CAPÍTULO 18: Información genética

Sinopsis

TODOS LOS SERES VIVOS SON SISTEMAS DE PROCESAMIENTO DE INFORMACIÓN. SU FUENTE BÁSICA DE INFORMACIÓN ESTÁ CODIFICADA EN LA SECUENCIA DE BASES DE NUCLEÓTIDOS del DNA. Todas las ciencias de la vida se han transformado a medida que los bioquímicos han investigado cada vez con mayor profundidad en los misterios del almacenamiento y la transmisión de la información genética. El conocimiento y las tecnologías adquiridas durante esta búsqueda nos han hecho comprender las complejidades de los procesos vitales que siguen descubriéndose.

Todos los seres vivos viables poseen las siguientes características: síntesis rápida y precisa del DNA y estabilidad genética proporcionada por mecanismos eficaces de reparación del DNA. De forma paradójica, la supervivencia a largo plazo de las especies depende también de las variaciones genéticas que les permiten adaptarse a los ambientes cambiantes. En la mayoría de las especies, estas variaciones resultan predominantemente de la recombinación genética, aunque las mutaciones también desempeñan una función importante. En las siguientes secciones se revisan los mecanismos que utilizan los organismos procariotas y eucariotas para lograr estos objetivos.

Replicación del DNA

La replicación del DNA tiene lugar antes de cada división celular. El mecanismo por el que se producen las copias de DNA es semejante en todos los seres vivos. Tras separarse las dos cadenas, cada una de ellas se utiliza como molde para la síntesis de una cadena complementaria figura 18.3. (En otras palabras, cada una de las dos nuevas moléculas de DNA contiene una cadena vieja y una nueva.) Este proceso, que se denomina replicación semiconservadora, se demostró por primera vez en un elegante experimento figura 18.4 que reportaron en 1958 Matthew Meselson y Franklin Stahl. En este trabajo clásico, Meselson y Stahl aprovecharon el aumento de la densidad del DNA marcado con el isótopo pesado del nitrógeno ¹⁵N (el isótopo del nitrógeno más abundante es ¹⁴N). Tras cultivar células de E. coli durante 14 generaciones en un medio de cultivo cuya fuente de nitrógeno consistía únicamente en ¹⁵NH₄Cl, las células que contenían ¹⁵N se transfirieron a un medio de cultivo que contenía el isótopo ¹⁴N. Después de una y de dos divisiones celulares, se tomaron muestras, y posteriormente se aisló y analizó el DNA de cada una de estas muestras mediante centrifugación en gradiente de densidad de CsCl. Debido a que este método analítico separa moléculas con base en su tamaño y su forma o “densidad”, los DNA con ¹⁵N y con ¹⁴N puros producen bandas características en los tubos de CsCl centrifugados (el DNA con ¹⁵N es más pesado que el que tiene ¹⁴N).

Al centrifugar el DNA aislado de las células que contenían ¹⁵N cultivadas durante exactamente una generación en el medio de ¹⁴N, se observaba una única banda. Debido a que esta banda se encontraba justo a la mitad de la distancia donde normalmente debían aparecer las bandas de DNA-¹⁵N y de DNA-¹⁴N, parecía razonable suponer que el nuevo DNA era una molécula híbrida; es decir, contenía una cadena de ¹⁵N y una cadena de ¹⁴N. (Cualquier otro modo de replicación habría creado más de una banda.) Luego de dos divisiones celulares, el DNA extraído se separaba en dos bandas diferenciadas de igual intensidad, una formada por ¹⁴N, DNA-¹⁴N (DNA ligero) y otra formada por moléculas híbridas (DNA-¹⁴N, ¹⁵N), un resultado que también apoyaba el modelo semiconservador de la síntesis de DNA.

En los años transcurridos desde el experimento de Meselson y Stahl se han descubierto muchos de los detalles de la replicación del DNA. Hasta hace poco se suponía que la maquinaria de replicación del DNA se movía a lo largo de un “riel” de DNA que en gran medida era estacionario. Esfuerzos de investigación recientes han revelado que la replicación del DNA ocurre en compartimentos nucleares o nucleoides específicos llamados fábricas de replicación, que son relativamente estacionarias durante el proceso. La maquinaria de replicación contenida en estas fábricas funciona como una bomba de DNA impulsada por energía. En los organismos procariotas, las fábricas de replicación están unidas a la membrana celular, mientras que en los eucariotas las fábricas se ensamblan durante la fase de síntesis del ciclo celular (fase S.: véase más adelante, fig. 18.14) asociadas a la matriz nuclear.

SÍNTESIS DE DNA EN LOS PROCARIOTAS La replicación del DNA en E. coli consta de varios pasos básicos, cada uno de los cuales requiere actividades enzimáticas asociadas con los siguientes procesos: desenrollamiento del DNA, síntesis de cebadores y síntesis de polinucleótidos de DNA. Aquí se describen además la unión de fragmentos de DNA y el control del superenrollamiento.

Las helicasas de desenrollamiento del DNA, como su nombre indica, son proteínas motoras que requieren ATP y que separan a las cadenas unidas del DNA bicatenario. La helicasa principal de E. coli es DnaB, un hexámero de forma anular que abre la doble hélice.

Síntesis de cebadores Es necesaria la formación de segmentos cortos de RNA complementarios a un molde de DNA monocatenario llamados cebadores, para que inicie la replicación del DNA. La síntesis de cebadores es catalizada por la primasa, una RNA polimerasa. La primasa es un polipéptido de 60 kD, producto del gen dnaG. Se denomina primosoma a un complejo multienzimático que contiene primasa y varias proteínas auxiliares.

Síntesis de DNA La síntesis de una cadena de DNA complementaria en la dirección 5′ → 3′ por la formación de enlaces fosfodiéster entre los nucleótidos apareados a una cadena molde es catalizada por grandes complejos multienzimáticos que se denominan polimerasas de DNA figura 18.5. En el modelo actual del mecanismo catalítico de las polimerasas de DNA, que se ilustra en la figura 18.6, el oxígeno del hidroxilo 3′ es un nucleófilo que ataca al fosfato α del nucleótido entrante para formar un nuevo enlace P—O. Con una velocidad de polimerización de 1 000 nucleótidos/s, la DNA polimerasa III (pol III) es la principal enzima sintetizadora de DNA de los organismos procariotas. La holoenzima pol III está formada por al menos 10 subunidades (cuadro 18.1). La polimerasa central consta de tres subunidades: α, ε y θ. La proteína β (también llamada proteína pinza deslizante o pinza β₂) está formada por dos subunidades figura 18.7 y crea un anillo en forma de rosquilla alrededor de la cadena molde de DNA. El complejo γ está formado por las subunidades τ, γ, δ, δ′, χ, y ψ. De éstas, τ, γ, δ y δ′ contienen un dominio ATPasa motriz que utiliza la energía liberada por la hidrólisis del ATP para catalizar la función mecánica de la carga de la pinza de DNA. El complejo γ reconoce cadenas sencillas de DNA con cebador y, actuando como un cargador de pinza, transfiere el dímero de la pinza β₂ a la polimerasa central, donde forma un anillo cerrado alrededor de la cadena de DNA. El diámetro interno de la pinza β₂ es unos 3.5 Å mayor que el DNA bicatenario, suficiente para que las cadenas de DNA hidratadas se deslicen por él con facilidad. La pinza β₂ promueve la procesividad; es decir, impide que la polimerasa se disocie con frecuencia del molde de DNA. El complejo γ se expulsa en un proceso impulsado por la hidrólisis de ATP, y la holoenzima pol III puede proceder a replicar el DNA. Obsérvese que la subunidad τ permite que dos complejos enzimáticos centrales formen un dímero, lo que también mejora la procesividad. La máquina de replicación del DNA, que se denomina replisoma, está formada por dos copias de la holoenzima pol III, el primosoma y las proteínas de desenrollamiento de DNA.

Escherichia coli posee también otras cuatro DNA polimerasas: I, II, IV y V. La DNA polimerasa I (pol I), la primera DNA polimerasa que se descubrió (Arthur Kornberg, premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1959), es una enzima versátil que aporta varias funciones en la replicación y la reparación del DNA. Tiene tres actividades catalíticas marcadamente diferentes: actividad de exonucleasa 5′ → 3′, actividad de polimerasa dirigida por plantilla (molde) 5′ → 3′ y actividad de exonucleasa 3′ → 5′. (Una exonucleasa es una enzima que elimina nucleótidos de un extremo de una cadena polinucleotídica.) La actividad de exonucleasa 5′ → 3′ de la pol I elimina (despolimeriza) segmentos mal apareados de DNA durante la replicación. Esta misma actividad elimina también los cebadores de RNA. Una vez eliminado el cebador de RNA, la actividad de polimerasa dirigida por molde 5′ → 3′ de la pol I reemplaza a los ribonucleótidos con desoxirribonucleótidos. (Obsérvese que la pol I es una enzima lenta [18 nucleótidos/s] con baja procesividad, en contraste con la pol III, la principal enzima de replicación.) A medida que la pol I sintetiza segmentos cortos de DNA, utiliza también su actividad de corrección exonucleasa 3′ → 5′ para asegurar su exactitud. La pol I tiene también funciones importantes en varios tipos de reparación de daños posreplicación.

Las pols II y IV son enzimas de reparación que normalmente están presentes en la células, en donde reparan daños de bajo nivel en el DNA. La exposición de las células a niveles altos de luz ultravioleta o sustancias químicas mutagénicas activa un mecanismo de reparación de emergencia denominado respuesta SOS. Las enzimas y otras proteínas inducidas por la respuesta SOS impiden la muerte celular causada por altos niveles de daño al DNA que impiden la replicación. Muy al principio en la respuesta SOS, aumenta la expresión de los genes pol II y pol IV, para ser seguida luego por la expresión del gen de la pol V. Estas enzimas reparadoras se conocen como polimerasas de translesión porque sus estructuras permiten el uso de DNA dañado como molde. Cuando se detiene la replicación porque la pol III ha encontrado una lesión (p. ej., aductos de bases, pérdida de bases o dímeros de timina), entonces la pol III es reemplazada por una de las enzimas de reparación. Una vez que la lesión ha sido librada por la incorporación de nucleótidos en la cadena opuesta a la lesión, la polimerasa de translesión se elimina y se reemplaza con pol III, que continúa la replicación hasta que se encuentra la siguiente lesión. Desafortunadamente, la reparación mediante el sistema SOS conlleva un alto costo porque es propenso a errores. Las características estructurales de las pols IV y V, y en menor grado de la pol II, que permiten su unión a las lesiones de DNA también disminuyen su exactitud. Se producen mutaciones si los errores introducidos por las polimerasas de translesión no son corregidos por la reparación posreplicación.

Unión de los fragmentos de DNA A menudo, durante la replicación del DNA (así como en procesos de reparación y recombinación del DNA), es necesario unir entre sí segmentos de cadena de DNA. Una enzima denominada DNA ligasa cataliza la formación de un enlace covalente fosfodiéster entre el extremo 3′-OH de un segmento y el extremo 5′-fosfato de otro segmento.

Control del superenrollamiento Las topoisomerasas de DNA evitan el enmarañamiento de las cadenas de DNA. Se anticipan a la maquinaria de replicación para reducir la torsión (fuerza de rotación) del DNA que puede lentificar el proceso de replicación. La generación de torsión es un problema muy real porque la doble hélice se desenrolla con rapidez (hasta a 50 revoluciones por segundo durante la replicación del DNA bacteriano). Las topoisomerasas son enzimas que cambian el superenrollamiento del DNA rompiendo una o ambas cadenas, tras lo cual pasan el DNA a través de la rotura y vuelven a unir ambas cadenas. Los términos topoisomerasa y topoisómeros (moléculas de DNA que sólo se diferencian en su grado de superenrollamiento) se derivan de topología, una rama de las matemáticas que investiga cambios de forma o de posición que pueden lograrse sin hacer cortes. Cuando se controla de manera adecuada, el superenrollamiento puede facilitar la separación de las cadenas de DNA. Las topoisomerasas de tipo I producen roturas transitorias de cadena individual en el DNA; las topoisomerasas de tipo II producen roturas transitorias de doble cadena. En los organismos procariotas, una topoisomerasa de tipo II llamada DNA girasa ayuda a separar (desencadenar) los productos de la replicación (p. ej., cromosomas circulares unidos) y a crear los superenrollamientos negativos (−) que se requieren para empaquetar el genoma.

