Capítulo 20: Sistemas y métodos experimentales

Ya han quedado atrás los días en que un capítulo de métodos experimentales en un libro de inmunología podía describir perfectamente todas las técnicas usadas por los practicantes de la materia. Los inmunólogos usan herramientas derivadas de los arsenales de biólogos estructurales, bioquímicos, biólogos celulares, anatomistas, microbiólogos y fisiólogos. A cambio, la ciencia de la inmunología ha donado a las ciencias biológicas una amplia caja de herramientas de técnicas basadas en anticuerpos y en fluorescencia.

En este capítulo se ha intentado proporcionar a los estudiantes la capacidad para entender las elecciones metodológicas hechas por inmunólogos profesionales. Los autores esperan que los estudiantes aprendan de él algunas de las ventajas y limitaciones de muchas de las técnicas que encontrarán conforme lean la literatura inmunológica. En segundo lugar, los autores han tratado de proporcionar a los estudiantes las herramientas para entender el contexto en el cual son aplicables métodos o técnicas particulares, conforme diseñan sus propios experimentos originales. La ausencia de temor al seguir las preguntas interesantes a dondequiera que lleven es uno de los atributos de los grandes científicos y en este capítulo se ofrece a los estudiantes un poco de información acerca de la amplia gama de posibilidades técnicas disponibles para ellos conforme traten de responder sus propias preguntas. Se han incluido algunas técnicas clásicas, a fin de apoyar a quienes leen la literatura pretérita del campo, pero también se ha intentado añadir algunos de los métodos desarrollados en fecha más reciente. El presente capítulo está diseñado para proporcionar información acerca de los aspectos técnicos de experimentos específicos descritos en capítulos previos que hicieron avanzar el área.

El espacio disponible no permite una descripción detallada de todas las técnicas, y este capítulo está diseñado para proporcionar un sentido general de la aplicabilidad de diferentes métodos inmunológicos, más que protocolos específicos para seguirlos. Los estudiantes que deseen profundizar más en los detalles de cualquier método particular pueden localizar protocolos específicos en diversas fuentes, algunas de las cuales se señalan en la sección de “Sitios web útiles” al final del capítulo. En aras de la concisión, los autores han optado por no describir métodos derivados de biología molecular o bioquímica, porque creen que la mayoría de los estudiantes de inmunología ya han estado expuestos a ellos, y que son mejor manejados en los textos relevantes.

Se empieza por enumerar las metodologías que se usan para generar anticuerpos, y después se describen algunas de las muchas maneras en las cuales pueden analizarse las interacciones entre anticuerpos y antígenos. A continuación se describen brevemente algunos de los métodos que se usan para visualizar estructuras celulares y subcelulares en el sistema inmunitario, antes de pasar a una exposición de las diversas técnicas basadas en magnetismo y fluorescencia que se usan para separar células y para el análisis celular en el ámbito de población. Posteriormente se abordan los ensayos que analizan el ciclo celular y miden la muerte celular, y se completa el capítulo con una descripción breve de varios sistemas experimentales en animales enteros usados comúnmente.

Desde los primeros días de la inmunología, investigadores y clínicos han hecho uso de la capacidad de los animales para mostrar respuesta a inmunización con la producción de anticuerpos dirigidos hacia antígenos inyectados, como virus, bacterias, hongos o sustancias químicas simples del anaquel de laboratorio. Los anticuerpos recolectados a partir del suero de animales inmunizados son los productos secretados de muchas clonas de células B y, así, se denominan anticuerpos policlonales. Con inmunizaciones subsiguientes usando el mismo antígeno, aumenta la afinidad promedio de esta mezcla de anticuerpos policlonales para el antígeno, como resultado del proceso de maduración de afinidad (capítulo 12).

Los anticuerpos policlonales son secretados por múltiples clonas de células B específicas para antígeno

Los anticuerpos policlonales son generados al inmunizar a un animal de experimentación o un ser humano con antígeno una o más veces, extraer sangre del sujeto, y purificar los anticuerpos a partir del suero del sujeto. El suero es lo que queda cuando se han eliminado tanto los componentes celulares como los factores de la coagulación de la sangre del sujeto. La adición de adyuvantes a la preparación inmunizante desencadena una respuesta inmunitaria más fuerte al activar deliberadamente el sistema inmunitario innato para ayudar en la activación de células B y T específicas para antígeno. En algunos métodos actuales para la generación de anticuerpos se emplean agonistas de receptor Toll, como poli I:C, una preparación de ácido nucleico artificial, como un adyuvante y, de hecho, este método se está siguiendo de manera activa en la investigación acerca de la inmunoterapia del cáncer. Tradicionalmente, el adyuvante completo de Freund (o alumbre) se usó para maximizar las respuestas de anticuerpos de ratones a antígenos que se mezclaban con los adyuvantes antes de inyección.

Dado que los anticuerpos policlonales son una mezcla de anticuerpos dirigidos hacia diversos epítopos diferentes del antígeno inmunizante, son en particular útiles para técnicas como aglutinación o inmunoprecipitación, que se fundamentan en la capacidad del anticuerpo para formar un complejo de antígeno-anticuerpo grande. La desventaja de usar una preparación policlonal es que algunos de los anticuerpos en la mezcla pueden tener reactividades cruzadas poco definidas con antígenos relacionados. Más aún, dado que la respuesta de anticuerpos madura con el tiempo después de la inmunización (capítulo 12), el rango de reactividades cruzadas de diferentes preparaciones de anticuerpos policlonales puede variar entre diferentes sangrías, aun cuando se deriven del mismo animal donante.

Un anticuerpo monoclonal es el producto de una célula B estimulada única

Las desventajas de reactividades cruzadas o variaciones imprevistas en la especificidad fina de anticuerpos monoclonales se eliminan cuando se usan anticuerpos monoclonales (mAb), que son el producto de una célula B estimulada única. En 1975, Georges Köhler y Cesar Milstein resolvieron cómo generar grandes cantidades de anticuerpos derivados de una clona de células B única (figura 20-1). Al fusionar una célula B productora de anticuerpos, activada, normal, con una célula de mieloma (una célula plasmática cancerosa), lograron generar un hibridoma que poseyó las propiedades de crecimiento inmortales del progenitor de la célula de mieloma y que secretaron el anticuerpo singular producido por la célula B progenitora. Con el tiempo, se generaron parejas de células de mieloma que habían perdido la capacidad para sintetizar su propia inmunoglobulina, lo que aseguró así que los únicos anticuerpos secretados hacia el medio de cultivo eran los de la pareja de fusión de célula B.

En las fusiones originales se usaron virus Sendai para alterar la membrana plasmática de las células; en la actualidad, en lugar de eso se utilizan fusógenos químicos, como el polietilén glicol. En general, las fusiones entre tres o más células son inestables, y casi todas las células fusionadas que crecen a partir de estos cultivos son los productos de la hibridación de dos células progenitoras.

Los híbridos formados por la fusión de dos células B productoras de anticuerpos no crecerán a partir de estos cultivos porque las células B tienen una vida media relativamente breve in vitro. Sin embargo, los híbridos formados por la fusión de dos o más células cancerosas tendrían el potencial de crecer a partir de las fusiones iniciales, y competir exitosamente por nutrientes con los híbridos de mieloma de célula B. Por ende, tuvo que idearse un método para eliminar estos híbridos de tumor-tumor de los cultivos de células fusionadas. Köhler y Milstein resolvieron este problema al usar células de mieloma que carecían de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil (phosphoribosyl) transferasa (hgprt). La hgprt es necesaria para una de las dos vías potenciales de síntesis de dna, la vía de salvamento. La vía alternativa de síntesis de dna, la vía de novo, puede inhibirse mediante el antibiótico aminopterina. Köhler y Milstein razonaron que si hacían crecer los cultivos híbridos en presencia de aminopterina, las células tumorales mutantes y los híbridos de tumor-tumor serían incapaces de sintetizar dna nuevo por medio de la vía de salvamento o la vía de novo y finalmente morirían. Empero, en los hibridomas formados por fusión entre células B y células tumorales, la célula B progenitora proporcionaría la hgprt y, así, estos híbridos sobrevivirían en el medio de selección. Dado que el medio que contiene aminopterina normalmente se complementa con hipoxantina y timidina para apoyar la síntesis de nucleótido, el medio selectivo se conoce como “medio hat”.

Las clonas resultantes de células de hibridoma pierden cromosomas al azar durante los primeros días después de la fusión, pero finalmente se estabilizan y pueden cultivarse indefinidamente, y secretan grandes cantidades de mAb de especificidad predefinida y reactividad cruzada conocida. La importancia de los hibridomas para las ciencias biológicas se reconoció cuando se otorgó a Köhler y Milstein el Premio Nobel en Fisiología o Medicina en 1984.

La especificidad, afinidad y reactividad cruzada precisas de los mAb son por completo estables con el tiempo, y son en particular útiles para propósitos diagnósticos. Con todo, los mAb son menos útiles que las preparaciones policlonales en aplicaciones que requieren aglutinación, porque cada anticuerpo en el experimento tiene el sitio de unión idéntico y, así, menos anticuerpos se unirán por cada molécula de antígeno.

Los anticuerpos monoclonales pueden modificarse para uso en el laboratorio o la clínica

Los anticuerpos monoclonales proporcionan un sitio de unión reproducible que fijará el anticuerpo a su célula o molécula blanco; así, no sorprende que el rango de aplicaciones para los mAb sólo sea limitado por la imaginación de los investigadores.

Un mAb puede modificarse genéticamente de modo que sólo se retiene el sitio de unión, y el resto de la molécula es reemplazada por otra molécula. Por ejemplo, dado que la inyección de grandes cantidades de anticuerpos xenogénicos puede inducir inflamación, los hibridomas que secretan mAb para uso en inmunoterapia en la clínica a menudo se sujetan a manipulaciones genéticas, de modo que los sitios de unión del mAb de ratón original se corten y se peguen en las regiones Fc de anticuerpos de ser humano. Además, algunos anticuerpos se modifican mediante conjugación con toxinas diseñadas para matar células a las cuales el anticuerpo se unirá. Muchos de esos anticuerpos quiméricos y conjugados con toxina ahora se encuentran en uso clínico regular.

Muchísimos anticuerpos están disponibles en formas conjugadas (fijadas de manera covalente), en las cuales otras moléculas están unidas a regiones del anticuerpo de maneras que no interfieren con su capacidad de unión a antígeno, pero que permiten el uso de dicha capacidad del anticuerpo en diferentes tipos de aplicaciones. Por ejemplo, algunos anticuerpos son modificados por medio de la fijación de biotina o enzimas, y se utilizan en ensayos elisa (véase más adelante). Otros son modificados por medio de conjugación con colorantes fluorescentes (o, de nuevo, biotina) para uso en aplicaciones inmunofluorescentes como microscopia o citometría de flujo. Aun otros son fijados por medio de sus regiones constantes a diversos tipos de cuentas sintéticas o partículas que permiten su uso en inmunoprecipitación, separación magnética de células, o experimentos de microscopia electrónica. Cada una de estas aplicaciones diferentes se comenta a continuación.

Un uso nuevo de los mAb ha sido la generación de anticuerpos que se unen de manera específica y estabilizan el estado de transición de una reacción química, lo que imita de manera directa la actividad de enzimas. Esos anticuerpos con actividades tipo enzima se denominan abzimas.

Una vez que la técnica de hibridoma se había establecido para linfocitos B, los inmunólogos reconocieron su utilidad potencial para la biología de células T y desde entonces se han generado muchos hibridomas de células T a largo plazo con especificidad definida. En el capítulo 3 se mencionó cómo un hibridoma de ese tipo se usó para caracterizar los aspectos bioquímicos del αβTCR. Otras líneas de hibridoma de células T han sido inestimables en la caracterización de las condiciones bajo las cuales diferentes citocinas son secretadas y la naturaleza de subpoblaciones de células T. Aun así, los híbridos de células T no han sido tan útiles como sus homólogos de células B en términos de proporcionar reactivos terapéuticos, diagnósticos y de laboratorio general, porque no secretan una molécula receptora soluble, y su especificidad de unión requiere un péptido basado en mhc.

La multivalencia de anticuerpos ha permitido el desarrollo de técnicas en las cuales moléculas unidas a anticuerpo pueden ser precipitadas desde solución, o por lo demás separadas de moléculas no unidas para análisis adicional. Algunas de estas técnicas son bastante venerables; otras aplicaciones son nuevas. Aun así, todas se fundamentan en la capacidad de los anticuerpos para unirse a más de un determinante antigénico sobre un antígeno único, lo que forma un complejo grande que se separará de la solución.

La inmunoprecipitación puede realizarse en solución

Cuando anticuerpos y antígeno soluble se mezclan en solución, la naturaleza bivalente o multivalente de las inmunoglobulinas permite que una molécula de anticuerpo única se una a más de un antígeno (figura 20-2). Si el antígeno es polivalente (tiene más de un sitio de unión a anticuerpo por cada molécula de antígeno), puede unir a su vez múltiples anticuerpos diferentes. Finalmente, el complejo unido con enlaces covalentes resultante se hace tan grande que se separa de la solución como un precipitado. Este precipitado puede centrifugarse para extraerlo de la solución, y separar el antígeno de los anticuerpos precipitantes por medios bioquímicos.

La inmunoprecipitación en solución puede usarse para purificar moléculas antigénicas a partir de una mezcla heterogénea de moléculas solubles, o para eliminar antígenos particulares de una solución. La inmunoprecipitación sólo ocurre cuando las concentraciones de anticuerpo y antígeno son en esencia equivalentes (figura 20-2, panel central). En exceso de antígeno (figura 20-2, panel izquierdo) o de anticuerpo (figura 20-2, panel derecho), se favorece la unión monovalente que no da lugar a la formación de un precipitado. Recuérdese que Kabat usó inmunoprecipitación con el antígeno de ovoalbúmina para eliminar anticuerpos anti-ovoalbúmina de la solución, seguido por electroforesis (capítulo 3); este experimento caracterizó a los anticuerpos como pertenecientes a la clase de globulina γ de proteínas séricas.

La inmunoprecipitación de antígenos solubles puede efectuarse en matrices de gel

Los precipitados inmunes pueden formarse no sólo en solución, sino también en una matriz de agar. Cuando el antígeno y el anticuerpo se difunden uno hacia otro en una matriz de gel, se formará una línea de precipitación visible. Al igual que en una reacción de precipitación en solución, ocurre precipitación visible cuando las concentraciones de anticuerpo y antígeno son equivalentes una a otra.

La inmunodifusión en gel es rápida, fácil de realizar y sorprendentemente exacta. En el método de Ouchterlony, la variación de la inmunoprecipitación en gel más a menudo utilizada; tanto el antígeno como el anticuerpo se difunden en dirección radial desde pozos uno hacia otro, lo que establece un gradiente de concentración. A las concentraciones de anticuerpo-antígeno relativas a las cuales se maximiza la formación de enrejado, llamadas “equivalencia”, se forma en el gel una línea de precipitación visible, o “línea de precipitina”. Los análisis más sofisticados de geles de Ouchterlony pueden ofrecer información respecto a la magnitud de la reactividad cruzada de preparaciones de anticuerpos con antígenos relacionados (figura 20-3).

Si bien diversas modificaciones de reacciones de precipitación alguna vez fueron los principales tipos de ensayos usados en inmunología, ahora se dispone de otros métodos más sensibles para la medición de antígeno y anticuerpo, y se describen a continuación. De cualquier modo, los ensayos de Ouchterlony en ocasiones todavía se utilizan en la clínica. El cuadro 20-1 presenta una comparación de la sensibilidad —o cantidad mínima de anticuerpo detectable— de varios inmunoensayos.

