CAPÍTULO 6: Enzimas

Sinopsis

LOS BIOQUÍMICOS HAN INVESTIGADO LAS ENZIMAS [CATALIZADORES BIOLÓGICOS] POR MÁS DE 130 AÑOS. MUCHO ANTES DE QUE TUVIERAN UNA COMPRENSIÓN realista de las bases físicas del estado vivo, los bioquímicos apreciaron de manera instintiva la importancia de las enzimas. Con la aplicación de tecnologías concebidas por los bioquímicos, los biólogos fueron determinando gradualmente las propiedades de los sistemas biológicos. Este trabajo demostró finalmente que casi todo proceso en los seres vivos sucede a causa de reacciones catalizadas por enzimas. Hasta fechas recientes todas las enzimas conocidas eran proteínas, pero investigaciones innovadoras revelaron que las moléculas de RNA también tienen propiedades catalíticas. Este capítulo trata sobre las proteínas catalíticas, mientras que las características de las moléculas catalíticas de RNA se describen en el capítulo 18.

Sin enzimas, la mayor parte de las miles de reacciones bioquímicas que sustentan los procesos vitales ocurrirían a velocidades imperceptibles. Determinaciones recientes de las velocidades de las reacciones no catalizadas (no mejoradas) en agua van desde 5 s para la hidratación del CO₂ hasta 1 100 millones de años para la descarboxilación de la glicina. En contraste, las reacciones catalizadas por enzimas suelen ocurrir en lapsos que van de los microsegundos a los milisegundos. De hecho, las enzimas son el medio por el cual los organismos canalizan el flujo de energía y materia. En la actualidad, como resultado de la acumulación de datos procedentes de la dinámica de proteínas (estudios de movimiento conformacional) y del análisis del hacinamiento macromolecular, la investigación de enzimas está experimentando cambios revolucionarios. Por ejemplo, según los puntos de vista tradicionales, el funcionamiento de las enzimas depende casi por completo de las formas complementarias y de las interacciones catalíticas entre las moléculas reactivas y sus sitios de unión más o menos flexibles. Sin embargo, en fechas recientes se demostró que la función catalítica de determinadas enzimas puede vincularse con movimientos internos que se extienden por toda la molécula de proteína. De modo similar, ahora se reconoce que las enzimas funcionan en condiciones muy distintas de aquellas en las que se han estudiado (p. ej., moléculas purificadas en baja concentración). Por el contrario, el ambiente in vivo de las enzimas es un medio hacinado parecido a un gel. Como resultado de investigaciones recientes, los modelos de la cinética enzimática están evolucionando y los métodos de experimentación, de colecta de datos y de simulación se hacen más sofisticados y más próximos a las condiciones reales in vivo. En el presente capítulo se revisan las propiedades estructurales y funcionales de las enzimas.

Las enzimas poseen varias propiedades notables (cuadro 6.1). En primer lugar, las velocidades de las reacciones catalizadas por enzimas a menudo son espectacularmente elevadas. Se han observado aumentos de la velocidad de 10⁷ a 10¹⁹ veces. En segundo lugar, en marcado contraste con los catalizadores inorgánicos las enzimas son sumamente específicas para las reacciones que catalizan, y rara vez forman productos secundarios. Por último, debido a sus estructuras relativamente grandes y complejas, las enzimas pueden regularse. Esto es en particular importante en los seres vivos, que deben conservar energía y materias primas. ¿Cómo funcionan las enzimas? Para responder a esta pregunta es necesario revisar la función de los catalizadores. Por definición, un catalizador aumenta la velocidad de una reacción química, pero no se altera de forma permanente por la reacción. Los catalizadores realizan esta hazaña debido a que disminuyen la energía de activación que se requiere para una reacción química. En otras palabras, los catalizadores ofrecen una vía de reacción alterna que requiere menos energía (fig. 6.1). En el ápice de ambas vías de reacción de la figura 6.1 se produce un estado de transición. La energía libre de activación, ΔG^‡, se define como la cantidad de energía para convertir 1 mol de moléculas de sustrato (reactivo) desde el estado basal (la forma estable de baja energía de una molécula) al estado de transición. En la reacción de oxidación del etanol para formar acetaldehído

este estado de transición podría observarse como

Obsérvese que el H alcohólico está empezando a separarse como un ion H⁺ y el H del metileno está empezando a partir como ion hidruro (H:⁻)

Para que ocurran a una velocidad útil, la mayoría de las reacciones químicas requiere un aporte inicial de energía. A temperaturas por encima del cero absoluto (−273.1°C o 0 K), todas las moléculas poseen energía vibratoria, que aumenta al calentar las moléculas. Considere la siguiente reacción espontánea:

Conforme aumenta la temperatura, las moléculas que vibran (A y B) tienen mayor probabilidad de chocar. Una reacción química ocurre cuando las moléculas que chocan poseen una cantidad mínima de energía denominada energía de activación (E_a) o, con mayor frecuencia en bioquímica, energía libre de activación (ΔG^‡). No todas las colisiones producen reacciones químicas, debido a que sólo una fracción de las moléculas posee la energía suficiente o la orientación correcta para reaccionar (p. ej., para romper los enlaces o para reagrupar los átomos en moléculas de producto). Se pueden incrementar las colisiones aumentando la temperatura de la reacción o la concentración de los reactivos para aumentar las velocidades de formación de productos. Sin embargo, elevar la temperatura en los sistemas vivos es poco realista por el daño estructural a las biomoléculas, y la concentración de la mayoría de los reactivos es relativamente baja. Los seres vivos utilizan enzimas para eludir estas restricciones. Cada tipo de enzima contiene una superficie de unión única e intrincada, que se denomina sitio activo. Cada sitio activo es una hendidura o grieta en una gran molécula de proteína en la que se pueden unir moléculas de sustrato en una orientación que favorece la catálisis. Sin embargo, el sitio activo es más que un sitio de unión. Varias de las cadenas laterales de los aminoácidos que recubren este sitio participan de forma activa en el proceso catalítico.

La forma y la distribución de la carga del sitio activo de una enzima limitan los movimientos y las conformaciones permitidas del sustrato, haciendo que éste se asemeje más al estado de transición. En otras palabras, la estructura del sitio activo se utiliza para orientar de forma óptima al sustrato. Como resultado, el complejo enzima-sustrato se convierte en producto y enzima libre sin el requerimiento de alta energía del estado de transición limitado. Como consecuencia, la velocidad de reacción se incrementa en grado significativo respecto a la de la reacción no catalizada. Varios factores más (que se describen en la sección 6.4) también contribuyen al incremento de la velocidad.

Las enzimas, como todos los catalizadores, no alteran el equilibrio de la reacción, sino que aumentan la velocidad hacia el equilibrio. Considere la siguiente reacción reversible:

Sin un catalizador, el reactivo A se convierte a producto B a una determinada velocidad. Debido a que es una reacción reversible, B también se convierte en A. La expresión de la velocidad para la reacción directa es k_F[A]ⁿ, y para la reacción inversa es k_R[B]^m. Los superíndices n y m representan el orden de la reacción, que refleja el mecanismo por el que A se convierte en B, y viceversa. Un orden de reacción de 2 para la conversión de A en B indica que es un proceso bimolecular y que las moléculas de A deben colisionar para que se produzca la reacción (sección 6.3). En el equilibrio, las velocidades de las reacciones directa e inversa son iguales:

que se reagrupa a

El cociente de las constantes directa e inversa es la constante de equilibrio:

Por ejemplo, en la ecuación (3), si m = n = 1 y k_F = 1 × 10⁻³ s⁻¹ y k_R = 1 × 10⁻⁶ s⁻¹, entonces:

En el equilibrio, por lo tanto, la proporción entre los productos y los reactivos es de 1 000 a uno.

En una reacción catalizada, las velocidades de reacción directa e inversa aumentan, pero la K_eq (en este caso 1 000) permanece sin cambio. Si el catalizador aumenta tanto la velocidad directa como la inversa por un factor de 100, entonces la velocidad directa se hace 100 000, y la inversa se transforma en 100. Debido al impresionante aumento de la velocidad de la reacción directa que hace posible el catalizador, el equilibrio se alcanza en segundos o minutos, en lugar de horas o días.

Es importante reconocer que la teoría del equilibrio químico supone condiciones ideales. Por ejemplo, las soluciones ideales contienen solutos en tan baja concentración que no existen interacciones como la repulsión estérica o las fuerzas de atracción. Sin embargo, la mayoría de las reacciones que ocurren en solución se desvía de la idealidad. En tales circunstancias, las constantes de equilibrio se basan no en las concentraciones de soluto, sino en actividades, cantidades llamadas concentraciones efectivas que toman en cuenta las interacciones intermoleculares. La concentración efectiva o actividad (a) de un soluto es igual a:

donde γ es un factor de corrección denominado coeficiente de actividad, que depende del tamaño y de la carga de la especie y de la fuerza iónica de la solución en que la especie está reaccionando, y c es la concentración en moles por litro. El impacto de este fenómeno puede ser considerable. Por ejemplo, la capacidad de unión al oxígeno de la hemoglobina, la proteína predominante en los eritrocitos, difiere en varios órdenes de magnitud dependiendo de si se mide dentro de los eritrocitos o en un amortiguador diluido. La constante de equilibrio para una reacción en condiciones no ideales está dada por:

donde $Keqi$ es la constante ideal y Γ es el factor de no idealidad, que es el cociente de los coeficientes de actividad de los productos y de los reactivos. Debe hacerse notar que los bioquímicos tradicionalmente han minimizado las interacciones inespecíficas al realizar las investigaciones de enzimas y de otras moléculas en soluciones diluidas. En el último decenio se ha hecho cada vez más evidente que es necesario reevaluar la suposición de condiciones ideales. En consecuencia, muchos investigadores usan ahora “agentes de hacinamiento” de alto peso molecular como el dextrán (un polímero de glucosa producido por algunas bacterias) o albúmina sérica para simular las condiciones intracelulares en los estudios enzimáticos. Los experimentos con enzimas en presencia de agentes de hacinamiento son más parecidos a aquellos en que se realizan mediciones directas in vivo, pero el ambiente del experimento sigue siendo demasiado homogéneo y difiere en grado significativo de las condiciones heterogéneas hacinadas in vivo. Diseñar experimentos y modelos que reproduzcan las condiciones in vivo es un desafío para los bioquímicos actuales.

La especificidad enzimática es una propiedad de las enzimas que se explica en parte por el modelo de llave y cerradura propuesto por Emil Fischer en 1890. Cada enzima se une a un solo tipo de sustrato debido a que el sitio activo y el sustrato poseen estructuras complementarias. La forma global del sustrato y su distribución de carga le permiten entrar e interactuar con el sitio activo de la enzima. En una variante moderna del modelo de llave y cerradura propuesta por Daniel Koshland, denominada modelo de ajuste inducido, se toma en cuenta la estructura flexible de las proteínas (fig. 6.2). En este modelo, el sustrato no se ajusta con precisión a un sitio activo rígido. En vez de ello, las interacciones no covalentes entre la enzima y el sustrato modifican la estructura tridimensional del sitio activo, adecuando la forma de éste a la del sustrato en su conformación de estado de transición.

Aunque la actividad catalítica de algunas enzimas sólo depende de las interacciones entre los aminoácidos del sitio activo y el sustrato, otras enzimas requieren componentes no proteínicos para realizar sus actividades. Los cofactores enzimáticos pueden ser iones, como el Mg²⁺ o el Zn²⁺, o moléculas orgánicas complejas denominadas coenzimas. El componente proteínico de una enzima que carece de un cofactor esencial se denomina apoenzima. Las enzimas intactas con sus cofactores unidos se denominan holoenzimas.

Las actividades de algunas enzimas pueden regularse. Los ajustes de la velocidad de las reacciones catalizadas por las enzimas permiten a las células responder con eficacia a los cambios en el ambiente. Los organismos pueden controlar las actividades enzimáticas de forma directa, principalmente mediante la unión de activadores o inhibidores, la modificación covalente de las moléculas enzimáticas, o de manera indirecta regulando la síntesis de enzimas. (El control de la síntesis de enzimas requiere de cambios en la expresión génica, un tema que se considera en los capítulos 18 y 19.)