PROCESO DE REPLICACIÓN PROCARIOTA La replicación del cromosoma circular de E. coli figura 18.8 comienza cuando existe una alta proporción ATP/ADP y hay suficientes copias de la proteína de unión al DNA denominada DnaA (53 kD) que sirve para iniciar el proceso de replicación fundiendo el dsDNA y atrayendo al sitio otras proteínas de replicación figura 18.9. El sitio de iniciación en el cromosoma de E. coli se conoce como oriC. Una vez que se ha iniciado, la replicación procede en dos direcciones. Las helicasas desenrollan el dúplex de DNA, se ensamblan dos replisomas y la replicación procede hacia afuera en ambas direcciones. Conforme se separan uno de otro los dos sitios de la síntesis activa de DNA (que se denominan horquillas de replicación) se forma un “ojal de replicación”. Debido a que un cromosoma de E. coli contiene un único sitio de iniciación, se considera una sola unidad de replicación. Una unidad de replicación, o replicón, es una molécula de DNA (o un segmento de DNA) que contiene un sitio de iniciación y secuencias reguladoras adecuadas.

Cuando se observó experimentalmente por primera vez la replicación del DNA (utilizando microscopia electrónica y autorradiografía), los investigadores se enfrentaron a una paradoja. La síntesis bidireccional del DNA tal y como aparecía en su investigación parecía indicar que ocurría una síntesis continua en la dirección 5′ → 3′ en una cadena y en el sentido opuesto (3′ → 5′) en la otra cadena. Sin embargo, todas las enzimas que catalizan la síntesis de DNA lo hacen sólo en la dirección 5′→ 3′. Ahora se sabe que sólo una cadena, que se denomina cadena líder, se sintetiza de forma continua en la dirección 5′ → 3′. La otra cadena, que se denomina cadena retrasada, también se sintetiza en la dirección 5′→ 3′, pero en pequeños segmentos figura 18.10. Reiji Okazaki y sus colegas proporcionaron evidencia experimental de la síntesis discontinua de DNA. Una vez que el cebador de RNA es eliminado de cada segmento y reemplazado por DNA, estos segmentos de la cadena retrasada, ahora llamados fragmentos de Okazaki, se unen de forma covalente por medio de la DNA ligasa. En los procariotas como E. coli, los fragmentos de Okazaki poseen cerca de 1 000 nucleótidos.

La replicación comienza cuando la proteína DnaA se une a entre cinco y ocho sitios con nueve pares de bases, denominados cajas de DnaA, dentro de la secuencia oriC. El número de cajas de DnaA varía entre los procariotas; E. coli tiene cinco de ellas. La oligomerización de DnaA, que produce una estructura parecida a un nucleosoma, requiere ATP y una proteína HU semejante a las histonas. Cuando se forma el complejo DnaA-DNA, la “fusión” localizada del DNA dúplex en una región cercana que contiene tres secuencias repetidas de 13 bp (pares de bases) hace que se abra un pequeño segmento de la doble hélice figura 18.11. La DnaB (una helicasa de 300 kD compuesta por seis subunidades), formando un complejo con la DnaC (29 kD), entra entonces en la región oriC abierta. Cuando la DnaB se carga en el DNA, se libera la DnaC. La horquilla de replicación se mueve hacia adelante a medida que la DnaB desenrolla la hélice. Las topoisomerasas alivian la torsión al frente de la maquinaria de replicación. Conforme se desenrolla el DNA, se va desplazando la DnaA. La hidrólisis de las moléculas de ATP unidas hace que la DnaA se revierta a una conformación inactiva que es incapaz de unirse al DNA. Las cadenas individuales se mantienen separadas por la unión de numerosas copias de la proteína de unión al DNA monocatenario (SSB). La SSB, un tetrámero, también puede proteger del ataque de las nucleasas a los segmentos vulnerables de ssDNA.

En la figura 18.12 se presenta un modelo de síntesis de DNA en la horquilla de replicación. Para que la pol III inicie la síntesis de DNA, debe sintetizarse un cebador de RNA. En la cadena líder, donde la síntesis de DNA es continua, la formación del cebador sólo ocurre una vez por cada horquilla de replicación. Por el contrario, la síntesis discontinua en la cadena retrasada requiere la síntesis de un cebador por cada uno de los fragmentos de Okazaki. El primosoma viaja a lo largo de la cadena retrasada y se detiene e invierte la dirección en intervalos para sintetizar un cebador corto de RNA. A continuación, la pol III sintetiza el DNA comenzando por el extremo 3′ del cebador. A medida que la síntesis de la cadena retrasada continúa, la pol I desprende los cebadores de RNA y también sintetiza un segmento de DNA complementario. La DNA ligasa une entonces los fragmentos de Okazaki.

Como lo muestra la figura 18.12, la síntesis de ambas cadenas, líder y retrasada, está acoplada. La operación en tándem de los dos complejos pol III requiere que una cadena (la cadena retrasada) haga un lazo alrededor del replisoma. Cuando el complejo pol III de la cadena retrasada completa un fragmento de Okazaki, libera el dúplex de DNA rompiendo su conexión con la pinza deslizante. Luego se reasocia con una nueva pinza deslizante ensamblada sobre el cebador de RNA recién sintetizado por el complejo γ que está directamente adyacente a la horquilla de replicación. Esto le permite al primosoma ingresar y sintetizar el siguiente cebador de RNA.

A pesar de la complejidad de la replicación del DNA en E. coli y de su alta velocidad de procesividad, este proceso es asombrosamente exacto –cerca de un error por 10⁹ a 10¹⁰ pares de bases por generación.

Esta baja tasa de errores, es en gran medida consecuencia de la naturaleza precisa del propio proceso de copiado (p. ej., el apareamiento de bases complementarias). Dentro del sitio activo de la pol III y la pol I hay un sitio con la forma precisa para dar cabida a un par de bases nucleotídicas en el que una purina y una pirimidina se alinean de forma correcta mediante enlaces de hidrógeno e interacciones de van der Waals. Si las bases nucleotídicas no concuerdan, esto es, no embonan en el sitio, y el nucleótido entrante suele dejar el sitio antes de que ocurra la reacción. Tanto la pol III como la pol I también verifican el DNA recién sintetizado. La mayoría de los nucleótidos mal apareados se elimina (por las actividades de exonucleasas 3′ → 5′ de la pol III y de la pol I) y luego se sustituyen. Asimismo diversos mecanismos de reparación posteriores a la replicación contribuyen a la baja tasa de errores de replicación del DNA.

La replicación finaliza cuando las horquillas de replicación se encuentran en el otro lado del cromosoma circular en el sitio de terminación, la región ter (τ). En E. coli, la región ter está formada por seis sitios de terminación de 20 bp los cuales, cuando se enlazan a la proteína de unión al DNA tus, hacen que la replicación se detenga. Este complejo asimétrico tus-ter impide que una horquilla de replicación viaje en un sentido pero no en el otro, gracias a una inhibición dependiente del sentido de la helicasa DnaB figura 18.13. Una vez que termina la replicación, los replisomas se desensamblan y las dos moléculas hijas son separadas por una topoisomerasa de tipo II.

SÍNTESIS DEL DNA EN LOS ORGANISMOS EUCARIOTAS Aunque los principios de la replicación del DNA tanto en los procariotas como en los eucariotas tienen mucho en común (p. ej., la replicación semiconservadora, los mecanismos de las polimerasas de DNA y los replicones bidireccionales), también tienen diferencias significativas. No es sorprendente que estas diferencias estén relacionadas con el tamaño y con la complejidad de los genomas eucariotas.

DNA polimerasas Hay 15 DNA polimerasas de organismos eucariotas. De ellas, tres (α, δ y ∊) participan en la replicación del DNA nuclear. La DNA polimerasa α (pol α) es una primasa que inicia la replicación del DNA sintetizando un segmento corto de RNA de 10 nucleótidos, seguido por un segmento de DNA de 10 a 20 nucleótidos. Tras la síntesis del cebador en la cadena líder, la síntesis del DNA es continuada por la pol ∊. La pol δ es la polimerasa de la cadena retrasada. Tanto la pol δ como la ∊ son polimerasas muy exactas y procesadoras con actividad de verificación de exonucleasas 3′ → 5′. La pol δ corrige errores cometidos por la pol α. Las polimerasas β, ς (zeta) y η (eta) trabajan en la reparación de DNA nuclear. La pol γ replica y repara DNA mitocondrial. A diferencia de las polimerasas de DNA procariótico, ninguna de las enzimas eucarióticas elimina cebadores de RNA. En cambio, la enzima Dna2, con actividades de nucleasa y helicasa, y la FEN1, una endonucleasa, sí eliminan los cebadores.

Temporización Al contrario que en las células bacterianas de crecimiento rápido, en las que la replicación sucede durante la mayor parte del ciclo de división celular, la replicación en las células eucariotas se limita a un periodo específico que se denomina fase S figura 18.14. Las células eucariotas producen determinadas proteínas (sección 18.3) que regulan las transiciones de fase dentro del ciclo celular.

Velocidad de replicación La replicación del DNA es mucho más lenta en los eucariotas que en los procariotas. La velocidad eucariota es de ~50 nucleótidos por segundo, por cada horquilla de replicación. (Recuérdese que la velocidad en los procariotas es unas 20 veces mayor.) Esta discrepancia tal vez se deba, en parte, a la estructura compleja de la cromatina.

Replicones Pese a la relativa lentitud de la síntesis del DNA en las células eucariotas, el proceso de replicación es breve en términos relativos, considerando las grandes dimensiones de los genomas eucariotas. Por ejemplo, según la velocidad de replicación antes mencionada, la replicación de un cromosoma eucariota promedio (aproximadamente 150 millones de pares de bases) tardaría en completarse un mes. Sin embargo, este proceso en general se completa en algunas horas. Los eucariotas utilizan múltiples replicones para comprimir la replicación de sus grandes genomas en periodos cortos figura 18.15. Casi cada 40 kb a lo largo de los cromosomas de los eucariotas hay un sitio en el que se ensambla la maquinaria de replicación. El ser humano tiene unos 30 000 orígenes de replicación.

Fragmentos de Okazaki Los fragmentos de Okazaki de los eucariotas, que tienen entre 100 y 200 nucleótidos, son mucho más cortos que los de los procariotas.

PROCESO DE REPLICACIÓN DE LOS EUCARIOTAS En los eucariotas superiores, la replicación comienza con el ensamblaje secuencial del complejo de replicación de preiniciación (preRC) figura 18.16. La formación de este complejo implica un proceso que comienza en la temprana fase G1 del ciclo celular, cuando son bajas las concentraciones de cinasa dependiente de ciclina (Cdk) y de proteínas de ciclo de división celular (Cdc). El proceso, llamado autorización, limita la replicación de DNA a una vez por ciclo celular.

El ensamblaje de los componentes del preRC comienza cuando el complejo del origen de replicación (ORC), cuyas subunidades son análogas a la DnaA, se une al origen o región de iniciación del DNA. Cdc6/Cdc18 y Cdt1 se unen al ORC y reclutan al complejo MCM. Se cree que MCM es la principal helicasa de DNA en los eucariotas. El reclutamiento de más proteínas de la maquinaria de control del ciclo celular (p. ej., cdk2-ciclina E y cdc45) permite que las proteínas de replicación de DNA sean cargadas en la horquilla de replicación y se inicie la síntesis de DNA figura 18.17. La conversión de preRC autorizada a un complejo de iniciación activo requiere la presencia de pol α/primasa, pol ε y varias proteínas accesorias, que ocurre sólo al inicio de la fase S. Las cinasas que regulan el ciclo celular entonces fosforilan y activan los componentes del preRC. Las proteínas que se unen al ORC y completan la estructura del preRC se denominan factores de autorización para la replicación (RLF).

Cuando el complejo de iniciación está activo, la MCM recién fosforilada separa las cadenas de DNA, cada una de las cuales es estabilizada entonces por proteína de replicación A (RPA) figura 18.18. La replicación es iniciada por la primasa, que sintetiza los RNA cebadores de la cadena líder y de cada fragmento de Okazaki de la cadena retrasada. La pol α/primasa alarga cada cebador con un corto segmento de DNA de unos 20 nucleótidos de longitud. Entonces la DNA polimerasa α es desplazada, y las polimerasas δ y ∊ continúan el proceso de replicación. La unión de la DNA polimerasa ∊ a la cadena líder y de la polimerasa δ a la cadena retrasada se controla por el factor de replicación C (RFC), que es una proteína cargadora de pinza. Después de unirse a ATP, el RFC se une a la PCNA (pinza deslizante), un factor de procesividad. El complejo RFC/PCNA, que convierte las polimerasas de DNA δ y ∊ en enzimas procesivas, carga entonces cualquiera de las polimerasas en el DNA, con lo que induce la hidrólisis de ATP.

