcleos generará un pulso de voltaje más estrecho que un fluorocromo que tiñe toda la célula (figura 4; compárense las células b con las células a). Las señales registradas a partir de este pmt verde se denominan como emanadas del canal FL1 (figura 3). El software del instrumento integrará la información proporcionada para cada célula conforme pasa por el haz láser, de modo que toda la información referente a la fluorescencia detectada y las propiedades de dispersión de luz se atribuyan a la célula correcta.
Cuando una célula T CD8+ marcada con pe anti-CD8 pasa enfrente del láser, la luz dispersa por esa célula también generará un pulso de voltaje en el pmt ssc, y será detectada por el fotodiodo fsc. Además, el fluorocromo pe será excitado y emitirá luz anaranjada que será reflejada por el espejo dicroico sp de 560 nm (dado que esta longitud de onda es demasiado larga como para pasar por el filtro) y por el espejo dicroico lp de 640 nm (porque esta longitud de onda, esta vez, es demasiado corta). Estos espejos reflejan la luz anaranjada directamente a través del filtro bp de 585 nm, donde es detectada por el detector pmt anaranjado (FL2), lo que genera un pulso de voltaje (figura 3). En teoría, la célula T CD8+ no debe generar luz que lograría pasar al pmt FL1; aun así, en realidad, todas las células emiten algunos fotones de diversas longitudes de onda, y generarán pulsos de voltaje pequeños en casi todos los pmt. Esta señal inapropiada debe compensarse cuando se realizan experimentos de citometría de flujo; diferentes modelos de instrumentos efectúan esta compensación de diferentes maneras.
Por último, considere una célula T CD4+ y una célula T CD8+ que están pegadas una a otra, es decir, forman un par; cuando pasan por el láser, serán consideradas una unidad, y dispersarán luz, emitirán fluorescencia y generarán pulsos de voltaje en los tres pmt ssc, FL1 y FL2, así como en el detector fosforilado fsc. Esto podría llevar a un investigador a asumir de manera inexacta que se trata de una célula única que expresa tanto CD4 como CD8. De cualquier modo, dado que el par de células es más grande, su pulso de voltaje será más largo y su anchura será desproporcionadamente grande (figura 4; considérense las células A en contraposición con C). Afortunadamente, programas de software permiten a los investigadores eliminar del análisis células que generan un pulso de voltaje demasiado ancho.
Cada célula (o evento) que pasa por un láser genera múltiples pulsos de voltaje en cada pmt. En los citómetros de flujo más nuevos, la altura, el ancho y el área de cada pulso de voltaje serán registrados y digitalizados. En aparatos más antiguos, sólo se registraba de manera sistemática la altura. Los investigadores pueden elegir graficar cualquiera de estas medidas (p. ej., FL1-H, SSC-W, FL2-A), aunque el área (que proporciona información acerca de la luz total detectada durante el tiempo que la célula pasa) probablemente es la más informativa.
Los citómetros de flujo también pueden detectar emisiones de fluorescencia provenientes de células que han sido permeabilizadas con detergente, lo que permite que anticuerpos entren a las células y tiñan componentes intracelulares. Este método de “tinción intracelular” se utiliza, por ejemplo, cuando se analizan células respecto a su capacidad para sintetizar citocinas particulares y liberarlas, así como en análisis del ciclo celular y en la detección de actividades de enzimas para las cuales se dispone de productos fluorescentes (véase más adelante). En muchos centros médicos, el citómetro de flujo se utiliza para detectar leucemias y clasificarlas por tipo de célula, lo que a su vez influye sobre las decisiones respecto al tratamiento futuro. De igual modo, la medición rápida de subpoblaciones de células T, un importante indicador pronóstico en el sida, se efectúa de manera sistemática mediante análisis con citometría de flujo. El hiv infecta células T que portan CD4, y las destruye. Para vigilar la etapa clínica de la enfermedad, mAb marcados contra células T que portan CD4 y CD8 se utilizan para determinar sus proporciones en la sangre del paciente (figura 20-19b). Cuando el número de células T CD4 cae por debajo de una cierta cifra, el paciente tiene riesgo alto de infecciones oportunistas.