En la primera época de la bioquímica, las enzimas se denominaban según el capricho de sus descubridores. Con frecuencia, los nombres no proporcionaban indicios sobre su función (p. ej., tripsina), o se utilizaban varios nombres para la misma enzima. Las enzimas solían llamarse añadiendo el sufijo -asa al nombre del sustrato. Por ejemplo, la ureasa cataliza la hidrólisis de la urea. Para eliminar la confusión, la Unión Internacional de Bioquímica (IUB, International Union of Biochemistry) instituyó un esquema sistemático para nombrar a las enzimas. Ahora cada enzima se clasifica y se nombra según la clase de reacción química que cataliza. En este esquema, a cada enzima se le asigna una clasificación de cuatro números y un nombre con dos partes denominado nombre sistemático. Además, la IUB sugiere para el uso cotidiano una versión más corta del nombre sistemático denominada nombre recomendado. Por ejemplo, a la alcohol:NAD⁺ oxidorreductasa (E.C. 1.1.1.1) de forma habitual se le llama alcohol deshidrogenasa. (Las letras E.C. son la abreviatura de Enzyme Commission, Comisión de enzimas, de la IUB.) Debido a que muchas enzimas fueron descubiertas antes de instituirse la nomenclatura sistemática, en muchos casos se conservaron los nombres antiguos ya establecidos.

Las seis categorías principales de enzimas son las siguientes:

1. Oxidorreductasas. Las oxidorreductasas catalizan reacciones redox en las cuales cambia el estado de oxidación de uno o más átomos en una molécula. La oxidación-reducción en los sistemas biológicos implica reacciones de transferencia de uno o dos electrones acompañadas del cambio compensatorio en la cantidad de hidrógeno y de oxígeno en la molécula. Son ejemplos notables las reacciones redox facilitadas por las deshidrogenasas y las reductasas. Por ejemplo, la alcohol deshidrogenasa cataliza la oxidación de etanol y de otros alcoholes, y la reductasa de ribonucleótido cataliza la reducción de ribonucleótidos para formar desoxirribonucleótidos. Las oxigenasas, las oxidasas y las peroxidasas se encuentran entre las enzimas que utilizan O₂ como aceptor de electrones.

2. Transferasas. Las transferasas transfieren grupos moleculares de una molécula donadora a una aceptora. Entre tales grupos están el amino, el carboxilo, el carbonilo, el metilo, el fosforilo y el acilo (RC=O). Los nombres comunes de las transferasas a menudo incluyen el prefijo trans; son ejemplos las transcarboxilasas, las transmetilasas y las transaminasas.

3. Hidrolasas. Las hidrolasas catalizan reacciones en las que se logra la rotura de enlaces como C—O, C—N y O—P por la adición de agua. Entre las hidrolasas están las esterasas, las fosfatasas y las proteasas.

4. Liasas. Las liasas catalizan reacciones en las que ciertos grupos (p. ej., H₂O, CO₂ y NH₃) se eliminan para formar un doble enlace, o se añaden a un doble enlace. Son ejemplos de liasas las descarboxilasas, las hidratasas, las deshidratasas, las desaminasas y las sintasas.

5. Isomerasas. Las isomerasas, un grupo heterogéneo de enzimas, catalizan varios tipos de reordenamientos intramoleculares. Las isomerasas de los azúcares interconvierten aldosas (azúcares que contienen aldehídos) en cetosas (azúcares que contienen cetona). Las epimerasas catalizan la inversión de átomos de carbono asimétricos y las mutasas catalizan la transferencia intramolecular de grupos funcionales.

6. Ligasas. Las ligasas catalizan la formación de enlaces entre dos moléculas de sustrato. Por ejemplo, la DNA ligasa une fragmentos de cadenas de DNA. Los nombres de muchas ligasas incluyen el término sintetasa. Varias otras ligasas se denominan carboxilasas.

En el cuadro 6.2 se proporciona un ejemplo de cada clase de enzima.

En el capítulo 4 se mencionó que los principios de la termodinámica pueden predecir la espontaneidad de una reacción pero no su velocidad. La velocidad de una reacción bioquímica se define como el cambio de la concentración de un reactivo o producto por unidad de tiempo. La velocidad inicial v₀ de la reacción A → P, donde A y P son moléculas de sustrato y de producto, respectivamente, es:

La velocidad inicial (v₀) es la velocidad de una reacción cuando la [A] es mucho mayor que la concentración de la enzima E, [E], y el tiempo de reacción es muy corto. Las mediciones de v₀ se realizan justo después de mezclar la enzima y el sustrato porque es posible suponer que la reacción inversa (p. ej., la conversión del producto en sustrato) aún no ha ocurrido en un grado apreciable.

El estudio cuantitativo de la catálisis enzimática, conocido como cinética enzimática, proporciona información sobre las velocidades de reacción. Los estudios cinéticos también miden la afinidad de las enzimas por los sustratos y por los inhibidores y permiten entrever los mecanismos de reacción. A su vez, la cinética enzimática ayuda a comprender las fuerzas que regulan las vías metabólicas. La velocidad de la reacción A → P es proporcional a la frecuencia con la que las moléculas que reaccionan forman el producto. La velocidad de reacción es:

Combinando las ecuaciones (6) y (7), se obtiene:

El orden de reacción es la suma de los exponentes de los términos de concentración en la expresión de velocidad, se determina de forma empírica, es decir, mediante experimentación (fig. 6.3). La determinación del orden de una reacción permite obtener ciertas conclusiones del mecanismo de la reacción. Se dice que una reacción sigue una cinética de primer orden si la velocidad depende de la primera potencia de la concentración de un solo reactivo y sugiere que el paso limitante de la velocidad es una reacción unimolecular (p. ej., no se requieren colisiones moleculares). En la reacción A → P se supone que la ecuación experimental de velocidad es:

Si [A] se duplica, se observa que la velocidad también. La reducción de [A] a la mitad reduce la velocidad de reacción observada a la mitad. En las reacciones de primer orden la concentración del reactivo es una función del tiempo, de modo que k se expresa en unidades de s⁻¹. En cualquier reacción, el tiempo que se requiere para que se consuma la mitad de las moléculas reaccionantes se denomina vida media (t_1/2).

En la reacción A + B → P, si el orden de A y B es uno en cada caso, se dice que la reacción es de segundo orden y A y B deben colisionar para que se forme el producto (una reacción bimolecular):

En estas circunstancias, la velocidad de reacción depende de las concentraciones de los dos reactivos. En otras palabras, tanto A y B, forman parte del paso determinante de la velocidad de reacción. Las constantes de velocidad de segundo orden se miden en unidades de M⁻¹s⁻¹.

Algunas veces las reacciones de segundo orden incluyen reactivos como el agua que están presentes en gran exceso:

La expresión de velocidad de segundo orden es:

Sin embargo, la reacción parece ser de primer orden debido a que el agua se encuentra presente en exceso y la [H₂O] es en esencia constante. Estas reacciones se dice que son de seudo-primer orden. Las reacciones de hidrólisis en los sistemas bioquímicos se tratan como de seudo-primer orden debido a la sustantiva disponibilidad del segundo reactivo, el H₂O, en los ambientes acuosos.

Otra posibilidad es que sólo uno de los dos reactivos participe en el paso determinante de la velocidad y aparezca solo en la expresión de velocidad. En el ejemplo anterior, si la velocidad es igual a k[A]², entonces el paso limitante de la velocidad implica colisiones entre moléculas de A. El agua participa en un paso rápido que no limita la velocidad en el mecanismo de la reacción.

Cuando la adición de un reactivo no altera la velocidad de una reacción, se dice que ésta es de orden cero para dicho reactivo. En la reacción A → P, la expresión de velocidad determinada experimentalmente bajo tales condiciones es

La velocidad es constante debido a que la concentración del reactivo es suficientemente elevada para saturar todos los sitios catalíticos en las moléculas enzimáticas. En el problema 6.1 se da un ejemplo para determinar el orden de reacción.

El orden de reacción también puede caracterizarse de otra manera. Es posible usar un término teórico para caracterizar reacciones simples: la molecularidad se define como el número de moléculas que colisionan en una reacción de un solo paso. Una reacción unimolecular A → B tiene molecularidad de uno, mientras que una reacción bimolecular A + B → C + D tiene molecularidad de dos.

Cinética de Michaelis-Menten

Uno de los modelos más útiles en la investigación sistemática de las velocidades enzimáticas fue propuesto por Leonor Michaelis y Maud Menten en 1913. El concepto del complejo enzima-sustrato, enunciado por vez primera por Victor Henri en 1903, es fundamental para el modelo cinético de Michaelis-Menten. Cuando el sustrato S se une al sitio activo de una enzima E, se forma un complejo intermedio (ES). Durante el estado de transición el sustrato se convierte en producto. Tras un lapso breve, el producto se disocia de la enzima. Este proceso puede resumirse así:

La ecuación (13) ignora la reversibilidad del paso en el que el complejo ES se convierte en enzima y producto. Se permite esta simplificación si la velocidad de reacción se cuantifica cuando la [P] es aún muy baja. Recuérdese que en la mayoría de los estudios cinéticos se determinan las velocidades iniciales. Además, muchas enzimas tienen poca afinidad por el producto, de modo que es poco probable la reacción inversa.

Según el modelo de Michaelis-Menten, tal como se concibe en la actualidad, se asume que (1) k₋₁ es despreciable en comparación con k₁, y (2) la velocidad de formación de ES es igual a la velocidad de su degradación durante la mayor parte del curso de la reacción (p. ej., [ES] permanece igual durante toda la reacción). Esta última premisa se denomina suposición del estado estacionario de equilibrio dinámico. La expresión general de la velocidad de reacción es

Para que sea de utilidad, la velocidad de una reacción debe definirse en términos de [S] y [E]. La velocidad de formación de ES es igual a k₁[E][S], mientras que la velocidad de disociación de ES es igual a (k₋₁ + k₂)[ES]. La suposición del estado estacionario iguala estas dos velocidades:

Michaelis y Menten introdujeron una nueva constante, K_m (conocida como constante de Michaelis):

También derivaron la ecuación:

donde V_máx = velocidad máxima que puede alcanzar la reacción. Esta ecuación, conocida ahora como ecuación de Michaelis-Menten, ha demostrado ser muy útil para definir determinados aspectos del comportamiento enzimático. Por ejemplo, cuando [S] es igual a K_m, el denominador de la ecuación (18) es igual a 2[S], y v es igual a V_máx/2 (fig. 6.4). El valor de K_m determinado experimentalmente (medido en moles por litro de sustrato) se considera una constante que es característica de la enzima y el sustrato en condiciones específicas. Puede reflejar la afinidad de la enzima por su sustrato. (Si k₂ es mucho menor que k_–1, es decir, k₂ << k_–1, entonces el valor de K_m se aproxima a k₁. En estas circunstancias, K_m es la constante de disociación del complejo ES.) Cuanto menor es el valor de K_m, menor es la [S] requerida para llegar a 1/2 V_máx y, por lo tanto, mayor es la “afinidad” de la enzima por el sustrato.