La inmunoprecipitación permite la caracterización de moléculas unidas a células

Una variante de la inmunoprecipitación a menudo se usa para aislar antígenos proteínicos a partir de muestras de células y de tejido. Un extracto de células o tejidos con detergente se mezcla con anticuerpos contra la proteína de interés para formar un complejo de antígeno-anticuerpo. A fin de facilitar la recuperación eficiente de este complejo, ahora puede añadirse un anticuerpo secundario, u otra proteína como las proteínas A o G bacterianas. Todos estos reactivos secundarios se unen de manera específica a la región Fc del primer anticuerpo, y en circunstancias normales están fijos de antemano a un soporte de fase sólida, como una cuenta sintética. Dado que las cuentas se pueden separar fácilmente en una centrífuga, el complejo de anticuerpo-antígeno-cuenta puede recolectarse por medio de centrifugación. Después de centrifugación, la proteína de interés puede separarse de los anticuerpos precipitantes por medio de electroforesis en gel de sds. En una variante de esta técnica, las cuentas fijas a los reactivos secundarios pueden ser magnéticas, en cuyo caso la proteína de interés se purifica por medio de paso sobre una columna magnética (véase más adelante).

A continuación puede usarse inmunoelectrotransferencia Western (véase más adelante) para verificar la eficacia de la inmunoprecipitación, para estimar la abundancia relativa de la proteína unida en la muestra de tejido, y para determinar cuáles otras proteínas se coinmunoprecipitaron y, por ende, es más probable que estén asociadas con la proteína blanco en su ubicación celular. Esos estudios de coinmunoprecipitación fueron el primer indicio respecto a las naturalezas multimoleculares de los complejos de correceptor de tcr y bcr.

La formación de enlaces covalentes que ocurre entre anticuerpos divalentes o multivalentes y antígenos multivalentes, bacterianos u otros antígenos celulares, puede dar lugar a agrupación visible de los complejos formados entre células que portan los antígenos, y las moléculas de anticuerpo. Esta reacción de agrupación se conoce como aglutinación y los anticuerpos que producen ese tipo de reacciones reciben el nombre de aglutininas. Las reacciones de aglutinación son idénticas en principio a las reacciones de precipitación; la única diferencia es que el producto unido con enlaces covalentes es visible a simple vista debido al tamaño más grande de los antígenos.

Las reacciones de hemaglutinación pueden usarse para detectar cualquier antígeno conjugado a la superficie de eritrocitos

Cuando anticuerpos se unen a antígenos sobre la superficie de eritrocitos, la reacción de agrupación resultante se denomina hemaglutinación. En el ejemplo que se muestra en la figura 20-4, se añadió amortiguador control al pozo 10 de la charola de microtítulo. Se añadieron anticuerpos contra eritrocitos de oveja (sheep red blood cells) (srbc) al pozo 1 en esta charola, y a continuación este antisuero se diluyó de manera seriada hacia los pozos 2 a 9, de modo que la concentración de anticuerpos contra los srbc en el pozo 2 fue la mitad que en el pozo 1, y así sucesivamente. A continuación se añadió el mismo número de srbc a cada pozo.

En el pozo 10, en ausencia de anticuerpos aglutinantes, los srbc se asientan en un botón apretado en el fondo del pozo; este botón apretado representa un resultado negativo en un ensayo de hemaglutinación. En el pozo 1, la concentración alta de anticuerpos anti-srbc indujo formación de enlaces covalentes de los srbc, de modo que forman una agrupación grande y no se precipitan al fondo del pozo. El sombreado difuso de eritrocitos que se observa en el pozo 1 representa una interacción positiva entre los anticuerpos y el antígeno de superficie del srbc. La concentración de anticuerpos anti-srbc en los pozos 2 y 3 permanece suficientemente alta como para permitir hemaglutinación, pero una vez que los anticuerpos se han diluido ocho veces (pozo 4), hay muy pocos anticuerpos como para generar la formación de enlaces covalentes, y los srbc de nuevo se pueden asentar en el fondo del pozo. Por ende, las respuestas en los pozos 1, 2 y 3 representan una reacción de hemaglutinación positiva.

Las reacciones de hemaglutinación se efectúan de manera sistemática para tipificar eritrocitos. Con decenas de millones de tipificaciones de sangre realizadas cada año, éste es uno de los inmunoensayos más frecuentemente usados en el mundo. En la tipificación para los antígenos abo de ser humano, se mezclan eritrocitos de ser humano con antisueros contra los antígenos de grupo sanguíneo A o B. Si el antígeno está presente sobre las células, se aglutinan, lo que forma una agrupación visible en la laminilla.

La facilidad con que se realizan las reacciones de hemaglutinación, y la sensibilidad de las mismas, así como el hecho de que no requieren instrumentación sensible para el análisis de datos, significan que los ensayos de hemaglutinación pueden adaptarse para medir anticuerpos dirigidos contra cualquier antígeno que pueda haberse fijado a la superficie del eritrocito.

Las reacciones de inhibición de la hemaglutinación se usan para detectar la presencia de virus y de anticuerpos antivirales

Las reacciones de inhibición de hemaglutinación también son recursos útiles en clínica y en el laboratorio para la detección de virus y de anticuerpos antivirales. Algunos virus (entre los que destaca el de la gripe) portan proteínas o glucoproteínas multivalentes sobre su superficie, que interactúan con macromoléculas sobre la superficie del eritrocito, e inducen aglutinación de este último. Por ejemplo, la envoltura del virus de la gripe porta una glucoproteína trimérica, la hemaglutinina (ha). Esta molécula de ha está sujeta a mutación y selección, de modo que diferentes cepas de virus de la gripe portan distintos tipos de ha, que a su vez son unidos por diferentes anticuerpos. No obstante, todas las moléculas de ha se unen de una manera multivalente a los residuos de ácido siálico sobre eritrocitos y los aglutinan.

A fin de determinar si un paciente tiene anticuerpos contra una cepa particular de virus de la gripe, un técnico efectuaría una dilución seriada del antisuero del paciente en una placa de microtitulación. El técnico a continuación agregaría el virus relevante y eritrocitos a cada pozo, a concentraciones que se sabe que inducen hemaglutinación. Si el antisuero del paciente tiene anticuerpos anti-ha que se unen a la cepa de virus de la gripe particular que se está probando, los anticuerpos se unirán a las moléculas de ha sobre la superficie del virus y evitarán que esas moléculas induzcan hemaglutinación. Por ende, la reacción de hemaglutinación será inhibida a varias concentraciones de anticuerpos.

La aglutinación bacteriana puede usarse para detectar anticuerpos contra bacterias

Una infección bacteriana a menudo desencadena la producción de anticuerpos antibacterianos específicos para antígenos de superficie sobre las células bacterianas; esos anticuerpos pueden detectarse mediante reacciones de aglutinación bacteriana. El principio de la aglutinación bacteriana es idéntico al que se utiliza para la hemaglutinación, pero en este caso la bolita visible está hecha de bacterias, enlazadas de manera covalente por anticuerpos antibacterianos.

Las reacciones de aglutinación también pueden proporcionar información cuantitativa acerca de la concentración de anticuerpos antibacterianos en el suero de un paciente. Los sueros de pacientes se diluyen de manera seriada, como se describió. El último pozo en el cual es visible aglutinación indica el título de aglutinina del paciente, definido como el recíproco de la dilución de suero mayor que desencadena una reacción de aglutinación positiva. El título de aglutinina de un antisuero puede usarse para diagnosticar una infección bacteriana. Los pacientes con tifoidea, por ejemplo, muestran un aumento significativo del título de aglutinación a Salmonella typhi. Las reacciones de aglutinación también proporcionan una manera de tipificar bacterias. Por ejemplo, diferentes especies de la bacteria Salmonella pueden distinguirse mediante reacciones de aglutinación con un panel de antisueros para tipificación.

Con los números crecientes de ensayos basados en anticuerpos en uso clínico, y la necesidad consiguiente de automatización para asegurar capacidad de proceso alta de pruebas diagnósticas de pacientes, muchos ensayos basados en anticuerpos ahora se fundamentan en anticuerpos o antígenos que están unidos a soportes de fase sólida, como placas de microtitulación, laminillas de microscopio o cuentas de diferentes clases.

Los radioinmunoensayos se usan para medir las concentraciones de proteínas y hormonas biológicamente importantes en líquidos corporales

Aunque muchos radioinmunoensayos (radioimmunoassays) (ria) ahora han quedado reemplazados por inmunoensayos basados en enzimas, algunas mediciones hormonales aún se realizan usando esta tecnología. Además, la importancia histórica de los ria requiere una breve introducción aquí.

En 1960, dos endocrinólogos, S. A. Berson y Rosalyn Yalow, diseñaron una técnica en extremo sensible para cuantificar la concentración de complejos de insulina/anti-insulina en pacientes diabéticos. Su técnica pronto probó su utilidad para la medición de hormonas, proteínas séricas, fármacos y vitaminas a concentraciones que fueron de órdenes de magnitud más bajos que los que previamente habían sido detectables. Su logro fue reconocido en 1977 (varios años después de la muerte de Berson), por el otorgamiento del Premio Nobel a Yalow (figura 20-5). La clave para entender la importancia de este avance tecnológico trascendental es percatarse de que, antes del desarrollo del ria, las concentraciones de muchas proteínas y hormonas biológicamente importantes en líquidos corporales eran demasiado bajas como para detectarlas mediante cualesquier métodos conocidos. Por ende, más que representar meramente una alteración de la sensibilidad de los ensayos establecidos, el ria hizo posible medir sustancias que hasta entonces habían sido indetectables por medio de cualquier metodología cuantitativa.

Desde la descripción inicial del ensayo de Yalow, se han desarrollado muchas variaciones técnicas para hacer el método más rápido y fiable. Sin embargo, todas las variaciones dependen de la disponibilidad de anticuerpo o antígeno marcado radiactivamente, y un método mediante el cual separar complejos de antígeno-anticuerpo desde reactivos no unidos. Aquí se describe uno de esos ensayos, pero hay muchas maneras de usar esta metodología para lograr el objetivo experimental deseado. Casi todos los ria aún en uso se basan en la unión de anticuerpo o antígeno a un soporte de fase sólida, como los pozos de poliestireno o cloruro de polivinilo en una placa de microtitulación. La marca radiactiva que se utiliza más comúnmente es el ¹²⁵I, que se une a residuos de tirosina expuestos sobre proteínas, con poco efecto sobre su estructura general.

El objetivo de la aplicación que se describirá es determinar la concentración de una citocina particular en la sangre de un paciente. En primer lugar, los pozos de una placa de microtitulación son cubiertos con una cantidad constante de anticuerpo específico para la citocina. La superficie del plástico se une de manera estrecha a proteínas que se pegan, de modo en esencia irreversible, a dicha superficie.

Se añade una cantidad conocida de citocina radiomarcada a un grupo de pozos control. A continuación se prepara una curva estándar de citocinas no marcadas al añadir concentraciones crecientes, conocidas, de citocina a pozos sucesivos, junto con la citocina radiomarcada. A medida que más antígeno no marcado compite con el antígeno marcado, cada vez menos citocina radiomarcada se unirá. Después de un periodo de incubación, la cantidad de material radiomarcado unido se mide al eliminar mediante lavado el material no unido y medir la radiactividad en pozos individuales. La figura 20-6 muestra un ejemplo de una curva estándar generada de esta manera.

La medición de la cantidad de citocina en las muestras experimentales se logra al tratar las muestras desconocidas exactamente de la misma manera que la curva estándar. El investigador a continuación compara la cantidad de radiactividad unida a la placa en los pozos experimentales con la señal radiactiva obtenida en los pozos de curva estándar que contienen cantidades conocidas de citocina no marcada.

Es posible medir concentraciones de antígeno o de anticuerpo usando variaciones de esta técnica básica, que es en extremo poderosa, y que tiene capacidad de sensibilidades en el rango de picogramo. Empero, la proliferación de ria se acompañó de preocupación creciente acerca de la cantidad de radiactividad generada por laboratorios de investigación y clínicos, y los riesgos asociados para el personal técnico y para el ambiente. El siguiente desarrollo en ensayos de antígeno-anticuerpo en soporte de fase sólida fue el Ensayo (Assay) Inmunosorbente Ligado a Enzima o elisa.

En los elisa se utilizan anticuerpos o antígenos unidos de manera covalente a enzimas

El principio de los elisa es similar al de los ria pero, en lugar de usar anticuerpos o antígenos conjugados con radioisótopos, usan anticuerpos o antígenos unidos de manera covalente a enzimas. Las enzimas conjugadas se seleccionan con base en su capacidad para catalizar la conversión de un sustrato en un producto coloreado, fluorescente o quimioluminiscente. Estos ensayos igualan la sensibilidad de los ria, y plantean la ventaja de ser más seguros y, a menudo, menos costosos.

Se han desarrollado diversas variaciones del elisa básico (figura 20-7). Cada tipo de elisa puede usarse de manera cualitativa para detectar la presencia de anticuerpo o antígeno. De manera alternativa, se puede preparar una curva estándar basada en concentraciones conocidas de anticuerpo o antígeno, y usarla para determinar la concentración de una muestra.

elisa indirecto

Es posible detectar anticuerpos, o determinar su concentración, con un elisa indirecto (figura 20-7a). Se añade suero o alguna otra muestra que contenga anticuerpo primario (Ab₁) a un pozo de microtitulación cubierto con antígeno, y se permite que reaccione con el antígeno fijo al pozo. Después de eliminar por lavado cualquier Ab₁ libre, el anticuerpo unido al antígeno se detecta al añadir un anticuerpo secundario conjugado con enzima (Ab₂) que se une al Ab₁. De nuevo, cualquier Ab₂ libre es eliminado por lavado, y se añade un sustrato para la enzima. Usando un lector de placa especializado, se mide la cantidad de producto de reacción coloreado, fluorescente o luminiscente que se forma, y se compara con la cantidad de producto generado cuando el mismo grupo de reacciones se efectúa usando una curva estándar de concentraciones de Ab₁ conocidas. (Un elisa directo detectaría la cantidad de antígeno sobre la placa usando anticuerpos acoplados a enzima, y rara vez se utiliza.)

Esta versión de elisa es el mejor método para detectar la presencia de anticuerpos séricos contra virus de la inmunodeficiencia humana (hiv), el agente causal del sida. En este ensayo, la envoltura y las proteínas centrales recombinantes del hiv son adsorbidas como antígenos de fase sólida a pozos de microtitulación. Los individuos infectados por hiv producirán anticuerpos séricos contra epítopos sobre estas proteínas virales. Por lo general, pueden detectarse anticuerpos séricos contra hiv por medio de elisa en el transcurso de seis semanas luego de la infección.

ELISA sándwich

Es posible detectar antígeno o medirlo mediante un elisa sándwich (figura 20-7b); en esta técnica, el anticuerpo (en lugar del antígeno) es inmovilizado en un pozo de microtitulación. Se permite que una muestra que contiene cantidades desconocidas de antígeno reaccione con el anticuerpo inmovilizado. Después de que se lava el pozo, se añade un segundo anticuerpo ligado a enzima específico para un epítopo diferente sobre el antígeno, y se permite que reaccione con el antígeno unido. Después de que cualquier segundo anticuerpo libre se elimina mediante lavado, se añade sustrato, y se mide el producto de reacción coloreado.