La replicación del DNA de cada cromosoma continúa hasta que los replicones se encuentran y se fusionan. Cuando la maquinaria de replicación llega al extremo 3′ de la cadena retrasada, el espacio es insuficiente para sintetizar un nuevo cebador de RNA. La síntesis incompleta de la cadena retrasada deja la cadena molde sin sus pares de bases complementarias al final del cromosoma. Los cromosomas con protrusiones 3′-ssDNA son muy susceptibles a la digestión por nucleasas y tienden a fusionarse entre sí, lo cual induce la rotura cromosómica durante la mitosis. Las células eucariotas pueden compensar este problema por medio de la telomerasa, una ribonucleoproteína con actividad de transcriptasa inversa, y de una molécula de RNA con una secuencia de bases que es complementaria a la secuencia rica en TG de los telómeros. Recuérdese que los telómeros son secuencias minisatelitales que se encuentran en los extremos de los cromosomas lineales. La telomerasa utiliza la secuencia de bases de RNA para sintetizar un DNA monocatenario y extender la cadena 3′ del telómero figura 18.19. Después, la maquinaria de replicación normal sintetiza un cebador y un nuevo fragmento de Okazaki. Los extremos del cromosoma son entonces secuestrados y estabilizados por proteínas de unión al extremo del telómero (TEBP), que se unen a secuencias teloméricas ricas en GT, y por factores de unión a repeticiones teloméricas (TRF) que fijan la protrusión 3′ (ahora más alejada de las secuencias de codificación críticas) en un lazo T en forma de nudo.

En la mayoría de los organismos eucariotas multicelulares, la telomerasa es activa sólo en las células germinales (células que dan origen a óvulos y espermatozoides). En el cuerpo humano, durante el envejecimiento normal, los telómeros de las células somáticas (células diferenciadas excepto óvulos y espermatozoides) se acortan con el tiempo. Cuando los telómeros se reducen a una longitud crítica, los cromosomas ya no pueden replicarse. Como resultado de ello las células somáticas finalmente mueren. Resulta notable que los fibroblastos (células de tejido conjuntivo) de los pacientes con síndrome de progeria de Hutchinson-Guilford tienen telómeros anormalmente cortos. Estos pacientes envejecen con rapidez, y mueren antes de la adolescencia. También se sabe que la telomerasa se expresa de forma excesiva en ~90% de todos los cánceres.

Reparación del DNA

Las actividades metabólicas normales y las exposiciones ambientales tienen efectos considerables sobre el DNA. Por ejemplo, la estimación de lesiones del DNA en células humanas varía entre decenas y centenas de miles por cada célula en cada día. Y aún así, sólo una pequeña fracción de estas lesiones pasa como mutaciones a las células hijas. La tasa media de mutación espontánea natural para gametos (células reproductoras) de animales y plantas es 1 mutación por cada 100 000 genes en cada generación. Este bajo índice es el resultado de una red de mantenimiento del genoma que detecta las lesiones de DNA y luego las repara. Hay varias clases de reparaciones de DNA. Las reparaciones directas eliminan el daño químico del DNA (p. ej., dímeros de pirimidina) revirtiéndolo. Cuando el daño se ubica en una de las dos cadenas de DNA, se pueden usar varias formas de reparación por escisión (reparación por escisión de base, reparación por escisión de nucleótido y reparación de errores de apareamiento). Las roturas del DNA bicatenario son reparadas mediante unión de extremos no homólogos o mediante recombinación homóloga. En humanos y otros mamíferos, las respuestas a daños del DNA son reguladas por varias cinasas serina-treonina. De éstas, la ATM (αtaxia telangiectasia mutada) y la ATR (proteína de ataxia telangiectasia y relacionada con Rad3) inician respuestas globales al daño al DNA que activan grandes cantidades de proteínas regulatorias de reparación del DNA y del ciclo celular. (La ataxia telangiectasia es una extraña enfermedad humana caracterizada por sensibilidad a radiaciones, una inestabilidad genómica que predispone a los individuos afectados a la neurodegeneración y al cáncer.) Unos pocos tipos de daños del DNA pueden repararse sin la eliminación de nucleótidos. Por ejemplo, las roturas de los enlaces fosfodiéster pueden ser reparadas por la DNA ligasa. En la reparación por fotorreactivación o reparación fotoinducida, los dímeros de pirimidina se restauran a sus estructuras monoméricas originales figura 18.20. En presencia de luz visible, la fotoliasa de DNA rompe el dímero, dejando intactos los enlaces fosfodiéster. La energía luminosa que capturan los cromóforos de flavina y pterina de la enzima rompe el anillo de ciclobutano.

Reparaciones directas

REPARACIONES DE DNA MONOCATENARIO Varios mecanismos reparan el daño limitado a un segmento de DNA monocatenario utilizando como molde la cadena complementaria no dañada. La reparación por escisión de bases es un mecanismo que elimina y luego repone nucleótidos individuales cuyas bases han sufrido daño (p. ej., alquilación, desaminación u oxidación). Una de varias enzimas llamadas glucosilasas de DNA rompe el enlace N-glucosídico entre la base dañada y el componente de desoxirribosa del nucleótido figura 18.21. Los sitios apúricos o apirimidínicos (AP) resultantes se resuelven mediante la acción de nucleasas que eliminan el residuo de desoxirribosa y varios nucleótidos adicionales. El espacio es reparado por una DNA polimerasa (pol I en las bacterias y polimerasa β de DNA en los mamíferos) y una DNA ligasa. En la reparación por escisión de nucleótidos (NER) se eliminan lesiones voluminosas (de 2 a 30 nt) y desestabilizadoras de la hélice, y el hueco resultante se resana. Hay dos formas de reparación por escisión de nucleótidos: la reparación genómica global (GG-NER) y la reparación acoplada a transcripción (TC-NER). Difieren en los mecanismos que permiten reconocer el daño al DNA. En ambas formas las enzimas de escisión parecen reconocer la distorsión física, más que secuencias de bases específicas. En E. coli GG-NER figura 18.22, la nucleasa de escisión (escinucleasa), formada por Uvr A, B y C, corta el DNA dañado y elimina una secuencia de ssDNA de 12 a 13 nt que contiene la lesión. Un complejo UvrA₂UvrB (A₂B) busca daños en el DNA (p. ej., un dímero de timina). Una vez que la UvrA capta una distorsión en la hélice, desenrolla parcialmente el segmento afectado. La UvrB desestabiliza aún más el segmento insertando un dominio de horquilla β. Luego A₂B dobla el DNA, y la Uvr A se disocia de Uvr B-DNA. La Uvr C se une entonces a la Uvr B y corta la cadena de DNA dañada cuatro o cinco nucleótidos hacia el lado 3′ del dímero de timina. La Uvr C corta la cadena ocho nucleótidos hacia el lado 5′. La Uvr D, una helicasa, libera la Uvr C y el oligonucleótido que contiene el dímero de timina. El hueco de escisión es reparado por la pol I y por la DNA ligasa.

La reparación acoplada a la transcripción ocurre sólo en la cadena que se está transcribiendo activamente. El daño se reconoce cuando la enzima de transcripción, RNA polimerasa, se estanca. El Mfd, un factor de acoplamiento transcripción-reparación, procede entonces a desplazar a la polimerasa y a reclutar al complejo UvrA₂B que iniciará la reparación del daño. La reparación por escisión de nucleótidos en humanos, lo mismo que en otros eucariotas, es más complicada que el proceso procariota y envuelve al menos nueve proteínas. La mayoría de estas proteínas es nombrada por su asociación con dos enfermedades causadas por su deficiencia: el xeroderma pigmentosum (un trastorno hereditario caracterizado por una extrema sensibilidad a la luz) y el síndrome de Cockayne (envejecimiento prematuro y anomalías auditivas y oculares). En el GG-NER, por ejemplo, la XPA, la XPC y la XPE participan en el reconocimiento de daños y en el reclutamiento de varias otras proteínas. La CSA y la CSB reconocen daños de DNA en TC-NER.

La reparación de errores de apareamiento es un mecanismo de reparación para una sola cadena que corrige errores de apareamiento de bases que distorsionan la hélice y que son producto de errores en la verificación de la replicación o de corrimiento en la replicación. (El corrimiento en la replicación es un tipo de error que ocurre cuando las secuencias de repetición son saltadas o copiadas doblemente, causando la formación de burbujas que necesitan repararse.) El proceso de reparación a menudo produce deleciones (secuencias saltadas) o inserciones (secuencias copiadas doblemente). También se pueden reparar algunos errores de recombinación y varias formas de daño químico (p. ej., aductos de 8-oxoguanina y de carcinógenos). Una característica notable de la reparación de errores de apareamiento es la capacidad de distinguir entre cadenas sintetizadas antigua o recientemente. En E. coli se logra esto mediante la metilación de ambas cadenas del DNA progenitor. La metiltransferasa del DNA (Dam) metila N-6 de los residuos de adenina en las secuencias 5′-GATC-3′ y la metilasa de la citosina del DNA (Dcm) convierte las citosinas de las secuencias 5′-CCTGG-3′ y 5′-CCAGG-3′ a 5-metilcitosina. Como estas secuencias forman palíndromos, se metilan igual ambas cadenas. Durante un lapso finito después de la replicación, cada DNA hija queda hemimetilada (p. ej., consiste en una cadena metilada y una no metilada). Justo durante este breve periodo, el DNA es explorado buscando pares de bases apareadas erróneamente. El sistema de reparación de errores de apareamiento consiste en tres proteínas: MutS, MutL y MutH. Un homodímero de MutS reconoce y se une a un sitio que contenga una base mal apareada en la cadena recién sintetizada. Luego, la MutH localiza y se une al sitio GATC más próximo. Después de que la MutS y la MutL realizan una activación dependiente de ATP, la MutH procede a cortar la cadena no metilada, marcándola así para ser reparada. Una helicasa de DNA separa las dos cadenas y varias exonucleasas proceden a degradar la cadena no metilada desde el sitio de corte hasta unos pocos nucleótidos más allá del sitio de apareamiento erróneo. La pol III entra entonces a resintetizar el segmento faltante utilizando como modelo la cadena metilada.

ROTURAS DE DOBLE CADENA Las roturas de doble cadena (DSB) son particularmente peligrosas para las células porque pueden ocasionar una destrucción letal de cromosomas. Causadas por radiación, ROS o sustancias químicas que dañan el DNA (p. ej., asbesto o cisplatino —un fármaco contra cáncer), o como consecuencia de errores en la replicación del DNA, las DSB se reparan mediante dos mecanismos. Un mecanismo encadena dos extremos de DNA (unión de terminales no homólogas), en tanto que otro aprovecha la información de la secuencia de bases en un cromosoma homólogo (recombinación homóloga). En humanos y otros mamíferos, la vía preferida para reparación de rotura de doble cadena es la unión de terminales no homólogas (NHEJ). Ambos procesos empiezan detectando que ha ocurrido una rotura de doble cadena. En los mamíferos, la detección de dicha rotura requiere varias moléculas; entre éstas están la ATM y la ATR, las cuales inician respuestas globales a daños de DNA que activan grandes números de proteínas reguladoras de reparación de DNA y de ciclo celular, y la DNA-PK, que está implicada en la reparación de DSB.

La NHEJ empieza con la unión de DNA-PK a los dos extremos del DNA. La DNA-PK es un heterotrímero de DNA-PK_CS (polipéptido catalítico proteína cinasa activado por DNA) y de un dímero de Ku. La DNA-PK_CS sufre una autofosforilación y luego recluta y fosforila a una proteína denominada artemisa. La artemisa es una nucleasa que convierte los dos extremos a sustratos de ligación. Un complejo trimérico que contiene ligasa IV de DNA y dos proteínas accesorias concluye la reparación reuniendo los extremos rotos de DNA. Debido a que no se requiere una homología de secuencia, la NHEJ es una vía propensa a errores. Por ejemplo, la incidencia de varias DSB en una célula puede conducir a la unión inadvertida de extremos de DNA pertenecientes a cromosomas distintos. La reparación por recombinación homóloga (HR), que se parece mucho a la recombinación general, se expone en la sección siguiente.