Las propiedades cinéticas de una enzima también se utilizan para determinar su eficiencia catalítica. El número de recambio (k_cat) de una enzima se define como:

En condiciones fisiológicas, [S] es usualmente mucho menor que K_m. Se obtiene una medida más útil de la eficacia catalítica reordenando la ecuación (19) de la siguiente forma:

y sustituyendo esta función en la ecuación de Michaelis-Menten (ecuación 18):

Cuando [S] es muy baja, [E_t] es aproximadamente igual a [E] y la ecuación (21) se reduce a:

En la ecuación (22) el término k_cat/K_m, también llamado constante de especificidad, es la constante de velocidad de segundo orden para una reacción en la que [S] << K_m, una situación común en los sistemas biológicos. En esta reacción, la [S] es lo suficientemente baja para que el valor de k_cat/K_m refleje la relación entre la velocidad catalítica y la afinidad de unión del sustrato. Un sustrato con elevada constante de especificidad tendrá baja K_m (alta afinidad) y elevada eficiencia cinética (alto número de recambio). La constante de especificidad puede ser muy útil cuando se comparan diferentes sustratos para la misma enzima. Cuando la [S] es baja y la [E_t] puede cuantificarse de manera exacta, se cumple la ecuación (22). En el cuadro 6.3 se proporcionan ejemplos de valores de k_cat, K_m y k_cat/K_m de algunas enzimas. Debe tenerse en cuenta que el límite superior del valor de k_cat/K_m para una enzima no puede exceder del valor máximo de la velocidad a la que la enzima puede unirse a las moléculas de sustrato (k₁). Este límite es impuesto por la velocidad de difusión del sustrato al sitio activo de la enzima. El límite del control de difusión de las reacciones enzimáticas es aproximadamente 10⁸ a 10⁹ M⁻¹s⁻¹. Varias enzimas, como las del cuadro 6.3, poseen valores de k_cat/K_m que se aproximan al límite del control de difusión. Debido a que dichas enzimas convierten el sustrato a producto prácticamente cada vez que el sustrato se difunde al sitio activo, se dice que han conseguido la perfección catalítica. Para enzimas en vías bioquímicas que no logran este grado elevado de eficiencia catalítica, los seres vivos superan el límite del control de difusión organizándolas en complejos multienzimáticos. En estos complejos, los sitios activos de las enzimas están tan próximos que la difusión no es un factor en la transferencia de las moléculas de sustrato y de producto.

La actividad enzimática se expresa en unidades internacionales (UI). Una UI se define como la cantidad de enzima que produce 1 μmol de producto por minuto. La actividad específica de una enzima, una magnitud que se utiliza para supervisar la purificación de la enzima, se define como el número de unidades internacionales por miligramo de proteína. [Recientemente se introdujo una nueva unidad de medida de la actividad enzimática, denominada katal. Un katal (kat) indica la cantidad de enzima que transforma 1 mol de sustrato por segundo. Un katal es igual a 6 × 10⁷ UI.]

Gráficas de Lineweaver-Burk

Los valores de K_m y V_máx para una enzima se determinan cuantificando las velocidades iniciales de la reacción a varias concentraciones de sustrato. Se pueden obtener valores aproximados de K_m y V_máx construyendo una gráfica como la de la figura 6.4. Con una transformación algebraica de los datos se puede derivar una determinación más exacta de esos valores. La ecuación de Michaelis-Menten, cuya gráfica es una hipérbola,

puede reordenarse obteniendo su expresión recíproca:

Se trazan los recíprocos de las velocidades iniciales frente a los recíprocos de las concentraciones de sustrato. En una gráfica de estas características, conocida como gráfica de dobles recíprocos de Lineweaver-Burk, la línea recta que se genera tiene la forma y = mx + b, donde y y x son variables (1/v y 1/[S], respectivamente) y m y b son constantes (K_m/V_máx y 1/V_máx, en el mismo orden). La pendiente de la línea recta es K_m/V_máx (fig. 6.6). Como se indica en la figura 6.6, la intercepción sobre el eje vertical es 1/V_máx. La intercepción sobre el eje horizontal es −1/K_m.

El siguiente es un ejemplo de un problema de cinética que utiliza la gráfica de Lineweaver-Burk.

Reacciones de sustratos múltiples

La mayoría de las reacciones bioquímicas implican dos o más sustratos. La reacción de sustratos múltiples (o multisustrato) más común, la reacción de dos sustratos, se representa como:

En la mayoría de estas reacciones ocurre la transferencia de un grupo funcional específico desde un sustrato hacia el otro (p. ej., grupos fosfato o metilo), o bien se realizan reacciones de oxidación-reducción en las que las coenzimas redox (p. ej., NAD⁺/NADH o FAD/FADH₂) son los sustratos. El análisis cinético de reacciones de dos sustratos es por necesidad más complicado que el de las reacciones con un sustrato. Sin embargo, para la mayoría de los casos a menudo basta con la determinación de la K_m para cada sustrato (cuando el otro está presente en cantidades de saturación). Con base en el análisis cinético, las reacciones multisustrato pueden dividirse en dos clases: secuenciales y de doble desplazamiento.

REACCIONES SECUENCIALES Una reacción secuencial no puede proceder sino hasta que todos los sustratos se han unido al sitio activo de la enzima. Existen dos mecanismos secuenciales posibles: el ordenado y el aleatorio. En un mecanismo ordenado de dos sustratos, el primer sustrato debe unirse a la enzima antes que el segundo para que la reacción proceda hasta la formación de producto. La notación para tales reacciones, creada por W. W. Cleland, es

En un mecanismo secuencial aleatorio, los sustratos pueden unirse en cualquier orden y los productos se pueden liberar en cualquier orden.

REACCIONES DE DOBLE DESPLAZAMIENTO En un mecanismo de doble desplazamiento, o de “ping-pong”, el primer producto se libera antes de que el segundo sustrato se una.

En tal reacción, la enzima es modificada por la primera fase de la reacción; su forma original se restablece durante la segunda fase, en la que el segundo sustrato es convertido en producto.

Inhibición enzimática

La actividad de las enzimas puede ser inhibida. Las moléculas que reducen la actividad de una enzima, denominadas inhibidores, incluyen muchos fármacos, antibióticos, conservadores alimentarios, venenos y metabolitos de procesos bioquímicos normales. Las investigaciones sobre la inhibición y los inhibidores enzimáticos llevadas a cabo por los bioquímicos son importantes por varias razones. Lo primero y más notable es que en los seres vivos la inhibición enzimática es un medio importante para regular las vías metabólicas. Una gran cantidad de pequeñas biomoléculas son utilizadas comúnmente para modular las velocidades de reacciones enzimáticas específicas de modo que las necesidades del organismo sean satisfechas de manera consistente. En segundo lugar, numerosos tratamientos clínicos se fundamentan en la inhibición enzimática. Por ejemplo, muchos antibióticos y otros fármacos reducen o suprimen la actividad de enzimas específicas. El tratamiento más eficaz contra el SIDA utiliza varios fármacos que incluyen inhibidores de proteasas, moléculas que desactivan a una enzima vírica que se requiere para formar nuevos virus. Por último, las investigaciones sobre la inhibición enzimática han permitido a los bioquímicos desarrollar técnicas para indagar la arquitectura física y química y las propiedades funcionales de las enzimas.

La inhibición enzimática puede ser reversible o irreversible. La inhibición reversible ocurre cuando el efecto inhibitorio de un compuesto se puede contrarrestar incrementando la concentración del sustrato o retirando el compuesto inhibidor mientras la enzima permanece intacta. La inhibición reversible es competitiva si el inhibidor y el sustrato se unen al mismo sitio, no competitiva si el inhibidor se une a un sitio distinto del sitio activo y acompetitiva si el sitio de unión al inhibidor se crea después de que el sustrato se une a la enzima. La inhibición irreversible ocurre cuando la unión al inhibidor desactiva de manera permanente la enzima, por lo común a través de una reacción covalente que la modifica químicamente.

INHIBIDORES COMPETITIVOS Los inhibidores competitivos se unen de forma reversible a la enzima libre, y no al complejo ES, para formar un complejo enzima-inhibidor (EI, enzyme-inhibitor).

El sustrato y el inhibidor compiten por el mismo sitio en la enzima. Tan pronto como el inhibidor se une, el acceso del sustrato al sitio activo queda bloqueado. La concentración del complejo EI depende de la concentración del inhibidor libre y de la constante de disociación K_I:

donde K_I es una medida de la afinidad de unión de la enzima al inhibidor.

Debido a que el complejo EI se disocia con facilidad, la enzima queda disponible de nuevo para unirse con el sustrato. En presencia de un inhibidor competitivo, la actividad de la enzima disminuye al aumentar K_m, sin que cambie V_máx (fig. 6.8), porque el complejo EI no participa en el proceso catalítico. Como V_máx no cambia, el efecto de un inhibidor competitivo sobre la actividad se revierte al aumentar la concentración de sustrato. A [S] elevadas, todos los sitios activos se llenan con el sustrato y la velocidad de reacción alcanza el valor que se observa sin el inhibidor. La ecuación de Michaelis-Menten para la inhibición competitiva que toma en cuenta la formación de [EI] se obtiene incorporando un término para el efecto del inhibidor sobre K_m:

donde α = 1+[I]/K_i. El término α es una función tanto de la concentración del inhibidor competitivo como de su afinidad por el sitio activo de la enzima. El valor de K_m (la [S] a la que v = 1/2 V_máx) aumenta de manera proporcional al factor α en presencia del inhibidor. Al término αK_m se le llama a menudo K_m aparente (K_m^ap).

Las sustancias que se comportan como inhibidores competitivos (p. ej., reducen la afinidad aparente de una enzima por el sustrato) suelen tener una estructura semejante a la del sustrato. Entre estas moléculas hay productos de la reacción, análogos del sustrato que no se metabolizan o derivados del sustrato. La succinato deshidrogenasa, una enzima del ciclo de Krebs del ácido cítrico (cap. 9), cataliza una reacción redox que convierte el succinato en fumarato.

Esta reacción es inhibida por el malonato (fig. 6.9). Éste se une al sitio activo de la enzima, pero no puede ser convertido en producto. Las moléculas que semejan una estructura del estado de transición de un sustrato, conocidas como análogos del estado de transición, pueden ser inhibidores competitivos especialmente eficientes. Se unen al sitio activo de la enzima con mayor afinidad que el sustrato. El oseltamivir, que se usa para prevenir y tratar la influenza, se convierte en el hígado como un análogo del estado de transición del ácido siálico (un azúcar de nueve carbones). La unión del oseltamivir al sitio activo de la enzima viral neuraminidasa inhibe la escisión del ácido siálico de ciertas proteínas celulares anfitrionas, impidiendo con ello la liberación de nuevos virus desde las células infectadas.

INHIBIDORES NO COMPETITIVOS En algunas reacciones catalizadas por enzimas el inhibidor puede unirse tanto a la enzima libre como al complejo enzima-sustrato:

En estas circunstancias, que se denominan inhibición no competitiva, el inhibidor se une a un lugar distinto del sitio activo. La unión del inhibidor ocasiona una modificación en la conformación de la enzima, lo que impide la formación del producto (fig. 6.10). Los inhibidores no competitivos tienen escasa o nula semejanza estructural con el sustrato, pero pueden influir en la unión del sustrato si sus sitios de unión están en estrecha cercanía con el sitio de unión del sustrato. En algunos casos la inhibición no competitiva se revierte en parte aumentando la concentración de sustrato. El análisis de las reacciones inhibidas por inhibidores no competitivos a menudo es complejo porque suelen participar dos o más sustratos. De esta forma, las características de inhibición que se observan pueden depender en parte de factores como el orden en que se unen los diferentes sustratos. Además, para la unión de los inhibidores no competitivos existen dos determinaciones de K_I.

Dependiendo del inhibidor que se considere, los valores de estas constantes de disociación pueden ser o no equivalentes. Existen dos formas de inhibición no competitiva: la pura y la mixta. En la inhibición no competitiva pura (el inhibidor se une lejos del sitio activo), que es un fenómeno poco frecuente, ambos valores de K_I son equivalentes. La inhibición no competitiva mixta (el inhibidor se une cerca del sitio activo) es en general más complicada debido a que los valores de K_I son diferentes. La ecuación de Michaelis-Menten que describe la inhibición no competitiva mixta es

donde α = 1+[I]/K_Ia y α′ = (1+[I]/K_Ib). En la inhibición no competitiva pura (p. ej., α = α′) los valores de V_máx cambian, pero la K_m permanece igual. En la inhibición no competitiva mixta se alteran los valores de ambos, K_m (K_m^ap = α/α′K_m) y V_máx (V_máx^ap = V_máx/α′).

INHIBIDORES ACOMPETITIVOS En la inhibición acompetitiva, que se considera un tipo poco frecuente de inhibición no competitiva, el inhibidor sólo se une al complejo enzima-sustrato, y no a la enzima libre. En consecuencia, el inhibidor es ineficaz a bajas concentraciones de sustrato porque hay muy poco complejo ES presente.

