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Todos los seres vivos viables poseen las siguientes características: síntesis rápida y precisa del DNA y estabilidad genética proporcionada por mecanismos eficaces de reparación del DNA. De forma paradójica, la supervivencia a largo plazo de las especies depende también de las variaciones genéticas que les permiten adaptarse a los ambientes cambiantes. En la mayoría de las especies, estas variaciones resultan predominantemente de la recombinación genética, aunque las mutaciones también desempeñan una función importante. En las siguientes secciones se revisan los mecanismos que utilizan los organismos procariotas y eucariotas para lograr estos objetivos.
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La replicación del DNA tiene lugar antes de cada división celular. El mecanismo por el que se producen las copias de DNA es semejante en todos los seres vivos. Tras separarse las dos cadenas, cada una de ellas se utiliza como molde para la síntesis de una cadena complementaria figura 18.3. (En otras palabras, cada una de las dos nuevas moléculas de DNA contiene una cadena vieja y una nueva.) Este proceso, que se denomina replicación semiconservadora, se demostró por primera vez en un elegante experimento figura 18.4 que reportaron en 1958 Matthew Meselson y Franklin Stahl. En este trabajo clásico, Meselson y Stahl aprovecharon el aumento de la densidad del DNA marcado con el isótopo pesado del nitrógeno 15N (el isótopo del nitrógeno más abundante es 14N). Tras cultivar células de E. coli durante 14 generaciones en un medio de cultivo cuya fuente de nitrógeno consistía únicamente en 15NH4Cl, las células que contenían 15N se transfirieron a un medio de cultivo que contenía el isótopo 14N. Después de una y de dos divisiones celulares, se tomaron muestras, y posteriormente se aisló y analizó el DNA de cada una de estas muestras mediante centrifugación en gradiente de densidad de CsCl. Debido a que este método analítico separa moléculas con base en su tamaño y su forma o “densidad”, los DNA con 15N y con 14N puros producen bandas características en los tubos de CsCl centrifugados (el DNA con 15N es más pesado que el que tiene 14N).
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Al centrifugar el DNA aislado de las células que contenían 15N cultivadas durante exactamente una generación en el medio de 14N, se observaba una única banda. Debido a que esta banda se encontraba justo a la mitad de la distancia donde normalmente debían aparecer las bandas de DNA-15N y de DNA-14N, parecía razonable suponer que el nuevo DNA era una molécula híbrida; es decir, contenía una cadena de 15N y una cadena de 14N. (Cualquier otro modo de replicación habría creado más de una banda.) Luego de dos divisiones celulares, el DNA extraído se separaba en dos bandas diferenciadas de igual intensidad, una formada por 14N, DNA-14N (DNA ligero) y otra formada por moléculas híbridas (DNA-14N, 15N), un resultado que también apoyaba el modelo semiconservador de la síntesis de DNA.
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En los años transcurridos desde el experimento de Meselson y Stahl se han descubierto muchos de los detalles de la replicación del DNA. Hasta hace poco se suponía que la maquinaria de replicación del DNA se movía a lo largo de un “riel” de DNA que en gran medida era estacionario. Esfuerzos de investigación recientes han revelado que la replicación del DNA ocurre en compartimentos nucleares o nucleoides específicos llamados fábricas de replicación, que son relativamente estacionarias durante el proceso. La maquinaria de replicación contenida en estas fábricas funciona como una bomba de DNA impulsada por energía. En los organismos procariotas, las fábricas de replicación están unidas a la membrana celular, mientras que en los eucariotas las fábricas se ensamblan durante la fase de síntesis del ciclo celular (fase S.: véase más adelante, fig. 18.14) asociadas a la matriz nuclear.
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SÍNTESIS DE DNA EN LOS PROCARIOTAS La replicación del DNA en E. coli consta de varios pasos básicos, cada uno de los cuales requiere actividades enzimáticas asociadas con los siguientes procesos: desenrollamiento del DNA, síntesis de cebadores y síntesis de polinucleótidos de DNA. Aquí se describen además la unión de fragmentos de DNA y el control del superenrollamiento.
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Las helicasas de desenrollamiento del DNA, como su nombre indica, son proteínas motoras que requieren ATP y que separan a las cadenas unidas del DNA bicatenario. La helicasa principal de E. coli es DnaB, un hexámero de forma anular que abre la doble hélice.
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Síntesis de cebadores Es necesaria la formación de segmentos cortos de RNA complementarios a un molde de DNA monocatenario llamados cebadores, para que inicie la replicación del DNA. La síntesis de cebadores es catalizada por la primasa, una RNA polimerasa. La primasa es un polipéptido de 60 kD, producto del gen dnaG. Se denomina primosoma a un complejo multienzimático que contiene primasa y varias proteínas auxiliares.
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Síntesis de DNA La síntesis de una cadena de DNA complementaria en la dirección 5′ → 3′ por la formación de enlaces fosfodiéster entre los nucleótidos apareados a una cadena molde es catalizada por grandes complejos multienzimáticos que se denominan polimerasas de DNA figura 18.5. En el modelo actual del mecanismo catalítico de las polimerasas de DNA, que se ilustra en la figura 18.6, el oxígeno del hidroxilo 3′ es un nucleófilo que ataca al fosfato α del nucleótido entrante para formar un nuevo enlace P—O. Con una velocidad de polimerización de 1 000 nucleótidos/s, la DNA polimerasa III (pol III) es la principal enzima sintetizadora de DNA de los organismos procariotas. La holoenzima pol III está formada por al menos 10 subunidades (cuadro 18.1). La polimerasa central consta de tres subunidades: α, ε y θ. La proteína β (también llamada proteína pinza deslizante o pinza β2) está formada por dos subunidades figura 18.7 y crea un anillo en forma de rosquilla alrededor de la cadena molde de DNA. El complejo γ está formado por las subunidades τ, γ, δ, δ′, χ, y ψ. De éstas, τ, γ, δ y δ′ contienen un dominio ATPasa motriz que utiliza la energía liberada por la hidrólisis del ATP para catalizar la función mecánica de la carga de la pinza de DNA. El complejo γ reconoce cadenas sencillas de DNA con cebador y, actuando como un cargador de pinza, transfiere el dímero de la pinza β2 a la polimerasa central, donde forma un anillo cerrado alrededor de la cadena de DNA. El diámetro interno de la pinza β2 es unos 3.5 Å mayor que el DNA bicatenario, suficiente para que las cadenas de DNA hidratadas se deslicen por él con facilidad. La pinza β2 promueve la procesividad; es decir, impide que la polimerasa se disocie con frecuencia del molde de DNA. El complejo γ se expulsa en un proceso impulsado por la hidrólisis de ATP, y la holoenzima pol III puede proceder a replicar el DNA. Obsérvese que la subunidad τ permite que dos complejos enzimáticos centrales formen un dímero, lo que también mejora la procesividad. La máquina de replicación del DNA, que se denomina replisoma, está formada por dos copias de la holoenzima pol III, el primosoma y las proteínas de desenrollamiento de DNA.
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Escherichia coli posee también otras cuatro DNA polimerasas: I, II, IV y V. La DNA polimerasa I (pol I), la primera DNA polimerasa que se descubrió (Arthur Kornberg, premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1959), es una enzima versátil que aporta varias funciones en la replicación y la reparación del DNA. Tiene tres actividades catalíticas marcadamente diferentes: actividad de exonucleasa 5′ → 3′, actividad de polimerasa dirigida por plantilla (molde) 5′ → 3′ y actividad de exonucleasa 3′ → 5′. (Una exonucleasa es una enzima que elimina nucleótidos de un extremo de una cadena polinucleotídica.) La actividad de exonucleasa 5′ → 3′ de la pol I elimina (despolimeriza) segmentos mal apareados de DNA durante la replicación. Esta misma actividad elimina también los cebadores de RNA. Una vez eliminado el cebador de RNA, la actividad de polimerasa dirigida por molde 5′ → 3′ de la pol I reemplaza a los ribonucleótidos con desoxirribonucleótidos. (Obsérvese que la pol I es una enzima lenta [18 nucleótidos/s] con baja procesividad, en contraste con la pol III, la principal enzima de replicación.) A medida que la pol I sintetiza segmentos cortos de DNA, utiliza también su actividad de corrección exonucleasa 3′ → 5′ para asegurar su exactitud. La pol I tiene también funciones importantes en varios tipos de reparación de daños posreplicación.
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Las pols II y IV son enzimas de reparación que normalmente están presentes en la células, en donde reparan daños de bajo nivel en el DNA. La exposición de las células a niveles altos de luz ultravioleta o sustancias químicas mutagénicas activa un mecanismo de reparación de emergencia denominado respuesta SOS. Las enzimas y otras proteínas inducidas por la respuesta SOS impiden la muerte celular causada por altos niveles de daño al DNA que impiden la replicación. Muy al principio en la respuesta SOS, aumenta la expresión de los genes pol II y pol IV, para ser seguida luego por la expresión del gen de la pol V. Estas enzimas reparadoras se conocen como polimerasas de translesión porque sus estructuras permiten el uso de DNA dañado como molde. Cuando se detiene la replicación porque la pol III ha encontrado una lesión (p. ej., aductos de bases, pérdida de bases o dímeros de timina), entonces la pol III es reemplazada por una de las enzimas de reparación. Una vez que la lesión ha sido librada por la incorporación de nucleótidos en la cadena opuesta a la lesión, la polimerasa de translesión se elimina y se reemplaza con pol III, que continúa la replicación hasta que se encuentra la siguiente lesión. Desafortunadamente, la reparación mediante el sistema SOS conlleva un alto costo porque es propenso a errores. Las características estructurales de las pols IV y V, y en menor grado de la pol II, que permiten su unión a las lesiones de DNA también disminuyen su exactitud. Se producen mutaciones si los errores introducidos por las polimerasas de translesión no son corregidos por la reparación posreplicación.