Recombinación del DNA

La recombinación puede definirse como el reordenamiento de las secuencias de DNA por medio del intercambio de segmentos de diferentes moléculas. El proceso de recombinación, que produce nuevas combinaciones de genes y fragmentos genéticos, es la causa fundamental de la diversidad de los seres vivos. Aún más importante, el gran número de variaciones que hace posible la recombinación otorga a las especies oportunidades para adaptarse a ambientes cambiantes. En otras palabras, la recombinación es una fuente importante de las variaciones que hacen posible la evolución. La recombinación se utiliza también para reparar roturas en el DNA bicatenario.

Existen dos formas de recombinación: general y específica de sitio. La recombinación general, que tiene lugar entre moléculas homólogas de DNA, ocurre sobre todo durante la meiosis. (La meiosis es la forma de división de las células eucariotas en la que se producen los gametos haploides.) En la recombinación específica de sitio, el intercambio de secuencias de moléculas diferentes sólo requiere regiones cortas de homología de DNA. Estas regiones están flanqueadas por largas secuencias no homólogas. Las recombinaciones específicas de sitio, que dependen más de las interacciones proteínas-DNA que de las homologías de secuencia, ocurren en toda la naturaleza. Por ejemplo, este mecanismo lo utiliza un bacteriófago para integrar su genoma al cromosoma de E. coli. En los eucariotas, la recombinación específica de sitio es causal de una gran variedad de reordenamientos génicos controlados durante el desarrollo. Los reordenamientos génicos son en parte responsables de la diferenciación celular en los organismos multicelulares complejos. Uno de los ejemplos más interesantes de reordenamiento génico es la generación de diversidad de anticuerpos en los mamíferos. En una variación de la recombinación específica de sitio, que se denomina transposición, determinadas secuencias de DNA llamadas elementos transponibles se mueven de un cromosoma o región del cromosoma a otro.

RECOMBINACIÓN GENERAL La recombinación general se presenta en todos los seres vivos, pero se ha investigado principalmente en E. coli y en hongos como Saccharomyces cerevisiae y Aspergillus nidulans. Además de generar diversidad genética, la recombinacion general es también un importante proceso de reparación de daños al DNA. Se han propuesto varios modelos para explicar la recombinación. Como ejemplos están el de Holliday, el de Meselson-Radding, la reparación de roturas de doble cadena y los modelos de hibridación de cadena dependiente de síntesis.

El primer modelo que explicaba la recombinación general se basó en el trabajo de Robin Holliday con hongos. El modelo de Holliday figura 18.23 comprende los pasos siguientes:

1. Dos moléculas homólogas de DNA se aparean.

2. Dos de las cadenas de DNA, una de cada molécula, se fracturan en ubicaciones idénticas (si no es que similares).

3. Los dos segmentos de cadena fracturados se entrecruzan, formando así un intermediario de Holliday.

4. La DNA ligasa sella los extremos cortados.

5. La migración de rama causada por el intercambio de apareamiento de bases conduce a la transferencia de un segmento de DNA de un homólogo al otro.

6. Se produce una segunda serie de cortes de cadenas de DNA.

7. La DNA polimerasa rellena los espacios y la DNA ligasa sella las cadenas cortadas.

El modelo de Meselson-Radding es el resultado de los esfuerzos para justificar varias observaciones de laboratorio que no se explican con el modelo de Holliday. Entre ellas, está el hecho de que la recombinación a veces produce una cadena recombinante en sólo una de las moléculas homólogas de DNA. Según el modelo de Meselson-Radding figura 18.24, la recombinación ocurre de la siguiente manera:

1. Se corta una cadena en una de las dos moléculas homólogas de DNA.

2. La extensión, inducida por la polimerasa, del extremo 3′ recién creado causa un desplazamiento de la cadena en el otro lado del corte. Conforme se alarga la cadena creciente, la cadena desplazada invade la doble hélice de un segmento homólogo del segundo cromosoma para crear una esctructura en lazo D.

3. El lazo D se corta y la cadena invasora se liga al extremo 3′ recién creado de la cadena homóloga.

4. El extremo 3′ de la cadena recién sintetizada y el extremo 5′ de la cadena homóloga se ligan para crear un intermediario de Holliday.

5. Puede ocurrir migración en rama.

6. Los cortes en las cadenas y la terminación de la unión de Holliday (véase la fig. 18.23f-i) dan origen ya sea a un producto entrecruzado (corte vertical) o un producto no entrecruzado (corte horizontal).

En los eucariotas la recombinación general tiene una función destacada en la meiosis, un tipo de división celular que es necesaria para la reproducción sexual. En un mecanismo que hace coincidir con precisión cromosomas homólogos paternos y maternos, la maquinaria de recombinación general facilita el intercambio de segmentos cromosómicos que crea la diversidad genética. El modelo de reparación de roturas de doble cadena (DSBR) (fig. 18.25a-d) explica muchas de las características de la recombinación meiótica que no explican los modelos de Holliday y de Meselson-Radding. Los mecanismos de reparación de roturas de doble cadena también protegen a las células de procariotas y eucariotas contra roturas de doble cadena causadas por factores mutagénicos como la radiación ionizante y las ROS. Las etapas principales en el DSBR son las siguientes:

1. Una endonucleasa induce una rotura de doble cadena en una sola de las dos moléculas homólogas de DNA.

2. Las exonucleasas degradan los extremos 5′, dejando los extremos 3′ sin alterar.

3. Uno de los extremos 3′ invade una molécula homóloga de DNA y tras una búsqueda exitosa de homología forma un lazo D.

4. Una DNA polimerasa prolonga los extremos 3′, tanto el invasor como el invadido.

5. La migración de rama, combinada con la ligación del extremo 3′ invasor y del extremo 5′ en el otro lado de la rotura, da por resultado la formación de una doble unión de Holliday.

6. La finalización de las dos estructuras de Holliday puede formar productos entrecruzados o no entrecruzados.

El DSBR también ocurre en la mitosis, usualmente sin productos entrecruzados. El modelo de hibridación de cadena dependiente de síntesis (SDSA) explica cómo ocurre este fenómeno. El SDSA se diferencia del DSBR cuando se desplaza la cadena en el lazo D (fig. 18.25e y f). La cadena invasora procede a hibridarse con la cadena simple complementaria de la otra rotura de cadena doble. El proceso finaliza con la síntesis completa del DNA, seguida por la ligación.

RECOMBINACIÓN PROCARIOTA En E. coli, la recombinación se inicia cuando la RecBCD, un complejo enzimático que posee actividades de exonucleasa y de helicasa encuentra una secuencia Chi (instigador de promotor de entrecruzamiento). Tras unirse a una molécula de DNA, la RecBCD corta una de las cadenas y procede a desenrollar la doble hélice hasta que alcanza la secuencia 5′-GCTGGTGG-3′ (el sitio Chi), que se presenta frecuentemente en el DNA de E. coli. El intercambio de cadenas se inicia cuando un filamento de nucleoproteína formado por monómeros de RecA, una ATPasa, recubre una de las cadenas. Impulsado por hidrólisis de ATP, el segmento de cadena recubierto por la RecA busca homología en el dsDNA cercano. Una vez que se localiza un segmento homólogo, la síntesis de DNA hace que se desplace la cadena, a lo que le sigue la rotura del lazo D, la captura de la cadena y la formación de una unión de Holliday. La subsiguiente migración de rama figura 18.26 se inicia cuando la RuvA reconoce la unión de Holliday y se une a ella. Dos copias de la RuvB, un hexámero con actividades ATPasa y helicasa, forman a continuación un anillo en ambos lados de la unión. La migración en rama es catalizada por el complejo RuvAB. Esta máquina molecular separa, gira y estira las cadenas en los dos conjuntos de hélices, aun después de la disociación de la RecA. La migración finaliza cuando se alcanza una secuencia específica [5′-(A o T)TT (G o C)-3′]. Al separarse la RuvAB, dos proteínas RuvC se vinculan a la unión. La recombinación finaliza cuando la RuvC rompe las cadenas entrecruzadas y la estructura de Holliday se resuelve a sí misma para formar dos moléculas separadas de DNA bicatenario. En las bacterias, la recombinación general parece participar en diversas formas de transferencia de DNA entre microorganismos:

1. Transformación. En la transformación, los fragmentos desnudos de DNA entran a una célula bacteriana a través de una pequeña abertura en la pared celular y se introducen en el genoma bacteriano. (Recuérdese el experimento de Fred Griffith.)

2. Transducción. La transducción ocurre cuando un bacteriófago de forma inadvertida transporta DNA bacteriano a una célula receptora. Tras una recombinación adecuada, la célula utiliza el DNA transducido.

3. Conjugación. Se sabe que en determinadas especies bacterianas ocurre la conjugación, un acoplamiento sexual no convencional entre una célula donadora y una célula receptora. La célula donadora posee un plásmido especializado que la permite sintetizar un pilus sexual, un apéndice filamentoso que actúa en un proceso de intercambio de DNA. Tras unirse el pilus a la superficie de la célula receptora, se transfiere un fragmento del material genético del donador. El segmento de DNA transferido puede integrarse en el cromosoma del receptor mediante recombinación o puede permanecer fuera de él en forma de plásmido.

RECOMBINACIÓN EUCARIOTA En los eucariotas la recombinación general ocurre durante la primera fase de la meiosis para asegurar exactitud en el apareamiento de cromosomas homólogos y en el entrecruzamiento, el mecanismo para introducir variación genética. La reparación de daños al DNA por roturas de doble cadena (DSB) utilizando moléculas de DNA homólogas se realiza durante las fases S y G2 del ciclo celular cuando hay disponible DNA recién replicado. (En las otras fases del ciclo, los DSB se reparan mediante NHEJ.)

Se cree que el mecanismo básico de la recombinación general en las eucariotas es semejante al proceso que ocurre en las procariotas. Sin embargo, como hay genomas mucho más complejos, el número de proteínas participantes en la recombinación eucariota es sustancialmente mayor. Se cree que la Rad52, una proteína multifuncional, es el sensor inicial de las DSB. En los mamíferos, el complejo MRN (Mre11, Rad50 y Nbs1) crea un puente que estabiliza los extremos del DNA en las roturas de doble cadena, ya sea causadas por daños exógenos o introducidas por la enzima meiótica Spo11. El MRN también cataliza el corte del extremo 5′. Cuando las DSB son causadas por agentes exógenos, el MRN recluta y activa la ATM, que a su vez activa varias proteínas de reparación de DNA y otras reguladoras del ciclo celular. Ejemplos de proteínas de reparación de DNA activadas mediante ATM son la Rad51, la BRCA1 y la BRCA2. La Rad51 es un homólogo de RecA que se une al ssDNA y facilita la invasión de cadenas. La BRCA1 (proteína de susceptibilidad tipo 1 al cáncer de mama) participa en un número de vías asociadas con reparaciones, las que incluyen la regulación del ciclo celular y el remodelado de cromatina. La BRCA1, vinculada con la BRCA2, interactúa con la Rad51 durante la reparación de DSB.

RECOMBINACIÓN ESPECÍFICA DE SITIO Y TRANSPOSICIÓN La recombinación específica de sitio depende de segmentos cortos de DNA homólogo llamados sitios de fijación (att) o elementos de inserción (IS). La recombinación en estos sitios puede causar inserciones, inversiones, deleciones y transposiciones que pueden beneficiar o perjudicar a la célula. Entre los ejemplos de recombinación específica de sitio se incluyen la inserción de DNA viral en el genoma de una célula hospedadora, la adquisición de resistencia a antibióticos, la variación fenotípica de las plantas y la maduración de anticuerpos en los mamíferos. Un caso simple de inserción lo ilustra la integración del DNA del bacteriófago λ en el cromosoma de E. coli figura 18.27. El proceso requiere sitios att homólogos en los genomas del fago y de la bacteria, una recombinasa vírica llamada integrasa λ y un producto génico bacteriano, el factor hospedador de integración (IHF). El mecanismo correspondiente a la resolución de la unión de Holliday da por resultado la inserción del genoma de λ en el cromosoma bacteriano.

Barbara McClintock, una genetista que trabajaba con maíz indígena, comunicó en la década de 1940 que determinados elementos genéticos móviles eran causantes de la variación fenotípica del color de los granos de maíz. La aceptación de esta idea fue lenta porque requería un cambio de paradigma que se apartaba del concepto de que el genoma es un componente estático de la célula. En 1967 se confirmó la presencia de elementos transponibles (transposones o “genes migratorios”) en E. coli, y finalmente se aceptó el concepto de plasticidad del genoma. La doctora McClintock recibió el premio Nobel de fisiología o medicina en 1983.