En una variante común de este ensayo se utiliza un segundo anticuerpo enlazado a biotina, y a continuación se añade avidina ligada a enzima en un paso adicional (véase más adelante). Los elisa sándwich han resultado en particular útiles para la medición de concentraciones de citocina soluble en sobrenadantes en cultivo de tejido, así como en suero y líquidos corporales. Nótese que, para que este ensayo funcione, los dos anticuerpos usados para las fases de inmovilización (captura) y detección de antígeno, respectivamente, deben unirse a distintos determinantes (epítopos) sobre el antígeno. Por ende, en el elisa sándwich se utiliza de manera sistemática un par de anticuerpos monoclonales específicos para regiones diferentes del antígeno.

ELISA competitivo

El elisa competitivo proporciona otra variación en extremo sensible para medir cantidades de antígeno (figura 20-7c). En esta técnica, primero se incuba anticuerpo en solución con una muestra que contiene antígeno. La mezcla de antígeno-anticuerpo a continuación se añade a un pozo de microtitulación cubierto con antígeno. Mientras más antígeno está presente en la muestra de fase de solución inicial, menos anticuerpo libre estará disponible para unirse al pozo cubierto con antígeno. Después de eliminar por lavado el anticuerpo no unido, puede añadirse un Ab₂ conjugado con enzima específico para el isotipo del Ab₁ para determinar la cantidad de Ab₁ unido al pozo. En el ensayo competitivo, cuanto más alta es la concentración de antígeno en la muestra original, más baja es la señal final, del mismo modo que en el ria específico para citocina antes descrito.

En el diseño de un elisa deben considerarse diversas opciones metodológicas

Cuando se diseña un elisa, es necesario poner atención a la concentración esperada del antígeno o anticuerpo en la solución de prueba y, por ende, a la sensibilidad requerida. El investigador también tendrá que tomar una decisión fundamentada respecto al número de duplicados requeridos, y esto determinará los límites de confianza de los resultados y afectará el costo del ensayo. Por último, deben considerarse las necesidades presentes y futuras del laboratorio para realizar múltiples elisa para diferentes antígenos o anticuerpos, porque esto determinará si el investigador adquiere reactivos que son aplicables a más de un tipo de elisa o sólo un tipo único de anticuerpo secundario. A continuación se comentan brevemente algunas de estas variables y otros factores técnicos que tienen que ser considerados por cualquier científico que esté preparando por vez primera un elisa particular.

Sistemas de enzimas disponibles para elisa

Las tres enzimas comúnmente usadas en elisa son la fosfatasa alcalina, la β-galactosidasa y la peroxidasa de rábano picante (horseradish) (hrp), cada una de las cuales puede usarse con sustratos cromogénicos (sustratos que son incoloros pero que dan lugar a un producto que absorbe luz dentro del rango visible). De estas tres, la β-galactosidasa es la que se emplea con menor frecuencia, y no se comentará más.

El sustrato más común para la fosfatasa alcalina es el p-nitrofenil (nitrophenyl) fosfato (pNPP), que es altamente soluble e incoloro. La fosfatasa alcalina divide el grupo fosfato desde este sustrato para dar p-nitrofenol, que es amarillo y absorbe luz a 460 nm. Tanto el sustrato como el producto son no tóxicos y económicos, y el sustrato puede adquirirse en forma de tabletas. Con todo, el sustrato se convertirá en producto si se deja en solución a temperatura ambiente, lo que limita un poco el rango del elisa cromogénico. Por ende, los ensayos de fosfatasa alcalina cromogénicos son en extremo útiles cuando se necesita una respuesta rápida y económica de “sí o no”, cuando las instalaciones de laboratorio son limitadas, y/o para laboratorios de enseñanza de propósitos múltiples. A últimas fechas, varias compañías han puesto a disposición kits de ensayo fluorescentes y luminiscentes para fosfatasa alcalina. La magnitud de emisión de luz de fondo más baja desde ese tipo de productos aumenta de manera notoria la sensibilidad de los ensayos, y permite que se detecten cifras de antígenos de fentogramo.

Se ha desarrollado una gama similar de sistemas de sustrato-producto para elisa basados en hrp. Dado que los sustratos fluorescentes y luminiscentes estuvieron disponibles primero para el sistema de hrp, en la actualidad hay más kits y variaciones de hrp disponibles que de fosfatasa alcalina. Las propiedades carcinogénicas de algunos sustratos y productos de hrp significan que la fosfatasa alcalina aún se usa en laboratorios de enseñanza de nivel inferior, donde manos inexpertas hacen trascendentales las preocupaciones en cuanto a seguridad.

Sustratos cromogénicos, fluorogénicos o quimioluminogénicos 

Como se indicó, los sustratos cromogénicos que dan lugar a un producto coloreado son en particular útiles para ensayos de “sí o no”, porque pueden interpretarse a simple vista. Se usan con rapidez y no requieren instrumentación costosa. Además, pueden adaptarse a aplicaciones cuantitativas mediante el uso de una curva estándar y un lector de placa espectrofotométrico. En contraste, los sustratos fluorogénicos y quimioluminogénicos ofrecen ventajas importantes en términos de sensibilidad, pero requieren equipo especializado. De hecho, algunos sistemas de ensayo basados en fluorescencia y quimioluminiscencia son capaces de detectar concentraciones attomolares de anticuerpos o antígenos. Como podría esperarse, los sustratos mismos también son un poco más caros que los que se usan en sistemas cromogénicos.

Modificaciones de elisa usando interacciones de unión de biotina-estreptavidina

El diseño original de elisa secundarios comprendió la adición de un anticuerpo primario al antígeno, seguida por un anticuerpo secundario, conjugado con enzima, específico para la región Fc del anticuerpo primario. Esto requiere que cada laboratorio adquiera un juego separado de anticuerpos conjugados con enzima específicos para cada clase de anticuerpo primario. Dado que en algunos kits de elisa se utilizan anticuerpos primarios que provienen de especies diferentes, los investigadores se percataron con rapidez de las ventajas que obtendrían si la enzima pudiera unirse al anticuerpo primario usando un método más estandarizado.

La biotina es una vitamina del complejo B hidrosoluble (figura 20-8a), que puede haber permanecido en la oscuridad química salvo por una propiedad importante: se une a la proteína bacteriana estreptavidina con una afinidad que casi no tiene igual en biología. De hecho, la K_d de la interacción de biotina-estreptavidina es del orden de 10^–14M, lo que hace de ella una de las interacciones no covalentes más fuertes que ocurren en la naturaleza. Además, esta interacción es estable bajo una amplia variedad de condiciones, incluso la presencia de solventes tanto orgánicos como inorgánicos, desnaturalizantes y detergentes, y en extremos de temperatura. La estreptavidina es una proteína tetramérica capaz de unirse con cuatro moléculas de biotina por cada molécula de estreptavidina (figura 20-8b).

Se han sintetizado muchos derivados químicos de la biotina que permiten conjugación covalente a anticuerpos, con efecto mínimo sobre la estructura del anticuerpo o de la biotina. Así, es posible usar diversos anticuerpos primarios, conjugados con biotina, con sólo un stock de estreptavidina conjugada con enzima. Los pasos basados en biotina-estreptavidina ahora son la norma en muchos ensayos inmunológicos.

Los estudiantes deben notar que una de las razones de la sensibilidad de los elisa estriba en la oportunidad de amplificación en cada paso. Cada molécula de anticuerpo primario es capaz de ser conjugada por más de una molécula de biotina y, por ende, puede unirse a más de una molécula de estreptavidina. De modo similar, cada molécula de enzima procesará múltiples sustratos hacia producto.

Los ensayos elispot miden moléculas secretadas por células individuales

Una modificación del elisa, llamado ensayo elispot, permite la determinación cuantitativa del número de células en una población que están produciendo un tipo de molécula particular. Los ensayos elispot suelen usarse para detectar y cuantificar el número de células en una población que están produciendo citocinas particulares. Representan una variación del elisa sándwich antes descrito.

En un ensayo elispot para interferón γ (ifn- γ), por ejemplo, placas de ensayo se cubren con anticuerpos anti-ifn-γ. Este anticuerpo se denomina “anticuerpo de captura” porque su papel es capturar el interferón conforme es secretado por células individuales, y antes de que haya tenido tiempo para difundirse hacia el resto del cultivo. A continuación se añade una suspensión de la población de células que se está investigando a las placas cubiertas y se incuba con cualesquier agentes estimuladores apropiados. Las células se asientan sobre la superficie de la placa y cualquier interferón que es secretado por las células estimuladas es unido por los anticuerpos de captura sobre la placa, lo cual crea un anillo de complejos de ifn-γ-anticuerpo alrededor de cada célula productora de interferón. A continuación se lava la placa para eliminar las células, y se añade, y se permite que se una, un anticuerpo enlazado a enzima, el “anticuerpo de detección”, específico para un determinante antigénico sobre ifn-γ distinto del unido por el anticuerpo de captura. Después de otro paso de lavado, se añade un sustrato de elispot. Los sustratos para ensayos elispot normalmente son incoloros pero, cuando su enzima cognada actúa sobre ellos, se precipitan fuera de la solución, y dejan una “mancha” coloreada claramente demarcada dondequiera que el anticuerpo conjugado con enzima se unió. En la figura 20-9 se muestra un ejemplo de datos generados en un ensayo elispot.

La inmunoelectrotransferencia Western permite identificar una proteína específica en una mezcla de proteínas compleja

La inmunoelectrotransferencia Western identifica y proporciona cuantificación preliminar de una proteína específica en una mezcla compleja de proteínas. En la inmunoelectrotransferencia Western, una mezcla de proteína es separada mediante electroforesis en gel de sds-poliacrilamida (figura 20-10). Para prevenir difusión de las bandas que han sido estrechamente enfocadas por el campo eléctrico, las bandas de proteína a continuación son objeto de transferencia mediante electroforesis a una membrana de nitrocelulosa o de fluoruro de polivinilideno (pvdf). A continuación, las bandas individuales de proteína se identifican al inundar la membrana con anticuerpos ligados a enzima específicos para la proteína de interés. En una versión alternativa del protocolo con el cual el lector ahora debe estar familiarizado, la membrana puede incubarse primero con un anticuerpo conjugado con biotina, seguido por lavado y adición de una enzima conjugada con estreptavidina. Los complejos de proteína-anticuerpo que se forman sobre la membrana son visualizados mediante la adición de un sustrato cromogénico que produce un producto altamente coloreado e insoluble en el sitio de la proteína blanco. Puede alcanzarse sensibilidad aún mayor si un compuesto quimioluminiscente con agentes aumentadores idóneos se utiliza para producir luz en el sitio del antígeno, que se detecta mediante la instrumentación apropiada.

Dos métodos se encuentran comúnmente en la literatura inmunológica para determinar la afinidad de la unión de antígeno-anticuerpo. El método más antiguo, la diálisis de equilibrio, es fácil, económico, e ilustra varios conceptos importantes acerca de interacciones de antígeno-anticuerpo. Se describe brevemente primero. La técnica más moderna de resonancia de plasmón de superficie (spr) ha desplazado a la diálisis de equilibrio como el mejor método en el laboratorio de investigación moderno (véase más adelante), pero requiere la adquisición de instrumentación específica.

La afinidad de anticuerpos es una medida cuantitativa de la fuerza de unión entre un antígeno y un anticuerpo. La fuerza combinada de las interacciones no covalentes entre un sitio de unión a antígeno único sobre un anticuerpo y un epítopo único es la afinidad del anticuerpo por ese epítopo, y puede describirse mediante la constante de asociación de la interacción (capítulo 3).

donde

[S] = la concentración de sitios de unión a anticuerpo,

[L] = la concentración de ligando libre y

[SL] = la concentración de complejos unidos.

La diálisis de equilibrio puede usarse para medir la afinidad de anticuerpo por antígeno

En la diálisis de equilibrio se usa una cámara que contiene dos compartimentos separados por una membrana semipermeable. Se colocan anticuerpos en un compartimento, y en el otro compartimento se coloca un ligando marcado radiactivamente (o de otro modo), suficientemente pequeño como para pasar por la membrana semipermeable (figura 20-11). En ausencia de anticuerpo, el ligando añadido al compartimento B se equilibrará en ambos lados de la membrana (figura 20-11a). Aun así, en presencia de anticuerpos, parte de las moléculas de ligando marcadas será unida al anticuerpo en equilibrio y atrapará el ligando en el lado del recipiente donde están los anticuerpos, mientras que el ligando no unido estará distribuido por igual en ambos compartimentos. De este modo, la concentración total de ligando será mayor en el compartimento que contiene anticuerpos (figura 20-11b). La diferencia de la concentración de ligando en los dos compartimentos representa la concentración de ligando unido al anticuerpo (esto es, la concentración de complejo Ag-Ab). Mientras más alta es la afinidad del anticuerpo, más ligando es unido.

Dado que la concentración de anticuerpo colocado en el compartimento A puede conocerse, y la concentración de antígeno unido (y, por ende, de anticuerpo unido) y antígeno libre puede deducirse a partir de las cantidades de radiactividad en los compartimentos con anticuerpos y sin anticuerpos, respectivamente, puede calcularse la constante de asociación.

La ecuación 1 puede reescribirse como

donde [S]_t = la concentración total de sitio de unión a anticuerpo, definida como [S] + [SL].

Si ahora se define:

y

entonces la tasa de unión a ligando libre:

La ecuación (3) indica que un gráfico de [SL]/[L] en contraposición con [SL] debe dar una línea recta con una pendiente de –K_a y una intersección en la abscisa que corresponde a la concentración de sitio de unión a anticuerpo. (Eso se debe a que cuando [SL]/[L] = 0, entonces K_a[S_t] = K_a[SL] y, por ende, S_t = [SL].) Este gráfico se denomina gráfico de Scatchard. Nótese que esta ecuación es válida cuando el ligando es monovalente, lo que sucede para casi todas las moléculas pequeñas cuya afinidad es medida en experimentos de diálisis de equilibrio.

A veces, las mediciones de unión a ligando se hacen a varias concentraciones totales de anticuerpos diferentes y, en este caso, es útil ser capaz de normalizar las mediciones a la concentración de anticuerpo. Si se divide la ecuación (3) por la concentración total de moléculas de anticuerpo, se obtiene una ecuación con la cual muchos inmunólogos y bioquímicos están familiarizados:

donde r se define como el número de sitios ocupados por cada molécula de anticuerpo, n se define como el número total de sitios por cada molécula de anticuerpo, y c es la concentración de ligando libre = [L]. Así,

donde [Ab]_t = concentración de anticuerpo molar total y

A partir de la ecuación (4) se observa que un gráfico de r/c en contraposición con r dará una pendiente de –K_a y una intersección en la abscisa de n (figura 20-12). Por ende, a partir de este gráfico, es posible también obtener información acerca de la valencia, n, de la población de anticuerpos bajo estudio.

Si el gráfico de r/c en contraposición con r es una línea recta, esto es indicativo de una afinidad de unión única (figura 20-12a), como la que se encontraría al trabajar con una población de mAb. Una mezcla heterogénea de anticuerpos daría en lugar de eso una línea curva. Con un gráfico de línea curva (figura 20-12b), aún es posible determinar la constante de afinidad promedio, al medir el valor de K_a cuando la mitad de los sitios de unión a antígeno están llenos. Esto puede efectuarse al usar el software apropiado para determinar la pendiente de la curva en el punto donde r = 1.