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Unión de los fragmentos de DNA A menudo, durante la replicación del DNA (así como en procesos de reparación y recombinación del DNA), es necesario unir entre sí segmentos de cadena de DNA. Una enzima denominada DNA ligasa cataliza la formación de un enlace covalente fosfodiéster entre el extremo 3′-OH de un segmento y el extremo 5′-fosfato de otro segmento.
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Control del superenrollamiento Las topoisomerasas de DNA evitan el enmarañamiento de las cadenas de DNA. Se anticipan a la maquinaria de replicación para reducir la torsión (fuerza de rotación) del DNA que puede lentificar el proceso de replicación. La generación de torsión es un problema muy real porque la doble hélice se desenrolla con rapidez (hasta a 50 revoluciones por segundo durante la replicación del DNA bacteriano). Las topoisomerasas son enzimas que cambian el superenrollamiento del DNA rompiendo una o ambas cadenas, tras lo cual pasan el DNA a través de la rotura y vuelven a unir ambas cadenas. Los términos topoisomerasa y topoisómeros (moléculas de DNA que sólo se diferencian en su grado de superenrollamiento) se derivan de topología, una rama de las matemáticas que investiga cambios de forma o de posición que pueden lograrse sin hacer cortes. Cuando se controla de manera adecuada, el superenrollamiento puede facilitar la separación de las cadenas de DNA. Las topoisomerasas de tipo I producen roturas transitorias de cadena individual en el DNA; las topoisomerasas de tipo II producen roturas transitorias de doble cadena. En los organismos procariotas, una topoisomerasa de tipo II llamada DNA girasa ayuda a separar (desencadenar) los productos de la replicación (p. ej., cromosomas circulares unidos) y a crear los superenrollamientos negativos (−) que se requieren para empaquetar el genoma.
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PROCESO DE REPLICACIÓN PROCARIOTA La replicación del cromosoma circular de E. coli figura 18.8 comienza cuando existe una alta proporción ATP/ADP y hay suficientes copias de la proteína de unión al DNA denominada DnaA (53 kD) que sirve para iniciar el proceso de replicación fundiendo el dsDNA y atrayendo al sitio otras proteínas de replicación figura 18.9. El sitio de iniciación en el cromosoma de E. coli se conoce como oriC. Una vez que se ha iniciado, la replicación procede en dos direcciones. Las helicasas desenrollan el dúplex de DNA, se ensamblan dos replisomas y la replicación procede hacia afuera en ambas direcciones. Conforme se separan uno de otro los dos sitios de la síntesis activa de DNA (que se denominan horquillas de replicación) se forma un “ojal de replicación”. Debido a que un cromosoma de E. coli contiene un único sitio de iniciación, se considera una sola unidad de replicación. Una unidad de replicación, o replicón, es una molécula de DNA (o un segmento de DNA) que contiene un sitio de iniciación y secuencias reguladoras adecuadas.
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Cuando se observó experimentalmente por primera vez la replicación del DNA (utilizando microscopia electrónica y autorradiografía), los investigadores se enfrentaron a una paradoja. La síntesis bidireccional del DNA tal y como aparecía en su investigación parecía indicar que ocurría una síntesis continua en la dirección 5′ → 3′ en una cadena y en el sentido opuesto (3′ → 5′) en la otra cadena. Sin embargo, todas las enzimas que catalizan la síntesis de DNA lo hacen sólo en la dirección 5′→ 3′. Ahora se sabe que sólo una cadena, que se denomina cadena líder, se sintetiza de forma continua en la dirección 5′ → 3′. La otra cadena, que se denomina cadena retrasada, también se sintetiza en la dirección 5′→ 3′, pero en pequeños segmentos figura 18.10. Reiji Okazaki y sus colegas proporcionaron evidencia experimental de la síntesis discontinua de DNA. Una vez que el cebador de RNA es eliminado de cada segmento y reemplazado por DNA, estos segmentos de la cadena retrasada, ahora llamados fragmentos de Okazaki, se unen de forma covalente por medio de la DNA ligasa. En los procariotas como E. coli, los fragmentos de Okazaki poseen cerca de 1 000 nucleótidos.
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La replicación comienza cuando la proteína DnaA se une a entre cinco y ocho sitios con nueve pares de bases, denominados cajas de DnaA, dentro de la secuencia oriC. El número de cajas de DnaA varía entre los procariotas; E. coli tiene cinco de ellas. La oligomerización de DnaA, que produce una estructura parecida a un nucleosoma, requiere ATP y una proteína HU semejante a las histonas. Cuando se forma el complejo DnaA-DNA, la “fusión” localizada del DNA dúplex en una región cercana que contiene tres secuencias repetidas de 13 bp (pares de bases) hace que se abra un pequeño segmento de la doble hélice figura 18.11. La DnaB (una helicasa de 300 kD compuesta por seis subunidades), formando un complejo con la DnaC (29 kD), entra entonces en la región oriC abierta. Cuando la DnaB se carga en el DNA, se libera la DnaC. La horquilla de replicación se mueve hacia adelante a medida que la DnaB desenrolla la hélice. Las topoisomerasas alivian la torsión al frente de la maquinaria de replicación. Conforme se desenrolla el DNA, se va desplazando la DnaA. La hidrólisis de las moléculas de ATP unidas hace que la DnaA se revierta a una conformación inactiva que es incapaz de unirse al DNA. Las cadenas individuales se mantienen separadas por la unión de numerosas copias de la proteína de unión al DNA monocatenario (SSB). La SSB, un tetrámero, también puede proteger del ataque de las nucleasas a los segmentos vulnerables de ssDNA.
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En la figura 18.12 se presenta un modelo de síntesis de DNA en la horquilla de replicación. Para que la pol III inicie la síntesis de DNA, debe sintetizarse un cebador de RNA. En la cadena líder, donde la síntesis de DNA es continua, la formación del cebador sólo ocurre una vez por cada horquilla de replicación. Por el contrario, la síntesis discontinua en la cadena retrasada requiere la síntesis de un cebador por cada uno de los fragmentos de Okazaki. El primosoma viaja a lo largo de la cadena retrasada y se detiene e invierte la dirección en intervalos para sintetizar un cebador corto de RNA. A continuación, la pol III sintetiza el DNA comenzando por el extremo 3′ del cebador. A medida que la síntesis de la cadena retrasada continúa, la pol I desprende los cebadores de RNA y también sintetiza un segmento de DNA complementario. La DNA ligasa une entonces los fragmentos de Okazaki.
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Como lo muestra la figura 18.12, la síntesis de ambas cadenas, líder y retrasada, está acoplada. La operación en tándem de los dos complejos pol III requiere que una cadena (la cadena retrasada) haga un lazo alrededor del replisoma. Cuando el complejo pol III de la cadena retrasada completa un fragmento de Okazaki, libera el dúplex de DNA rompiendo su conexión con la pinza deslizante. Luego se reasocia con una nueva pinza deslizante ensamblada sobre el cebador de RNA recién sintetizado por el complejo γ que está directamente adyacente a la horquilla de replicación. Esto le permite al primosoma ingresar y sintetizar el siguiente cebador de RNA.
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A pesar de la complejidad de la replicación del DNA en E. coli y de su alta velocidad de procesividad, este proceso es asombrosamente exacto –cerca de un error por 109 a 1010 pares de bases por generación.
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Esta baja tasa de errores, es en gran medida consecuencia de la naturaleza precisa del propio proceso de copiado (p. ej., el apareamiento de bases complementarias). Dentro del sitio activo de la pol III y la pol I hay un sitio con la forma precisa para dar cabida a un par de bases nucleotídicas en el que una purina y una pirimidina se alinean de forma correcta mediante enlaces de hidrógeno e interacciones de van der Waals. Si las bases nucleotídicas no concuerdan, esto es, no embonan en el sitio, y el nucleótido entrante suele dejar el sitio antes de que ocurra la reacción. Tanto la pol III como la pol I también verifican el DNA recién sintetizado. La mayoría de los nucleótidos mal apareados se elimina (por las actividades de exonucleasas 3′ → 5′ de la pol III y de la pol I) y luego se sustituyen. Asimismo diversos mecanismos de reparación posteriores a la replicación contribuyen a la baja tasa de errores de replicación del DNA.