Los elementos IS de transposones procariotas simples constan del gen que codifica la enzima de transposición transposasa, flanqueado por repeticiones terminales cortas e invertidas que definen la frontera del transposón figura 18.28. (Una repetición invertida es una secuencia que es el reverso de otra secuencia que aparece más adelante en el flujo descendente. Las repeticiones invertidas sin secuencias intermedias constituyen un palíndromo, o sea una secuencia de DNA cuyo complemento se lee igual pero en sentido inverso.) Los transposones bacterianos más complicados, que se denominan transposones compuestos, consisten en dos transposones separados que están unidos mediante el DNA entre ellos. Los dos transposones (elementos IS) se unen cuando mutaciones desactivadoras (p. ej., en las repeticiones invertidas interiores, o uno de los genes de transposasa IS) impiden la migración independiente de los dos elementos IS. La presencia de secuencias de DNA entre los dos elementos IS que tienen propiedades útiles (p. ej., genes de resistencia a antibióticos) también promueve la retención de un transposón compuesto. Se han observado dos mecanismos de transposición: no replicativa y replicativa.

Transposición no replicativa La transposasa realiza un corte de doble cadena en el DNA donador y lo empalma en los extremos cortados escalonados del ssDNA del sitio diana (un mecanismo de “corte y empalme”). El sistema de reparación de DNA de la célula llena los espacios en el DNA diana, de lo que resulta una repetición directa corta a cada lado de la inserción del transposón figura 18.29. Un espacio no reparado puede ser letal para la célula.

Transposición replicativa En la transposición replicativa sólo una cadena del DNA donador se transfiere a la posición diana y la replicación seguida de una recombinación específica de sitio da por resultado la duplicación del transposón en vez de la inserción en el nuevo sitio figura 18.30. Entonces se forma un intermediario (el cointegrado), que consta del segmento donador unido de forma covalente al DNA diana. Una enzima adicional, que se denomina resolvasa, cataliza una recombinación específica de sitio que permite la resolución del cointegrado en dos moléculas separadas.

Algunos transposones encontrados en las células eucariotas se parecen a los de las bacterias. Por ejemplo, el elemento Ac, el transposón del maíz que describió por vez primera McClintock, está compuesto por un gen de transposasa flanqueado por repeticiones cortas invertidas. McClintock se refirió al transposón Ac como un “elemento controlador” debido a que parecía regular la síntesis del pigmento antocianina en los granos del maíz (p. ej., había un cambio en la expresión génica). Sin embargo, otros muchos transposones eucariotas tienen estructuras un tanto diferentes a las observadas en las bacterias. Como ya se describió, los retrotransposones, también llamados retroposones o retroelementos, son una característica importante de los genomas eucariotas. Dependiendo de los cambios, y de su ubicación, los efectos de los transposones pueden ser vistos como indeseables y dañinos o como proveedores de oportunidades para la diversidad genética. Algunos efectos de la transposición se observan como cambios en la expresión génica, un tópico que se desarrolla en la sección 18.3.

En otra estrategia, la técnica de hibridación de colonias (fig. 18D), las bacterias se detectan utilizando una sonda de ácido nucleico marcada radiactivamente, una molécula de RNA o una molécula de DNA de cadena individual con una secuencia complementaria a la de una secuencia específica dentro del DNA recombinante. Las bacterias se siembran en un medio sólido en cajas de Petri y se permite que crezcan en colonias. El contenido de cada caja se transfiere a un filtro de nitrocelulosa. (Algunas células de cada una de las colonias originales permanecen sobre las cajas de Petri.) Las células que se encuentran sobre el filtro se lisan y el DNA liberado se trata de forma que pueda producirse la hibridación con la sonda. Una vez que han sido eliminadas las moléculas de sonda que no se han hibridado (mediante lavado), se utiliza autorradiografía para identificar en la placa maestra las colonias que poseen el DNA recombinante de interés.

La transcripción, que es la creación de copias en RNA de secuencias de DNA, es un proceso sumamente regulado que transforma señales ambientales (p. ej., disponibilidad de nutrientes en el caso de bacterias, y señales de desarrollo en eucariotas multicelulares) en cambios de expresión génica. Como con todos los aspectos de la función de los ácidos nucleicos, la síntesis de las moléculas de RNA es un proceso muy complejo en el que participan diversas enzimas y proteínas asociadas. Recuérdese que las moléculas de RNA se transcriben a partir de los genes de la célula. Conforme procede la síntesis de RNA, la incorporación de ribonucleótidos es catalizada por la RNA polimerasa, que algunas veces se denomina RNA polimerasa dependiente de DNA, o RNAP. La reacción que catalizan todas las RNA polimerasas es

Como la cadena que no sirve de plantilla, plus (+), tiene la misma secuencia de bases que el RNA producto de la transcripción (salvo la sustitución de U por T), se denomina también cadena codificadora figura 18.31. Por convención, la dirección del gen (un segmento de DNA bicatenario) es la misma que la de la cadena codificadora. La polimerización procede desde el extremo 5′ hasta el extremo 3′ del gen debido a que la cadena molde de DNA, también llamada cadena (−) negativa, y la molécula de RNA recién sintetizada son antiparalelas. Como se ha señalado, la transcripción genera varios tipos de RNA, de los cuales los rRNA, tRNA y mRNA participan de forma directa en la síntesis de proteínas (cap. 19).

Transcripción en procariotas

La RNA polimerasa figura 18.32 de E. coli cataliza la síntesis de todas las clases de RNA. Con un peso molecular de 370 kD, la enzima central (α₂, β y β′) cataliza la síntesis de RNA. Otra proteína, la subunidad ω, promueve el ensamblaje de la holoenzima RNAP. La unión transitoria del factor σ (sigma) a la enzima central le permite unirse tanto a la cadena molde correcta y al sitio adecuado para iniciar la transcripción. Se han identificado varios factores σ. Por ejemplo, en E. coli el factor σ⁷⁰ participa en la transcripción de la mayoría de los genes, mientras que σ³² y σ²⁸ promueven la transcripción de los genes de choque térmico y del gen de la flagelina, respectivamente. (Como sugiere su nombre, la flagelina es una proteína componente de los flagelos bacterianos.) El superíndice indica el peso molecular de la proteína en kilodaltones.

En la figura 18.33 se resume la transcripción de un gen de E. coli. El proceso consta de tres fases: iniciación, elongación y terminación. A continuación se describen con brevedad cada una de ellas.

El inicio de la transcripción comienza con la unión de la RNA polimerasa a un promotor, una secuencia reguladora de DNA que se localiza corriente arriba (es decir, hacia el extremo 5′ del polinucleótido) de un gen. Aunque los promotores procariotas son variables en tamaño (de 20 a 200 bp), hay dos secuencias cortas que son muy semejantes entre las diversas especies bacterianas y se ubican en posiciones situadas a unos 10 y 35 bp del sitio de inicio de la transcripción. En cada uno de estos sitios hay un conjunto de secuencias de bases, que se denominan secuencias de consenso. Una secuencia de consenso representa un promedio de varias secuencias estrechamente relacionadas pero no idénticas. Las secuencias que se presentan en la figura 18.34 reciben su nombre con base en el punto de comienzo de la transcripción, región −35 y región −10. (La región −10 también se denomina caja de Pribnow, por su descubridor.) La RNA polimerasa se desliza a lo largo del DNA hasta que alcanza una secuencia promotora. Los promotores varían ampliamente en cuanto a la eficiencia con la que se unen de modo productivo a la RNA polimerasa. Las velocidades de inicio de la transcripción pueden variar hasta en un factor de 1 000 entre promotores “fuertes” (localizados cerca de la secuencia de consenso) y promotores “débiles” (alejados de la secuencia de consenso). Mutaciones en una secuencia promotora suelen debilitar al promotor, pero también pueden convertir un promotor débil en uno fuerte. Ninguna de tales posibilidades es favorable.

RNAP y el proceso de transcripción procariota

La holoenzima RNAP (es decir, la holoenzima central y su factor σ asociado) se une a la región promotora. Luego, un segmento corto de DNA se desenrolla mientras las subunidades β′ y σ rompen los enlaces de hidrógeno en un tramo de 13 bp en la caja de Pribnow. Puesto que ahora están separadas las cadenas de DNA, se dice que el complejo enzima-promotor está “abierto”. La transcripción comienza con la unión del primer nucleósido trifosfatado (por lo general ATP o GTP) al complejo de la RNA polimerasa. Un ataque nucleófilo del grupo 3′-OH del primer nucleósido trifosfatado sobre el fosfato α de un segundo nucleósido, también con tres grupos fosfato (colocado del mismo modo por apareamiento de bases en el sitio adyacente), causa la formación del primer enlace fosfodiéster. (Debido a que los grupos fosfato de la primera molécula no participan en esta reacción, el extremo 5′ de los transcritos procariotas posee un grupo trifosfato.) La RNAP procede a catalizar la formación de enlaces fosfodiéster adicionales entre ribonucleótidos apareados con la cadena molde de DNA dentro del promotor. Para que la fase de inicio concluya de manera exitosa (p. ej., para que la holoenzima RNAP se mueva alejándose del promotor), la cadena creciente de RNA debe alcanzar una longitud aproximada de 10 nt. Suelen fallar varios intentos de “despeje del promotor” y los transcritos truncados se liberan y degradan. Cuando la secuencia transcrita alcanza una longitud de 10 nucleótidos, la conformación del complejo de RNA polimerasa cambia, se libera el factor σ y finaliza la fase de iniciación. Tan pronto como una RNA polimerasa se desplaza más allá del sitio promotor, puede entrar otra RNA polimerasa, unirse al sitio y comenzar otra ronda de síntesis de RNA.

Una vez que el factor σ se desprende y disminuye la afinidad del complejo de la RNA polimerasa por el sitio promotor, comienza la fase de elongación. La RNA polimerasa central se convierte en un complejo de transcripción activo uniéndose a varias proteínas accesorias. A medida que la síntesis de RNA procede en la dirección 5′ → 3′ figura 18.33, el DNA se desenrolla por delante de la burbuja de transcripción (el segmento de DNA desenrollado de forma transitoria, constituido por 12 a 14 bp, en el que se ha formado un híbrido RNA-DNA). En cualquier momento hay el equivalente a unos 30 bp de DNA dentro de la RNAP. El sitio activo del complejo enzimático yace entre las subunidades β y β′ figura 18.35. Cuando el dsDNA entra en la enzima y se separa en dos cadenas, la cadena molde pasa al sitio activo a través de un conducto. La otra cadena (no-molde) es desviada del sitio activo y viaja por su propio conducto. Cuando ambas cadenas emergen de sus conductos separados, vuelven a formar una doble hélice. Mientras tanto, el transcrito de RNA creciente sale por su propio conducto, formado en las subunidades β y β′. La acción de desenrollamiento de la RNA polimerasa crea superenrollamientos positivos por delante de la burbuja de transcripción y negativos por detrás de la burbuja, que deshacen las topoisomerasas. A medida que la burbuja se mueve hacia abajo en el gen, se dice que se mueve “corriente abajo” (hacia 3′). La incorporación de ribonucleótidos continúa hasta que se alcanza una señal de terminación.

En las bacterias existen dos tipos de terminación de transcripción: terminación intrínseca y terminación dependiente de ρ (rho). En la terminación intrínseca (también llamada terminación independiente de ρ), la síntesis de RNA termina porque se transcribe la secuencia de terminación, que consiste en una secuencia de repetición invertida seguida de seis a ocho adeninas (A) figura 18.36. Cuando se transcribe la secuencia de terminación, la repetición invertida forma una horquilla estable que hace que la RNA polimerasa se haga más lenta o se detenga. El transcrito de RNA se libera entonces, en virtud de que el híbrido RNA-DNA se disocia, debido a las débiles interacciones de pares de bases entre las A (adeninas), en una secuencia corta de poliadenilato [poli(A)] que sigue a la repetición invertida, y los U complementarios en el transcrito. En la terminación dependiente de ρ no se forman horquillas fuertes y la terminación requiere la ayuda de una proteína conocida como factor ρ, una helicasa dependiente de ATP figura 18.37. El factor ρ se une a una secuencia de reconocimiento específica en la cadena de mRNA naciente localizada hacia arriba del sitio de terminación. Entonces procede a desenrollar la hélice RNA-DNA para liberar el transcrito y separar la polimerasa.