Aunque ahora existen tecnologías más sofisticadas para la determinación de la afinidad de anticuerpo (véase más adelante), requieren instrumentación cara, mientras que la diálisis de equilibrio meramente requiere tubería para diálisis, antígeno, anticuerpo, y una manera en la cual distinguir entre anticuerpo unido y anticuerpo libre. La diálisis de equilibrio es una técnica general que mide la afinidad de cualquier molécula grande por cualquier molécula pequeña capaz de penetrar en una membrana de diálisis.

La resonancia de plasmón de superficie ahora se utiliza comúnmente para mediciones de afinidad de anticuerpo

Desde mediados de la década de 1990-1999, la diálisis de equilibrio ha sido reemplazada como un método para la determinación de afinidad por la resonancia de plasmón de superficie (spr), que es más rápida y sensible, y puede proporcionar también información acerca de las tasas de reacción de antígeno-anticuerpo (figura 20-13). La spr se fundamenta en la formación de ondas electromagnéticas, llamadas plasmones de superficie, que se propagan en la interfaz de un metal y un solvente. La naturaleza de la onda es sensible a cualquier alteración en esta frontera, como la adsorción de moléculas a la superficie de metal. La spr funciona al detectar cambios de las propiedades de reflectancia en la superficie de un sensor metálico cubierto con antígeno cuando se une a anticuerpo.

Aunque las propiedades físicas que fundamentan la spr son más bien sofisticadas, la metodología real es bastante sencilla (figura 20-13a). Se dirige un haz de luz polarizada a través de un prisma sobre un chip cubierto con una película de oro delgada (cubierta con antígeno en el lado opuesto) y se refleja desde la película de oro hacia un sensor que recolecta luz. A un ángulo único, la capa de oro absorbe algo de luz incidente, y su energía es transformada hacia ondas de plasmón de superficie. A ese ángulo puede medirse una disminución aguda de la intensidad de luz reflejada, que se llama ángulo de resonancia. Este ángulo depende del color de la luz, el grosor y la conductividad de la película metálica, y las propiedades ópticas del material cerca de las superficies de la capa de oro.

En el método de spr se aprovecha el último de estos factores, porque la unión de anticuerpos al antígeno fijo a la película produce un cambio detectable en el ángulo de resonancia, y la cantidad del cambio es proporcional al número de anticuerpos unidos. Al medir la tasa a la cual el ángulo de resonancia cambia durante una reacción de antígeno-anticuerpo, es posible determinar la tasa de la reacción de unión de antígeno-anticuerpo (figura 20-13b).

Desde el punto de vista operativo, esto se realiza al pasar una solución de concentración conocida de anticuerpos sobre el chip cubierto con antígeno. Un gráfico de los cambios del ángulo de resonancia en contraposición con el tiempo medido durante un experimento de spr se llama sensorgrama. En el transcurso de una reacción de antígeno-anticuerpo, el gráfico de sensorgrama aumenta hasta que todos los sitios capaces de unir anticuerpo (a una concentración dada) lo han hecho. Más allá de ese punto, el sensorgrama alcanza una meseta. Los datos provenientes de estas mediciones pueden usarse para calcular k₁, la constante de tasa de asociación para la reacción de unión de anticuerpo-antígeno.

Una vez que se ha alcanzado la meseta en el gráfico del sensorgrama, la solución que no contiene anticuerpo puede pasarse por la cámara. En estas condiciones, los complejos de antígeno-anticuerpo se disocian, lo que permite calcular la constante de tasa de disociación, k₂. La medición de k₁ y k₂ permite la determinación de la constante de afinidad, K_a, porque K_a = k₁/k₂.

La obtención de imágenes de células y tejidos puede lograrse usando anticuerpos específicos para antígenos presentes en tejidos que están conjugados con otras moléculas. Si la molécula unida al anticuerpo es una enzima, la presencia de los antígenos en la muestra de tejido puede visualizarse al eliminar por lavado los anticuerpos excesivos, y añadir sustratos que son modificados por las enzimas conjugadas con anticuerpo para crear precipitados coloreados insolubles en los sitios precisos de unión a anticuerpo. Las técnicas que se fundamentan en este método básico son inmunocitoquímica e inmunohistoquímica y en estos métodos se utilizan microscopios compuestos simples, acoplados con sistemas controlados por computadora para crear imágenes de los tejidos fijados. Si la molécula conjugada con el anticuerpo es un colorante fluorescente, el antígeno se visualiza de manera directa por medio de microscopia de fluorescencia como se describe en la sección que sigue.

En los estudios inmunocitoquímicos e inmunohistoquímicos se usan anticuerpos conjugados con enzimas para crear imágenes de tejidos fijos

Las técnicas de inmunocitoquímica e inmunohistoquímica se fundamentan en el uso de anticuerpos conjugados con enzima para unirse a proteínas u otros antígenos en células intactas. En la actualidad se dispone de varios anticuerpos conjugados con enzima, pero clásicamente la célula se trata de tal manera que un anticuerpo conjugado con una enzima como la peroxidasa está situado en el sitio de unión a antígeno. Esto puede lograrse de modo directo, al usar un anticuerpo conjugado con peroxidasa para unirse al antígeno celular, o de modo indirecto, al usar un anticuerpo primario conjugado con biotina y peroxidasa conjugada con estreptavidina, como se describió. De manera alternativa, al igual que para elisa, puede usarse un anticuerpo secundario, conjugado con peroxidasa, que se une a la región Fc del anticuerpo primario, específico para tejido.

En estos experimentos, el sustrato de peroxidasa es seleccionado de modo que el producto de la enzima forma un precipitado coloreado que es visible bajo el microscopio óptico, y es depositado en el sitio de unión a anticuerpo. El uso de una gama de enzimas con sustratos diferentes puede permitir el depósito de productos de diferentes colores que reflejan la unión de distintos anticuerpos. Se dispone de varios aditivos químicos que pueden aumentar la densidad y/o el color de la tinción. La calidad de la reacción de tinción depende de la proporción entre tinción específica y no específica y, así, el investigador por lo general realiza la reacción de tinción en presencia de concentraciones relativamente altas de proteínas inespecíficas, como leche seca sin grasa (¡realmente!), para minimizar la unión de anticuerpos inespecíficos. En manos expertas, las imágenes obtenidas a partir de estas técnicas pueden ser extraordinariamente detalladas y agradables desde el punto de vista estético (figura 20-14).

Las técnicas de inmunocitoquímica e inmunohistoquímica difieren entre sí en la naturaleza de la muestra que se está analizando. En las técnicas de inmunohistoquímica, las muestras son preparadas al seccionar tejido intacto y, por ende, las células teñidas están ubicadas en su contexto biológico. Dado que la muestra se prepara al seccionar (cortar), las muestras inmunohistoquímicas no necesitan ser permeabilizadas mediante tratamiento con detergente antes de la tinción, porque las superficies de corte de células permiten que el anticuerpo llegue a blancos intracelulares. En contraste, la técnica de inmunocitoquímica se efectúa en células aisladas, a menudo las que crecen en suspensión de cultivo de tejido. Si la tinción se diseña para detectar blancos intracelulares, las células deben permeabilizarse primero mediante fijadores orgánicos, o por medio de detergente.

En la microscopia inmunoelectrónica se utilizan cuentas de oro para visualizar antígenos unidos a anticuerpo

Para resolver los detalles de estructura fina a aumento alto, los científicos quizá necesiten usar microscopia electrónica, en lugar de microscopia óptica. En esos experimentos, los anticuerpos son acoplados a partículas electrodensas, como partículas de oro coloidal. Siempre que se unen anticuerpos, el microscopio electrónico detectará depósitos de oro. Al usar partículas de oro de diferentes tamaños conjugadas con anticuerpos particulares, puede analizarse la relación subcelular entre dos o más epítopos antigénicos diferentes (figura 20-15).

El decenio pasado ha visto una explosión verdadera de la manera en la cual la microscopia de fluorescencia se ha aplicado a estudios del sistema inmunitario. Dado que los estudiantes quedaron expuestos a muchas de estas técnicas en la literatura primaria actual, aquí se presenta un resumen de las variaciones comunes de técnicas de inmunofluorescencia. Véase también el recuadro 14-1, que describe algunas técnicas de obtención de imágenes dinámicas importantes.

La fluorescencia puede usarse para visualizar células y moléculas

El fenómeno de la fluorescencia se produce por la propiedad de algunas moléculas para absorber luz a una longitud de onda y emitirla como una longitud de onda más larga. Si la luz emitida tiene una longitud de onda en la región visible del espectro, el colorante fluorescente puede usarse para obtener imágenes de cualesquier moléculas unidas por ese colorante. Conjugados de anticuerpo y estreptavidina de muchos colorantes se han usado para proporcionar imágenes espectaculares de estructuras celulares y subcelulares, así como para identificar células que se unen a esos anticuerpos en experimentos de citometría de flujo (véase más adelante). Además, es posible someter células y animales a procedimientos de ingeniería para que expresen proteínas fluorescentes particulares, como la proteína fluorescente verde (green) (gfp) o la proteína fluorescente roja (rfp) bajo el control de promotores específicos para célula o para tejido. Los colorantes a continuación pueden usarse para visualizar los loci donde son expresadas proteínas bajo el control de esos mismos promotores. Otros colorantes se unen de manera específica a macromoléculas particulares. Por ejemplo, el colorante azul 4′,6-diamidino-2-fenilindol (phenylindole) (dapi) tiñe de manera específica dna. La proteína faloidina, que se une de modo específico a actina filamentosa, también puede conjugarse con sondas fluorescentes (figura 20-16a).

En la microscopia de inmunofluorescencia se usan anticuerpos conjugados con colorantes fluorescentes

En la microscopia de inmunofluorescencia estándar, la célula o la muestra de tejido se tiñe con un anticuerpo unido sea de manera directa o indirecta con un colorante fluorescente, y a continuación la laminilla que sostiene la muestra es colocada sobre la platina del microscopio. La luz incidente excita la fluorescencia en la muestra y unos filtros aseguran que sólo la luz de la longitud de onda requerida llegue al objetivo (figura 20-16b). Los instrumentos más modernos detectan luz a múltiples longitudes de onda fluorescentes distintas que es emitida después de excitación de colorantes conjugados a diversos anticuerpos. Las múltiples imágenes a color a continuación pueden superponerse mediante el software del instrumento para proporcionar una representación única en la cual pueden compararse las ubicaciones de las moléculas unidas a anticuerpo.

La microscopia de fluorescencia confocal proporciona imágenes tridimensionales de extraordinaria claridad

Uno de los factores limitantes en la obtención de imágenes claras a partir de microscopia de fluorescencia es la tendencia de las moléculas fluorescentes que yacen por arriba y por debajo del plano focal a contribuir a la luz que llega al objetivo. En la microscopia confocal ese artefacto se elimina al usar un lente objetivo que enfoca la luz desde el plano focal deseado directamente sobre una abertura puntiforme enfrente del detector (figura 20-17a). La luz emitida a partir de moléculas situadas a otros niveles dentro de la muestra es detenida en el perímetro del agujero puntiforme, y así pueden generarse imágenes notoriamente claras de un plano único dentro de la muestra. En la microscopia confocal de barrido láser, el investigador usa láseres para proporcionar la luz excitadora y el poder de computación para mover el plano focal en las tres dimensiones, lo que le permite explorar un plano x,y a diferentes profundidades de foco, y reconstituir imágenes tridimensionales poderosas. En la figura 20-17b se muestra una imagen espectacular de vasos sanguíneos en el epiplón de ratón, generada mediante esta técnica.

La microscopia de fluorescencia multifotón es una variación de la microscopia confocal

Las microscopias de dos fotones y multifotón son variaciones de la microscopia confocal que ofrecen resolución aún mayor en el desarrollo de imágenes tridimensionales, después de exploración de tejidos con láser (recuadro 14-1). En la microscopia confocal estándar, la excitación de las sondas fluorescentes (colorantes) ocurre a lo largo de toda la trayectoria del haz láser a través del tejido. Esto significa que, si bien los haces de emisión se derivan de un solo nivel dentro de la muestra, están siendo excitadas sondas fluorescentes en muchos niveles del tejido. Dado que las sondas fluorescentes finalmente se “blanquearán” (esto es, dejarán de emitir luz) después de excitación extensa, esto limita la vida útil de la muestra. También significa que la muestra emite luz adicional que debe ser filtrada para eliminarla de la imagen final.

En la microscopia de fluorescencia multifotón se usan láseres de longitud de onda larga que emiten en la región infrarroja del espectro; éstos son de energía relativamente baja y, así, más de un fotón debe incidir sobre una molécula fluorescente para proporcionar suficiente energía para excitar los electrones. La energía baja de estos láseres infrarrojos minimiza la magnitud de fotoblanqueado y aumenta el tiempo de vida útil de la muestra. Además, el hecho de que se requieren al menos dos haces de luz para desencadenar excitación de fluorescencia asegura que sólo ocurre excitación dentro del plano de intersección de los haces láser (figura 20-18). Al mover el punto focal de excitación dentro de los planos x y y, puede generarse información acerca de una sección óptica completa, y ese proceso entero a continuación puede repetirse en niveles z adicionales, lo que da lugar a una imagen tridimensional. En el capítulo 14 pueden observarse algunas de las imágenes poderosas desarrolladas con esta técnica.

La obtención de imágenes intravital permite la observación de respuestas inmunitarias in vivo

El tema de la obtención de imágenes intravital se abordó en el capítulo 14, de modo que aquí sólo se describirá brevemente. La obtención de imágenes intravital aprovecha la capacidad para mantener la circulación de ganglios linfáticos y otros órganos inmunitarios después de que han sido disecados hacia el exterior de un organismo donante anestesiado y sobre una platina de microscopio calentada. Ahí, al usar un microscopio multifotón, pueden generarse imágenes tridimensionales de células y estructuras marcadas con fluorescencia, y reunir información acerca de la conducta de células inmunitarias esencialmente in vivo. En el capítulo 14 se presentan varios enlaces a películas filmadas en tiempo real de células del sistema inmunitario teñidas in situ usando esta tecnología poderosa.

La citometría de flujo es el sine qua non (“sin el cual nada hay”) de la caja de herramientas del inmunólogo moderno. Fue desarrollada por Leonore Herzenberg y Leonard Herzenberg y colegas, y encontró algunas de sus aplicaciones más tempranas en el análisis de células provenientes de la sangre, entre las que destacan subpoblaciones de linfocitos. La citometría de flujo en sí es una técnica analítica que cuantifica las frecuencias de unión de células a anticuerpos fluorescentes y que dispersan luz de maneras características (véase más adelante). Cuando un citómetro de flujo es adaptado para clasificar poblaciones celulares con base en la fluorescencia y la dispersión de luz, se denomina clasificador (sorter) de células activadas por fluorescencia (facs). Las tecnologías de anticuerpos monoclonales y facs se desarrollaron aproximadamente al mismo tiempo, y los dos importantes avances tecnológicos resultaron ser sinérgicos: cuantos más anticuerpos estuvieron disponibles para tipificación y clasificación de células, más informativos se hicieron los experimentos de citometría de flujo.

Las aplicaciones de microscopia fluorescente descritas hasta ahora son instrumentos cualitativos en extremo valiosos, pero no proporcionan datos cuantitativos respecto a las frecuencias de células dentro de una población que se tiñe con anticuerpos específicos y que, por ende, pertenece a subpoblaciones experimentalmente definibles. Este defecto se abordó mediante la invención del citómetro de flujo, que se diseñó para automatizar el análisis y la separación de células teñidas con distintos anticuerpos fluorescentes.