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La replicación finaliza cuando las horquillas de replicación se encuentran en el otro lado del cromosoma circular en el sitio de terminación, la región ter (τ). En E. coli, la región ter está formada por seis sitios de terminación de 20 bp los cuales, cuando se enlazan a la proteína de unión al DNA tus, hacen que la replicación se detenga. Este complejo asimétrico tus-ter impide que una horquilla de replicación viaje en un sentido pero no en el otro, gracias a una inhibición dependiente del sentido de la helicasa DnaB figura 18.13. Una vez que termina la replicación, los replisomas se desensamblan y las dos moléculas hijas son separadas por una topoisomerasa de tipo II.
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SÍNTESIS DEL DNA EN LOS ORGANISMOS EUCARIOTAS Aunque los principios de la replicación del DNA tanto en los procariotas como en los eucariotas tienen mucho en común (p. ej., la replicación semiconservadora, los mecanismos de las polimerasas de DNA y los replicones bidireccionales), también tienen diferencias significativas. No es sorprendente que estas diferencias estén relacionadas con el tamaño y con la complejidad de los genomas eucariotas.
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DNA polimerasas Hay 15 DNA polimerasas de organismos eucariotas. De ellas, tres (α, δ y ∊) participan en la replicación del DNA nuclear. La DNA polimerasa α (pol α) es una primasa que inicia la replicación del DNA sintetizando un segmento corto de RNA de 10 nucleótidos, seguido por un segmento de DNA de 10 a 20 nucleótidos. Tras la síntesis del cebador en la cadena líder, la síntesis del DNA es continuada por la pol ∊. La pol δ es la polimerasa de la cadena retrasada. Tanto la pol δ como la ∊ son polimerasas muy exactas y procesadoras con actividad de verificación de exonucleasas 3′ → 5′. La pol δ corrige errores cometidos por la pol α. Las polimerasas β, ς (zeta) y η (eta) trabajan en la reparación de DNA nuclear. La pol γ replica y repara DNA mitocondrial. A diferencia de las polimerasas de DNA procariótico, ninguna de las enzimas eucarióticas elimina cebadores de RNA. En cambio, la enzima Dna2, con actividades de nucleasa y helicasa, y la FEN1, una endonucleasa, sí eliminan los cebadores.
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Temporización Al contrario que en las células bacterianas de crecimiento rápido, en las que la replicación sucede durante la mayor parte del ciclo de división celular, la replicación en las células eucariotas se limita a un periodo específico que se denomina fase S figura 18.14. Las células eucariotas producen determinadas proteínas (sección 18.3) que regulan las transiciones de fase dentro del ciclo celular.
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Velocidad de replicación La replicación del DNA es mucho más lenta en los eucariotas que en los procariotas. La velocidad eucariota es de ~50 nucleótidos por segundo, por cada horquilla de replicación. (Recuérdese que la velocidad en los procariotas es unas 20 veces mayor.) Esta discrepancia tal vez se deba, en parte, a la estructura compleja de la cromatina.
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Replicones Pese a la relativa lentitud de la síntesis del DNA en las células eucariotas, el proceso de replicación es breve en términos relativos, considerando las grandes dimensiones de los genomas eucariotas. Por ejemplo, según la velocidad de replicación antes mencionada, la replicación de un cromosoma eucariota promedio (aproximadamente 150 millones de pares de bases) tardaría en completarse un mes. Sin embargo, este proceso en general se completa en algunas horas. Los eucariotas utilizan múltiples replicones para comprimir la replicación de sus grandes genomas en periodos cortos figura 18.15. Casi cada 40 kb a lo largo de los cromosomas de los eucariotas hay un sitio en el que se ensambla la maquinaria de replicación. El ser humano tiene unos 30 000 orígenes de replicación.
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Fragmentos de Okazaki Los fragmentos de Okazaki de los eucariotas, que tienen entre 100 y 200 nucleótidos, son mucho más cortos que los de los procariotas.
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PROCESO DE REPLICACIÓN DE LOS EUCARIOTAS En los eucariotas superiores, la replicación comienza con el ensamblaje secuencial del complejo de replicación de preiniciación (preRC) figura 18.16. La formación de este complejo implica un proceso que comienza en la temprana fase G1 del ciclo celular, cuando son bajas las concentraciones de cinasa dependiente de ciclina (Cdk) y de proteínas de ciclo de división celular (Cdc). El proceso, llamado autorización, limita la replicación de DNA a una vez por ciclo celular.
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El ensamblaje de los componentes del preRC comienza cuando el complejo del origen de replicación (ORC), cuyas subunidades son análogas a la DnaA, se une al origen o región de iniciación del DNA. Cdc6/Cdc18 y Cdt1 se unen al ORC y reclutan al complejo MCM. Se cree que MCM es la principal helicasa de DNA en los eucariotas. El reclutamiento de más proteínas de la maquinaria de control del ciclo celular (p. ej., cdk2-ciclina E y cdc45) permite que las proteínas de replicación de DNA sean cargadas en la horquilla de replicación y se inicie la síntesis de DNA figura 18.17. La conversión de preRC autorizada a un complejo de iniciación activo requiere la presencia de pol α/primasa, pol ε y varias proteínas accesorias, que ocurre sólo al inicio de la fase S. Las cinasas que regulan el ciclo celular entonces fosforilan y activan los componentes del preRC. Las proteínas que se unen al ORC y completan la estructura del preRC se denominan factores de autorización para la replicación (RLF).
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Cuando el complejo de iniciación está activo, la MCM recién fosforilada separa las cadenas de DNA, cada una de las cuales es estabilizada entonces por proteína de replicación A (RPA) figura 18.18. La replicación es iniciada por la primasa, que sintetiza los RNA cebadores de la cadena líder y de cada fragmento de Okazaki de la cadena retrasada. La pol α/primasa alarga cada cebador con un corto segmento de DNA de unos 20 nucleótidos de longitud. Entonces la DNA polimerasa α es desplazada, y las polimerasas δ y ∊ continúan el proceso de replicación. La unión de la DNA polimerasa ∊ a la cadena líder y de la polimerasa δ a la cadena retrasada se controla por el factor de replicación C (RFC), que es una proteína cargadora de pinza. Después de unirse a ATP, el RFC se une a la PCNA (pinza deslizante), un factor de procesividad. El complejo RFC/PCNA, que convierte las polimerasas de DNA δ y ∊ en enzimas procesivas, carga entonces cualquiera de las polimerasas en el DNA, con lo que induce la hidrólisis de ATP.
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La replicación del DNA de cada cromosoma continúa hasta que los replicones se encuentran y se fusionan. Cuando la maquinaria de replicación llega al extremo 3′ de la cadena retrasada, el espacio es insuficiente para sintetizar un nuevo cebador de RNA. La síntesis incompleta de la cadena retrasada deja la cadena molde sin sus pares de bases complementarias al final del cromosoma. Los cromosomas con protrusiones 3′-ssDNA son muy susceptibles a la digestión por nucleasas y tienden a fusionarse entre sí, lo cual induce la rotura cromosómica durante la mitosis. Las células eucariotas pueden compensar este problema por medio de la telomerasa, una ribonucleoproteína con actividad de transcriptasa inversa, y de una molécula de RNA con una secuencia de bases que es complementaria a la secuencia rica en TG de los telómeros. Recuérdese que los telómeros son secuencias minisatelitales que se encuentran en los extremos de los cromosomas lineales. La telomerasa utiliza la secuencia de bases de RNA para sintetizar un DNA monocatenario y extender la cadena 3′ del telómero figura 18.19. Después, la maquinaria de replicación normal sintetiza un cebador y un nuevo fragmento de Okazaki. Los extremos del cromosoma son entonces secuestrados y estabilizados por proteínas de unión al extremo del telómero (TEBP), que se unen a secuencias teloméricas ricas en GT, y por factores de unión a repeticiones teloméricas (TRF) que fijan la protrusión 3′ (ahora más alejada de las secuencias de codificación críticas) en un lazo T en forma de nudo.
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En la mayoría de los organismos eucariotas multicelulares, la telomerasa es activa sólo en las células germinales (células que dan origen a óvulos y espermatozoides). En el cuerpo humano, durante el envejecimiento normal, los telómeros de las células somáticas (células diferenciadas excepto óvulos y espermatozoides) se acortan con el tiempo. Cuando los telómeros se reducen a una longitud crítica, los cromosomas ya no pueden replicarse. Como resultado de ello las células somáticas finalmente mueren. Resulta notable que los fibroblastos (células de tejido conjuntivo) de los pacientes con síndrome de progeria de Hutchinson-Guilford tienen telómeros anormalmente cortos. Estos pacientes envejecen con rapidez, y mueren antes de la adolescencia. También se sabe que la telomerasa se expresa de forma excesiva en ~90% de todos los cánceres.
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PREGUNTA 18.1
Compárense los procesos de replicación de los procariotas con los de eucariotas.
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CONCEPTOS CLAVE 
El DNA se replica mediante un mecanismo semiconservador en el que participan varias enzimas.
La cadena líder se sintetiza de forma continua en la dirección 5′ → 3′.
La cadena retrasada se sintetiza en fragmentos en la dirección 5′ → 3′; los trozos se unen luego de forma covalente.