En las células procariotas, el mRNA se traduce tan pronto como se expone un sitio de unión a ribosomas (traducción cotranscripcional). Sin embargo, las moléculas maduras de rRNA y de tRNA se producen a partir de transcritos más grandes mediante un procesamiento posterior a la transcripción. En la figura 18.38 se presentan las reacciones del procesamiento de los rRNA de E. coli. El genoma de esta bacteria contiene varios conjuntos de los genes de rRNA 16S, 23S y 5S. En el paso de procesamiento primario, el transcrito policistrónico 30S es metilado y fraccionado en varios segmentos más cortos por varias RNasas. Un mayor fraccionamiento realizado por otras RNasas produce rRNA maduros. También se producen unos pocos tRNA y los otros se fabrican a partir de transcritos primarios en una serie de reacciones de procesamiento en las que varias RNasas los recortan. En el último paso del procesamiento del tRNA, un gran número de bases se alteran mediante varias reacciones de modificación (p. ej., desaminación, metilación y reducción).

Transcripción en eucariotas

La transcripción del DNA en las células procariotas y en las eucariotas es semejante en numerosos aspectos. Por ejemplo, las RNA polimerasa bacterianas y sus contrapartes eucariotas tienen estructuras similares y utilizan un mecanismo de transcripción en común (p. ej., reconocimiento de promotor, transcritos truncados y despeje del promotor). Además, aunque en bacterias y en eucariotas los factores de iniciación sólo están lejanamente relacionados, realizan funciones similares. Sin embargo, estos dos tipos de organismos difieren en grado significativo en cuanto a los mecanismos reguladores que controlan la expresión génica. Uno de los ejemplos más prominentes de estas diferencias es el acceso limitado de la maquinaria de transcripción eucariota al DNA. La cromatina suele estar, al menos parcialmente, condensada. Sin embargo, para que ocurra la transcripción, el DNA debe estar suficientemente expuesto y accesible a la actividad de la RNA polimerasa. Para que el DNA sea permisivo a la transcripción, las colas de histona deben ser acetiladas por acetiltransferasas de histonas (HAT) y los contactos histona-DNA deben ser debilitados por complejos remodeladores de cromatina. Existen dos clases de complejos remodeladores de cromatina. Las proteínas SWI y SNF (en la forma de un complejo SWI/SNF) facilitan la liberación de la partícula de histona, mientras que las proteínas NURF liberan los contactos sólo lo suficiente para permitir que la partícula de histona se aparte del camino figura 18.39.

La transcripción del DNA eucariota no se conoce tan bien como el proceso procariota, principalmente por la complejidad de los genomas eucariotas. Sin embargo, se sabe que el proceso eucariota posee varias características propias.

ACTIVIDAD DE LA RNA POLIMERASA Los eucariotas poseen tres RNA polimerasa nucleares, cada una de las cuales se diferencia por la clase de RNA que sintetiza, la estructura de sus subunidades y las cantidades relativas. La polimerasa I de RNA (RNAP I), que se localiza dentro del nucléolo, transcribe los rRNA grandes (de 28S, 18S y 5.8S). Los precursores de los mRNA y la mayoría de los miRNA y los snRNA los transcribe la RNA polimerasa II (RNAP II), y la RNA polimerasa III (RNAP III) es la encargada de transcribir los precursores de los tRNA, de los rRNA 5S, de los snRNA U6 y de los snoRNA. Cada polimerasa posee dos subunidades grandes y varias (de ocho a 12) subunidades más pequeñas. Por ejemplo, las dos subunidades grandes de la RNAP II tienen pesos moleculares de 215 y 139 kD. El número de subunidades más pequeñas varía entre las especies; por ejemplo, las plantas poseen ocho, mientras que los vertebrados tienen seis. Algunas de las subunidades más pequeñas también están presentes en las otras dos polimerasas de RNA. A diferencia de la RNA polimerasa procariota, las enzimas eucariotas no pueden iniciar por sí mismas la transcripción. Antes de que pueda empezar la transcripción, deben unirse al promotor varios factores de transcripción.

PROMOTORES DE EUCARIOTAS Los promotores de los eucariotas son más complejos y variables que los de los procariotas. Cada uno consiste en un promotor central, la secuencia mínima de DNA requerida para que se una la RNA polimerasa e inicie la transcripción, y en secuencias adicionales proximales (cercanas) y distales (lejanas) que contribuyen a regular la transcripción.

Hay dos clases de promotores centrales en los eucariotas: enfocados y dispersos. Los promotores enfocados contienen un sitio de inicio de la transcripción (TSS) que consiste en un nucleótido único o un intervalo estrecho de nucleótidos y un conjunto variable de motivos de secuencia, conocidos como elementos promotores centrales (CPE), que permiten la unión de la maquinaria de transcripción. La caja TATA, identificada primero en levadura, es el CPE de eucariota más investigado. Encontrada sólo en cerca de 10% de los promotores centrales de los mamíferos, la caja TATA, rica en AT, es reconocida y unida a ella por la proteína de unión a TATA (TBP), una subunidad del factor de transcripción TFIID. Otros ejemplos de CPE que se encuentran entre los promotores centrales enfocados incluyen el Inr (iniciador), el BRE (elemento de reconocimiento de B), el MTE (motivo de 10 elementos) y el DPE (elemento promotor corriente abajo) figura 18.40. Los promotores centrales dispersos reciben ese nombre porque poseen muchos TSS (en general, un sitio de iniciación fuerte y varios débiles), que parecen distribuirse en forma aleatoria sobre una amplia región de 50 a 100 bp. Encontrados en vertebrados y especialmente en mamíferos, los promotores centrales dispersos tienden a ocurrir dentro de islas CpG y están asociados principalmente con genes de mantenimiento. (Los genes de mantenimiento codifican proteínas como enzimas glucolíticas y proteínas ribosómicas que son constantemente requeridas por las células para funciones esenciales.) En la actualidad se cree que las CpG facilitan la transcripción desestabilizando nucleosomas.

Los elementos promotores proximales son sitios de unión de factores de transcripción ubicados a unos 250 bp corriente arriba del TSS. Las cajas GC y CCAAT son ejemplos de elementos promotores proximales, las cuales favorecen la transcripción cuando se unen a ciertos factores de transcripción. Por ejemplo, las velocidades de transcripción aumentan cuando el factor de transcripción Sp1 se une a elementos de la caja GC corriente arriba de los genes que codifican proteínas tales como el receptor de insulina y la reductasa de HMG-CoA.

Las secuencias reguladoras distales son elementos de DNA independientes de la distancia, que pueden estar ubicados corriente arriba o corriente abajo, o dentro de los intrones de sus genes diana. Los elementos distales pueden aumentar (potenciadores) o disminuir (silenciadores) la transcripción. La transcripción se inhibe cuando una proteína represora se une a un elemento silenciador.

RNA POLIMERASA II Y EL PROCESO DE TRANSCRIPCIÓN EUCARIOTAS La RNA polimerasa II dirigida por DNA (RNAP II) es el tipo más investigado de RNA polimerasa en eucariotas, debido en gran medida a su función en la síntesis de mRNA. Las propiedades estructurales y funcionales de la RNAP II de la levadura fueron determinadas por Roger Kornberg figura 18.41, quien recibió en 2006 el premio Nobel de Química por este trabajo. En el ser humano, la enzima central contiene 12 subunidades. La mayor subunidad RBP1, forma parte del sitio activo de la enzima, el surco que permite unir DNA. RBP1 también contiene un dominio C-terminal (CTD) con 25 a 52 repeticiones de la héptada YSPTSPS (52 en el ser humano). La capacidad del CTD para actuar como sitio de anclaje para proteínas implicadas en diversas fases de la transcripción se regula mediante modificaciones covalentes reversibles de diversos residuos de héptadas (sobre todo, fosforilación de Ser2 y Ser5). La RNAP II se puede unir a promotores cuando las héptadas no están fosforiladas. Conforme avanza la transcripción, un patrón de residuos de Ser2 y Ser5 fosforilados creados por cinasas y fosfatasas permite reclutar enzimas específicas para procesamiento de RNA. Durante la transcripción, el patrón de fosforilación de serinas cambia de ser alto para Ser5P y bajo para Ser2P casi al principio, a la proporción inversa conforme avanza el proceso corriente abajo. Otros ejemplos de procesos afectados por patrones de fosforilación de la serina del dominio C-terminal incluyen la conversión de RNAP II a una enzima procesiva, la remodelación de histonas y la formación del casquete 5′ del mRNA con iniciación del corte empalme. Por el tiempo en el que la RNAP II empieza a sintetizar la cola poli A, los residuos de Ser5 no están fosforilados. La completa desfosforilación del CTD permite que la RNAP II se separe y sea reciclada en otra ronda de transcripción. Además de la enzima central figura 18.42, la maquinaria de transcripción de la RNAP II (3 000 kD) consta de un conjunto de seis factores de transcripción, denominados factores de transcripción generales, y un complejo proteínico de múltiples subunidades llamado mediador. Los factores de transcripción generales (GTF) TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF y TFIIH son el número mínimo de proteínas adicionales necesarias para la transcripción precisa. Facilitan la construcción del complejo de preiniciación (PIC) de la transcripción, el reconocimiento del promotor y el desenrollamiento del DNA dependiente de ATP. El mediador es un complejo proteínico necesario para la transcripción de casi todos los promotores de la RNAP II. El mediador de levadura es un complejo de 25 subunidades con una masa molecular de 1.4 MD. Su estructura tiene tres dominios: cabeza, parte media y cola figura 18.43. El mediador es en esencia una plataforma de integración de señales que actúa como adaptador entre la RNAP II y los factores de transcripción que están unidos a secuencias de DNA reguladoras positivas (potenciadores) y negativas (silenciadores), las cuales pueden estar a cierta distancia del gen o de los genes que modulan figura 18.44. Esta elaborada forma de regulación es principalmente responsable de los intrincados mecanismos de expresión génica en procesos eucariotas complejos, como el desarrollo y la diferenciación celulares.

La transcripción eucariota ocurre en varias fases: ensamblaje del PIC, iniciación, elongación y terminación. El ensamblaje del PIC figura 18.45 empieza uniendo a la caja de TATA la subunidad de la proteína de unión a TATA (TBP) perteneciente al TFIID, un proceso facilitado por el TFIIA. La TBP es una proteína con forma de silla de montar que distorsiona la estructura del DNA causando la separación de sus cadenas. La inserción de cuatro cadenas laterales de fenilalanina entre los pares de bases del surco menor causa que un segmento de DNA se combe. A medida que se comba el DNA, favorece su interacción con la TBP, aumentando la forma del doblez hasta aproximadamente 90°. La subsiguiente unión de los otros GTF seguida por el mediador produce el PIC transcripcionalmente activo. Se cataliza la formación de una burbuja de transcripción por medio de actividades de helicasa y de APTasa de las subunidades del TFIIH, que crean una tensión de superenrollamiento negativo. La burbuja se mantiene en la posición abierta mediante el TFIIF, que se une a la cadena codificante. Luego, la cadena no codificante entra al sitio activo de la RNAP II. Una vez que se sintetiza el primer enlace, continúa el proceso de transcripción hasta que el mRNA llega a cerca de 23 nt, punto en el que ocurre el despeje del promotor y empieza la fase de elongación con la liberación de los GIF TFIIE y TFIIH.

Una vez que se ha logrado el despeje del promotor, la holoenzima RNAP II se disocia del mediador y empieza la fase de elongación de la transcripción. El complejo RNAP II continúa el proceso de transcripción bastante más allá del extremo funcional del transcrito naciente hasta que se alcanza una secuencia de señal (5′-AAUAAA-3′) llamada secuencia de poli(A). Tan pronto como se transcribe dicha secuencia, varias proteínas ahora enlazadas al complejo RNAPII-CTD, se unen a ella y causan la terminación al escindir el transcrito unos 10 a 30 nt corriente abajo de la secuencia de poli(A). Una cadena de poliadenilato (100 a 250 residuos de adenilato), llamada cola de poli(A), es sintetizada por la polimerasa de poli(A) y luego unida de manera covalente a los extremos 3′ de los transcritos de mRNA.