En el citómetro de flujo se utilizan un haz láser y una serie de detectores para identificar tanto luz dispersa como señales fluorescentes de longitudes de onda particulares provenientes de células intactas únicas que fluyen en un chorro enfocado más allá del láser (figura 20-19a). Las células en suspensión son enfocadas de manera hidrodinámica hacia un chorro estrecho al ser introducidas dentro de una columna de líquido vaina que se mueve con rapidez. Cada vez que una célula pasa enfrente del haz láser, se dispersa luz, y se registra esta interrupción de la señal láser.

Un detector, llamado un fotodiodo, capta luz dispersa en la dirección frontal (esto es, dentro de algunos grados de la vía original del haz láser). La dispersión alta de luz hacia adelante (dentro de 5 a 10° de la trayectoria de la luz del haz láser) proporciona una indicación de que las células de las cuales depende esta dispersión de luz son grandes. Mientras mayor es la dispersión de luz hacia adelante, más grande es la célula; así, la cantidad de luz dispersa en la dirección frontal puede usarse como una medida aproximada del rango de tamaños de las células en el chorro. Un segundo detector de dispersión de luz se coloca a aproximadamente 90° respecto a la trayectoria del haz láser. La cantidad de luz dispersa en dirección lateral ofrece una indicación de la extensión de la complejidad intracelular de las células que producen dispersión. Cuanto mayor es el ángulo lateral de dispersión de luz, más estructuras membranosas intracelulares, como retículo endoplasmático (er) y mitocondrias, están presentes en la célula que produce dispersión. Dado que los detectores de dispersión de ángulo lateral detectan mucho menos luz que el detector de fotodiodo de dispersión hacia adelante, la luz dispersa lateralmente se mide mediante tubos fotomultiplicadores sensibles.

Anticuerpos marcados con fluorescencia unidos a los antígenos de superficie de células particulares pueden ser excitados por el láser. Después de la excitación, emiten luz que es registrada por una serie de tubos fotomultiplicadores ubicados a un ángulo recto respecto al haz láser. Cada detector de fluorescencia con tubo fotomultiplicador es colocado detrás de una serie de filtros y espejos dicroicos, de modo que sólo recibe y detecta luz dentro de un rango particular de longitudes de onda. Los citómetros de flujo cuentan cada célula conforme pasa por el haz láser y registran la magnitud de la fluorescencia emitida a diversas longitudes de onda, así como las cantidades de luz dispersa en dirección frontal y lateral para cada célula; una computadora adosada almacena todos los datos para cada célula, a los cuales puede recurrir el software de análisis según sea necesario. Esta tecnología está avanzando con mucha rapidez, y citómetros de flujo capaces de detectar 8 a 12 parámetros de fluorescencia y de dispersión de luz se utilizan de manera sistemática en laboratorios clínicos y de investigación.

A la izquierda de la figura 20-19b se muestra un ejemplo de un gráfico de dispersión hacia adelante y lateral típico de leucocitos de ser humano. A la derecha de la figura 20-19b se presenta un gráfico de la intensidad de fluorescencia de células derivadas de la región que se muestra separada en rojo en el gráfico de dispersión, que representa células pequeñas que generan dispersión baja de luz, o linfocitos. Estas células han sido teñidas con un anticuerpo conjugado con fluoresceína contra CD8; por ende, las células T que portan CD8 emitirán fluorescencia en la parte verde del espectro. La fluorescencia verde es detectada en el canal FL1, o canal verde, del detector. De modo similar, las células T CD4⁺ se han teñido con un anticuerpo conjugado con un fluorocromo (p. ej., f icoeritrina [phycoerythrin], o pe) que es detectado en el canal FL2, o canal rojo. Por consiguiente, este gráfico muestra que, de las células que caen en la separación de linfocitos, 44% fueron células que portaban CD4 y que se teñían de rojo, y 23% fueron células que portaban CD8 y que se teñían de verde. En el recuadro 20-1, Avances, se presenta una exposición más matizada de cómo funciona un citómetro de flujo.

Los citómetros de flujo también pueden detectar emisiones de fluorescencia provenientes de células que han sido permeabilizadas con detergente, lo que permite que anticuerpos entren a las células y tiñan componentes intracelulares. Este método de “tinción intracelular” se utiliza, por ejemplo, cuando se analizan células respecto a su capacidad para sintetizar citocinas particulares y liberarlas, así como en análisis del ciclo celular y en la detección de actividades de enzimas para las cuales se dispone de productos fluorescentes (véase más adelante). En muchos centros médicos, el citómetro de flujo se utiliza para detectar leucemias y clasificarlas por tipo de célula, lo que a su vez influye sobre las decisiones respecto al tratamiento futuro. De igual modo, la medición rápida de subpoblaciones de células T, un importante indicador pronóstico en el sida, se efectúa de manera sistemática mediante análisis con citometría de flujo. El hiv infecta células T que portan CD4, y las destruye. Para vigilar la etapa clínica de la enfermedad, mAb marcados contra células T que portan CD4 y CD8 se utilizan para determinar sus proporciones en la sangre del paciente (figura 20-19b). Cuando el número de células T CD4 cae por debajo de una cierta cifra, el paciente tiene riesgo alto de infecciones oportunistas.

La fluorescencia no es el único tipo de marcador que los inmunólogos pueden usar para separar células. Una malla de lana fina hecha de metal ferromagnético puede ser localizada en una columna corta. La aplicación de un campo magnético a través de la columna asegurará que cualquier material magnetizado se pegará a la malla. Al conjugar anticuerpos con cuentas o moléculas magnéticas, que permiten a los anticuerpos unirse a sus antígenos sobre la superficie de células particulares y después pasar las células a través de la columna, las células que se unen a las cuentas magnéticas pueden ser mantenidas sobre la malla en la columna, mientras que las que no se unieron a los anticuerpos fluyen a través. Después de eliminar por lavado con un chorro de amortiguador cualesquier células unidas de manera inespecífica, las células conjugadas con cuentas magnéticas pueden ser liberadas al eliminar el imán del exterior de la columna y pasar amortiguador a través. La separación magnética de células es en particular útil para separación de lotes de números grandes de células, mientras que la clasificación de células activadas por fluorescencia, al clasificar una célula a la vez, comete menos errores pero es mucho más lenta. En el laboratorio o en clínica, los inmunólogos a menudo efectuarán una clasificación de lote usando clasificación de células activadas por magnetismo, y después le darán seguimiento con una clasificación de células activadas por fluorescencia, a fin de maximizar la exactitud de la separación de células.

Después de activación, una de las primeras respuestas de los linfocitos es dividirse. Por ende, los inmunólogos han estado en el frente del desarrollo de metodologías para análisis del ciclo celular. Se describirán varios métodos (tanto clásicos como más modernos) que los inmunólogos utilizan comúnmente en el análisis del estado del ciclo celular de poblaciones de células inmunitarias.

La captación de timidina tritiada (³H) fue uno de los primeros métodos usados para evaluar división celular

Los ensayos de captación de ³H timidina fueron los primeros en ser usados de manera sistemática para medir la división celular en cultivos de linfocitos. Se fundamentan en el hecho de que las células en división sintetizan dna a un ritmo rápido y, por ende, la timidina radiactiva en el líquido de cultivo será incorporada con rapidez hacia dna de peso molecular alto. En un ensayo de captación de ³H timidina, las células sujetas a señales proliferativas son lisadas en periodos definidos después de la estimulación, y su dna es precipitado hacia filtros que se unen a los ácidos nucleicos de alto peso molecular, pero permiten que la timidina no incorporada se lave directamente a través. La cantidad de radiactividad retenida en los filtros a continuación puede proporcionar una medida de la cantidad de dna recién sintetizado y, por ende, del número de células que están pasando por división en el cultivo.

Los análisis colorimétricos para división celular son rápidos y eliminan el uso de isótopos radiactivos

Motivados por razones de seguridad y responsabilidad ambiental para alejarse del uso de mediciones basadas en radiactividad, los científicos desarrollaron varios ensayos diferentes en los cuales células metabólicamente activas dividen sustratos incoloros hacia productos coloreados, a menudo insolubles, que a continuación pueden medirse por medio de espectrofotometría. En un ensayo de ese tipo, el compuesto de tetrazolio mtt (3-[4,5-simetil-tiazol-2-il]-2, 5-bromuro de difeniltetrazolio, un tetrazol amarillo) es reducido por células metabólicamente activas para formar cristales de colorante formazán púrpura, insolubles. La absorbancia a continuación se puede leer de manera directa en los pozos de cultivo a 570 nm, el máximo de absorbancia del formazán. Cuantas más células metabólicamente activas están presentes en el cultivo, más formazán se generará y, así, este ensayo proporciona una lectura del número de células vivas en función del tiempo. De esta manera, el ensayo mtt puede medir la proliferación celular o la muerte celular.

En ensayos basados en bromodesoxiuridina para división celular se utilizan anticuerpos para detectar dna recién sintetizado

Cuando se introduce hacia células, la bromodesoxiuridina (BrdU) es fosforilada con rapidez hacia bromodesoxiuridil trifosfato (un análogo para el desoxitimidina trifosfato), y es incorporada en su sitio hacia dna recién sintetizado (figura 20-20). Las células que se dividen después de incorporación de BrdU, a continuación se pueden identificar usando anticuerpos contra BrdU. Además de servir como una marca para células recién divididas, la BrdU también puede marcar células para muerte celular inducida por luz. Si las células que han incorporado una cifra alta de BrdU quedan expuestas a luz, sufrirán fotólisis; esto se ha usado para matar de manera selectiva células recién divididas. Durante los últimos años, se han generado otros análogos químicos que imitan las funciones de la BrdU como un marcador de células en división, entre ellos EdU, que puede detectarse usando reactivos específicos.

El yoduro de propidio permite el análisis del estado del ciclo celular de poblaciones de células

El yoduro de propidio es un colorante fluorescente con una estructura planar (plana), que se desliza entre los peldaños de la escalera de dna (o se intercala hacia los mismos) de una manera cuantitativa (figura 20-21a). Al usar el citómetro de flujo para medir la fluorescencia proveniente de una población de células marcadas con yoduro de propidio, es posible identificar cuáles células dentro de las poblaciones se encuentran en cada etapa del ciclo celular. Las células G1 tendrán la mitad del dna de células G2, o células a punto de pasar por mitosis, y las células que actualmente están replicando dna y que, por ende, se encuentran en la fase S, tendrán un valor intermedio. Las células apoptóticas y los fragmentos que han empezado a desintegrar su dna aparecerán como eventos con cantidades de dna menores que en las células en G1 (figura 20-21b). Los pares de células primero deben excluirse del análisis porque tienen la misma cantidad de dna por cada par que una célula en la fase G2 o M del ciclo celular; por ende, la falta de exclusión de pares de células dará lugar a un sobreestimado de la fracción de células en división.

Para hacer las mediciones más exactas de la cantidad de colorante captado por células, los investigadores utilizan de manera sistemática la capacidad del citómetro de flujo para calcular el área bajo el pulso de voltaje en el canal Fl2 (recuadro 20-1, Avances). Otros colorantes que se unen al dna y que permiten tipos similares de análisis del ciclo celular son dapi, Hoechst 33342, y 7-amino-actinomicina D (aad).

El carboxifluoresceína succinimidil éster puede usarse para dar seguimiento a la división celular

El carboxifluoresceína succinimidil éster (cfse) se denomina más correctamente carboxifluoresceína diacetato succinimidil éster (cfdase). Los grupos diacetilo, que se observan en las partes superiores derecha e izquierda de la molécula que se muestra en la figura 20-22a, permiten que el cfdase entre a la célula, y a continuación son divididos por medio de esterasas intracelulares, de modo que el cfse permanece atrapado dentro del citoplasma. En el citoplasma, las moléculas de cfse son fijadas con eficiencia y de manera covalente a proteínas intracitoplasmáticas; el succinimidil éster actúa como un grupo que sale. Sorprende un poco que la fijación de cfse a proteínas intracitoplasmáticas ocurre en esencia sin efecto nocivo sobre el metabolismo celular o la división celular.

El poder del marcado con cfse yace en el hecho de que la cantidad de fluorescencia emitida se reduce a la mitad cada vez que la célula se divide (figura 20-22b). El pico a la derecha representa las células que no se dividieron después de incorporación de cfse. El pico inmediatamente a la izquierda representa células que se han dividido una vez, el siguiente pico a la izquierda representa células que se han dividido dos veces, y así sucesivamente. Es posible usar la capacidad de clasificación del citómetro de flujo para separar físicamente las células que no se han dividido, o que se han dividido una vez, dos veces, o más veces, y después analizar las poblaciones celulares separadas respecto a la expresión de genes particulares. En el ejemplo que se muestra en la figura 20-22c, se observa que el gen que codifica para la proteína survivina apenas es expresado en todas las células T que no se están dividiendo, pero que es expresado inmediatamente en el momento de la activación de célula T. Para el momento en que la célula se ha dividido tres veces, las células expresan dos isoformas del gen.

Al final de una respuesta inmunitaria, casi todas las células inmunitarias activadas mueren. Además, el resultado de muchas respuestas inmunitarias es la muerte de células infectadas o afectadas; así, los inmunólogos han desarrollado una batería de metodologías para efectuar pruebas para muerte celular.

El ensayo de liberación de ⁵¹Cr fue el primer ensayo usado para medir muerte celular

Durante décadas el ensayo de liberación de ⁵¹Cr fue el mejor método para medir muerte mediada por células T citotóxicas y por células asesinas naturales, y se utilizó en los experimentos efectuados por Doherty y Zinkernagel que describieron por vez primera la restricción a mhc en el reconocimiento por células T. Las células blanco primero se incuban en una solución de ⁵¹cromato de sodio, que es captado hacia las células. El cromo excesivo se elimina de la suspensión por lavado y los blancos marcados con radiactividad se mezclan con la población de células asesinas a proporciones definidas entre células efectoras y células blanco. La muerte de las células blanco es indicada por la liberación de ⁵¹Cr hacia el sobrenadante del cultivo de células mixto, y se cuantifica al comparar la liberación de ⁵¹Cr a partir de las células de prueba con la de células tratadas con detergente y control. El ⁵¹Cr es un isótopo radiactivo que emite rayos γ; por ende, la radiactividad en los sobrenadantes del ensayo puede medirse fácilmente en un contador γ. En una alternativa moderna para esta técnica se utiliza cfse para marcar las células y cuantifica la liberación de material fluorescente hacia el sobrenadante con un lector de placa fluorescente. Estos dos ensayos miden todas las formas de muerte celular.

La anexina V marcada con fluorescencia mide la fosfatidilserina en la envoltura lipídica externa de células apoptóticas

En células que están pasando por apoptosis (muerte celular programada), pero no otros modos de muerte celular, el fosfolípido de membrana fosfatidil serina pasa del lado interior al lado exterior de la bicapa de fosfolípido de la membrana plasmática. La anexina V es una proteína que se une a la fosfatidil serina de una manera dependiente del calcio; por consiguiente, la anexina V marcada con fluorescencia puede usarse para marcar células apoptóticas para detección usando citometría de flujo o un lector de placa fluorescente.

El ensayo tunel mide fragmentación de dna generada por apoptosis

En otro método común para la detección de muerte celular apoptótica se utiliza el hecho de que las células apoptóticas pasan por un proceso de degradación progresiva de dna, que da lugar a la generación de fragmentos de dna cortos dentro del núcleo. El ensayo tunel se fundamenta en el uso de la enzima desoxirribonucleotidil transferasa terminal (TdT) (en el capítulo 7 se explica con detalle la actividad de esta enzima) para añadir bases hacia los extremos rotos de secuencias de dna de una manera sin plantilla. En la variación clásica del método tunel se utiliza TdT para añadir BrdU a células fijas y permeabilizadas. La BrdU es incorporada hacia el dna recién sintetizado, y a continuación se detecta con anticuerpos anti-BrdU marcados con fluorescencia (figura 20-23). En iteraciones más recientes de este método se utiliza la incorporación de segmentos de dna cortos premarcados con una molécula que a continuación se une a una marca fluorescente en situaciones muy suaves.