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Las actividades metabólicas normales y las exposiciones ambientales tienen efectos considerables sobre el DNA. Por ejemplo, la estimación de lesiones del DNA en células humanas varía entre decenas y centenas de miles por cada célula en cada día. Y aún así, sólo una pequeña fracción de estas lesiones pasa como mutaciones a las células hijas. La tasa media de mutación espontánea natural para gametos (células reproductoras) de animales y plantas es 1 mutación por cada 100 000 genes en cada generación. Este bajo índice es el resultado de una red de mantenimiento del genoma que detecta las lesiones de DNA y luego las repara. Hay varias clases de reparaciones de DNA. Las reparaciones directas eliminan el daño químico del DNA (p. ej., dímeros de pirimidina) revirtiéndolo. Cuando el daño se ubica en una de las dos cadenas de DNA, se pueden usar varias formas de reparación por escisión (reparación por escisión de base, reparación por escisión de nucleótido y reparación de errores de apareamiento). Las roturas del DNA bicatenario son reparadas mediante unión de extremos no homólogos o mediante recombinación homóloga. En humanos y otros mamíferos, las respuestas a daños del DNA son reguladas por varias cinasas serina-treonina. De éstas, la ATM (αtaxia telangiectasia mutada) y la ATR (proteína de ataxia telangiectasia y relacionada con Rad3) inician respuestas globales al daño al DNA que activan grandes cantidades de proteínas regulatorias de reparación del DNA y del ciclo celular. (La ataxia telangiectasia es una extraña enfermedad humana caracterizada por sensibilidad a radiaciones, una inestabilidad genómica que predispone a los individuos afectados a la neurodegeneración y al cáncer.) Unos pocos tipos de daños del DNA pueden repararse sin la eliminación de nucleótidos. Por ejemplo, las roturas de los enlaces fosfodiéster pueden ser reparadas por la DNA ligasa. En la reparación por fotorreactivación o reparación fotoinducida, los dímeros de pirimidina se restauran a sus estructuras monoméricas originales figura 18.20. En presencia de luz visible, la fotoliasa de DNA rompe el dímero, dejando intactos los enlaces fosfodiéster. La energía luminosa que capturan los cromóforos de flavina y pterina de la enzima rompe el anillo de ciclobutano.
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Reparaciones directas
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REPARACIONES DE DNA MONOCATENARIO Varios mecanismos reparan el daño limitado a un segmento de DNA monocatenario utilizando como molde la cadena complementaria no dañada. La reparación por escisión de bases es un mecanismo que elimina y luego repone nucleótidos individuales cuyas bases han sufrido daño (p. ej., alquilación, desaminación u oxidación). Una de varias enzimas llamadas glucosilasas de DNA rompe el enlace N-glucosídico entre la base dañada y el componente de desoxirribosa del nucleótido figura 18.21. Los sitios apúricos o apirimidínicos (AP) resultantes se resuelven mediante la acción de nucleasas que eliminan el residuo de desoxirribosa y varios nucleótidos adicionales. El espacio es reparado por una DNA polimerasa (pol I en las bacterias y polimerasa β de DNA en los mamíferos) y una DNA ligasa. En la reparación por escisión de nucleótidos (NER) se eliminan lesiones voluminosas (de 2 a 30 nt) y desestabilizadoras de la hélice, y el hueco resultante se resana. Hay dos formas de reparación por escisión de nucleótidos: la reparación genómica global (GG-NER) y la reparación acoplada a transcripción (TC-NER). Difieren en los mecanismos que permiten reconocer el daño al DNA. En ambas formas las enzimas de escisión parecen reconocer la distorsión física, más que secuencias de bases específicas. En E. coli GG-NER figura 18.22, la nucleasa de escisión (escinucleasa), formada por Uvr A, B y C, corta el DNA dañado y elimina una secuencia de ssDNA de 12 a 13 nt que contiene la lesión. Un complejo UvrA2UvrB (A2B) busca daños en el DNA (p. ej., un dímero de timina). Una vez que la UvrA capta una distorsión en la hélice, desenrolla parcialmente el segmento afectado. La UvrB desestabiliza aún más el segmento insertando un dominio de horquilla β. Luego A2B dobla el DNA, y la Uvr A se disocia de Uvr B-DNA. La Uvr C se une entonces a la Uvr B y corta la cadena de DNA dañada cuatro o cinco nucleótidos hacia el lado 3′ del dímero de timina. La Uvr C corta la cadena ocho nucleótidos hacia el lado 5′. La Uvr D, una helicasa, libera la Uvr C y el oligonucleótido que contiene el dímero de timina. El hueco de escisión es reparado por la pol I y por la DNA ligasa.
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La reparación acoplada a la transcripción ocurre sólo en la cadena que se está transcribiendo activamente. El daño se reconoce cuando la enzima de transcripción, RNA polimerasa, se estanca. El Mfd, un factor de acoplamiento transcripción-reparación, procede entonces a desplazar a la polimerasa y a reclutar al complejo UvrA2B que iniciará la reparación del daño. La reparación por escisión de nucleótidos en humanos, lo mismo que en otros eucariotas, es más complicada que el proceso procariota y envuelve al menos nueve proteínas. La mayoría de estas proteínas es nombrada por su asociación con dos enfermedades causadas por su deficiencia: el xeroderma pigmentosum (un trastorno hereditario caracterizado por una extrema sensibilidad a la luz) y el síndrome de Cockayne (envejecimiento prematuro y anomalías auditivas y oculares). En el GG-NER, por ejemplo, la XPA, la XPC y la XPE participan en el reconocimiento de daños y en el reclutamiento de varias otras proteínas. La CSA y la CSB reconocen daños de DNA en TC-NER.
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CONCEPTOS CLAVE 
El DNA se encuentra expuesto constantemente a procesos químicos y físicos que alteran su estructura.
La supervivencia de cada organismo depende de su capacidad para reparar este daño estructural.
Entre los ejemplos se incluyen la reparación fotoinducida, la reparación por escisión de bases, la reparación por escisión de nucleótidos, la reparación de malos apareamientos, la unión de extremos no homólogos y la reparación por recombinación de homólogos.
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La reparación de errores de apareamiento es un mecanismo de reparación para una sola cadena que corrige errores de apareamiento de bases que distorsionan la hélice y que son producto de errores en la verificación de la replicación o de corrimiento en la replicación. (El corrimiento en la replicación es un tipo de error que ocurre cuando las secuencias de repetición son saltadas o copiadas doblemente, causando la formación de burbujas que necesitan repararse.) El proceso de reparación a menudo produce deleciones (secuencias saltadas) o inserciones (secuencias copiadas doblemente). También se pueden reparar algunos errores de recombinación y varias formas de daño químico (p. ej., aductos de 8-oxoguanina y de carcinógenos). Una característica notable de la reparación de errores de apareamiento es la capacidad de distinguir entre cadenas sintetizadas antigua o recientemente. En E. coli se logra esto mediante la metilación de ambas cadenas del DNA progenitor. La metiltransferasa del DNA (Dam) metila N-6 de los residuos de adenina en las secuencias 5′-GATC-3′ y la metilasa de la citosina del DNA (Dcm) convierte las citosinas de las secuencias 5′-CCTGG-3′ y 5′-CCAGG-3′ a 5-metilcitosina. Como estas secuencias forman palíndromos, se metilan igual ambas cadenas. Durante un lapso finito después de la replicación, cada DNA hija queda hemimetilada (p. ej., consiste en una cadena metilada y una no metilada). Justo durante este breve periodo, el DNA es explorado buscando pares de bases apareadas erróneamente. El sistema de reparación de errores de apareamiento consiste en tres proteínas: MutS, MutL y MutH. Un homodímero de MutS reconoce y se une a un sitio que contenga una base mal apareada en la cadena recién sintetizada. Luego, la MutH localiza y se une al sitio GATC más próximo. Después de que la MutS y la MutL realizan una activación dependiente de ATP, la MutH procede a cortar la cadena no metilada, marcándola así para ser reparada. Una helicasa de DNA separa las dos cadenas y varias exonucleasas proceden a degradar la cadena no metilada desde el sitio de corte hasta unos pocos nucleótidos más allá del sitio de apareamiento erróneo. La pol III entra entonces a resintetizar el segmento faltante utilizando como modelo la cadena metilada.
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ROTURAS DE DOBLE CADENA Las roturas de doble cadena (DSB) son particularmente peligrosas para las células porque pueden ocasionar una destrucción letal de cromosomas. Causadas por radiación, ROS o sustancias químicas que dañan el DNA (p. ej., asbesto o cisplatino —un fármaco contra cáncer), o como consecuencia de errores en la replicación del DNA, las DSB se reparan mediante dos mecanismos. Un mecanismo encadena dos extremos de DNA (unión de terminales no homólogas), en tanto que otro aprovecha la información de la secuencia de bases en un cromosoma homólogo (recombinación homóloga). En humanos y otros mamíferos, la vía preferida para reparación de rotura de doble cadena es la unión de terminales no homólogas (NHEJ). Ambos procesos empiezan detectando que ha ocurrido una rotura de doble cadena. En los mamíferos, la detección de dicha rotura requiere varias moléculas; entre éstas están la ATM y la ATR, las cuales inician respuestas globales a daños de DNA que activan grandes números de proteínas reguladoras de reparación de DNA y de ciclo celular, y la DNA-PK, que está implicada en la reparación de DSB.