La constante de disociación para el paso de unión de un inhibidor acompetitivo a una enzima es

La inhibición acompetitiva se observa más fácilmente a una [S] alta. Cuando I se une al ES, el sustrato no queda libre para disociarse de la enzima y la K_m (K_m^ap = K_m/α′) disminuye, dando la apariencia de mayor afinidad por el sustrato. La ecuación de Michaelis-Menten que describe la inhibición acompetitiva es

donde α′ = 1+[I]/K_I′. Debido a que un inhibidor acompetitivo se une sólo a ES, el equilibrio E + S ⇌ ES se desplaza a la derecha dando como resultado aumentar la cantidad de ES disponible para unirse al inhibidor. El valor de V_máx (V_máx^ap = V_máx/α′) disminuye por un factor de α′. La inhibición acompetitiva se observa más a menudo en el caso de enzimas que se unen a más de un sustrato.

ANÁLISIS CINÉTICO DE LA INHIBICIÓN ENZIMÁTICA La inhibición competitiva, la no competitiva y la acompetitiva pueden distinguirse mediante gráficas de los dobles recíprocos (fig. 6.11a-e). En dos conjuntos de determinaciones de velocidad, la concentración de la enzima se mantiene constante. En el primer experimento se establecen la velocidad y los parámetros cinéticos (K_m y V_máx) de la enzima sin inhibir. En el segundo experimento se incluye una cantidad constante de inhibidor en cada análisis enzimático. La figura 6.11 exhibe los diferentes efectos que tienen los inhibidores sobre la actividad enzimática. La inhibición competitiva aumenta la K_m de la enzima, pero la V_máx permanece inalterada. (Esto se muestra en la gráfica de doble recíproco como un desplazamiento de la intercepción horizontal.) En la inhibición no competitiva pura (p. ej., K_Ia = K_Ib), V_máx disminuye (p. ej., la intercepción vertical se desplaza); en este caso poco frecuente la K_m no cambia porque los valores de k para la unión a la E y al complejo ES son los mismos. En la inhibición no competitiva mixta, estos valores de k difieren porque el sitio de unión del inhibidor está muy cerca del sitio activo y sus actividades de unión se interfieren mutuamente. En consecuencia, cambian V_máx y K_m. En tales casos las gráficas de 1/v contra 1/[S] se intersecarán a la izquierda del eje vertical ya sea arriba del eje horizontal si K_I′ es mayor que K_I, o abajo del eje si K_I′ es menor que K_I. En la inhibición acompetitiva cambian tanto K_m como V_máx, aunque su cociente (p. ej., la pendiente K_m/V_máx) permanece igual.

INHIBICIÓN IRREVERSIBLE En la inhibición reversible el inhibidor puede disociarse de la enzima debido a que se une mediante enlaces no covalentes. Los inhibidores irreversibles usualmente se unen de forma covalente a la enzima, con frecuencia a la cadena lateral de un residuo de aminoácido del sitio activo. Por ejemplo, las enzimas que contienen grupos sulfhidrilo libres pueden reaccionar con agentes alquilantes como el yodoacetato:

La gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, una enzima de la vía glucolítica (cap. 8), se inactiva mediante alquilación con yodoacetato. Las enzimas que utilizan grupos sulfhidrilo para formar enlaces covalentes con cofactores metálicos con frecuencia son inhibidos en forma irreversible por metales pesados (p. ej., el mercurio y el plomo). La anemia que es sintomática de envenenamiento por plomo se produce en parte por la unión de éste a un grupo sulfhidrilo de la ferroquelatasa. Ésta cataliza la inserción de Fe²⁺ en el grupo prostético hemo de la hemoglobina.

El problema 6.4 está relacionado con la inhibición enzimática.

ENZIMAS ALOSTÉRICAS Aunque el modelo de Michaelis-Menten es una herramienta inestimable, no explica las propiedades cinéticas de muchas enzimas. Por ejemplo, las gráficas de velocidad de reacción frente a concentración de sustrato de muchas enzimas con varias subunidades son a menudo sigmoideas en lugar de hiperbólicas, como lo predice el modelo de Michaelis-Menten (fig. 6.13). Estos efectos se ven en un grupo importante de enzimas denominadas enzimas alostéricas. Obsérvese que la curva de unión del sustrato de la figura 6.13 se parece a la curva de unión del oxígeno a la hemoglobina.

Las propiedades de las enzimas alostéricas se discuten más adelante en este capítulo.

Cinética enzimática, metabolismo y hacinamiento macromolecular

El objetivo final de las investigaciones sobre cinética enzimática es desarrollar una comprensión realista del metabolismo de los seres vivos. A pesar del gran acervo de conocimientos acumulados durante muchas décadas acerca de las vías bioquímicas y de las propiedades cinéticas de las enzimas in vitro (“en vidrio”, es decir, determinadas en el laboratorio), la comprensión de los procesos metabólicos en las células “vivas” es difícil de lograr. Ahora se piensa que una razón importante de esta falta de éxito radica en las suposiciones de la ley de acción de masas. Según esta regla, cuando se calcula la constante de equilibrio de una reacción como

se hace la suposición de que la velocidad de la reacción directa (hacia la derecha) es lineal (p. ej., directamente proporcional) para las concentraciones de A y B, y que la velocidad de la reacción inversa (k_R) es lineal con respecto a la concentración de C. Para que sea válido el valor de K_eq deducido para esta reacción o para cualquier otra, se asume además que 1) el sistema en el que ocurre la reacción es homogéneo (p. ej., la mezcla del contenido es uniforme) y 2) las moléculas que interactúan se mueven al azar y de manera independiente entre sí. Ahora se entiende que en condiciones de hacinamiento in vivo, ninguna de estas suposiciones parece cumplirse. El interior hacinado de las células es demasiado heterogéneo (p. ej., hay una enorme variedad de especies moleculares) y está repleto de macromoléculas, membranas, componentes citoesqueléticos y otros obstáculos que limitan el movimiento de las moléculas. Este fenómeno se denomina hacinamiento macromolecular. Entre sus efectos observados dentro de las células están el aumento de los valores de las concentraciones efectivas de las macromoléculas, la mejoría en el plegamiento de proteínas y en las afinidades de unión, los cambios de las velocidades de reacción y de las constantes de equilibrio y menores velocidades de difusión. Estos efectos son no lineales, o sea, son difíciles de predecir. Por ejemplo, los valores cinéticos in vivo (p. ej., K_m, V_máx y K_eq) de cada reacción bioquímica dependen del coeficiente de actividad de su enzima y de las velocidades de difusión del sustrato y de las moléculas efectoras, ninguno de los cuales es fácil de describir en el ambiente heterogéneo de la célula. La lenta difusión del sustrato puede superarse segregando las reacciones en microcompartimentos en los que la concentración de sustrato es relativamente elevada, o incorporando algunas o todas las enzimas de una vía en complejos llamados metabolones, en los que los intermediarios de la vía se transfieren o “canalizan” directamente de un sitio activo al siguiente. Estos microambientes tienen su propia y singular composición iónica que promueve la eficiente operación de las enzimas que ahí residen. Es un gran reto para los bioquímicos identificar estas condiciones locales y duplicarlas in vitro para facilitar la investigación de enzimas específicas y determinar parámetros cinéticos realistas. Las discrepancias entre los resultados obtenidos in vivo, in vitro e in silico (mediante simulación por computadora) sugieren que una enzima aislada de su vía metabólica y de otras vías que la intersecan no funciona con los mismos parámetros cinéticos.

A pesar de las intimidantes complejidades de las células vivas, los biólogos de sistemas se han empeñado en desarrollar nuevas estrategias para investigar los procesos metabólicos. A menudo este trabajo lo realizan ingenieros metabólicos, científicos industriales que mejoran las capacidades metabólicas de microorganismos que se utilizan en la manufactura de productos comerciales. Entre las herramientas más importantes usadas por los ingenieros metabólicos hay simulaciones dinámicas por computadora de procesos metabólicos basadas en datos obtenidos in vivo e in vitro. El modelo matemático en el que se basa la simulación por computadora se construye a partir de datos y de ecuaciones cinéticos que definen el flujo metabólico, la velocidad del flujo de metabolitos como sustratos, productos e intermediarios en las vías bioquímicas. (A pesar de las limitaciones de los valores de cinética in vitro recién descritos, se les reconoce como invaluables datos de referencia durante las primeras fases del desarrollo de modelos.) El fin último de una simulación por computadora es acercarse al comportamiento en estado de equilibrio dinámico in vivo de los procesos metabólicos y predecir cómo reaccionarán éstos a cambios de parámetros como la disponibilidad de nutrientes o a enzimas mutantes. Los conocimientos ya obtenidos a partir de simulaciones por computadora (véase Glucólisis y los motores a reacción, en el capítulo 8) garantizan que la modelación y la simulación de vías in silico serán más importantes en futuras investigaciones en cinética enzimática.

A pesar de lo valiosos que son los estudios cinéticos, no aclaran los mecanismos catalíticos de las enzimas. [Un mecanismo debe describir cómo se rompen los enlaces y se forman nuevos en la conversión de sustrato(s) a producto(s).] Las investigaciones de los mecanismos enzimáticos buscan relacionar la actividad enzimática con la estructura y función del sitio activo. En el estudio de estos mecanismos se utilizan métodos como la cristalografía de rayos X, la inactivación química de las cadenas laterales del sitio activo y el modelado con compuestos simples como sustratos y como inhibidores.

Reacciones orgánicas y estado de transición

Las reacciones bioquímicas siguen el mismo conjunto de reglas que las reacciones estudiadas en química orgánica. Las características esenciales de ambas son la reacción que ocurre entre átomos deficientes en electrones (electrófilos) y átomos ricos en electrones (nucleófilos), y la formación de estados de transición. Cada una se discute de forma breve.

Se forman enlaces químicos cuando un nucleófilo dona un par de electrones a un electrófilo. Por ejemplo, en la reacción

los electrones π del doble enlace nucleófilo reaccionan con un átomo de hidrógeno parcialmente positivo de un ion hidronio electrófilo. Como en todas las reacciones orgánicas, la formación del producto se realiza en varios pasos.

Esta descripción paso a paso se denomina mecanismo de reacción. Las flechas curvas ilustran el flujo de electrones desde un nucleófilo hacia un electrófilo. Durante el curso de la reacción se forman uno o más intermediarios. Un intermediario es una especie que existe durante un tiempo finito (10^–13 s o menos) y luego se transforma en producto. En el ejemplo se forma un intermediario carbocatión cuando electrones π del doble enlace atacan a un ion hidronio electrófilo. (Un carbocatión, o ion carbonio, contiene un átomo de carbono con carga positiva deficiente en electrones.) Este tipo de intermediario es estabilizado por los grupos R que reducen la carga positiva en el átomo de carbono. El estado de transición es estabilizado además por cadenas laterales dentro del sitio activo. En el siguiente paso de la reacción, un par de electrones del átomo de oxígeno de una molécula de agua forma un enlace σ con el átomo de carbono con carga positiva. En el paso final el alcohol se produce por la transferencia de un protón a otra molécula de agua. Otros ejemplos de intermediarios reactivos observados en reacciones bioquímicas son los carbaniones (aniones de carbono nucleófilos con tres enlaces y un par de electrones no compartido) y los radicales libres (una especie muy reactiva con al menos un electrón no apareado).

En cualquier reacción química, sólo moléculas que alcanzan la condición activada conocida como estado de transición pueden convertirse en moléculas de producto. La conversión de una molécula reactiva estable en una activada es análoga al proceso de rodar una roca colina arriba, que requiere energía. Una vez que la roca alcanza la cima, basta un ligero empujón para hacerla rodar por el otro lado, liberando energía en el proceso. Conforme a la teoría del estado de transición, la velocidad de reacción la determina el número relativo de moléculas de reactivo que poseen energía suficiente para vencer la barrera de la energía de activación (E_a) (fig. 6.1). Las velocidades de reacción aumentan si es posible reducir la E_a. Las enzimas lo logran principalmente estabilizando el estado de transición. (En la siguiente sección se describen varios factores que las enzimas usan para realizar esta hazaña.) Sin embargo, una característica relevante del proceso de estabilizar el estado de transición es la afinidad relativa de los sitios activos por el sustrato, el producto y el estado de transición. Las investigaciones con análogos de estados de transición, moléculas estables muy parecidas al estado de transición, han revelado que los sitios activos de la enzima se unen al estado de transición con más fuerza que a las moléculas de sustrato o de producto. El diagrama de energía para una reacción de dos pasos de la figura 6.14 ilustra la diferencia entre un intermediario (una especie reactiva con un lapso de vida finito) y un estado de transición (una especie inestable con máxima energía libre).