PROCESAMIENTO DEL RNA Al contrario del mRNA procariota, que suele requerir poco o ningún procesamiento, los mRNA eucariotas son productos de un largo proceso después de la transcripción. Mediante el procesamiento, que comienza poco después del inicio de la transcripción, los transcritos nacientes de mRNA, llamados pre-mRNA, se unen a unos 20 tipos diferentes de proteínas nucleares formando partículas ribonucleoproteínicas (hnRNP). Poco después de comenzar la transcripción del transcrito primario, se produce una modificación del extremo 5′ que se denomina encasquetamiento. La estructura del casquete o caperuza figura 18.46, que consta de 7-metilguanosina ligada al mRNA mediante un enlace trifosfato, se sintetiza cuando el pre-mRNA tiene unos 30 nt de longitud. Protege el extremo 5′ contra las exonucleasas e impulsa la traducción del mRNA por los ribosomas.

Una de las características más notables del procesamiento del RNA eucariota es la eliminación de intrones de los transcritos de RNA. En este proceso, denominado corte y empalme del RNA, se cortan los intrones del transcrito primario, y los exones se unen entre sí para formar un producto funcional. La mayor parte de los esfuerzos de investigación se han centrado en el empalme de los pre-mRNA, que se describe enseguida. El número de intrones en los genes eucariotas que codifican proteínas varía ampliamente, desde uno en los genes que contienen intrones de eucariotas inferiores como las levaduras hasta docenas o incluso cientos en algunos genes de mamíferos. El gen de la distrofina humana, el más grande del ser humano, tiene 2.4 millones de pares de bases (Mb) de largo y contiene 79 exones. (¡La síntesis del transcrito primario de la distrofina toma 16 horas!) El mRNA empalmado de la distrofina (14 kb) codifica una proteína estructural (427 kD) con 3 600 aminoácidos que conecta el citoesqueleto de la célula muscular con la membrana plasmática y la matriz extracelular. Varias mutaciones en el gen de la distrofina causan el trastorno recesivo ligado al cromosoma X, denominado distrofia muscular de Duchenne, que se presenta como una degeneración muscular progresiva.

El empalme del RNA se realiza en un sitio muy cercano a la transcripción, en un complejo RNA-proteína de 4.8 megadaltones (MD) formado por snRNP llamado empalmosoma. El empalme ocurre en ciertas secuencias conservadas, de las cuales hay cuatro tipos. En los transcritos pre-mRNA nucleares de las eucariotas hay dos tipos de intrones: GU-AG y AU-AC. En los intrones de GU-AG, por ejemplo, 5′-GU-3′ y 5′-AG-3′ son la primera y la última secuencias de dinucleótidos, respectivamente. El suceso de empalme figura 18.47 ocurre en dos reacciones:

1. Un grupo 2′-OH de un nucleótido de adenosina ubicado en un intrón, denominado “sitio de ramificación”, ataca a un fosfato en el sitio de empalme 5′ mediante una reacción de transesterificación. El intrón forma un asa llamada lazo debido al recién creado enlace fosfodiéster 5′ → 2′.

2. El lazo se escinde y se degrada, y los dos exones se unen entre sí cuando el 3′-OH del exón localizado corriente arriba ataca un fosfato adyacente al lazo.

Al terminar un suceso de empalme, un complejo de unión de exón (EJC) se une en cada sitio de empalme a 20 nt corriente arriba de la junta exón-exón. Los EJC se mantienen asociados con los mRNA durante la exportación nuclear y la localización citoplásmica hasta la primera ronda de traducción por un ribosoma. Los EJC participan en la degradación sin sentido, un mecanismo de supervisión del mRNA que detecta señales de terminación prematura (codones de detención) que provocan la síntesis de polipéptidos truncados y posiblemente tóxicos. Originados por errores de corte y empalme de RNA (así como por mutaciones aleatorias y reordenación defectuosa de DNA), los codones prematuros de detención se distinguen de los codones normales de detención por su posición relativa a un EJC. A medida que el mRNA es traducido por un ribosoma, la detección de un codón de detención en dirección 5′ de un EJC (que indica que hay otro codón de detención corriente abajo) hace que el mecanismo de revisión inicie el proceso de degradación del mRNA.

La mayoría de los pre-mRNA de mamíferos, casi todos con múltiples intrones, es procesado por supraempalmosomas (21.1 MD), cada uno formado por cuatro empalmosomas activos figura 18.48. Se ha sugerido que el supraempalmosoma incrementa la velocidad y la eficiencia de empalme de los transcritos y permite la corrección de la escisión de intrones.

En última instancia, el orden interno más esencial de los seres vivos requiere la regulación precisa y oportuna de la expresión génica. Es, después de todo, la capacidad de activar y desactivar genes la que permite a las células responder de manera eficaz a los entornos cambiantes. En los organismos multicelulares, patrones complejos programados de expresión génica se encargan de la diferenciación celular y de la cooperación intercelular.

La regulación de genes, a juzgar por sus velocidades de transcripción, es el producto de una jerarquía compleja de elementos de control que coordina las actividades metabólicas de la célula. Algunos genes, que se denominan genes constitutivos o de mantenimiento, se transcriben de forma rutinaria porque codifican productos génicos necesarios para el funcionamiento celular. Además, en las células diferenciadas de los organismos multicelulares se producen ciertas proteínas especializadas que no pueden detectarse en otra parte (p. ej., la hemoglobina en los eritrocitos). Los genes que sólo se expresan en determinadas circunstancias se denominan inducibles. Por ejemplo, las enzimas que se requieren para el metabolismo de la lactosa en E. coli sólo se sintetizan cuando hay lactosa y está ausente la glucosa, que es la fuente de energía preferida de la bacteria.

En general, la expresión de los genes procariotas involucra la interacción de proteínas específicas con el DNA en la vecindad inmediata de un sitio de inicio de transcripción. Estas interacciones pueden tener ya sea un efecto positivo (p. ej., la transcripción se inicia o aumenta) o uno negativo (p. ej., la transcripción se bloquea). En una variación interesante, la inhibición de un regulador negativo (denominado represor) activa a los genes afectados. (La inhibición de un gen represor se denomina desrepresión.) La expresión de los genes eucariotas utiliza estos mecanismos y otros varios, entre ellos la reordenación y la amplificación de los genes, mecanismos epigenéticos y diversos controles complejos de la transcripción, del procesamiento del RNA y de la traducción. Además, la separación espacial de la transcripción y de la traducción, inherente en las células eucariotas, proporciona otra oportunidad para la regulación: el control del transporte del mRNA.

En esta sección se describen varios ejemplos de control de la expresión génica. La discusión de la expresión génica en procariotas se centra en los operones y los ribointerruptores. Un operón es un conjunto de genes regulados por el mismo operador y el mismo o los mismos promotores. El operador es una secuencia reguladora que se une a proteínas represoras o activadoras específicas que modulan la expresión génica. El operón lac de E. coli, que estudiaron inicialmente François Jacob y Jacques Monod en la década de 1950, es el ejemplo que se ha investigado más a fondo. Las bacterias también emplean un mecanismo de control basado en RNA llamado ribointerruptor, constituido por una secuencia específica no traducida (UTS) dentro del mRNA junto con el pequeño metabolito al que se une. La acción del ribointerruptor suele reprimir la expresión génica al dar fin a la transcripción, bloquear la traducción o causar la autodestrucción del mRNA. La expresión génica en eucariotas se comprende menos que en procariotas como E. coli, debido a que sus genomas son más grandes y a que sus mecanismos reguladores son más variados y complejos. Esta sección culmina con un breve panorama de la expresión génica inducida por factores de crecimiento.

Expresión génica en procariotas

El metabolismo altamente regulado de los procariotas, como E. coli, les permite vivir con recursos limitados y responder a un entorno cambiante. La síntesis oportuna de enzimas y de otros productos génicos sólo cuando son necesarios, combinada con la rápida destrucción de las moléculas de mRNA por medio de ribonucleasas (RNasas), evita el desperdicio de energía y de nutrimentos. Esta flexibilidad se hace posible al nivel genético, en donde el control de los genes inducibles a menudo está a cargo de grupos de genes estructurales y de genes reguladores ligados que se denominan operones. Las investigaciones de los operones, en especial del operón lac, han proporcionado un conocimiento sustancial sobre la forma en la que las condiciones ambientales pueden modificar la expresión de los genes. A continuación se describen el operón lac y varios tipos de ribointerruptores, descubiertos más recientemente.

OPERÓN LAC El operón lac figura 18.49 está formado por un elemento de control y genes estructurales que codifican las enzimas del metabolismo de la lactosa. El elemento de control contiene el sitio promotor, que se solapa con el sitio operador. Otro elemento regulador es el sitio CAP (que se describe más adelante), una secuencia de DNA de 16 bp ubicado corriente arriba del promotor. Los genes estructurales Z, Y y A especifican la estructura primaria de la β-galactosidasa, de la permeasa de lactosa y de la transacetilasa de tiogalactósido, respectivamente. La β-galactosidasa cataliza la hidrólisis de la lactosa, que produce los monosacáridos galactosa y glucosa, mientras que la permeasa de lactosa estimula el transporte de la lactosa al interior de la célula. La función de la transacetilasa de tiogalactosa no está clara, ya que el metabolismo de la lactosa procede normalmente sin ella. Un gen represor lacI, ubicado justo al lado del operón lac, codifica la proteína represora de lac, un tetrámero que se une con gran afinidad al sitio del operador. (Existen alrededor de 10 copias de la proteína represora de lac por célula.) La unión del represor de lac al operador impide la unión funcional de la RNA polimerasa al promotor figura 18.50.

Sin su inductor (alolactosa, un isómero β-1,6 de la lactosa), el operón lac permanece reprimido debido a que el represor de lac está unido al operador. Cuando hay disponibilidad de lactosa, unas pocas moléculas se convierten en alolactosa por medio de la β-galactosidasa. La alolactosa se une entonces al represor, cambiando su conformación y promoviendo la disociación del operador. Una vez que el represor inactivo se aleja del operador, comienza la transcripción de los genes estructurales. El operón lac permanece activo hasta que se consume la lactosa suministrada o hay disponibilidad de glucosa, la fuente preferida de energía. Entonces el represor regresa a su forma activa y vuelve a unirse al operador.

Si el operón lac es reprimido en ausencia de lactosa, ¿cuál es la fuente de alolactosa? La transcripción nunca se bloquea por completo, ya que ocasionalmente se desprende la proteína represora, lo que resulta en la síntesis de una baja cantidad de proteínas codificadas por el operón. Así, cuando la célula bacteriana encuentra lactosa, hay unas pocas moléculas de permeasa de lactosa disponibles para facilitar el transporte de lactosa al interior de la célula, donde es convertida en alolactosa.

La glucosa es la fuente preferida de carbono y de energía de E. coli. Si hay glucosa y lactosa disponibles, se metaboliza primero la glucosa. La síntesis de las enzimas del operón lac sólo se induce después de haberse consumido la glucosa. (Esto tiene sentido porque en general la glucosa está más disponible y tiene una función primordial en el metabolismo celular. ¿Por qué gastar energía en la síntesis de las enzimas que se requieren para metabolizar otros azúcares si se dispone también de glucosa?) El retraso en la activación del operón lac es mediado por una proteína activadora del catabolismo (CAP). La CAP es un homodímero alostérico que, cuando no hay glucosa, se une al cromosoma en un sitio ubicado corriente arriba del promotor de lac. La CAP es un indicador de concentración de glucosa porque se une al cAMP. La concentración de cAMP de la célula está relacionada en forma inversa con la concentración de glucosa porque el transporte de glucosa deprime la actividad de la ciclasa de adenilato. La unión del cAMP a la CAP, que sólo ocurre cuando no hay glucosa y las concentraciones de cAMP son elevadas, produce un cambio conformacional que permite a la proteína unirse al promotor de lac. La unión de la CAP impulsa la transcripción al aumentar la afinidad de la RNA polimerasa por el promotor de lac. En otras palabras, la CAP ejerce un control positivo o activador del metabolismo de la lactosa.