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La NHEJ empieza con la unión de DNA-PK a los dos extremos del DNA. La DNA-PK es un heterotrímero de DNA-PKCS (polipéptido catalítico proteína cinasa activado por DNA) y de un dímero de Ku. La DNA-PKCS sufre una autofosforilación y luego recluta y fosforila a una proteína denominada artemisa. La artemisa es una nucleasa que convierte los dos extremos a sustratos de ligación. Un complejo trimérico que contiene ligasa IV de DNA y dos proteínas accesorias concluye la reparación reuniendo los extremos rotos de DNA. Debido a que no se requiere una homología de secuencia, la NHEJ es una vía propensa a errores. Por ejemplo, la incidencia de varias DSB en una célula puede conducir a la unión inadvertida de extremos de DNA pertenecientes a cromosomas distintos. La reparación por recombinación homóloga (HR), que se parece mucho a la recombinación general, se expone en la sección siguiente.
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PREGUNTA 18.2
Mencione seis tipos de reparación del DNA. Explíquense las características básicas de cada uno.
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Recombinación del DNA
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La recombinación puede definirse como el reordenamiento de las secuencias de DNA por medio del intercambio de segmentos de diferentes moléculas. El proceso de recombinación, que produce nuevas combinaciones de genes y fragmentos genéticos, es la causa fundamental de la diversidad de los seres vivos. Aún más importante, el gran número de variaciones que hace posible la recombinación otorga a las especies oportunidades para adaptarse a ambientes cambiantes. En otras palabras, la recombinación es una fuente importante de las variaciones que hacen posible la evolución. La recombinación se utiliza también para reparar roturas en el DNA bicatenario.
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Existen dos formas de recombinación: general y específica de sitio. La recombinación general, que tiene lugar entre moléculas homólogas de DNA, ocurre sobre todo durante la meiosis. (La meiosis es la forma de división de las células eucariotas en la que se producen los gametos haploides.) En la recombinación específica de sitio, el intercambio de secuencias de moléculas diferentes sólo requiere regiones cortas de homología de DNA. Estas regiones están flanqueadas por largas secuencias no homólogas. Las recombinaciones específicas de sitio, que dependen más de las interacciones proteínas-DNA que de las homologías de secuencia, ocurren en toda la naturaleza. Por ejemplo, este mecanismo lo utiliza un bacteriófago para integrar su genoma al cromosoma de E. coli. En los eucariotas, la recombinación específica de sitio es causal de una gran variedad de reordenamientos génicos controlados durante el desarrollo. Los reordenamientos génicos son en parte responsables de la diferenciación celular en los organismos multicelulares complejos. Uno de los ejemplos más interesantes de reordenamiento génico es la generación de diversidad de anticuerpos en los mamíferos. En una variación de la recombinación específica de sitio, que se denomina transposición, determinadas secuencias de DNA llamadas elementos transponibles se mueven de un cromosoma o región del cromosoma a otro.
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RECOMBINACIÓN GENERAL La recombinación general se presenta en todos los seres vivos, pero se ha investigado principalmente en E. coli y en hongos como Saccharomyces cerevisiae y Aspergillus nidulans. Además de generar diversidad genética, la recombinacion general es también un importante proceso de reparación de daños al DNA. Se han propuesto varios modelos para explicar la recombinación. Como ejemplos están el de Holliday, el de Meselson-Radding, la reparación de roturas de doble cadena y los modelos de hibridación de cadena dependiente de síntesis.
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El primer modelo que explicaba la recombinación general se basó en el trabajo de Robin Holliday con hongos. El modelo de Holliday figura 18.23 comprende los pasos siguientes:
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Dos moléculas homólogas de DNA se aparean.
Dos de las cadenas de DNA, una de cada molécula, se fracturan en ubicaciones idénticas (si no es que similares).
Los dos segmentos de cadena fracturados se entrecruzan, formando así un intermediario de Holliday.
La DNA ligasa sella los extremos cortados.
La migración de rama causada por el intercambio de apareamiento de bases conduce a la transferencia de un segmento de DNA de un homólogo al otro.
Se produce una segunda serie de cortes de cadenas de DNA.
La DNA polimerasa rellena los espacios y la DNA ligasa sella las cadenas cortadas.
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El modelo de Meselson-Radding es el resultado de los esfuerzos para justificar varias observaciones de laboratorio que no se explican con el modelo de Holliday. Entre ellas, está el hecho de que la recombinación a veces produce una cadena recombinante en sólo una de las moléculas homólogas de DNA. Según el modelo de Meselson-Radding figura 18.24, la recombinación ocurre de la siguiente manera:
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Se corta una cadena en una de las dos moléculas homólogas de DNA.
La extensión, inducida por la polimerasa, del extremo 3′ recién creado causa un desplazamiento de la cadena en el otro lado del corte. Conforme se alarga la cadena creciente, la cadena desplazada invade la doble hélice de un segmento homólogo del segundo cromosoma para crear una esctructura en lazo D.
El lazo D se corta y la cadena invasora se liga al extremo 3′ recién creado de la cadena homóloga.
El extremo 3′ de la cadena recién sintetizada y el extremo 5′ de la cadena homóloga se ligan para crear un intermediario de Holliday.
Puede ocurrir migración en rama.
Los cortes en las cadenas y la terminación de la unión de Holliday (véase la fig. 18.23f-i) dan origen ya sea a un producto entrecruzado (corte vertical) o un producto no entrecruzado (corte horizontal).
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En los eucariotas la recombinación general tiene una función destacada en la meiosis, un tipo de división celular que es necesaria para la reproducción sexual. En un mecanismo que hace coincidir con precisión cromosomas homólogos paternos y maternos, la maquinaria de recombinación general facilita el intercambio de segmentos cromosómicos que crea la diversidad genética. El modelo de reparación de roturas de doble cadena (DSBR) (fig. 18.25a-d) explica muchas de las características de la recombinación meiótica que no explican los modelos de Holliday y de Meselson-Radding. Los mecanismos de reparación de roturas de doble cadena también protegen a las células de procariotas y eucariotas contra roturas de doble cadena causadas por factores mutagénicos como la radiación ionizante y las ROS. Las etapas principales en el DSBR son las siguientes:
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Una endonucleasa induce una rotura de doble cadena en una sola de las dos moléculas homólogas de DNA.
Las exonucleasas degradan los extremos 5′, dejando los extremos 3′ sin alterar.
Uno de los extremos 3′ invade una molécula homóloga de DNA y tras una búsqueda exitosa de homología forma un lazo D.
Una DNA polimerasa prolonga los extremos 3′, tanto el invasor como el invadido.
La migración de rama, combinada con la ligación del extremo 3′ invasor y del extremo 5′ en el otro lado de la rotura, da por resultado la formación de una doble unión de Holliday.
La finalización de las dos estructuras de Holliday puede formar productos entrecruzados o no entrecruzados.
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El DSBR también ocurre en la mitosis, usualmente sin productos entrecruzados. El modelo de hibridación de cadena dependiente de síntesis (SDSA) explica cómo ocurre este fenómeno. El SDSA se diferencia del DSBR cuando se desplaza la cadena en el lazo D (fig. 18.25e y f). La cadena invasora procede a hibridarse con la cadena simple complementaria de la otra rotura de cadena doble. El proceso finaliza con la síntesis completa del DNA, seguida por la ligación.
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RECOMBINACIÓN PROCARIOTA En E. coli, la recombinación se inicia cuando la RecBCD, un complejo enzimático que posee actividades de exonucleasa y de helicasa encuentra una secuencia Chi (instigador de promotor de entrecruzamiento). Tras unirse a una molécula de DNA, la RecBCD corta una de las cadenas y procede a desenrollar la doble hélice hasta que alcanza la secuencia 5′-GCTGGTGG-3′ (el sitio Chi), que se presenta frecuentemente en el DNA de E. coli. El intercambio de cadenas se inicia cuando un filamento de nucleoproteína formado por monómeros de RecA, una ATPasa, recubre una de las cadenas. Impulsado por hidrólisis de ATP, el segmento de cadena recubierto por la RecA busca homología en el dsDNA cercano. Una vez que se localiza un segmento homólogo, la síntesis de DNA hace que se desplace la cadena, a lo que le sigue la rotura del lazo D, la captura de la cadena y la formación de una unión de Holliday. La subsiguiente migración de rama figura 18.26 se inicia cuando la RuvA reconoce la unión de Holliday y se une a ella. Dos copias de la RuvB, un hexámero con actividades ATPasa y helicasa, forman a continuación un anillo en ambos lados de la unión. La migración en rama es catalizada por el complejo RuvAB. Esta máquina molecular separa, gira y estira las cadenas en los dos conjuntos de hélices, aun después de la disociación de la RecA. La migración finaliza cuando se alcanza una secuencia específica [5′-(A o T)TT (G o C)-3′]. Al separarse la RuvAB, dos proteínas RuvC se vinculan a la unión. La recombinación finaliza cuando la RuvC rompe las cadenas entrecruzadas y la estructura de Holliday se resuelve a sí misma para formar dos moléculas separadas de DNA bicatenario. En las bacterias, la recombinación general parece participar en diversas formas de transferencia de DNA entre microorganismos:
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Transformación. En la transformación, los fragmentos desnudos de DNA entran a una célula bacteriana a través de una pequeña abertura en la pared celular y se introducen en el genoma bacteriano. (Recuérdese el experimento de Fred Griffith.)