Mecanismos catalíticos

A pesar de una extensa investigación, sólo se conocen en detalle los mecanismos de unas pocas enzimas. Se sabe que éstas logran velocidades catalíticas mucho más altas que otros catalizadores porque sus sitios activos poseen estructuras singularmente aptas para promover la catálisis. Varios factores contribuyen a la catálisis enzimática; los más importantes son los efectos de proximidad y de tensión, los efectos electrostáticos, la catálisis acidobásica y la catálisis covalente. La canalización cuántica, que ocurre cuando se transfiere el hidrógeno, se revisa en un ensayo en línea denominado Biochemistry in Perspective. Se debe advertir que ninguno de estos factores catalíticos excluye a cualquiera de los demás. En grados variables, todos participan en cada tipo de mecanismo catalítico.

EFECTOS DE PROXIMIDAD Y DE TENSIÓN Para que ocurra una reacción bioquímica, el sustrato debe aproximarse mucho a los grupos funcionales catalíticos (grupos de las cadenas laterales que participan en un mecanismo catalítico) dentro del sitio activo. Además, el sustrato debe orientarse de forma precisa hacia los grupos catalíticos. Una vez situado el sustrato de manera correcta, un cambio de la conformación enzimática puede originar un complejo enzima-sustrato tenso. Esta tensión ayuda a llevar al complejo enzima-sustrato al estado de transición.

EFECTOS ELECTROSTÁTICOS Recuérdese que la fuerza de las interacciones electrostáticas es inversamente proporcional a la hidratación de las especies participantes (cap. 3). Las capas de hidratación aumentan la distancia entre los centros de carga y reducen la atracción electrostática. Debido a que el agua es excluida en gran medida del sitio activo cuando el sustrato se une, a menudo la constante dieléctrica local es baja. La distribución de carga en el sitio activo relativamente anhidro puede facilitar el posicionamiento óptimo de las moléculas de sustrato e influir en su reactividad química. Además, se piensa que a la catálisis contribuyen las interacciones electrostáticas débiles como las que ocurren entre dipolos permanentes e inducidos tanto en el sitio activo como en el sustrato.

CATÁLISIS ACIDOBÁSICA La catálisis acidobásica (transferencia de protones) es un factor importante en las reacciones químicas. Por ejemplo, considere la hidrólisis de un éster:

Dado que el agua es un nucleófilo débil, la hidrólisis de ésteres es relativamente lenta en solución neutra, pero se realiza mucho más rápido si se eleva el pH. Cuando el ion hidróxido ataca al átomo de carbono polarizado del grupo carbonilo (fig. 6.15a), se forma un intermediario tetraédrico. Cuando éste se descompone, se transfiere un protón desde una molécula de agua cercana. La reacción culmina cuando se libera el alcohol. Sin embargo, la catálisis de ion hidróxido no es práctica en los sistemas vivos. Las enzimas utilizan varios grupos funcionales que se comportan como bases generales para transferir protones con eficiencia. Tales grupos pueden colocarse de manera precisa en relación con el sustrato (fig. 6.15b). La hidrólisis de ésteres también puede ser catalizada por un ácido general (fig. 6.15c). Cuando el oxígeno del grupo carbonilo del éster se une al protón, el átomo de carbono se hace más electrófilo. Entonces el éster se hace más susceptible al ataque nucleófilo de una molécula de agua.

Dentro de los sitios activos de la enzima, los grupos funcionales en las cadenas laterales de la histidina (imidazol), del aspartato y del glutamato (carboxilato), de la tirosina (hidroxilo), de la cisteína (sulfhidrilo) y de la lisina (amina) pueden actuar como donadores de protones (llamados ácidos generales) o como aceptores de protones (llamados bases generales), dependiendo de su estado de protonación. Cada uno de estos grupos de cadena lateral tiene un valor característico de pK_a que puede ser influido por átomos cargados o polares cercanos. Por ejemplo, la cadena lateral de la histidina con frecuencia participa en la catálisis acidobásica concertada debido a que su intervalo de pK_a es cercano al pH fisiológico. El anillo imidazol protonado puede servir como ácido general, y el anillo imidazol desprotonado puede servir como base general:

Dentro del sitio activo de las proteasas de serina (una clase de enzimas proteolíticas como la tripsina y la quimotripsina), la estrecha proximidad de un grupo carboxilato de aspartato a la histidina eleva el pK_a de ésta. En consecuencia la histidina, actuando como una base general, extrae un protón de una cadena lateral cercana de serina y con ello convierte el oxígeno de la serina en un mejor nucleófilo.

CATÁLISIS COVALENTE En algunas enzimas un grupo de cadena lateral nucleófila forma un enlace covalente inestable con un grupo electrófilo en el sustrato. Como recién se describió, las proteasas de serina utilizan el grupo —CH₂—OH de la serina como un nucleófilo para hidrolizar enlaces peptídicos. Durante el primer paso, el nucleófilo (p. ej., el oxígeno de la serina) ataca al grupo carbonilo del sustrato peptídico. Cuando se forma el enlace estérico, el enlace peptídico se rompe. El intermediario aciloenzima resultante es hidrolizado por el agua en una segunda reacción:

Algunas otras cadenas laterales de aminoácidos pueden actuar como nucleófilos. El grupo sulfhidrilo de la cisteína y los grupos carboxilato del aspartato y del glutamato pueden realizar esta función.

Función de los aminoácidos en la catálisis enzimática

Los sitios activos de las enzimas están recubiertos con cadenas laterales de aminoácidos que están muy próximas como resultado del proceso de plegamiento de las proteínas y que juntas crean un microambiente propicio para la catálisis. Las funciones de las cadenas laterales de los sitios activos se agrupan en dos categorías principales: catalíticas y no catalíticas. Los residuos catalíticos participan de forma directa en el mecanismo de la catálisis, mientras que los residuos no catalíticos tienen funciones de apoyo. De los 20 aminoácidos presentes en las proteínas (fig. 5.2), sólo los que tienen cadenas laterales polares y con carga participan realmente en la catálisis. Estos aminoácidos (y sus grupos de cadenas laterales) son: serina, treonina y tirosina (hidroxilo); cisteína (tiol); glutamina y asparagina (amida); glutamato y aspartato (carboxilato); lisina (amina); arginina (guanidinio), e histidina (imidazol).

Extensas investigaciones han revelado que los mecanismos catalíticos requieren el posicionamiento preciso de una o más unidades catalíticas que están compuestas de dos o tres cadenas laterales de aminoácidos llamadas díadas o tríadas, respectivamente. Aunque es vasto el número de enzimas, las unidades catalíticas están formadas por relativamente pocas combinaciones de aminoácidos. Algunos ejemplos comunes son las díadas arginina-arginina, carboxilato-carboxilato y carboxilato-histidina. La díada arginina-arginina es una unidad catalítica en la cinasa de adenilato, una enzima que cataliza la transferencia de grupos fosforilo del ATP a otros nucleótidos. El efecto polarizador de las dos argininas sobre los oxígenos del grupo fosfato convierte a este último en un buen grupo saliente. Se encuentran díadas carboxilato-carboxilato en los sitios activos de las proteasas aspárticas, una familia de enzimas proteolíticas como la pepsina, que los animales utilizan para digerir las proteínas de los alimentos. La estrecha proximidad de los dos grupos carboxilo del aspartato, con carga negativa, eleva el pK_a de uno de los aspartatos haciéndolo menos ácido y más básico. Su mejorada capacidad de aceptar un protón inicia un mecanismo hidrolítico acidobásico. Las propiedades funcionales de las díadas aspartato-histidina se deben a un anillo de imidazol polarizado por la estrecha proximidad del grupo carboxilato con carga negativa del aspartato. En el sitio activo de la aconitasa, la enzima que cataliza la isomerización de citrato para formar isocitrato, la histidina actúa como un ácido general y protona al grupo —OH del citrato haciéndolo un mejor grupo saliente.

El HOH resultante es mantenido en el sitio activo por la histidina el tiempo suficiente para poder atacar al intermediario y generar el isómero del citrato (isocitrato). Resulta muy notable que la díada aspartato-histidina también sea un componente de la muy investigada tríada Asp-His-Ser de la proteasa de serina. La estrecha proximidad del grupo carboxilato del aspartato con el grupo imidazol de la histidina eleva el pK_a de este último, con lo cual incrementa su capacidad de extraer un protón de la serina. La serina desprotonada se convierte así en un mejor nucleófilo.

Las funciones de los grupos laterales no catalíticos, que incluyen orientación del sustrato y estabilización del estado de transición, son más sutiles que las de los residuos catalíticos. Por ejemplo, la especificidad del sustrato de la quimotripsina, que se manifiesta en la rotura de enlaces peptídicos en el extremo terminal C de los aminoácidos aromáticos triptófano, tirosina y fenilalanina, es posible gracias al tamaño relativamente grande de la cavidad hidrófoba localizada dentro del sitio activo que acomoda a las cadenas laterales aromáticas y las orienta. El intermediario oxianión (una especie molecular con un oxígeno de carga negativa, fig. 6.18) que se forma durante el mecanismo catalítico es estabilizado por interacciones entre el grupo carbonilo del enlace peptídico del sustrato y los hidrógenos de la amida de los residuos de serina y glicina de la cadena principal.

Funciones de los cofactores en la catálisis enzimática

Además de las cadenas laterales de los aminoácidos del sitio activo, muchas enzimas requieren cofactores no proteínicos, a saber, cationes metálicos y coenzimas. Cada grupo tiene propiedades estructurales y reactividades químicas muy distintivas.

METALES Los metales importantes en los seres vivos son de dos clases: metales alcalinos y alcalinotérreos (p. ej., Na⁺, K⁺, Mg²⁺ y Ca²⁺) y metales de transición (p. ej., Zn²⁺, Fe²⁺ y Cu²⁺). En las enzimas, los metales alcalinos y alcalinotérreos están unidos de forma laxa y suelen tener funciones estructurales. En cambio, los metales de transición tienen funciones clave en la catálisis, ya sea unidos a grupos funcionales como el carboxilato, el imidazol o el hidroxilo, o como componentes de grupos prostéticos como el Fe²⁺ del hemo.

Varias propiedades de los metales de transición los hacen útiles en la catálisis. Los iones metálicos proporcionan una concentración elevada de carga positiva que es en especial útil para la unión de las moléculas pequeñas. Debido a que los metales de transición actúan como ácidos de Lewis (aceptores de pares electrónicos), son eficaces electrófilos. (Las cadenas laterales de los aminoácidos son electrófilos deficientes debido a que no pueden aceptar pares de electrones sin compartir.) Debido a que sus valencias dirigidas de la capa d les permiten interactuar con dos o más ligandos, los iones metálicos ayudan al sustrato a orientarse dentro del sitio activo. Como consecuencia, el complejo enzima-ion metálico polariza al sustrato y estimula la catálisis. Por ejemplo, la anhidrasa carbónica es la enzima que cataliza la hidratación reversible del CO₂ para formar bicarbonato (HCO₃⁻). Su sitio activo contiene un cofactor de cinc (Zn²⁺) que está coordinado con tres cadenas laterales de histidina. El ion cinc polariza una molécula de agua haciendo que un grupo OH se una al Zn²⁺. El grupo OH (que actúa como nucleófilo) ataca al CO₂ y lo convierte en HCO₃⁻:

Por último, como los metales de transición tienen dos o más estados de valencia, pueden actuar como mediadores en reacciones de oxidación-reducción al ganar o perder electrones de forma reversible. Por ejemplo, la oxidación reversible del Fe²⁺ para formar Fe³⁺ es importante en la función del citocromo P₄₅₀, un tipo de enzima que procesa sustancias tóxicas en los animales.