Los ensayos de caspasa miden la actividad de enzimas involucradas en la apoptosis

Las caspasas son una familia de cisteína proteasas que dividen proteínas después de residuos de ácido aspártico. Diferentes miembros de la familia de la caspasa son activados durante cascadas apoptóticas, dependiendo de su modo de inicio. Por ejemplo, la caspasa 8 es activada en el momento de unión del receptor Fas por ligando Fas. Ahora se dispone en el comercio de varios tipos de ensayos de caspasa, incluso kits de detección de caspasa que dan productos fluorescentes en el momento de división mediada por caspasa, así como kits que detectan las formas dividida y activa de caspasas usando metodología de inmunoelectrotransferencia Western.

Para identificar los miembros de una vía de transducción de señal y la naturaleza de las interacciones que ocurren entre los diversos componentes, los inmunólogos usan una amplia variedad de herramientas bioquímicas y genéticas. Ese tipo de investigación por lo general empieza cuando un científico determina que la interacción de un ligando y receptor particulares tiene un cierto resultado, por ejemplo, la activación de la transcripción de un gen particular. A continuación la pregunta se torna en ¿cuáles son las moléculas interpuestas que pasan la señal desde un receptor al núcleo y dan lugar a la activación de transcripción?

A menudo se usan inhibidores bioquímicos para identificar intermediarios en vías de señalización

Ciertas familias de enzimas (p. ej., tirosina cinasas, serina/treonina cinasas, caspasas y ubiquitinasas) transducen señales moleculares en varias vías diferentes. Otras vías requieren la integridad de orgánulos intracelulares, como los lisosomas. Se han desarrollado inhibidores químicos disponibles en el comercio para muchas familias de enzimas implicadas en la transducción de señal, así como para miembros individuales de muchas de estas familias. La aplicación simultánea de un inhibidor con la molécula emisora de señales puede proporcionar información rápida acerca de si la proteína inhibida está implicada en la vía bajo estudio, y los estudios de inhibidor a menudo resultan una manera valiosa de empezar a examinar un nuevo problema y obtener algunos resultados rápidos. También hay inhibidores químicos que afectan el funcionamiento de compartimentos intracelulares, y su uso permite a un investigador determinar si la vía en investigación comprende ese compartimento.

De cualquier modo, al usar inhibidores para caracterizar una vía, siempre es necesario ser cauteloso, porque su especificidad no siempre está caracterizada por completo, y la inhibición de la transducción de señal que se mide puede no depender de la inhibición de la proteína que el fabricante especificó o que el investigador cree que está estudiando. Por ejemplo, ahora se sabe que los inhibidores inicialmente desarrollados para el factor de transcripción Erk1 también inhiben Erk5, un miembro de la familia que se desconocía cuando se desarrolló el primer inhibidor. Además, la inhibición observada puede producirse por interferencia con una vía relacionada. Por ejemplo, la enzima inhibida puede evitar la producción de uno de los componentes de la vía bajo estudio. Debido a estas advertencias, los estudios de inhibidor siempre deben ser apoyados con otros medios de análisis. El cuadro 20-2 lista algunos inhibidores de enzimas y factores de transcripción representativos involucrados en la transducción de señal que los estudiantes quizá encuentren en su lectura, junto con su modo de acción.

Se usan muchos métodos para identificar proteínas que interactúan con moléculas de interés

Como se describió en la sección “Técnicas basadas en inmunoprecipitación”, la coinmunoprecipitación puede usarse para identificar proteínas que interactúan con una molécula blanco. Por ejemplo, un anticuerpo contra una proteína adaptadora puede usarse para inmunoprecipitar esa proteína. Después de solubilizar los componentes del precipitado y correrlos sobre un gel de sds-page, pueden hacerse visibles otras bandas que representan proteínas que estuvieron interactuando con la proteína adaptadora en la célula intacta. A veces, la inspección del peso molecular de las proteínas que se están coprecipitando, junto con información acerca de otras proteínas que se sabe que interactúan con ese adaptador, permite al investigador desarrollar una hipótesis acerca de la identidad de la molécula que se está coprecipitando, que a continuación puede confirmarse con una inmunoelectrotransferencia Western. En otras ocasiones, el investigador debe sujetar una muestra de la banda misterio a microsecuenciación e identificarla usando las herramientas de bioinformática. Si las inmunoelectrotransferencias Western no identifican proteínas que están interactuando, pueden usarse técnicas como pantallas de dos híbridos de levaduras, pero la descripción de estos métodos está más allá del objetivo de este capítulo.

Se han usado muchos sistemas de animal entero en el estudio de la inmunología. La especie de animal seleccionada para estudio es la que satisface mejor las necesidades de la investigación particular. Para probar la eficacia de vacunas particulares contra virus o bacterias que afectan sólo a primates, deben usarse modelos en animales primates. Los estudios de caballos, ovejas, cabras, perros y conejos también han brindado mucha información acerca de las respuestas inmunitarias, y han proporcionado muchos reactivos para el estudio de la inmunología en humanos y ratones. No obstante, la especie que se ha usado con mayor frecuencia, y con la mayor eficacia en el modelado del sistema inmunitario de humano, es el ratón. Los ratones son fáciles de manejar, están bien caracterizados desde el punto de vista genético y tienen un ciclo de crianza rápido. En esta sección se esbozarán varios tipos de modelos en animal murinos, y se aclarará parte de la nomenclatura más desorientadora que es probable que los estudiantes encuentren conforme leen la literatura inmunológica. Primero se abordarán brevemente las preguntas éticas que deben surgir en la mente de quienes trabajan con animales enteros, y las regulaciones que se han desarrollado para proteger sujetos de investigación no humanos.

La investigación en animales está sujeta a pautas federales que protegen a sujetos de investigación no humanos

El entendimiento de la respuesta inmunitaria debe mucho a los animales, y se han hecho enormes avances usando diversos modelos en animales. Sin embargo, estos avances se han acompañado de preocupaciones respecto al bienestar del animal, y han llevado a muchos países a adoptar leyes que regulan el uso de animales en el aspecto ético. En Estados Unidos, las instituciones y los investigadores que trabajan con animales deben cumplir con la Animal Welfare Act de 1966. Los investigadores que reciben fondos federales deben establecer un Institutional Animal Care and Use Committee (iacuc) que supervisa las prácticas de investigadores y programas. Todos los investigadores deben detallar y justificar sus métodos ante este comité, y el U.S. Department of Agriculture (usda) hace cumplir el apego a esto.

Los estándares para el tratamiento ético de animales se están evaluando y actualizando continuamente conforme se desarrollan el conocimiento de los aspectos biológicos de los animales, tecnologías alternativas y preocupaciones éticas. Desde que se firmó como una ley, la Animal Welfare Act se ha enmendado siete veces a fin de reflejar estos avances. En 2010, la Unión Europea aprobó una ley que actualizó y fortaleció estándares esbozados en sus leyes de bienestar animal de 1986. En respuesta a preocupaciones de que la investigación en animales estaba poco descrita en la literatura, la revista influyente Nature estableció nuevas políticas en 2012 que exigen a los autores incluir descripciones más detalladas de los métodos y los estándares asociados con experimentación en animales. Por último, un número creciente de investigadores ha abrazado formalmente los principios de las Three R’s originalmente articulados en 1954 por Hume y descritos a fondo por Russell y Burch; los cuales describen un compromiso para refinar, reducir y reemplazar métodos en los que se usan animales en investigación. Estos principios fueron comunicados a científicos primero por un comité que incluyó al ganador del Premio Nobel e inmunólogo Peter Medawar y han sido el enfoque de varias conferencias prominentes durante los últimos años.

Muchos individuos y grupos consideran que las regulaciones aún no abordan o respetan por completo las necesidades de los animales. Continúa la tensión entre preocupaciones éticas y el deseo de hacer avanzar el conocimiento; aunque en ocasiones inspira conflicto, también inspira esfuerzos continuos por refinar políticas y mejorarlas.

Las cepas endogámicas pueden reducir la variación experimental

Para controlar la variación experimental causada por diferencias en los trasfondos genéticos de animales de experimentación, los inmunólogos a menudo trabajan con cepas de ratones endogámicas producidas por medio de 20 o más generaciones de apareamiento entre hermano y hermana. El ciclo de crianza rápido de los ratones hace que sean en particular idóneos para la producción de cepas endogámicas en las cuales la heterocigosidad de alelos que normalmente se encuentra en ratones exogámicos al azar es reemplazada por homocigosidad en todos los loci. La endogamia repetida durante 20 generaciones da una cepa endogámica cuya progenie es homocigótica e idéntica (singénica) en más de 99% de todos los loci. Se dispone de alrededor de 500 cepas endogámicas diferentes de ratones, cada una designada por medio de una serie de letras y/o números (cuadro 20-3) y casi todas estas cepas se encuentran disponibles en el comercio. También se han producido cepas endogámicas en ratas, conejillos de Indias (cobayos), hámsters, conejos y gallos domésticos.

Las cepas endogámicas recombinantes de ratones son aquellas en las cuales dos cepas endogámicas (p. ej., las cepas A y B) han sido apareadas, lo que da lugar a una recombinación dentro de un locus interesante (p. ej., el locus mhc). La endogamia subsiguiente de los animales con esta recombinación da lugar a una cepa endogámica de ratones que portan parte de su mhc de la cepa A y la otra del mhc de la cepa B. Los animales de esta cepa a continuación pueden usarse para determinar cuáles subregiones de un locus contribuyen a cuáles propiedades en el sistema inmunitario del animal. Esas cepas se usaron para delinear las funciones de proteínas clase 1 en contraposición con clase 2 codificadas por el locus de mhc.

Las cepas resistentes congénicas se usan para estudiar los efectos de loci de genes particulares sobre respuestas inmunitarias

Dos cepas de ratones son congénicas si son genéticamente idénticas excepto en un locus o región genético único. Por ende, cualesquier diferencias fenotípicas que pueden detectarse entre cepas congénicas deben estar codificadas en la región genética que difiere entre las dos cepas. Las cepas congénicas son idénticas una a otra excepto en que el mhc puede ser producido al tomar ratones F1 (primera generación filial) derivados del apareamiento de dos cepas (p. ej., A y B), cruzarlos, y después seleccionar los F2 (ratones de segunda generación) que rechazan un tumor de una de las cepas (p. ej., cepa A). Estos ratones deben ser homocigóticos para el mhc de la cepa B, porque si fueran heterocigóticos para A y B en el locus de mhc, aceptarían el tumor y morirían. En este punto, 50% de su material genético general se deriva de la cepa B. Empero, dentro de ese 50% están incluidos ambos alelos de mhc.

A continuación, estos ratones son retrocruzados a la cepa A, y se repite el proceso de cruce de la progenie y práctica de pruebas para los animales que rechazan el tumor de la cepa A. En cada generación retrocruzada, la fracción de los genes de fondo (no mhc) que se derivan de la cepa B es disminuida a la mitad, pero sólo se retienen los ratones homocigóticos para el mhc de la cepa B. Entre 15 y 20 rondas de estos cruces llevan a una nueva cepa de ratón que es cepa A en todo excepto en su mhc, que se deriva por completo de la cepa B. Esos ratones se denominan ratones A.B.

Los experimentos de transferencia adoptiva permiten el examen in vivo de poblaciones de células aisladas

Subpoblaciones de linfocitos aisladas a partir de un animal pueden inyectarse en otro animal de la misma cepa sin desencadenar una reacción de rechazo. Este tipo de sistema experimental permitió a los inmunólogos demostrar por vez primera que los linfocitos de un animal preparado con antígeno podían transferir inmunidad a un receptor singénico no preparado. Experimentos de transferencia adoptiva con el uso de subpoblaciones de linfocitos clasificadas también probaron la necesidad de células tanto T como B en la generación de una respuesta de anticuerpos.

Los sistemas de transferencia adoptiva permiten el examen in vivo de las funciones de poblaciones de células aisladas in vitro. Los modelos de transferencia adoptiva más sofisticados involucran la transferencia de células entre animales que difieren en un marcador alotípico que no desencadena una reacción de rechazo, pero permite al investigador dar seguimiento al destino de las células inyectadas usando un anticuerpo contra ese marcador. Otro protocolo de transferencia adoptiva comúnmente usado comprende la transferencia de células que han sido marcadas con fluorescencia hacia un animal receptor, de modo que se pueda dar seguimiento a su destino usando tecnologías de obtención de imágenes in vivo.

En algunos protocolos de transferencia adoptiva, es importante eliminar la capacidad de respuesta inmunitaria del huésped al exponerlo a rayos X para matar los linfocitos huésped, antes de la inyección de células donadas. Si las células hematopoyéticas del huésped podrían influir sobre un experimento de transferencia adoptiva, se utilizan cifras altas de rayos X (900 a 1 000 rad) para eliminar todo el sistema hematopoyético. Los ratones irradiados con esas dosis morirán a menos que se reconstituyan con médula ósea proveniente de un donante singénico.

Los animales transgénicos portan genes que han sido introducidos artificialmente

El desarrollo de técnicas para introducir genes extraños clonados (transgenes) hacia embriones de ratón ha permitido a los inmunólogos estudiar los efectos de muchos genes aislados sobre la respuesta inmunitaria in vivo. Si el gen introducido se integra de manera estable hacia células de la línea germinal, será transmitido a la descendencia.

El primer paso en la producción de ratones transgénicos es la inyección de dna clonado extraño hacia un huevo fecundado. En este proceso técnicamente demandante, huevos de ratón fecundados son mantenidos bajo succión en el extremo de una pipeta y se efectúa microinyección del transgén hacia uno de los pronúcleos con una aguja fina. En cierta fracción de las células inyectadas, el transgén se integra en el dna cromosómico del pronúcleo, y es pasado a las células hijas de huevos que sobreviven al proceso. Los huevos, o embriones tempranos, a continuación se implantan en el oviducto de hembras “seudopreñadas”, y las crías transgénicas nacen después de 19 o 20 días de gestación (figura 20-24).

Con ratones transgénicos, los inmunólogos han podido estudiar los patrones de expresión y las funciones de un gran número de transgenes dentro del contexto de animales vivos. Al construir un transgén con un promotor particular, los investigadores también pueden controlar artificialmente la expresión del transgén. Por ejemplo, la expresión de genes controlados por el promotor metalotioneína es activada por cinc, y los ratones transgénicos que portan un transgén enlazado a un promotor metalotioneína sólo expresarán el transgén cuando se añade cinc a su aporte de agua. Otros promotores sólo son funcionales en ciertos tejidos; el promotor de la insulina, por ejemplo, promueve la transcripción sólo en células pancreáticas.

Si un transgén es integrado en el dna cromosómico dentro del embrión de ratón de una célula, será integrado tanto en células somáticas como en células de la línea germinal. Así, los ratones transgénicos resultantes pueden transmitir el transgén a su descendencia como un rasgo mendeliano. De esta manera, ha sido posible producir líneas de ratones transgénicos en las cuales cada miembro de una línea contiene el mismo transgén. En la actualidad diversas líneas transgénicas de ese tipo se encuentran disponibles en el comercio o por medio de colaboraciones con los laboratorios productores.