Transducción. La transducción ocurre cuando un bacteriófago de forma inadvertida transporta DNA bacteriano a una célula receptora. Tras una recombinación adecuada, la célula utiliza el DNA transducido.
Conjugación. Se sabe que en determinadas especies bacterianas ocurre la conjugación, un acoplamiento sexual no convencional entre una célula donadora y una célula receptora. La célula donadora posee un plásmido especializado que la permite sintetizar un pilus sexual, un apéndice filamentoso que actúa en un proceso de intercambio de DNA. Tras unirse el pilus a la superficie de la célula receptora, se transfiere un fragmento del material genético del donador. El segmento de DNA transferido puede integrarse en el cromosoma del receptor mediante recombinación o puede permanecer fuera de él en forma de plásmido.
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RECOMBINACIÓN EUCARIOTA En los eucariotas la recombinación general ocurre durante la primera fase de la meiosis para asegurar exactitud en el apareamiento de cromosomas homólogos y en el entrecruzamiento, el mecanismo para introducir variación genética. La reparación de daños al DNA por roturas de doble cadena (DSB) utilizando moléculas de DNA homólogas se realiza durante las fases S y G2 del ciclo celular cuando hay disponible DNA recién replicado. (En las otras fases del ciclo, los DSB se reparan mediante NHEJ.)
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Se cree que el mecanismo básico de la recombinación general en las eucariotas es semejante al proceso que ocurre en las procariotas. Sin embargo, como hay genomas mucho más complejos, el número de proteínas participantes en la recombinación eucariota es sustancialmente mayor. Se cree que la Rad52, una proteína multifuncional, es el sensor inicial de las DSB. En los mamíferos, el complejo MRN (Mre11, Rad50 y Nbs1) crea un puente que estabiliza los extremos del DNA en las roturas de doble cadena, ya sea causadas por daños exógenos o introducidas por la enzima meiótica Spo11. El MRN también cataliza el corte del extremo 5′. Cuando las DSB son causadas por agentes exógenos, el MRN recluta y activa la ATM, que a su vez activa varias proteínas de reparación de DNA y otras reguladoras del ciclo celular. Ejemplos de proteínas de reparación de DNA activadas mediante ATM son la Rad51, la BRCA1 y la BRCA2. La Rad51 es un homólogo de RecA que se une al ssDNA y facilita la invasión de cadenas. La BRCA1 (proteína de susceptibilidad tipo 1 al cáncer de mama) participa en un número de vías asociadas con reparaciones, las que incluyen la regulación del ciclo celular y el remodelado de cromatina. La BRCA1, vinculada con la BRCA2, interactúa con la Rad51 durante la reparación de DSB.
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RECOMBINACIÓN ESPECÍFICA DE SITIO Y TRANSPOSICIÓN La recombinación específica de sitio depende de segmentos cortos de DNA homólogo llamados sitios de fijación (att) o elementos de inserción (IS). La recombinación en estos sitios puede causar inserciones, inversiones, deleciones y transposiciones que pueden beneficiar o perjudicar a la célula. Entre los ejemplos de recombinación específica de sitio se incluyen la inserción de DNA viral en el genoma de una célula hospedadora, la adquisición de resistencia a antibióticos, la variación fenotípica de las plantas y la maduración de anticuerpos en los mamíferos. Un caso simple de inserción lo ilustra la integración del DNA del bacteriófago λ en el cromosoma de E. coli figura 18.27. El proceso requiere sitios att homólogos en los genomas del fago y de la bacteria, una recombinasa vírica llamada integrasa λ y un producto génico bacteriano, el factor hospedador de integración (IHF). El mecanismo correspondiente a la resolución de la unión de Holliday da por resultado la inserción del genoma de λ en el cromosoma bacteriano.
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PREGUNTA 18.3
La conjugación bacteriana tiene consecuencias médicas. Por ejemplo, determinados plásmidos contienen genes que codifican toxinas. El agente causal de una forma mortal de intoxicación alimentaria, la E. coli 0157, sintetiza una toxina que produce una diarrea masiva hemorrágica e insuficiencia renal. Se cree que esta toxina se originó en Shigella, otra bacteria que produce disentería. De forma similar, el problema creciente de resistencia a los antibióticos es atribuible, en parte, a la diseminación de genes de resistencia a los antibióticos entre las poblaciones bacterianas. La resistencia a los antibióticos aparece debido a que se abusa de éstos en la práctica médica y en la alimentación del ganado. Sugiérase un mecanismo por medio del cual este abuso promueva la resistencia a los antibióticos. (Pista: El excesivo uso de antibióticos actúa como una medida de presión selectiva.)
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Conjugación bacteriana 
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Barbara McClintock, una genetista que trabajaba con maíz indígena, comunicó en la década de 1940 que determinados elementos genéticos móviles eran causantes de la variación fenotípica del color de los granos de maíz. La aceptación de esta idea fue lenta porque requería un cambio de paradigma que se apartaba del concepto de que el genoma es un componente estático de la célula. En 1967 se confirmó la presencia de elementos transponibles (transposones o “genes migratorios”) en E. coli, y finalmente se aceptó el concepto de plasticidad del genoma. La doctora McClintock recibió el premio Nobel de fisiología o medicina en 1983.
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Los elementos IS de transposones procariotas simples constan del gen que codifica la enzima de transposición transposasa, flanqueado por repeticiones terminales cortas e invertidas que definen la frontera del transposón figura 18.28. (Una repetición invertida es una secuencia que es el reverso de otra secuencia que aparece más adelante en el flujo descendente. Las repeticiones invertidas sin secuencias intermedias constituyen un palíndromo, o sea una secuencia de DNA cuyo complemento se lee igual pero en sentido inverso.) Los transposones bacterianos más complicados, que se denominan transposones compuestos, consisten en dos transposones separados que están unidos mediante el DNA entre ellos. Los dos transposones (elementos IS) se unen cuando mutaciones desactivadoras (p. ej., en las repeticiones invertidas interiores, o uno de los genes de transposasa IS) impiden la migración independiente de los dos elementos IS. La presencia de secuencias de DNA entre los dos elementos IS que tienen propiedades útiles (p. ej., genes de resistencia a antibióticos) también promueve la retención de un transposón compuesto. Se han observado dos mecanismos de transposición: no replicativa y replicativa.
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Transposición no replicativa La transposasa realiza un corte de doble cadena en el DNA donador y lo empalma en los extremos cortados escalonados del ssDNA del sitio diana (un mecanismo de “corte y empalme”). El sistema de reparación de DNA de la célula llena los espacios en el DNA diana, de lo que resulta una repetición directa corta a cada lado de la inserción del transposón figura 18.29. Un espacio no reparado puede ser letal para la célula.
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Transposición replicativa En la transposición replicativa sólo una cadena del DNA donador se transfiere a la posición diana y la replicación seguida de una recombinación específica de sitio da por resultado la duplicación del transposón en vez de la inserción en el nuevo sitio figura 18.30. Entonces se forma un intermediario (el cointegrado), que consta del segmento donador unido de forma covalente al DNA diana. Una enzima adicional, que se denomina resolvasa, cataliza una recombinación específica de sitio que permite la resolución del cointegrado en dos moléculas separadas.
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CONCEPTOS CLAVE 
En la recombinación general, el intercambio de secuencias de DNA tiene lugar entre secuencias homólogas.
En la recombinación específica de sitio, las interacciones DNA-proteína son las causales principales del intercambio de secuencias no homólogas.
Las secuencias de DNA llamadas transposones pueden moverse de un sitio del genoma a otro.
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Algunos transposones encontrados en las células eucariotas se parecen a los de las bacterias. Por ejemplo, el elemento Ac, el transposón del maíz que describió por vez primera McClintock, está compuesto por un gen de transposasa flanqueado por repeticiones cortas invertidas. McClintock se refirió al transposón Ac como un “elemento controlador” debido a que parecía regular la síntesis del pigmento antocianina en los granos del maíz (p. ej., había un cambio en la expresión génica). Sin embargo, otros muchos transposones eucariotas tienen estructuras un tanto diferentes a las observadas en las bacterias. Como ya se describió, los retrotransposones, también llamados retroposones o retroelementos, son una característica importante de los genomas eucariotas. Dependiendo de los cambios, y de su ubicación, los efectos de los transposones pueden ser vistos como indeseables y dañinos o como proveedores de oportunidades para la diversidad genética. Algunos efectos de la transposición se observan como cambios en la expresión génica, un tópico que se desarrolla en la sección 18.3.
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PREGUNTA 18.4
Uno de los aspectos fascinantes de los organismos complejos como los mamíferos es la existencia de familias de genes (grupos de genes que codifican la síntesis de un conjunto de proteínas muy relacionadas). Por ejemplo, se requieren varios tipos diferentes de colágenos para que los tejidos conjuntivos tengan la estructura y la función adecuadas. De forma similar, existen varias clases de genes de globina. Se cree que las familias de genes se originan a partir de un acontecimiento poco habitual en el que se duplica una secuencia de DNA. Algunas duplicaciones de genes proporcionan una ventaja selectiva al aportar grandes cantidades de productos génicos importantes. En otros casos, los dos genes duplicados evolucionan de manera independiente. Una copia continúa realizando la misma función, mientras que la otra finalmente evoluciona para ejecutar otro cometido. Especúlese la forma en la que se producen las duplicaciones génicas. Una vez que un gen se ha duplicado, ¿qué mecanismos introducen las variaciones?