COENZIMAS Las coenzimas son moléculas orgánicas que dan versatilidad química a las enzimas porque aportan grupos reactivos que no están presentes en las cadenas laterales de sus aminoácidos o porque pueden actuar como transportadoras de moléculas de sustrato. Algunas coenzimas sólo se unen de manera transitoria a la enzima y son esencialmente cosustratos, mientras que otras están unidas con firmeza por medio de enlaces covalentes o no covalentes. A diferencia de los catalizadores ordinarios, la estructura de las coenzimas sí es modificada por las reacciones en las que participan. Sus formas catalíticamente activas deben regenerarse antes de que pueda ocurrir otro ciclo catalítico. Las coenzimas unidas de forma transitoria suelen regenerarse mediante una reacción catalizada por otra enzima, mientras que las coenzimas firmemente unidas se regeneran durante una etapa del ciclo catalítico. La mayoría de las coenzimas derivan de las vitaminas. Las vitaminas (nutrientes orgánicos que se requieren en cantidades pequeñas en la alimentación del ser humano) se dividen en dos clases: hidrosolubles y liposolubles. Además, existen determinadas sustancias semejantes a las vitaminas que los organismos pueden sintetizar en cantidades suficientes para facilitar reacciones catalizadas por enzimas. Algunos ejemplos son el ácido lipoico, la carnitina, la coenzima Q, la biopterina, la S-adenosilmetionina y el ácido p-aminobenzoico.

Las coenzimas pueden clasificarse conforme a su función en tres grupos: de transferencia de electrones, de transferencia de grupos y con potencial de transferencia de alta energía. Entre las coenzimas que participan en reacciones redox (transferencia de electrones o de hidrógeno) se incluyen el dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD⁺), el fosfato de dinucleótido de nicotinamida y adenina (NADP⁺), el dinucleótido de flavina y adenina (FAD), el mononucleótido de flavina (FMN), la coenzima Q (CoQ) y la tetrahidrobiopterina (BH₄). Coenzimas como el pirofosfato de tiamina (TPP), la coenzima A (CoASH) y el fosfato de piridoxal intervienen en la transferencia de grupos aldehído, acilo y amino, respectivamente. Las transferencias de un carbono, que constituyen un grupo diverso de reacciones en las que se transfieren átomos de carbono en diversos estados de oxidación entre sustratos, requieren biotina, tetrahidrofolato (TH₄) o S-adenosilmetionina (SAM). Los nucleótidos, conocidos por su potencial de transferencia de alta energía, funcionan como coenzimas en el sentido de que activan intermediarios metabólicos o sirven como donadores de fosfato o como transportadores de moléculas pequeñas, o ambas cosas. Son ejemplos de estos últimos la UDP-glucosa, un intermediario en la síntesis de glucógeno, y el CDP (difosfato de citidina)-etanolamina, un intermediario en la síntesis de ciertos lípidos. En tales casos el nucleótido funciona como transportador molecular y como un buen grupo saliente en reacciones subsecuentes. Los numerosos enlaces no covalentes que se forman cuando se une al sitio activo de la enzima garantizan que el metabolito capturado se posicione de forma correcta. Obsérvese que las estructuras de coenzimas como el NAD⁺, el NADP⁺, el FAD, el FMN y la CoASH también contienen componentes de nucleótidos de adenina. En el cuadro 6.4 se presenta una lista de las vitaminas y sustancias semejantes a las vitaminas, de sus formas coenzimáticas y de las reacciones que facilitan, además de las páginas en las que se describen sus propiedades estructurales y funcionales.

Efectos de la temperatura y del pH en reacciones catalizadas por enzimas

Cualquier factor ambiental que distorsiona la estructura proteínica puede alterar la actividad enzimática. Las enzimas son especialmente sensibles a variaciones de la temperatura y del pH.

TEMPERATURA La temperatura afecta a todas las reacciones químicas. En general, cuanto mayor es la temperatura, mayor es la velocidad de reacción; es decir, es mayor el número de colisiones. La velocidad de reacción crece debido a que hay más moléculas con energía suficiente para entrar en el estado de transición. Las velocidades de las reacciones catalizadas por enzimas también aumentan con la temperatura. Sin embargo, las enzimas son proteínas que se desnaturalizan a temperaturas elevadas. La temperatura óptima de una enzima, aquella a la que actúa con su máxima eficiencia (fig. 6.16), se determina en el laboratorio en condiciones específicas de pH, fuerza iónica y concentraciones de solutos. En los seres vivos no hay una única temperatura óptima definible para las enzimas.

pH La concentración de iones hidrógeno, expresada como un valor de pH, afecta a las enzimas de diversas formas. En primer lugar, la actividad catalítica está relacionada con el estado iónico del sitio activo. Los cambios en la concentración de iones hidrógeno pueden afectar a la ionización de los grupos del sitio activo. Por ejemplo, la actividad catalítica de cierta enzima requiere la forma protonada del grupo amino de una cadena lateral. Si el pH se vuelve tan alcalino que el grupo pierde su protón, la actividad enzimática puede disminuir. Además, pueden ser afectados los sustratos. Si un sustrato contiene un grupo ionizable, un cambio del pH puede alterar su capacidad para unirse al sitio activo. En segundo lugar, los cambios en los grupos ionizables pueden alterar la estructura terciaria de la enzima. Los cambios drásticos del pH a menudo provocan desnaturalización.

Aunque unas pocas enzimas toleran cambios importantes de pH, la mayoría son activas sólo dentro de un intervalo estrecho de pH. Por esta razón, los seres vivos emplean amortiguadores para regular rigurosamente el pH. El valor de pH en el que la actividad de una enzima es máxima se denomina pH óptimo (fig. 6.17). Los pH óptimos de las enzimas, determinados en laboratorio, varían de manera considerable. Por ejemplo, el pH óptimo de la pepsina, una enzima proteolítica que se produce en el estómago, es alrededor de 2. Para la quimotripsina, que digiere las proteínas en el intestino delgado, el pH óptimo es aproximadamente 8.

Mecanismos detallados de la catálisis enzimática

Cada una de las miles de enzimas que se han investigado tiene una estructura, una especificidad de sustrato y un mecanismo de reacción únicos. Durante las décadas pasadas se han investigado con ahínco los mecanismos de diversas enzimas. En las subsecciones siguientes se describen los mecanismos catalíticos de dos enzimas bien caracterizadas.

QUIMOTRIPSINA La quimotripsina es una proteína de 27 000 Da que pertenece a la familia de las proteasas de serina. Los sitios activos de todas las proteasas de serina contienen un conjunto característico de residuos de aminoácidos, a menudo llamado tríada de proteasa de serina. En el sistema de numeración de la quimotripsina son Asp 102, His 57 y Ser 195. Los estudios de la enzima cristalizada unida a análogos de sustrato han revelado que estos residuos están cerca unos de otros en el sitio activo. El residuo de serina del sitio activo desempeña un papel especialmente importante en los mecanismos catalíticos de este grupo de enzimas. Las proteasas de serina son inhibidas de forma irreversible por el diisopropilfluorofosfato (DFP). También, en las enzimas inhibidas por el DFP, el inhibidor se une de forma covalente a la Ser 195 y nunca a alguna de las otras 29 serinas. La reactividad especial de la Ser 195 se atribuye a la proximidad de la His 57 y de la Asp 102. El anillo imidazol de la His 57 se encuentra entre el grupo carboxilo de la Asp 102 y el grupo —CH₂OH de la Ser 195. El grupo carboxilo de la Asp 102 polariza a la His 57, permitiéndole así actuar como una base general (p. ej., se fomenta la captura de un protón por el grupo imidazol):

La eliminación del protón del grupo OH de la serina la convierte en un nucleófilo más eficaz.

La quimotripsina cataliza la hidrólisis de los enlaces peptídicos adyacentes a los aminoácidos aromáticos. En la figura 6.18 se exhibe el mecanismo probable de esta reacción. El paso (a) de la figura muestra el complejo inicial enzima-sustrato. El posicionamiento de los residuos de aminoácidos dentro del sitio activo, incluida la tríada catalítica de Asp 102, His 57 y Ser 195, crea una posición temporalmente desocupada llamada hueco de oxianión. Además, el sitio activo aporta una cavidad de unión hidrófoba para la cadena lateral de la fenilalanina del sustrato. El oxígeno nucleófilo del hidroxilo de la Ser 195 lanza un ataque nucleófilo contra el carbono del carbonilo del sustrato. El intermediario tetraédrico que se forma (paso b) está suficientemente distorsionado para que el oxianión recién formado sea estabilizado por la formación de enlaces de hidrógeno con los hidrógenos amídicos de Ser 195 y Gly 193, e ingrese en el hueco del oxianión. Se piensa que la formación del intermediario tetraédrico, semejante al estado de transición, y su unión preferencial a la enzima son la razón de la eficiencia catalítica de las proteasas de serina.

El intermediario tetraédrico se descompone después para formar el intermediario acilo-enzima unido de forma covalente (paso c). Se cree que la His 57, al actuar como ácido general, facilita esta descomposición. En los pasos (d) y (e) se revierten los dos pasos previos. Con el agua actuando como nucleófilo atacante, se forma un intermediario tetraédrico (oxianión). Al llegar al paso (f) (el complejo final enzima-producto) se ha roto el enlace entre el oxígeno de la serina y el carbono del carbonilo. La serina vuelve a formar un enlace de hidrógeno con la His 57.

ALCOHOL DESHIDROGENASA Las alcohol deshidrogenasas (ADH) son un grupo variado de enzimas que se distribuyen en los tres dominios de seres vivos (Bacteria, Archaea y Eucariota). Catalizan la oxidación reversible de alcoholes para formar aldehídos o cetonas. En la siguiente reacción, oxidación de etanol, se suprimen dos electrones y dos protones de la molécula de alcohol. La coenzima NAD⁺ actúa como un aceptor de ion hidruro (H:^–).

La mayoría de las ADH están compuestas por dos o cuatro subunidades, cada una con dos iones cinc. Un ion cinc, ubicado en el sitio activo, es crucial para la catálisis, mientras que el otro tiene una función estructural. El sitio activo de la alcohol deshidrogenasa contiene también dos residuos de cisteína (Cys 48 y Cys 174) y un residuo de histidina (His 67), todos ellos coordinados con un ion cinc (fig. 6.19a). Tras la unión del NAD⁺ al sitio activo, el sustrato etanol entra y se une al Zn²⁺ como anión alcoholato (fig. 6.19b). El efecto electrostático del Zn²⁺ estabiliza el estado de transición. Al descomponerse el intermediario, se transfiere el ion hidruro del sustrato al anillo de nicotinamida del NAD⁺. Después de liberarse el producto aldehídico del sitio activo, el NADH también se disocia.

Los seres vivos tienen mecanismos sofisticados para regular sus extensas redes de vías bioquímicas. La regulación es esencial por varias razones:

1. Mantenimiento de un estado ordenado. La regulación de cada vía da lugar a la producción de las sustancias que se requieren para mantener la estructura y la función celulares de forma oportuna y sin desperdiciar recursos.

2. Conservación de la energía. Las células se aseguran de consumir sólo los nutrientes suficientes para satisfacer sus requerimientos de energía mediante un control constante de las reacciones que la generan.

3. Capacidad de respuesta a los cambios ambientales. Las células pueden realizar ajustes relativamente rápidos a los cambios de temperatura, pH, fuerza iónica y concentración de nutrientes, debido a que pueden aumentar o disminuir las velocidades de reacciones específicas.

La regulación de las vías bioquímicas se logra principalmente ajustando las concentraciones y las actividades de determinadas enzimas. El control se realiza mediante (1) control genético, (2) modificación covalente, (3) regulación alostérica y (4) compartimentación.

Control genético

La síntesis de enzimas en respuesta a variaciones de las necesidades metabólicas, un proceso que se denomina inducción enzimática, permite a las células responder de forma eficiente a los cambios en su ambiente. Por ejemplo, las células de E. coli cultivadas sin el azúcar lactosa no pueden metabolizar al principio este nutriente cuando se introduce en el medio de cultivo de la bacteria. Sin embargo, la introducción de lactosa en ausencia de glucosa activa los genes que codifican las enzimas necesarias para utilizar la lactosa como fuente de energía. Tras consumirse toda la lactosa, se interrumpe la síntesis de estas enzimas.