Las tecnologías de introducción (knock-in) y deleción (knockout) reemplazan una copia de gen endógeno con una copia de gen no funcional o sometida a procedimientos de ingeniería

Una limitación de los ratones transgénicos que se generan como se describió es que el transgén es integrado al azar dentro del genoma. Esto significa que algunos transgenes se insertan en regiones del dna que no son activas desde el punto de vista transcripcional y, por ende, los genes no son expresados, mientras que otros pueden alterar genes vitales. A fin de sortear esta limitación los investigadores han desarrollado la tecnología para dirigir el gen deseado a sitios específicos dentro de la línea germinal de un animal, usando recombinación de dna homóloga. Esta técnica puede usarse para reemplazar el gen endógeno con una forma truncada, mutada o por lo demás alterada de ese gen, o de manera alternativa para reemplazar por completo el gen endógeno con una secuencia de dna que se elija. Por ejemplo, una forma no funcional de un gen puede usarse para reemplazar el alelo normal, a fin de determinar los efectos de la pérdida de la expresión del gen en el animal intacto. De manera alternativa, puede usarse tecnología de introducción (knock-in) para determinar cuándo y dónde es activado el promotor para un gen particular. En este último caso, un gen que codifica para una proteína fluorescente, como proteína fluorescente verde, puede someterse a procedimientos de ingeniería de manera específica hacia un sitio torrente abajo desde el promotor del gen de interés. Cada vez que el promotor es activado, las células en las cuales el promotor se activa brillarán de color verde. ¿Cómo podría lograrse esto?

Se describirá un método para la generación de ratones con deleción (knockout) usando recombinación de dna homóloga. Se aplican los mismos principios a la generación de ratones con introducción (knock-in), que simplemente usarían segmentos de gen diferentes unidos por los tramos homólogos de dna. La producción de ratones con deleción (knockout) dirigida a gen involucra los pasos que siguen:

• Aislamiento y cultivo de células madre (stem) embrionarias (es) a partir de la masa celular interna de un blastocisto de ratón.

• Generación de la forma alterada deseada del gen, unida por suficiente secuencia de dna proveniente del gen natural para facilitar la recombinación homóloga.

• Introducción del gen deseado en las células es cultivadas, y selección de células recombinantes homólogas en las cuales se ha incorporado el gen de interés. Pueden usarse técnicas de reacción en cadena de polimerasa (pcr) sensibles para determinar cuáles colonias de células es han incorporado el gen deseado hacia la ubicación correcta.

• Inyección de células es recombinantes homólogas en un blastocisto de ratón receptor, e implantación quirúrgica del blastocisto en una hembra de ratón seudopreñada.

• Apareamiento de descendencia quimérica heterocigótica para el gen alterado, para producir ratones con deleción (knockout) homocigóticos.

Las células es que se utilizan en este procedimiento se obtienen al cultivar la masa de células internas de un blastocisto de ratón en presencia de factores de crecimiento específicos, y sobre una capa alimentadora de fibroblastos. En estas condiciones, las células madre crecen pero permanecen pluripotentes. Una de las ventajas de las células es es la facilidad con la cual pueden ser manipuladas genéticamente. dna clonado que contiene un gen deseado puede introducirse en células es en cultivo por medio de diversas técnicas de transfección; el dna introducido será insertado mediante recombinación hacia el dna cromosómico de una pequeña fracción de éstas.

En un modelo de generación de ratones con deleción (knockout), las construcciones de inserción introducidas en células es contienen tres genes: el gen blanco de interés y dos genes de selección, como neo^R, que confiere resistencia a la neomicina, y el gen que codifica para la timidina cinasa del virus del herpes simple (tk^HSV) que confiere sensibilidad al ganciclovir, un análogo de nucleótido citotóxico (figura 20-25a). La construcción en este ejemplo es sometida a procedimientos de ingeniería con la secuencia de gen blanco alterada por el gen neo^R y con el gen tk^HSV en un extremo, más allá de la secuencia del gen blanco. Casi todas las construcciones se insertarán al azar mediante recombinación no homóloga más que por medio de inserción dirigida a gen por medio de recombinación homóloga. Las células en las cuales la construcción se inserta al azar retienen la expresión del gen tk^HSV, mientras que las células en las cuales la construcción se inserta por medio de recombinación homóloga pierden el gen tk^HSV y, por ende, la sensibilidad al ganciclovir (figura 20-25a). Se usa un esquema de selección de dos pasos para obtener las células es que han pasado por recombinación homóloga, por la cual el gen alterado reemplaza el gen blanco (figura 20-25b). Las células deseadas son resistentes tanto al ganciclovir como a la neomicina. Hay otros esquemas de selección, y científicos individuales eligen el que se adapta mejor a sus necesidades, pero este ejemplo ilustra algunos de los principios generales involucrados en la generación y la selección de las células con la alteración genética deseada.

Las células es obtenidas mediante este procedimiento serán heterocigóticas para la mutación de deleción (knockout) en el gen blanco. Estas células son expandidas de manera clonal en cultivo de células, e inyectadas en un blastocisto de ratón, que a continuación es implantado en una hembra seudopreñada. La descendencia transgénica que desarrolla es quimérica, compuesta de células derivadas de las células es alteradas genéticamente y células derivadas de células normales del blastocisto huésped. Cuando las células de la línea germinal se derivan de las células es alteradas genéticamente, la alteración genética puede pasarse a la descendencia. Si las células es recombinantes son homocigóticas para pelaje de color negro (u otro marcador visible), y son inyectadas en un blastocisto homocigótico para pelaje de color blanco, la progenie quimérica que porta la mutación con deleción (knockout) heterocigótica en su línea germinal puede identificarse fácilmente (figura 20-26). Cuando éstos son apareados entre sí, parte de la descendencia será homocigótica para la mutación con deleción (knockout).

El sistema Cre/Iox permite la deleción de gen inducible en tejidos seleccionados

Además de la deleción de genes mediante establecimiento de gen como objetivo, se han desarrollado estrategias experimentales que permiten la deleción específica de un gen de interés sólo en tejidos seleccionados. Esto permite a los investigadores determinar los efectos de la pérdida de la actividad de gen sólo en, por ejemplo, los tejidos del sistema inmunitario, incluso si la expresión de esos genes en otros tejidos es necesaria para la viabilidad del organismo. Estas tecnologías se fundamentan en el uso de recombinasas específicas para sitio provenientes de bacterias o levaduras.

La recombinasa de uso más común es Cre, aislada a partir del bacteriófago P1. Cre reconoce un sitio de 34 bp específico en el dna, conocido como loxP, y cataliza un evento de recombinación entre dos sitios loxP, de modo que el dna entre ambos sitios es eliminado. Por ende, los animales que expresan de modo omnipresente la recombinasa Cre eliminarán todas las secuencias flanqueadas por loxP, mientras que los animales que expresan Cre sólo en ciertos tejidos únicamente eliminarán secuencias flanqueadas por loxP en estos tejidos. Si la expresión del gen que codifica para la recombinasa Cre es colocada bajo el control de un promotor específico para tejido, ocurrirá deleción específica para tejido de cualquier dna que esté flanqueado por sitios loxP. Por ejemplo, uno podría expresar Cre en células B usando el promotor de inmunoglobulina, y esto daría lugar a la deleción dirigida de secuencias de dna flanqueadas por loxP sólo en células B.

Esta tecnología es en particular útil cuando la deleción dirigida de un gen particular en el animal entero tendría consecuencias mortales. Por ejemplo, el gen que codifica para la dna polimerasa β se requiere para el desarrollo embrionario y, por ende, la deleción de este gen en el animal entero daría lugar a letalidad embrionaria. En experimentos diseñados para eliminar el gen que codifica para la dna polimerasa β sólo en tejidos tímicos, los científicos flanquearon el gen que codifica para la dna polimerasa β de ratón con loxP y aparearon estos ratones con otros que portaban un transgén Cre bajo el control de un promotor de células T (figura 20-27). Los resultados de este apareamiento son descendencia que expresa la recombinasa Cre específicamente en células T, lo que permite a los científicos examinar los efectos de la deleción específica de la enzima dna polimerasa β en células T.

El sistema Cre/lox también puede usarse para activar la expresión de gen en un tejido particular. Del mismo modo que la falta de un gen particular puede ser mortal durante el desarrollo embrionario, la expresión de un gen puede ser tóxica. Para examinar expresión específica para tejido de un gen de ese tipo, es posible insertar una secuencia de paro de la traducción flanqueada por loxP hacia un intrón al inicio del gen (figura 20-27b). Al usar un promotor específico para tejido que impulsa la expresión de Cre, la secuencia de paro puede eliminarse en el tejido de elección, y examinar en este tejido la expresión del gen en potencia tóxico.

Algunos investigadores han combinado esta tecnología con el uso de un inductor artificial de la actividad de Cre para controlar precisamente cuándo se pierde el gen. Se han desarrollado ratones transgénicos que expresan proteínas de fusión en las cuales la recombinasa Cre está enlazada a una segunda proteína; por ejemplo, un receptor de estrógeno alterado diseñado para responder al fármaco tamoxifeno. Esta proteína de fusión Cre está diseñada de modo que Cre no es activa a menos que haya presente tamoxifeno. De este modo, es posible colocar la expresión de la proteína de fusión Cre bajo el control de un promotor específico para tejido, y cronometrar con precisión la deleción (knockout) del gen en ese tejido mediante la administración de tamoxifeno. Se han desarrollado otras proteínas de fusión similares que permiten que la expresión de Cre quede bajo el control de diversos antibióticos. Estas modificaciones de tecnología dirigida a gen han sido esenciales en la determinación de los efectos de genes particulares en células y tejidos del sistema inmunitario.

• Los anticuerpos policlonales son generados al inmunizar un animal con un antígeno (por lo general en complejo con un adyuvante) una o más veces, y después recuperar el antisuero.

• Los anticuerpos monoclonales son generados mediante fusión de una célula B productora de anticuerpos con un tumor de células B de vida prolongada.

• Cuando anticuerpos bivalentes o multivalentes se mezclan con antígeno, pueden formar una matriz con enlaces covalentes en solución, lo que da lugar a la formación de un inmunoprecipitado. La inmunoprecipitación puede usarse para purificar proteínas provenientes de un extracto de células o tejidos con detergente.

• Las reacciones de hemaglutinación miden la presencia de anticuerpos contra antígenos situados sobre eritrocitos. Las reacciones de inhibición de la hemaglutinación miden la presencia de anticuerpos contra los virus que inducen hemaglutinación, entre los que destaca el de la gripe.

• Las reacciones de aglutinación bacterianas miden la presencia de anticuerpos que se unen a cepas de bacterias específicas.

• Los radioinmunoensayos proporcionan medios sensibles para medir concentraciones de anticuerpo o antígeno al usar radiactividad. En los ensayos inmunosorbentes ligados a enzima (elisa) se utilizan anticuerpos conjugados con enzima para medir las concentraciones de antígeno y anticuerpo sin la necesidad de radioisótopos. Diferentes sistemas de enzima y sustrato permiten la adaptación de tecnología de elisa para aumentar la sensibilidad. Los sustratos pueden ser cromogénicos, fluorogénicos o quimioluminogénicos.

• Los anticuerpos conjugados con biotina pueden usarse con enzimas conjugadas con estreptavidina para aumentar la flexibilidad de elisa y otros ensayos.

• En la inmunoelectrotransferencia Western se utilizan anticuerpos para detectar la presencia de bandas de proteína particulares después de sds page y transferir las bandas hacia un soporte de fase sólida.

• La diálisis de equilibrio es una manera económica y relativamente fácil de medir la afinidad de anticuerpo por antígenos. La resonancia de plasmón de superficie mide las constantes de tasa en dirección anterógrada y reversa de unión a anticuerpos, además de constantes de asociación.

• En las técnicas de inmunocitoquímica e inmunohistoquímica se utilizan anticuerpos conjugados de modo covalente con enzimas para visualizar células y tejidos. Una vez que los anticuerpos están unidos, se añaden sustratos que son convertidos en productos que forman precipitados coloreados que se depositan en el sitio de unión a anticuerpo.

• En la microscopia inmunoelectrónica se utilizan anticuerpos conjugados con cuentas de oro a fin de visualizar a resolución alta estructuras unidas a anticuerpo. Los anticuerpos conjugados de manera covalente con sondas fluorescentes proporcionan imágenes vividas de estructuras bajo el microscopio de fluorescencia.

• Al usar un agujero puntiforme para sólo permitir imágenes de una profundidad de campo particular, la microscopia confocal permite la visualización de tejidos en diferentes planos focales. A continuación puede utilizarse software para recrear una imagen tridimensional del tejido. La microscopia de dos fotones o multifotón proporciona resolución adicional al requerir que dos o más fotones incidan de manera simultánea sobre una sonda fluorescente antes de que sea posible la emisión.

• Órganos enteros, como los ganglios linfáticos, pueden colocarse sobre una platina de microscopio calentada mientras se mantiene la circulación linfática y sanguínea. Al marcar células particulares in vivo con sondas fluorescentes particulares, pueden captarse imágenes intravitales de respuestas inmunitarias en proceso.

• La citometría de flujo permite mediciones cuantitativas de las frecuencias de células que se unen a anticuerpos o sustratos fluorescentes particulares, y permite la clasificación de células con base en sus propiedades de fluorescencia y de dispersión de luz.

• La separación de células basada en magnetismo puede usarse para clasificar células cubiertas con anticuerpos acopladas a cuentas o moléculas magnéticas.

• Las células que se están dividiendo captan timidina tritiada y la incorporan hacia dna de alto peso molecular; la radiactividad del dna puede medirse para proporcionar un indicador de división celular. El número de células que tienen metabolismo activo en un cultivo puede medirse mediante el ensayo mtt.

• La bromodesoxiuridina (BrdU) es un análogo de timidina que es incorporado hacia dna que se está replicando de manera activa. Pueden usarse anticuerpos contra BrdU para verificar si una célula se dividió después de la adición de BrdU al cultivo.

• El yoduro de propidio se intercala hacia la hélice de dna de una manera cuantitativa. Los perfiles citométricos de flujo de yoduro de propidio permiten el análisis del estado del ciclo celular de una población celular.

• El carboxifluoresceína diacetato succinimidil éster (cfse) se une a las proteínas citoplasmáticas de células de una manera cuantitativa; su concentración intracelular disminuye a la mitad con cada división celular. Por consiguiente, la fluorescencia de cfse puede usarse para medir el número de veces que una célula se ha dividido desde la adición del cfse.

• El ⁵¹Cr es liberado a partir de células premarcadas, en el momento de la muerte. Por ende, la liberación de ⁵¹Cr puede usarse para medir la extensión de muerte celular dentro de la población marcada.

• La anexina V marcada con fluoresceína se une a la fosfatidilserina expuesta sobre la superficie de células que están pasando por apoptosis y, por ende, puede usarse como una medida de la apoptosis en experimentos de inmunofluorescencia o de citometría de flujo.

• Las células apoptóticas pasan por fragmentación de dna. En el ensayo tunel se usa desoxirribonucleotidil transferasa terminal para añadir nucleótidos marcados a los extremos de dna expuestos en el momento de la fragmentación apoptótica. La cantidad de marca agregada es una medida de la extensión de la apoptosis.

• Las caspasas son activadas en células apoptóticas y, por consiguiente, ensayos de caspasa basados en fluorescencia o en inmunoelectrotransferencia Western proporcionan una medida de la apoptosis.

• Los inhibidores de enzimas que se sabe que son activos en las vías de señalización pueden usarse para verificar los componentes de vías recién descritas.