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MÉTODOS bioquímicos
Genómica
Las ciencias relativamente nuevas de la genómica y la genómica funcional han acelerado los esfuerzos de investigación en todas las ciencias de la vida. La genómica es el análisis a gran escala de genomas enteros. La genómica funcional es una metodología que se utiliza para analizar las propiedades funcionales de genes y proteínas y cómo interactúan estas moléculas dentro de los seres vivos. Como resultado de avances espectaculares en la tecnología del DNA, la genómica ha producido información de secuencia de genomas de más de 1 250 organismos y una buena variedad de tecnologías prácticas sobre genomas. Por ejemplo, los chips de DNA o micromatrices (pequeños soportes de vidrio o plástico a las que se les colocan miles de sondas de diferentes secuencias de DNA) hacen posible el análisis simultáneo de la expresión de miles de genes en células de cultivos. A continuación se describen las herramientas básicas que se utilizan en la tecnología genómica.
El aislamiento, la caracterización y la manipulación de secuencias de DNA, que en la actualidad se consideran procedimientos comunes, son posibles gracias a un conjunto de técnicas a las que se conoce como tecnología de DNA recombinante. La característica esencial de esta tecnología es que las moléculas de DNA que se obtienen de diversos orígenes pueden cortarse y pegarse entre sí. Estas técnicas han hecho más accesibles que nunca las investigaciones sobre genomas porque el gran número de copias de DNA que se requieren en los métodos de secuenciación de DNA se pueden obtener mediante clonación molecular y (más recientemente) por medio de la reacción en cadena de la polimerasa. Las aplicaciones comerciales de las técnicas de DNA recombinante han revolucionado la práctica médica. Por ejemplo, los productos de genes humanos, como la insulina y la hormona del crecimiento, así como determinadas vacunas y pruebas diagnósticas, se producen en la actualidad en vastas cantidades mediante células bacterianas en las que se han insertado genes recombinantes. Actualmente, varios grupos investigan la utilización de las técnicas recombinantes en la genoterapia humana, un proceso en el que (se espera) puedan sustituirse los genes defectuosos por sus correspondientes normales.
La figura 18A ilustra las características básicas de la construcción de un DNA recombinante. El proceso comienza utilizando una enzima de restricción que genera extremos cohesivos para romper DNA de dos orígenes diferentes. Los fragmentos de DNA se mezclan a continuación en condiciones que permiten la hibridación (apareamiento de bases) entre los extremos cohesivos. Una vez que se ha producido el apareamiento de bases, los fragmentos se unen de forma covalente mediante la DNA ligasa. Tras aislar y purificar las moléculas de DNA recombinante, en general es necesario reproducirlas de forma que se obtengan cantidades suficientes para la investigación posterior. A continuación se presenta la clonación molecular, un método que se utiliza con frecuencia para aumentar el número de copias de DNA.
Clonación molecular En la clonación molecular, un trozo de DNA aislado de una célula donadora (p. ej., cualquier célula animal o vegetal) se introduce en un vector. Un vector es una molécula de DNA capaz de replicarse que se utiliza para transportar una secuencia ajena de DNA, a menudo un gen, al interior de una célula hospedadora.
La elección del vector depende del tamaño del DNA donador. Por ejemplo, se suelen utilizar plásmidos bacterianos para clonar pequeños trozos (15 kb) de DNA. Los fragmentos un poco más grandes (24 kb) se incorporan en vectores bacteriófagos λ, mientras que se utilizan vectores cósmidos para fragmentos de DNA de hasta 50 kb. El bacteriófago λ puede utilizarse como vector debido a que una porción sustancial de su genoma no codifica la producción del fago y por lo tanto puede eliminarse. El DNA viral eliminado puede sustituirse por DNA ajeno. Los cósmidos son vehículos de clonación que contienen sitios cos del bacteriófago λ incorporados en secuencias de DNA del plásmido con uno o varios marcadores selectivos. Los sitios cos permiten su entrega a la célula hospedadora en una cabeza de fago, el DNA del plásmido facilita la replicación independiente de la unidad recombinada y los marcadores de selección permiten la detección de los recombinantes que han tenido éxito. Pueden insertarse trozos aún mayores en cromosomas artificiales bacterianos y en cromosomas artificiales de levaduras. Los cromosomas artificiales bacterianos (BAC), que proceden de un gran plásmido de E. coli denominado factor F, se utilizan para clonar secuencias de DNA de hasta 300 kb. Los cromosomas artificiales de levaduras (YAC), que pueden acomodar hasta 1 000 kb, se construyen utilizando secuencias de DNA de levaduras que se replican de forma autónoma (p. ej., contienen un origen de replicación de DNA eucariota).
Como se ha indicado, la formación de un DNA recombinante requiere una enzima de restricción que corte el DNA vector (p. ej., un plásmido) y lo abra (fig. 18B). Tras hibridar los extremos cohesivos del plásmido con los del DNA donador, una DNA ligasa une de forma covalente las dos moléculas. Después, el vector recombinante se inserta en las células hospedadoras.
En algunas circunstancias, la introducción de un vector de clonación en una célula hospedadora es un proceso trivial. Por ejemplo, los vectores de fagos se diseñan de tal forma que introducen el DNA recombinante en un proceso infeccioso que se denomina transfección y algunas bacterias captan los plásmidos sin ayuda. Sin embargo, para que capten el DNA ajeno, la mayoría de las células hospedadoras debe ser inducida. Se utilizan varios métodos. En algunas células procariotas y en algunas eucariotas la adición de Ca2+ al medio promueve la captación. En otras, se utiliza un proceso que se denomina electroporación, en el que las células se tratan con una corriente eléctrica. Uno de los métodos más eficaces para transformar células animales y vegetales es la microinyección directa de material genético. Por ejemplo, los animales transgénicos se crean mediante la microinyección de un DNA recombinante en óvulos fertilizados.
Una vez que se introduce, cada clase de célula replica el DNA recombinante junto con su propio genoma. Obsérvese que los vectores recombinantes deben contener regiones reguladoras que sean reconocidas por las enzimas de la célula hospedadora.
Al proliferar las células hospedadoras que han sido transformadas con éxito, ellas amplifican con rapidez el DNA recombinante. Por ejemplo, en condiciones favorables de disponibilidad de nutrientes y de temperatura, un único plásmido recombinante introducido en una célula de E. coli puede replicarse 1 000 millones de veces en unas 11 horas. Sin embargo, las células transformadas y sin transformar suelen verse exactamente iguales. Por consiguiente, los investigadores suelen diseñar protocolos de clonación que utilizan vectores con genes marcadores de selección (genes cuya presencia puede detectarse), para facilitar la identificación de las células transformadas. Por ejemplo, usualmente se incorporan genes de resistencia a antibióticos o marcadores de selección de color (fig. 18C) en los vectores plasmídicos que se introducen en las bacterias. Cuando las bacterias tratadas con plásmidos que tienen genes de resistencia a antibióticos se siembran en un medio que contiene el antibiótico, sólo crecerán las células transformadas. En los organismos eucariotas como las levaduras, pueden utilizarse células que carecen de una enzima necesaria para sintetizar un nutriente. Por ejemplo, para transformar las células de levadura mutantes que carecen de una enzima específica de la vía de biosíntesis de leucina se utilizan vectores que contienen el gen LEU2. Sólo las células que se han transformado con éxito son capaces de crecer en un medio con déficit de leucina.
Reacción en cadena de la polimerasa Aunque la clonación ha sido inmensamente útil en biología molecular, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un método más conveniente para obtener grandes cantidades de copias de DNA. Utilizando la DNA polimerasa termoestable de Thermus aquaticus (polimerasa Taq), la PCR puede amplificar cualquier secuencia de DNA cuando se conocen las secuencias flanqueantes (fig. 18E). Las secuencias flanqueantes deben conocerse debido a que la amplificación por PCR requiere cebadores. Las secuencias cebadoras se producen mediante máquinas automáticas sintetizadoras de DNA.
La PCR comienza añadiendo la polimerasa Taq, los cebadores y los ingredientes para la replicación del DNA a una muestra calentada del DNA diana. (Recuerde que el calentamiento del DNA separa sus cadenas.) Al enfriarse la muestra, los cebadores se unen a sus secuencias complementarias en ambos lados de la secuencia diana. Cada cadena sirve entonces como molde para la replicación del DNA. Al final de este proceso, que se conoce como un ciclo, se han duplicado las copias de la secuencia diana. El proceso puede repetirse de forma indefinida, sintetizando un enorme número de copias. Por ejemplo, al final de 30 ciclos un único fragmento de DNA se ha amplificado 1 000 millones de veces.