Modificación covalente

Algunas enzimas son reguladas por la interconversión reversible entre sus formas activa e inactiva. Estos cambios de función son producidos por varias modificaciones covalentes. Muchas de estas enzimas poseen residuos específicos que pueden ser fosforilados y desfosforilados. Por ejemplo, la fosforilasa de glucógeno (cap. 8) cataliza la primera reacción de la degradación del glucógeno, una molécula que almacena energía en forma de carbohidratos. En un proceso controlado por hormonas, la forma inactiva de la enzima (fosforilasa de glucógeno b) se convierte a la forma activa (fosforilasa de glucógeno a) por adición de un grupo fosfato a un residuo específico de serina. Otros tipos de modificación covalente reversible son la metilación, la acetilación y la nucleotidilación (la adición covalente de un nucleótido).

Varias enzimas se sintetizan y almacenan en forma de precursores inactivos denominados proenzimas o zimógenos. Éstos se convierten en las enzimas activas por la rotura irreversible de uno o varios enlaces peptídicos. Por ejemplo, el quimotripsinógeno se produce en el páncreas. Tras ser secretado hacia el intestino delgado, se convierte en su forma activa que se encarga de digerir las proteínas de los alimentos en varios pasos (fig. 6.20).

Regulación alostérica

En cada vía bioquímica hay una o más enzimas cuya actividad catalítica puede modularse (p. ej., aumentarse o reducirse) mediante unión de moléculas efectoras. Esta unión de ligandos a los sitios alostéricos de tales enzimas induce rápidos cambios de conformación que pueden incrementar o reducir su velocidad de unión al sustrato. La gráfica de una reacción catalizada por una enzima alostérica difiere de las que corresponden a enzimas que siguen la cinética de Michaelis-Menten. En lugar de ello, la curva de velocidad es sigmoidea (fig. 6.21). Si el ligando es el mismo que el sustrato (p. ej., si la unión de un sustrato favorece la unión de más sustrato), se dice que los efectos alostéricos son homotrópicos. En los efectos heterotrópicos intervienen ligandos moduladores, que son diferentes del sustrato. La mayoría de las enzimas alostéricas son enzimas multisubunitarias con múltiples sitios de unión a sustratos y efectores.

Dos modelos teóricos, el concertado y el secuencial (fig. 6.22), intentan explicar el comportamiento de las enzimas alostéricas. En el modelo concertado (o simétrico), se supone que la enzima sólo existe en dos estados: T (tenso) y R (relajado). Los activadores se unen a la conformación R y la estabilizan, mientras que los inhibidores hacen lo propio con la conformación T. El término concertado se aplica a este modelo porque se cree que las conformaciones de todas las subunidades proteínicas cambian de manera simultánea cuando se une el primer efector. (Este rápido cambio concertado de la conformación mantiene la simetría global de la proteína.) La unión de un activador desplaza el equilibrio a favor de la forma R. Un inhibidor desplaza el equilibrio hacia la conformación T.

El modelo concertado explica algunas propiedades de las enzimas alostéricas, pero no todas. Por ejemplo, explica la cooperatividad positiva, en la cual el primer ligando incrementa la unión de ligandos subsiguientes, pero no la cooperatividad negativa, un fenómeno observado en enzimas en las que la unión de un primer ligando reduce la afinidad de la enzima por ligandos semejantes. Además, el modelo concertado no permite conformaciones híbridas. Dos ejemplos de enzimas cuyo comportamiento parece ser consistente con el modelo concertado son la transcarbamoilasa de aspartato (ATCasa) de E. coli y la fosfofructocinasa (PFK).

La ATCasa cataliza el primer paso de una vía de reacción que conduce a la síntesis del nucleótido pirimídico llamado trifosfato de citidina (CTP) (fig. 6.23). El CTP actúa como inhibidor de la actividad de la ATCasa. Desplaza la curva de velocidad a la derecha, lo que indica un incremento de la K_m aparente de la ATCasa, que corresponde a una menor velocidad de actividad de la enzima a una concentración dada de sustrato. La inhibición de la ATCasa por medio de CTP es un ejemplo de inhibición por retroalimentación negativa, el proceso en el cual el producto de una vía inhibe la actividad de una enzima al principio o casi al principio de una vía bioquímica, o en un punto de ramificación. El nucleótido púrico ATP actúa como activador. La activación de la ATCasa por ATP es lógica porque la biosíntesis de ácidos nucleicos requiere cantidades relativamente iguales de nucleótidos púricos y pirimídicos. Cuando la concentración de ATP es mayor que la de CTP, se activa la ATCasa. Cuando la concentración de ATP es menor que la de CTP, el efecto neto sobre la ATCasa es de inhibición.

La fosfofructocinasa cataliza una reacción importante de la glucólisis: la transferencia de un grupo fosfato desde el ATP al grupo OH del C-1 de la fructosa-6-fosfato.

La fosfofructocinasa está formada por cuatro subunidades idénticas, cada una con un sitio activo y varios sitios alostéricos.

El estado R de la enzima es estabilizado por ADP y AMP (un indicador sensible del agotamiento de ATP y de la necesidad de energía de la célula).

El estado T es estabilizado por moléculas como el ATP y otras, que son indicadores de que la energía celular es alta.

En el modelo secuencial, propuesto inicialmente por Daniel Koshland, la unión de un ligando a una subunidad flexible de una proteína multisubunitaria induce un cambio de conformación que se transmite de manera sucesiva a las subunidades adyacentes. El modelo secuencial más elaborado da cabida a conformaciones intermedias que tal vez sean representaciones más realistas del funcionamiento de algunas enzimas. El modelo también incluye la cooperatividad negativa (la unión de un ligando a una subunidad induce cambios de conformación en subunidades adyacentes que hacen menos probable la unión de ligandos). Por lo tanto, se puede considerar al modelo secuencial como un modelo general que explica todas las posibilidades alostéricas. Desde este punto de vista, el modelo concertado es sólo un ejemplo simple del modelo secuencial.

Hay dos aspectos importantes de la regulación alostérica que deben destacarse. Primero, los modelos concertado y secuencial son modelos teóricos, es decir, el comportamiento de muchas proteínas alostéricas parece más complejo de lo que explica cualquiera de esos modelos. Por ejemplo, la unión cooperativa del O₂ a la hemoglobina (la proteína alostérica más estudiada) parece exhibir características de ambos modelos. La unión del primer O₂ inicia una transición concertada T → R que implica pequeños cambios de conformación de cada subunidad (una característica del modelo secuencial). Además, se han observado especies de hemoglobina con sólo uno o dos O₂ unidos.

Un segundo aspecto, más importante, es que no hay reglas simples que expliquen la regulación metabólica. Por ejemplo, han fracasado los intentos de incrementar el flujo metabólico de ciertas vías en organismos como levaduras mediante manipulaciones que incrementen la síntesis de enzimas alostéricas. (El flujo es la velocidad de recambio de moléculas en una vía.) Sólo se observaron aumentos de flujo cuando todas las enzimas en la vía se incrementaron. Parece ser que la regulación de una vía es el resultado de aportaciones regulatorias que en mayor o menor grado hacen todas las enzimas o la mayoría de ellas.

Compartimentación

La compartimentación, creada por la infraestructura celular, es un recurso importante para regular reacciones bioquímicas, porque la separación física hace posible el control independiente. La intrincada arquitectura interna de las células contiene compartimentos (p. ej., los organelos de las eucariotas) y microcompartimentos de diversos tipos (p. ej., enzimas individuales o complejos multiproteínicos unidos a membranas o a filamentos citoesqueléticos). La compartimentación celular resuelve varios problemas interrelacionados:

1. División y control. La separación física de reacciones en mutua competencia (p. ej., aquellas en las que una revierte lo hecho por otra, como en el caso de las cinasas y las fosfatasas) permite una regulación coordinada que impide el derroche de recursos.

2. Barreras a la difusión. En el interior hacinado de las células, la difusión de moléculas de sustrato es un factor potencialmente limitante de las velocidades de reacción. Las células evitan este problema creando microambientes en los que se concentran las enzimas y sus sustratos, y mediante la canalización de metabolitos, que es la transferencia de moléculas de producto de una enzima a la siguiente en un complejo multienzimático.

3. Condiciones de reacción especializadas. Determinadas reacciones requieren de un ambiente con propiedades únicas. Por ejemplo, el bajo pH dentro de los lisosomas facilita las reacciones hidrolíticas.

4. Control de daños. La segregación de productos potencialmente tóxicos de las reacciones protege a otros componentes celulares.

El control metabólico global requiere la integración de todas las vías bioquímicas de la célula, lo que se logra en parte mediante mecanismos de transporte que transfieren metabolitos y moléculas de señal entre los compartimentos.

Resumen del capítulo

1. Las enzimas son catalizadores biológicos. Aumentan la velocidad de una reacción al proporcionar una vía de reacción alternativa que requiere menos energía que la reacción sin catalizar. A diferencia de algunos catalizadores inorgánicos, la mayoría de las enzimas catalizan reacciones a temperaturas templadas. Además, las enzimas son específicas para las clases de reacciones que catalizan. Cada clase de enzima tiene una superficie de unión única e intrincada denominada sitio activo. El sustrato se une al sitio activo de la enzima, que consiste en una pequeña hendidura o grieta en una gran molécula de proteína. En el modelo llave-cerradura de la acción enzimática las estructuras del sitio activo de la enzima y del estado de transición del sustrato son complementarias. En el modelo de ajuste inducido se asume que la molécula de proteína es flexible.

2. Cada enzima se clasifica y se le denomina según la clase de reacción que cataliza. Existen seis categorías principales de enzimas: oxidorreductasas, transferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas y ligasas.

3. La cinética enzimática consiste en el estudio cuantitativo de la catálisis enzimática. Según el modelo de Michaelis-Menten, cuando el sustrato S se une al sitio activo de una enzima E, se forma un complejo de estado de transición ES. Durante el estado de transición, el sustrato se convierte en producto. Tras un tiempo, el producto se disocia de la enzima. El símbolo V_máx es la velocidad máxima de la reacción y K_m es una constante de afinidad llamada constante de Michaelis. Las determinaciones experimentales de K_m y V_máx se realizan con las gráficas de los dobles recíprocos de Lineweaver-Burk.

4. El número de recambio (k_cat) es una medida del número de moléculas de sustrato que se convierten en producto en cada unidad de tiempo mediante una enzima cuando ésta está saturada con el sustrato. Debido a que en condiciones fisiológicas la [S] es relativamente baja ([S] << K_m), la constante de especificidad k_cat/K_m es una medida más fiable de la eficiencia catalítica de las enzimas.

5. La inhibición enzimática puede ser reversible o irreversible. En la inhibición reversible, el inhibidor puede disociarse de la enzima. Las clases más comunes de inhibición reversible son competitiva, no competitiva y acompetitiva. Al parecer, las suposiciones de la ley de acción de masas en que se basa el análisis enzimático in vitro no se cumplen en el espacio interior hacinado y heterogéneo de los seres vivos. Los inhibidores irreversibles usualmente se unen de manera covalente a las enzimas.

6. El modelo de Michaelis-Menten no explica las propiedades cinéticas de las enzimas alostéricas. La mayoría de las enzimas alostéricas son proteínas con varias subunidades. La unión del sustrato o efector a una subunidad afecta a las propiedades de unión de otras subunidades.

7. Las enzimas utilizan los mismos mecanismos catalíticos que los catalizadores no enzimáticos. Varios factores contribuyen a la catálisis enzimática: efectos de proximidad y de tensión, efectos electrostáticos, catálisis acidobásica y catálisis covalente. Los mecanismos enzimáticos son afectados por combinaciones de estos factores.

8. Las cadenas laterales de los aminoácidos del sitio activo facilitan la transferencia de protones y las sustituciones nucleófilas, además de estabilizar el estado de transición. Muchas enzimas utilizan cofactores no proteínicos (metales y coenzimas) para facilitar reacciones.

9. Las enzimas son sensibles a factores ambientales como la temperatura y el pH. Cada enzima posee una temperatura y un pH óptimos.

10. Las reacciones químicas de las células están organizadas en una serie de vías bioquímicas. Las vías se controlan principalmente ajustando las concentraciones y las actividades de las enzimas por medio del control genético, de la modificación covalente, de la regulación alostérica y de la compartimentación.