• La inmunoprecipitación y las pantallas de dos híbridos de levaduras son dos técnicas de uso común para identificar pares o grupos de proteínas que interactúan.

• La investigación en animales debe emprenderse de una manera congruente con estándares éticos altos, y está sujeta a pautas federales.

• Diferentes tipos de cepas de ratón han hecho una enorme contribución a la investigación inmunológica. Cepas de ratones endogámicas, congénicas-resistentes y endogámicas recombinantes han proporcionado, cada una, información valiosa a investigadores.

• Las técnicas de transferencia adoptiva introducen células tomadas de un animal y transferidas de diversas maneras hacia un segundo animal.

•  Los animales transgénicos portan genes que han sido introducidos de manera artificial. Las tecnologías de introducción (knock-in) y deleción (knockout) de gen permiten la introducción de formas alteradas o inactivas de genes hacia ubicaciones específicas en el genoma. El sistema de recombinasa Cre/lox permite a los investigadores dirigir genes alterados hacia ubicaciones específicas en el genoma de una manera inducible.

Sitios web útiles

www.currentprotocols.com/WileyCDA/CurPro3Title/isbn-0471142735.html Current Protocols in Immunology es un compendio de casi todas las técnicas usadas por inmunólogos actualizado frecuentemente.

Muchas de las fuentes más útiles de información sobre protocolos y productos son las que se encuentran en sitios web y en insertos de productos de fabricantes de reactivos importantes. La que sigue es una selección de los sitios web más útiles, pero se anima a los estudiantes a navegar en la red y comparar y contrastar protocolos de diferentes fabricantes antes de finalizar sus diseños experimentales.

www.miltenyibiotec.com/en/NN_628_Protocols.aspx Aquí se encuentran descripciones de protocolos para uso con cuentas magnéticas Miltenyi.

www.bdbiosciences.com/home.jsp La página principal de bd Biosciences proporciona mucha información acerca de citometría de flujo.

www.jax.org La página principal de los Jackson Laboratories proporciona información respecto a muchas cepas de ratones endogámicas, transgénicas y otras cepas de ratones útiles.

http://cre.jax.org/introduction.html Una introducción a tecnología de Cre-lox proporcionada por los Jackson Laboratories.

www.wikipedia.org

www.wikimedia.org Wikipedia y Wikimedia a menudo proporcionan información útil y actualizada, y enlaces a protocolos.

www.youtube.com

www.jove.com Tanto YouTube como JoVE proporcionan protocolos en video de muchos tipos de experimentos inmunológicos.

www.immunoportal.com

bitesizebio.com (“Brain Food for Biologists”) Estos dos sitios proporcionan protocolos y revisiones útiles de tecnologías modernas y que compiten.

www.virology.ws/2009/05/27/influenza-hemagglutination-inhibition-assay En este sitio se proporciona información sobre hemaglutinación viral o inhibición de hemaglutinación.

www.rockefeller.edu/bioimaging/ El sitio de imágenes de la Rockefeller University proporciona información útil y algunas imágenes bellas en su microscopio.

www.bd.com

www.invitrogen.com/site/us/en/home.html

www.promega.com

www.sigmaaldrich.com/united-states.html Estos sitios web están orientados hacia muchas aplicaciones, incluso biología molecular, bioquímica y citometría de flujo.

1. ¿Cuándo podría usted elegir usar una preparación de anticuerpo policlonal, en lugar de una monoclonal, y por qué?

2. Usted usó con buenos resultados un lote de sueros policlonales para inmunoprecipitar una proteína de interés. El análisis de la proteína precipitada mediante electroforesis en gel de poliacrilamida mostró una banda única, lo que indica una proteína pura. Con todo, cuando repitió el experimento usando un segundo lote del suero derivado del mismo animal, pero en una fecha posterior, su precipitado de proteína estuvo contaminado con otras proteínas que no se coprecipitaron la primera vez. ¿Por qué?

3. Para las aplicaciones que siguen, ¿optaría por usar una preparación de anticuerpos policlonales, un anticuerpo monoclonal, o más de un anticuerpo monoclonal para detectar su antígeno? Explique su respuesta.

   1. Aglutinación bacteriana

   2. Inmunoprecipitación

   3. Inmunoelectrotransferencia Western

   4. Detección de una citocina usando un elisa de fase sólida

   5. Tipificación de tejido diagnóstica

4. En la figura que sigue se ilustra un ensayo de inhibición de hemaglutinación. Muestra el cambio con el tiempo del título de anticuerpos de un recién nacido que sobrevivió a la epidemia de gripe H1N1 en 2009 en Tailandia. Los números a lo largo de la parte inferior de la placa representan la dilución de los sueros usados en el experimento. El suero más concentrado es una dilución de 10 veces del suero del paciente. En este experimento, sueros obtenidos en diferentes momentos y a partir de distintas fuentes se han diluido de manera seriada como se indicó. A continuación se han añadido virus de la gripe y eritrocitos a cada pozo en la placa, y se evaluó la capacidad de los diversos antisueros para inhibir hemaglutinación.

   

   En la hilera superior de esta placa se muestra la inhibición de la hemaglutinación que ocurre cuando se añade una muestra de anticuerpos anti-gripe control positivo a la combinación de virus y eritrocitos. Muestra que el suero puede diluirse hasta 1 en 320, y aún unirse al virus lo suficiente como para inhibir la hemaglutinación. La segunda hilera muestra la hemaglutinación que ocurre cuando el virus es añadido en ausencia de cualesquier anticuerpos neutralizantes; representa el control negativo en este experimento.

   Las seis hileras inferiores representan la capacidad de inhibición de la hemaglutinación del suero de la lactante que está sujeta al experimento. El suero diluido en las hileras 3 y 4 (duplicado) se extrajo de la lactante cuando tuvo 10 días de edad. El suero diluido en las hileras 5 y 6 se extrajo cuando la lactante tenía 24 días de edad, y el suero en las hileras 7 y 8, cuando la lactante tenía 42 días de edad.

   1. ¿El suero de la lactante contuvo cualesquier anticuerpos específicos para gripe cuando tuvo 10 días de edad?

   2. ¿Qué edad tenía la lactante antes de que su suero mostrara la misma capacidad de hemaglutinación que la muestra control positiva?

   3. ¿Es posible concluir a partir de este experimento que la lactante está sintetizando ella misma estos anticuerpos?

5. ¿Por qué podría usted elegir usar un ria en lugar de un elisa con sustratos cromogénicos convencionales? ¿Un elisa con un sustrato quimioluminogénico resolvería el problema?

6. Los sustratos usados en un ensayo elispot difieren de los que se emplean en un elisa convencional, pero pueden ser similares a, o idénticos a, los que se usan en inmunoelectrotransferencias Western. ¿Por qué?

7. 1. Usted acaba de montar su laboratorio y está trabajando con un presupuesto reducido hasta que escucha acerca de su primera subvención. Necesita medir la afinidad de un anticuerpo monoclonal en el cual está trabajando, y lo tiene disponible en forma marcada con radiactividad. ¿Qué método usaría, y por qué?

   2. Su experimento indica que usted ahora necesita saber la tasa de asociación de la interacción de anticuerpo-antígeno. Usted recibe buenas noticias acerca de su subvención. ¿Cómo procede?

8. ¿Qué ventajas ofrece la microscopia de dos fotones o multifotón sobre la microscopia confocal más tradicional?

9. ¿Cuándo podría usted elegir purificar poblaciones celulares con clasificación de células activadas por magnetismo, más que con clasificación de células activadas por fluorescencia, y cuándo podría usted elegir separación basada en fluorescencia en lugar de métodos basados en magnetismo?

10. Pregunta desafío. Esta pregunta debe responderse con referencia al cuadro 20-3 y el material de los capítulos 3 y 4.

    Ustedestá investigando la vía de señalización de una citocina recién descubierta que activa la transcripción de un grupo de genes bien definido. Descubre que la transcripción inducida por señal no ocurre en presencia de wortmanina, Ly294002 y BX795.

    1. ¿Cuáles dos enzimas implica esto como parte de su vía?

    2. ¿Qué factor de transcripción está implicado como mediador de la transcripción de los genes activados, y por qué?

    3. ¿Qué dominios de proteína espera encontrar sobre intermediarios de la vía torrente abajo desde la PI3 cinasa?

11. Pregunta de diseño experimental. Usted plantea que bajo condiciones de infección por un virus en particular virulento, las células B B-1 están entrando a regiones inflamadas del pulmón. ¿Cómo podría probar esta hipótesis?

12. Pregunta de diseño experimental. Usted desea efectuar deleción (knockout) de la expresión de un gen particular, sólo en células B, y desea realizar la deleción (knockout) sólo después de que usted ha expuesto sus células B a antígeno. ¿Qué construcciones genéticas necesita generar para este experimento?

1. Si yo deseara precipitar mi antígeno, podría elegir usar una preparación policlonal, porque contendría anticuerpos hacia múltiples determinantes diferentes sobre el antígeno y, por ende, muchas moléculas de anticuerpo podrían unirse por cada molécula de antígeno, lo que maximizaría las probabilidades de que al menos algunos de los anticuerpos pudieran unirse a más de un antígeno y facilitar precipitación.

2. Con el tiempo, la población de clonas de células B que muestran respuesta a un antígeno en un individuo cambiará. Algunas clonas de células B morirán y diferentes clonas predominarán. En general, la afinidad de los anticuerpos en el suero aumentará de acuerdo con los métodos descritos en el capítulo 12. Empero, esto significa que las proteínas con las cuales anticuerpos individuales mostrarán reacción cruzada cambiarán conforme el rango de sitios de unión modula, y esto es lo que ha sucedido en su experimento.

3. a) En circunstancias ideales, policlonal. Tendré la aglutinación más eficaz si los anticuerpos pueden formar enlaces covalentes en múltiples sitios sobre la superficie bacteriana. Con todo, un anticuerpo monoclonal también podría funcionar, puesto que casi todos los antígenos se repiten muchas veces sobre la superficie bacteriana. b) En circunstancias ideales, policlonal. Para formar un precipitado, necesitaré la formación de enlaces covalentes con múltiples proteínas. Si cada una sólo tiene un sitio en el cual puede unirse un anticuerpo, un anticuerpo bivalente puede formar enlaces covalentes con sólo dos proteínas, y eso sería insuficiente para crear un precipitado. Si estoy precipitando una proteína con múltiples copias del mismo sitio, los anticuerpos monoclonales aún podrían funcionar. c) Aquí, uno u otro funcionaría. El anticuerpo se une a la banda, lo cual localiza una reacción enzimática en la banda, y causa conversión de sustrato en producto. Una mezcla de anticuerpo policlonal tendría la ventaja de que diferentes anticuerpos podrían unirse en distintos determinantes antigénicos sobre la proteína blanco y, por ende, podrían dar lugar a una señal más fuerte. Aun así, diferentes muestras de sueros policlonales tendrían distintas magnitudes de reactividad cruzada con otros determinantes estructuralmente similares sobre otras proteínas. Los anticuerpos monoclonales se unirán a determinantes predecibles y, si bien aún podrían mostrar reacción cruzada con determinantes estructuralmente similares sobre otras proteínas, esas reactividades cruzadas son predecibles y no cambiarán de un lote a otro. d) Aquí, yo usaría dos anticuerpos monoclonales dirigidos hacia determinantes diferentes sobre la citocina. Si el anticuerpo de captura fuera a ser policlonal, de modo que todos los sitios de unión sobre la citocina fueran unidos, esto competiría con un anticuerpo de detección policlonal. e) Monoclonal. Aquí, la seguridad clínica demanda reproducibilidad de la reactividad y reactividad cruzada.

4. a) Sí. Hay cierta evidencia de hemaglutinación en el primer pozo, que representa una dilución de antisuero de 1 en 10. b) Hacia los 42 días de edad, el suero del lactante tiene la misma capacidad de inhibición de la hemaglutinación que la muestra control positiva. c) No. Éstos podrían ser anticuerpos maternos absorbidos por medio de la leche materna o el calostro.

5. Los ria son órdenes de magnitud más sensibles que las elisa con sustratos cromogénicos. Y sí, los sustratos quimioluminogénicos permiten más amplificación y mayor sensibilidad, lo que da lugar a un ensayo que iguala la capacidad del ria para medir concentraciones bajas de anticuerpos o antígenos.

6. Los ensayos elispot miden el número de células capaces de secretar moléculas particulares, como anticuerpos o citocinas. Por ende, estos ensayos requieren que cuando se convierte sustrato en producto, el producto permanezca en el sitio donde ocurrió la reacción de sustrato a producto. Por ende, los productos en reacciones elispot son insolubles. De modo similar, en ensayos de inmunoelectrotransferencia Western se usan anticuerpos para determinar la ubicación de bandas particulares sobre un gel. De nuevo, se requiere que el producto del ensayo enzimático permanezca localizado precisamente donde la enzima es unida.

7. a) Dado que el costo es un problema, y ya tengo el anticuerpo marcado, probablemente yo usaría diálisis de equilibrio. b) Los experimentos de resonancia de plasmón de superficie me permitirán medir la asociación, así como la constante de tasa de disociación, de la reacción de unión entre mi antígeno y anticuerpo.

8. Al usar luz de energía más baja, de longitud de onda más larga, la microscopia de dos fotones induce menos fotoblanqueamiento de la preparación de tejido. Además, puesto que no se emite fluorescencia a menos que dos fotones excitadores lleguen simultáneamente a la muestra, el plano focal de las imágenes observadas puede definirse de manera más estrecha.

9. La distribución de células activada por magnetismo es más útil para separaciones de poblaciones celulares hacia lotes. Es más rápida que los métodos basados en fluorescencia, pero no es tan precisa. Yo elegiría distribución basada en fluorescencia en situaciones en las cuales necesitara estar seguro de que no hay células contaminantes, porque en la facs las células son separadas literalmente una a la vez.

10. a) PI3 cinasa de IKKα. b) NFκB. La actividad de NFκB normalmente es inhibida por la unión del inhibidor de NFκB, IκB. Cuando las células son activadas por señales particulares, la cinasa ikk fosforila IκB, y lo establece como objetivo para destrucción, y permite el paso de NFκB hacia el núcleo, lo que activa la transcripción. c) Espero que una o más de las proteínas intermedias porte dominios de homología de plecstrina (ph), porque estos dominios se unen a PIP₃, que es el producto de la reacción catalizada por PI3 cinasa.

11. Hay muchas maneras de probar esta idea, pero aquí se ofrecerá sólo una, que hace uso de transferencia adoptiva y marcado fluorescente.

    Se generan células B B-1 en cultivo específicas para el virus en cuestión, y se cargan con cfse. Se inyectan las células en la cola de un ratón infectado por el virus, se permite que las células se alojen durante 12 a 24 h, y a continuación se sacrifica el ratón y se buscan células marcadas con cfse en el pulmón usando cortes de tejido e inmunofluorescencia.

12. Usaré una proteína de fusión de tamoxifeno/Cre cuya expresión esté bajo el control de un promotor específico para célula B, como el que controla la expresión de CD19. En consecuencia, Cre sólo será activa en células B, y sólo si añado el tamoxifeno y, por ende, puedo controlar exactamente cuándo ocurrirá direccionamiento de gen en referencia a inmunización con antígeno.

    También necesito generar una forma inactiva, truncada, del gen en cuestión, que es flanqueada por sitios loxP. En circunstancias ideales, el gen tendrá un marcador seleccionable, como resistencia a neomicina, y portará también una secuencia externa a los sitios loxP que controlará para inserción del gen hacia la ubicación correcta (figura 20-25a, izquierda).