Bibliotecas genómicas Las bibliotecas genómicas (genotecas), también llamadas clones o bancos de genes, son colecciones de clones que proceden de fragmentos de cromosomas o genomas enteros. Se utilizan con diversos fines, los más importantes de los cuales son el aislamiento de genes específicos cuya ubicación cromosómica se desconoce, y los esfuerzos de secuenciación de genomas completos (mapeo génico). Las genotecas se producen en un proceso, que se denomina clonación aleatoria (o clonación de tipo shotgun), en el que se digiere de forma aleatoria un genoma (fig. 18F). El intervalo de tamaños de los fragmentos, que se determina por la clase de enzima de restricción y las condiciones experimentales elegidas, debe ser compatible con el vector. Para asegurar que todas las secuencias de interés estén representadas en la genoteca, las muestras de DNA se suelen digerir sólo parcialmente. Si se dispone de una sonda adecuada puede identificarse la ubicación de cualquier gen.
En una variante de las genotecas, se producen colecciones de moléculas de DNA complementario, denominadas bibliotecas de cDNA, a partir de moléculas de mRNA mediante transcripción inversa. Esta técnica puede utilizarse para evaluar el transcriptoma de determinados tipos celulares en circunstancias especificadas. En otras palabras, es un método para determinar qué genes se expresan en un determinado tipo celular. Por ejemplo, con el uso de la tecnología de chips de DNA (micromatrices de DNA), puede investigarse y compararse la expresión de los genes en células normales y enfermas. Las bibliotecas de cDNA son especialmente útiles cuando se clona DNA eucariota porque las moléculas de mRNA carecen de secuencias no codificadoras o intrones. Por consiguiente, los productos génicos pueden identificarse con mayor facilidad y pueden generarse en grandes cantidades en bacterias, las cuales no pueden procesar intrones.
Caminata cromosómica La caminata cromosómica se utiliza cuando una secuencia de DNA (un clon) de una genoteca es demasiado grande para ser secuenciada. El DNA clonado se fragmenta y se subclona. Uno de los subclones se toma y se secuencia y un pequeño fragmento de un extremo se utiliza como sonda para seleccionar uno de los subclones restantes que contiene esa secuencia (fig. 18G). El nuevo fragmento se secuencia y una porción se utiliza como sonda para seleccionar otros clones solapantes. De este modo, se pueden mapear secuencias contiguas. Un conjunto de secuencias solapantes se denomina contig. Cuando se analizan los genomas eucariotas, su gran tamaño suele requerir el uso de grandes vectores de clonación como los YAC y una técnica que se denomina migración cromosómica. En la migración cromosómica los clones solapantes contienen secuencias de DNA de varios centenares de kb que se generan utilizando enzimas de restricción que realizan cortes con poca frecuencia.
Micromatrices de DNA Las micromatrices de DNA, o “chips” de DNA, se utilizan para analizar la expresión de miles de genes de manera simultánea (fig. 18H). A menudo no mayor que una estampilla postal, una micromatriz de DNA consiste en miles, o cientos de miles, de oligonucleótidos o fragmentos de ssDNA adheridos a una base de vidrio o plástico. En cada posición de la micromatriz la secuencia adherida, que actúa como una sonda de DNA, se diseña de forma que se hibride con una diana que es una secuencia específica de DNA o RNA. En las investigaciones de la expresión génica, un conjunto completo de moléculas de mRNA de las células de interés (es decir, el transcriptoma) se transcribe de forma inversa en cDNA. Tras marcar las moléculas de cDNA con un tinte fluorescente, se incuban con una micromatriz en condiciones de hibridación. La micromatriz se lava a continuación para eliminar las moléculas que no hibridaron. Los investigadores determinan entonces cuáles genes se expresan identificando las posiciones que emiten fluorescencia en la micromatriz. Mediante microscopios, tubos fotomultiplicadores y programas de computadora es posible observar cambios en la expresión génica en diversas circunstancias. Entre los ejemplos están las comparaciones entre células normales y cancerosas, y células expuestas a diferentes nutrientes o moléculas señalizadoras.
Proyectos genómicos Cada proyecto de genoma determina el conjunto total de secuencias de bases en el DNA de un organismo en particular. El proceso requiere tomar un gran número de fragmentos de secuencias que se obtienen rompiendo el genoma y determinando luego sus secuencias de bases con un método de secuenciación automático. Luego se ensamblan los datos de secuencia de cada uno de los fragmentos usando métodos computacionales para producir la secuencia total del genoma.
El Proyecto Genoma Humano fue un intenso esfuerzo internacional para determinar la secuencia de nucleótidos del genoma humano completo. Una vez alcanzado este objetivo, la atención de los investigadores se dirigió hacia la anotación (p. ej., la identificación funcional) de los cerca de 22 000 genes humanos. Igual que los científicos han utilizado históricamente comparaciones estructurales y funcionales de otros organismos en campos como la anatomía, la bioquímica, la fisiología y la medicina para comprender mejor la biología humana, el esfuerzo actual para interpretar los datos del genoma humano está siendo apoyado en gran medida por comparaciones con la información obtenida en otros proyectos genómicos. Los genomas de organismos bien investigados tan diversos como las bacterias (p. ej., E. coli), las levaduras (p. ej., Saccharomyces cerevisiae), el gusano Caenorhabditis elegans, la mosca de la fruta Drosophila y varios mamíferos (p. ej., el ratón) se han utilizado en el análisis de estructura de genomas y en la asignación de los genes recién descubiertos en otros organismos.
Bioinformática El surgimiento de tecnologías de alto rendimiento (p. ej., rápidas, que manejan grandes volúmenes y automatizadas) para analizar los seres vivos ha creado una vasta cantidad de datos sobre secuencias de ácidos nucleicos y de polipéptidos. La información, que se recolecta de proyectos de secuenciación de genomas y de proteomas y de análisis de micromatrices de procesos celulares como la transcripción, se coloca en bases de datos que están disponibles para la comunidad científica. ¿Cómo analizan los científicos esos enormes volúmenes de datos no procesados? Como resultado de los avances tecnológicos en ciencias de la computación, matemática aplicada y estadística, la bioinformática ha dotado a los científicos de una poderosa herramienta de investigación. El uso de algoritmos de cómputo ha hecho factible resolver una amplia variedad de problemas antes inabordables, como lo ilustran los siguientes ejemplos.
Es muy posible localizar los genes mediante un proceso llamado inspección de secuencias. Los programas de predicción génica utilizan varias claves para localizar secuencias que potencialmente podrían codificar polipéptidos, llamadas marcos de lectura abiertos (ORF). Los ORF son secuencias extendidas de DNA que potencialmente podrían codificar un polipéptido. Comienzan con la secuencia de tres bases AUG, llamada codón de iniciación, y terminan con un codón de terminación de UAA, UAG o UGA. El rastreo de ORF eucariotas es complicado por la presencia de intrones, algunos de los cuales son más largos que los exones codificadores de dominios polipeptídicos.
El alineamiento de secuencias de DNA permite a los investigadores explorar los genomas de cientos de organismos en busca de semejanzas entre secuencias de genes o secuencias reguladoras y ha dado invaluables conocimientos sobre las relaciones que hay entre los organismos vivos y los mecanismos usados para sustentar los procesos vitales.
Un método llamado modelación de homología ha facilitado la predicción de estructuras de proteínas. Una vez que se descubre un nuevo gen codificador de proteína, se emplea el análisis bioinformático para buscar entre moléculas homólogas o casi homólogas cuya estructura ya se conoce.
El análisis bioinformático de la enorme cantidad de datos derivados de micromatrices proteicas y de datos de proteoma celular derivados de MS aporta un medio invaluable para analizar patrones de síntesis de proteínas celulares. Por ejemplo, este tipo de análisis de datos permite a los científicos médicos comparar cómo se alteran las proteínas normales en estados patológicos.
En el campo de la biología evolutiva se han utilizado programas de bioinformática para rastrear los linajes de organismos con base en sucesos raros como duplicaciones génicas y transferencia lateral de genes (transferencia de genes entre especies).
El análisis de la expresión génica de alto rendimiento, se usa en la actualidad para identificar los genes implicados en trastornos médicos (p. ej., para comparar los productos de transcripción de células normales y cancerosas).
Los biólogos de sistemas utilizan modelación matemática compleja combinada con una fuente siempre creciente de datos biológicos; ello promete mejorar en grado sustancial la comprensión de los sistemas operativos biológicos.
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En otra estrategia, la técnica de hibridación de colonias (fig. 18D), las bacterias se detectan utilizando una sonda de ácido nucleico marcada radiactivamente, una molécula de RNA o una molécula de DNA de cadena individual con una secuencia complementaria a la de una secuencia específica dentro del DNA recombinante. Las bacterias se siembran en un medio sólido en cajas de Petri y se permite que crezcan en colonias. El contenido de cada caja se transfiere a un filtro de nitrocelulosa. (Algunas células de cada una de las colonias originales permanecen sobre las cajas de Petri.) Las células que se encuentran sobre el filtro se lisan y el DNA liberado se trata de forma que pueda producirse la hibridación con la sonda. Una vez que han sido eliminadas las moléculas de sonda que no se han hibridado (mediante lavado), se utiliza autorradiografía para identificar en la placa maestra las colonias que poseen el DNA recombinante de interés.
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