Lecturas recomendadas

Palabras clave

• apoenzima

• carbanión

• carbocatión

• catalizador

• cinética enzimática

• coeficiente de actividad

• coenzima

• cofactor

• constante de especificidad

• cooperatividad negativa

• cooperatividad positiva

• energía de activación

• enzima

• enzima alostérica

• estado de transición

• hacinamiento macromolecular

• hidrolasas

• holoenzimas

• inducción enzimática

• inhibición competitiva

• inhibición irreversible

• inhibición no competitiva

• inhibición reversible

• inhibidor

• intermediario

• isomerasa

• liasa

• ligasa

• mecanismo de reacción

• número de recambio

• oxianión

• oxidorreductasa

• pH óptimo

• proenzima

• radical libre

• sitio activo

• sustrato

• transferasa

• velocidad

• vitamina

• zimógeno

Estas preguntas están diseñadas para poner a prueba los conocimientos del lector sobre los conceptos clave expuestos en este capítulo, antes de pasar al siguiente.

1. Los seres vivos deben regular la velocidad de procesos catalíticos. Explique cómo regula la célula las reacciones enzimáticas.

2. Varios factores contribuyen a la catálisis enzimática. ¿Cuáles son? Explique brevemente el efecto de cada uno.

3. Describa la inhibición por retroalimentación negativa.

4. Describa los dos modelos que explican la unión de las enzimas alostéricas. Utilice cualquier modelo para explicar la unión del oxígeno a la hemoglobina.

5. ¿Qué propiedades de los metales de transición los hacen útiles como cofactores enzimáticos?

6. El cambio de entalpía ΔH de la siguiente reacción es −28.2 kJ/mol:

   C₆H₁₂O₆ + 6O₂ → 6CO₂ + 6H₂O

   Explique por qué la glucosa (C₆H₁₂O₆) es estable en una atmósfera con oxígeno durante periodos apreciables.

7. Las enzimas actúan reduciendo la energía de activación de una reacción. Describa varias formas en las que se logra esto.

8. En la cinética enzimática, ¿por qué se hacen las mediciones al comienzo de una reacción?

9. La histidina se utiliza a menudo como ácido general o como base general en la catálisis enzimática. Considérense los valores de pK_a de los grupos laterales de los aminoácidos del cuadro 5.2 para sugerir una razón por la que esto es así.

10. Las enzimas son estereoquímicamente específicas; es decir, suelen convertir sólo una forma estereoisomérica de sustrato en producto. ¿Por qué esta especificidad es inherente a su estructura?

11. Defínanse los siguientes términos:

    1. oxigenasa

    2. epimerasa

    3. proteasa

    4. hidroxilasa

    5. oxidasa

12. Defínanse los siguientes términos:

    1. metabolón

    2. in vivo

    3. in vitro

    4. in silico

    5. flujo metabólico

13. Dibuje las estructuras de los aminoácidos cuyas cadenas laterales participan más a menudo en mecanismos catalíticos cuando se encuentran en los sitios activos de enzimas.

14. Describa la compartimentación dentro de las células eucariotas. ¿Qué problemas resuelve este fenómeno en los seres vivos?

15. En cualquier enzima dada, el sitio activo es sólo una pequeña porción de toda la molécula. La síntesis de esta máquina molecular relativamente grande requiere una enorme cantidad de energía celular. Explique por qué se tolera esta ineficiencia.

16. ¿Un mecanismo de reacción se altera por la presencia de un catalizador? Explique.

El objetivo de estas preguntas es reforzar la comprensión de todos los conceptos clave expuestos en el libro hasta el momento, incluyendo este capítulo y todos los que le preceden. Es factible que no tengan sólo una respuesta correcta.

1. Considere la siguiente reacción:

   

   Utilizando los datos siguientes, determine el orden de la reacción para cada sustrato y el orden global de la reacción.

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   Experimento	Concentración (mol/L)			Velocidad (mol L−1 s−1)
   	Piruvato	ADP	P1
   1	0.1	0.1	0.1	8 × 10−4
   2	0.2	0.1	0.1	1.6 × 10−3
   3	0.2	0.2	0.1	3.2 × 10−3
   4	0.1	0.2	0.1	3.2 × 10−3

2. Considere los siguientes datos para una reacción de hidrólisis catalizada por una enzima en presencia y en ausencia del inhibidor I:

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   [Sustrato] (M)	ν0 (μmol/min)	ν0I (μmol/min)
   6 × 10−6	20.8	4.2
   1 × 10−5	29	5.8
   2 × 10−5	45	9
   6 × 10−5	67.6	13.6
   1.8 × 10−4	87	16.2

   Utilizando una gráfica de Michaelis-Menten, determine la K_m de la reacción sin inhibir y de la reacción inhibida.

3. Utilice los datos de la tabla de la pregunta 18 para realizar lo siguiente:

   1. Realice las gráficas de Lineweaver-Burk de los datos.

   2. Explique la significancia de la intersección horizontal, la intersección vertical y la pendiente.

   3. Identifique el tipo de inhibición que se está determinando.

4. Se realizaron dos experimentos con la enzima ribonucleasa. En el experimento 1 se determinó cómo afectaba a la velocidad de reacción el aumentar la concentración de sustrato. En el experimento 2, las mezclas de reacción fueron idénticas a las del experimento 1, excepto que se agregó a cada tubo 0.1 mg de un compuesto desconocido. Realice una gráfica de los datos de acuerdo con el método de Lineweaver-Burk. Determine el efecto del compuesto desconocido sobre la actividad enzimática. (La concentración de sustrato se mide en milimoles por litro. La velocidad se determina mediante el cambio de la densidad óptica por hora.)

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   Experimento 1		Experimento 2
   [S]	ν	[S]	ν
   0.5	0.81	0.5	0.42
   0.67	0.95	0.67	0.53
   1	1.25	1	0.71
   2	1.61	2	1.08

5. Describa el mecanismo de la quimotripsina. Muéstrese cómo participan en la reacción los residuos de aminoácidos del sitio activo.

6. Numerosos alcoholes inhiben a la alcohol deshidrogenasa (ADH). Utilizando los datos de la tabla siguiente, calcúlense los valores k_cat/K_m para cada uno de los alcoholes. ¿Cuál de los alcoholes de la lista es metabolizado con mayor facilidad por la alcohol deshidrogenasa?

   Parámetros cinéticos de la ADH de testículo de hámster

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   Sustrato	Km (μM)	kcat(min−1)
   Etanol	960	480
   1-butanol	440	450
   1-hexanol	69	182
   12-hidroxidodecanoato	50	146
   Todo-trans-retinol	20	78
   Alcohol bencílico	410	82
   2-butanol	250 000	285
   Ciclohexanol	31 000	122

7. El 4-metil pirazol (4-MP) se ha desarrollado como una alternativa más duradera y menos tóxica que el etanol en el tratamiento del envenenamiento por etilenglicol. A continuación se muestra una gráfica de Lineweaver-Burk de la inhibición de la alcohol deshidrogenasa por varias concentraciones de 4-metil pirazol. ¿Qué tipo de inhibición parece exhibir esta molécula?

   

8. La catalasa tiene una K_m de 25 mM y un k_cat de 4.0 × 10⁷ s⁻¹ con H₂O₂ como sustrato. La anhidrasa carbónica tiene una K_m de 26 mM y una k_cat de 4.0 × 10⁵ s⁻¹. ¿Qué sugieren estos datos acerca de estas dos enzimas?

9. Considere la siguiente reacción, junto con los datos sobre su velocidad.

   A + B → C

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   [A] (mM)	[B] (mM)	Velocidad (mM/s)
   0.05	0.05	2 × 107
   0.10	0.05	4 × 107
   0.05	0.10	4 × 107
   0.10	0.10	8 × 107

   ¿Cuál es la expresión para la velocidad global de esta reacción? ¿Cuál es su orden?

10. Revise los siguientes valores aproximados de K_m del etanol y el acetaldehído para la ADH1 en Saccharomyces cerevisiae y explique por qué estos datos apoyan la función observada de esta enzima en el metabolismo del etanol dentro del organismo.

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    	Km (etanol)	Km (acetaldehído)
    ADH1	20 000 μM	1 500 μM

6.1

Los aminoácidos que forman la estructura tridimensional del sitio activo son quirales. En consecuencia, el sitio activo es quiral y sólo puede unirse a una forma isomérica de un azúcar hexosa, en este caso el d-isómero.

6.2

1. Isomerasa.

2. Transferasa.

3. Liasa.

4. Oxidorreductasa.

5. Ligasa.

6. Hidrolasa.

6.3

Los productos de la degradación son los siguientes compuestos:

La rotura del enlace éster es catalizada por una esterasa; el enlace amida es dividido por una peptidasa.

6.4

6.5

La diálisis elimina el formaldehído, el ácido fórmico y el metanol que se acumulan en el torrente sanguíneo. El bicarbonato neutraliza el ácido producido y ayuda a compensar la acidosis resultante. El etanol se une de manera competitiva a la deshidrogenasa alcohólica, lo cual desacelera la deshidrogenación del metanol y da tiempo a que los riñones lo eliminen.

6.6

Síndrome de Menkes: las inyecciones de sales de cobre en la sangre pueden impedir la absorción intestinal deficiente y proporcionar el cobre necesario para formar cantidades adecuadas de ceruloplasmina y neutralizar los síntomas de la enfermedad.

6.7

Enfermedad de Wilson: el zinc induce la síntesis de metalotioneína, que tiene elevada afinidad por el cobre. Parte del daño orgánico puede invertirse debido a que la metalotioneína secuestra el cobre y evita que este metal tóxico se una a las proteínas y a las enzimas susceptibles y las inactive. La penicilamina forma un complejo con el cobre en la sangre. Este complejo se transporta a los riñones, donde se elimina.

6.8

1. Cofactor.

2. Holoenzima.

3. Apoenzima.

4. Coenzima.

5. Coenzima.

6.9

El paciente que no mostró mejoría probablemente tenga mayor concentración de enzimas acetilantes. La dosis del paciente debe basarse en la capacidad de procesar el fármaco y no en el peso corporal.

PREGUNTAS DE REVISIÓN

2

Los factores que contribuyen con la catálisis enzimática incluyen efectos de tensión y de proximidad, efectos electrostáticos, catálisis acidobásica y catálisis covalente.

5

Los iones metálicos de transición son útiles como cofactores enzimáticos porque tienen altas concentraciones de carga positiva, pueden actuar como ácidos de Lewis y pueden unirse con uno o más ligandos al mismo tiempo.

8

Al comienzo de la reacción pueden conocerse de manera precisa las concentraciones de los reactivos y de los productos. Debido a que aún no se ha establecido el equilibrio, presumiblemente sólo está ocurriendo la reacción en sentido directo (hacia los productos).

12

1. Metabolón: complejo de enzimas que comparten intermediarios de una vía metabólica, de modo que el producto de una enzima está en estrecha proximidad con el sitio activo de la siguiente enzima en la vía.

2. In vivo: en una célula u organismo vivo

3. In vitro: en vidrio (en un tubo de ensayo); que ocurre en el laboratorio bajo condiciones controladas, y no dentro de una célula u organismo.

4. In silico: que resulta de la simulación o del modelado en una computadora.

5. Flujo metabólico: velocidad del flujo (gasto) de metabolitos, como sustratos, productos e intermediarios, a lo largo de vías bioquímicas.

14

La compartimentalización en células eucariotas es la separación física de enzimas por una membrana (es decir, la contención de determinadas enzimas dentro de un organelo), o mediante la fijación de enzimas a membranas o filamentos del citoesqueleto. La compartimentalización (1) impide que reacciones competitivas ocurran de manera simultánea y permite regularlas por separado (“divide y controlarás”), (2) reduce o elimina barreras de difusión al ubicar enzimas en estrecha proximidad entre sí, (3) proporciona condiciones de reacción especializadas (p. ej., bajo pH) que no serían posibles de otra manera y (4) protege otros componentes celulares contra productos de reacción potencialmente tóxicos (“control de daños”).

PREGUNTAS DE ANÁLISIS

19

22

Los valores de k_cat/K_m para los alcoholes son los siguientes:

Con base en los valores de K_cat/k_m, los valores de estos alcoholes, el retinol todo-trans es el alcohol que se metaboliza más fácilmente con ADH.