RIBOINTERRUPTORES Un ribointerruptor es un dominio sensor de metabolitos ubicado en la región 5′ no traducida de los mRNA. Más comúnmente encontrados en bacterias, los ribointerruptores vigilan las concentraciones celulares de metabolitos específicos. Los genes que contienen ribointerruptores en general codifican proteínas que intervienen en el transporte o en la síntesis de moléculas cuya producción es costosa, como TPP (pirofosfato de tiamina) o FMN (mononucleótido de flavina). Los ribointerruptores son dispositivos parecidos a apagadores de palanca que actúan como inhibidores por retroalimentación para impedir la costosa adquisición innecesaria de moléculas ya disponibles en concentraciones suficientes. Están formados por dos elementos estructurales: un aptámero, que se une directamente al metabolito, y una plataforma de expresión, el regulador de la expresión génica. Cuando el aptámero se une al metabolito, sufre un cambio estructural que a su vez modifica la estructura de la plataforma de expresión. El resultado más frecuente de este proceso es la inhibición de la transcripción y de la traducción.

Cuando el TPP se une a su aptámero (fig. 18.51a), el ribointerruptor convierte su estructura, que posee un sitio de inicio de traducción abierto, a otra en la que el sitio de inicio está secuestrado en un lazo en forma de horquilla, lo que bloquea con eficacia la traducción. El ribointerruptor de FMN que se ilustra en la figura 18.51b ocasiona la terminación prematura de la transcripción cuando se reconfigura para formar una horquilla terminadora que causa que la RNA polimerasa no tenga ya capacidad de unión. Otros ejemplos de ribointerruptores son los de la cobalamina (coenzima B₁₂), los de purinas y los de lisina. En casos raros, el ribointerruptor cataliza una reacción de autoescisión (fig. 18.51c) que da por resultado un decremento en el número de copias de mRNA.

Expresión génica en eucariotas

Los genomas de los eucariotas se regulan en una forma sustancialmente más elaborada que los de los procariotas, como lo confirma el siguiente ejemplo. Con excepción de los eritrocitos maduros, las células humanas contienen el mismo genoma. (Los eritrocitos pierden su núcleo a medida que se desarrollan a partir de células precursoras llamadas reticulocitos.) Con todo, cada uno de los más de 200 tipos celulares altamente diferenciados expresa un subconjunto único de genes que cambia en respuesta a mecanismos de señalización intercelular y/o a indicaciones ambientales. Las pruebas actuales indican que la expresión de los genes eucariotas, que se mide por las variaciones de las cantidades y actividades de los productos generados por los genes, se regula en los siguientes niveles: control genómico, control de la transcripción, procesamiento del RNA, edición del RNA, transporte del RNA y control de la traducción. Enseguida se describen con brevedad estos temas y luego se presenta un panorama general de la expresión génica inducida por transducción de señales.

CONTROL GENÓMICO Al parecer existen dos factores principales que actúan sobre el inicio de la transcripción en las eucariotas: la estructura de la cromatina y la formación del complejo de RNA polimerasa regulada por factor de transcripción. La expresión génica es influida por cambios en la organización estructural del genoma, p. ej., la remodelación de la cromatina inducida por la metilación del DNA y la modificación covalente de histonas. Gran parte de la regulación génica ocurre a través del control del inicio de la transcripción. El conjunto específico de proteínas que se ensamblan en una secuencia reguladora de DNA figura 18.52 es resultado de la estructura misma de la secuencia de DNA, así como de las proteínas reguladoras génicas, muchas de ellas factores de transcripción, que estén presentes en la célula.

Otros ejemplos de control genómico incluyen los reordenamientos de los genes y su amplificación. La diferenciación de determinadas células implica reordenamientos de los genes, como los reordenamientos de genes de los anticuerpos en los linfocitos B. También se cree que la transposición afecta a la regulación génica. Durante ciertas fases del desarrollo, el requerimiento de productos específicos de los genes puede ser tan grande que se amplifican de forma selectiva los genes que codifican su síntesis. La amplificación se produce a través de ciclos de replicación repetidos dentro de la región amplificada. Por ejemplo, los genes de rRNA de varios animales (principalmente anfibios, insectos y peces) se amplifican dentro de las células inmaduras de los huevos (que se denominan ovocitos).

PROCESAMIENTO DEL RNA Ya se han descrito varios tipos de reacciones de procesamiento de RNA en las eucariotas. Entre los más importantes están el empalme alternativo, la unión de diferentes combinaciones de exones para formar proteínas específicas para cada célula figura 18.53. La tropomiosina es una proteína hallada en una amplia variedad de células (p. ej., en las de los músculos esqueléticos, liso y cardiaco, en los fibroblastos y en el encéfalo) figura 18.54. El gen de la tropomiosina de los vertebrados consta de 13 a 15 exones. Cinco de éstos son comunes a todas las isoformas de la proteína, mientras que los restantes se usan de manera alternativa en diferentes mRNA de tropomiosina. Por ejemplo, el mRNA para tropomiosina de músculo estriado de la rata contiene los exones 3, 11 y 12, pero no los exones 2 o 13, mientras que la isoforma para músculo liso contiene los exones 2 y 3, pero no los exones 11 y 12. Esta variación explica en parte las diferencias en estructura y función de las fibras contráctiles en estos dos tipos musculares. El mRNA para tropomiosina del cerebro de rata carece de los exones 2, 7 y 11 a 13 y participa en el sistema citoesquelético de actina-miosina de estas células no contráctiles.

La selección de sitios alternativos para la poliadenilación también influye en la función del mRNA. Además de alterar los sitios de unión que tiene el mRNA para unirse a los miRNA, los cambios en los sitios de poliadenilación también afectan la longevidad del mRNA. En general, los mRNA con colas de poli(A) más largas son más estables, lo que incrementa sus oportunidades de traducción. Lo que es más importante, los cambios en sitio de poliadenilación pueden modificar las propiedades estructurales y funcionales de un mRNA. El mRNA que codifica la cadena pesada del anticuerpo IgM es un ejemplo bien investigado. Hay dos formas de IgM: el anticuerpo unido a la membrana y el anticuerpo secretado. Durante la fase temprana de diferenciación del linfocito B, la célula produce el IgM de membrana plasmática porque la poliadenilación del transcrito de la cadena pesada ocurre en un sitio ubicado corriente abajo de dos exones que codifican dominios de anclaje a la membrana. Más tarde, la célula sintetiza ambas versiones del IgM, la anclada a la membrana y la secretada. La cadena pesada del IgM secretado es una molécula truncada que carece del ancla de membrana porque el transcrito de mRNA se poliadenila corriente arriba de los exones de dominio de membrana. La selección del sitio de poliadenilación del mRNA de la cadena pesada depende de la expresión de la proteína CstF, que determina el sitio que se procesa. La CstF se une con mayor eficiencia al sitio de la forma anclada a la membrana del transcrito de la cadena pesada. En consecuencia, cuando la CstF está en concentraciones bajas (temprano en el desarrollo del linfocito B), sólo se produce la versión de la cadena pesada anclada a la membrana. Más adelante, cuando se eleva la concentración de CstF, la célula produce ambas versiones porque entonces la proteína se une tanto a los sitios de alta afinidad (forma anclada) como a los de baja afinidad (forma secretada).

Después de la transcripción, los cambios de bases se realizan mediante la edición del RNA. Las modificaciones en la secuencia de bases del mRNA pueden tener varias consecuencias. Por ejemplo, cuando ocurren en las UTR 5′ y 3′, pueden verse afectados, respectivamente, el inicio de la traducción y la estabilidad del RNA. Otras posibilidades incluyen la modificación de los sitios de empalme de intrones y los cambios en la secuencia de aminoácidos del producto polipeptídico. Entre los ejemplos mejor conocidos de edición de RNA están las conversiones C → U y A → I, donde I significa inosina. El mRNA del gen de la apolipoproteína B-100 codifica un polipéptido de 4 563 aminoácidos que es un componente de la lipoproteína de muy baja densidad (VLDL). Las células intestinales producen una versión más corta de esa molécula, a saber, la apolipoproteína B-48 (2 153 aminoácidos) que se incorpora a las partículas de quilomicrones que producen estas células. La citosina del codón CAA, que especifica glutamina, se convierte a un uracilo mediante la citidina desaminasa. El codón nuevo, UAA, es una señal de detención de la traducción; de ahí que se produzca un polipéptido truncado durante la traducción del mRNA editado.

Uno de los mejores ejemplos de transición A → I ocurre en algunas neuronas del encéfalo, donde un residuo específico de adenosina del mRNA para una subunidad del receptor de glutamato es desaminado por la ADAR (desaminasa de adenosina que actúa sobre el RNA). Cuando un ribosoma lee un mRNA editado, la base I se lee como G. En consecuencia, un residuo arginina (codón CGA) es sustituido por uno de glutamato (codón CAA), y el conducto iónico en el receptor se hace menos permeable al Ca²⁺. Se observó que los ratones transgénicos en los que se impidió la transición A → I desarrollaban una forma grave de epilepsia.

SILENCIAMIENTO POSTRANSCRIPCIONAL DE GENES El silenciamiento de genes, una forma de regulación postranscripcional de genes en los eucariotas superiores, utiliza RNA cortos de 22 nt llamados microRNA (miRNA). Los miRNA, que se descubrieron primero en el nematodo Caenorhabditis elegans, inhiben la traducción de los mRNA diana uniéndose a secuencias parcialmente complementarias en sus UTR 3′, aunque se han observado ejemplos de unión a UTR 5′ y a una región codificante. El primer miRNA investigado, el lin-4, regula una fase temprana del desarrollo de la larva del gusano. Al impedir la traducción de los mRNA de lin-14 y lin-28, el lin-4 facilita el progreso de las larvas en desarrollo desde una etapa temprana hasta una tardía. Los miRNA, cada uno de los cuales puede tener cientos de mRNA dianas, se han descubierto en organismos tan diversos como moscas de la fruta, ranas, arroz y maíz. Se estima que el ser humano tiene unos 1 000 miRNA, que se cree regulan cerca de un tercio de los genes humanos. Los defectos en la regulación por miRNA se han asociado con trastornos como cáncer (p. ej., leucemia) y cardiopatías.

El silenciamiento génico (fig.18.55) empieza con la síntesis catalizada por RNAP II de un precursor de ssRNA de 70 nt de largo denominado miRNA primario (pri-miRNA). Cada pri-miRNA, que puede tener una longitud de miles de nt, es una estructura tallo-lazo que se procesa en el núcleo en uno o varios miRNA mediante un complejo proteínico denominado microprocesador. El microprocesador, compuesto de pasha y una RNasa llamada drosha, escinde el pri-miRNA a 11 nt lejos de la base de cada estructura de horquilla para liberar el pre-miRNA. Tras ser exportado del núcleo, en un proceso impulsado por GTP, por medio de la proteína transportadora exportina-5, cada pre-miRNA es cortado por una RNasa denominada rebanador para producir un miRNA bicatenario. Una de las cadenas del miRNA bicatenario, llamada cadena líder, se incorpora en un complejo ribonucleoproteínico llamado RISC (complejo silenciador inducido por RNA). La otra cadena del miRNA (la cadena pasajera) se degrada. Una proteína RISC llamada argonauta acomoda el miRNA de modo que pueda unirse al mRNA diana y desactivarlo.

El silenciamiento génico mediado por miRNA utiliza componentes del RNA de interferencia, un proceso que originalmente se creyó estaba limitado a la protección contra virus y transposones. Las células utilizan pequeños ds-RNA llamados pequeños RNA de interferencia (si-RNA) para reconocer y luego degradar los mRNA diana. Los siRNA son productos de la escisión mediada por rebanador de las moléculas más grandes de RNA (p. ej., el genoma de un RNA viral). Una vez que el siRNA guía se incorpora al RISC, se une a su secuencia complementaria en el mRNA diana. Debido a que las secuencias coinciden con exactitud, la cortadora (slicer) (una actividad enzimática en un dominio de argonauta) corta al mRNA en pedazos.

TRANSPORTE DE RNA El transporte de mRNA hacia afuera del núcleo, un proceso altamente regulado, ocurre en tres fases: reacciones de procesamiento, anclaje y paso a través de complejos de poros nucleares (NPC) y liberación hacia el citoplasma. En la primera fase las moléculas de pre-mRNA son simultáneamente procesadas a mRNA y empacadas en complejos de ribonucleoproteína (mRNP). Las proteínas de la mRNP [p. ej., la proteína de unión al casquete, los EJC y la proteína de unión a poli(A)] reclutan factores de exportación que permiten dirigirlos hacia el NPC. Las proteínas de encasquetamiento y de empalme permiten la unión al TREX, un complejo de proteínas de exportación. Una vez que las mRNP se ligan mediante una subunidad TREX a Nxf1-Nxt1, un receptor heterodimérico de exportación nuclear, se mueven a través del NPC. Cuando un complejo de mRNP llega al citoplasma, la liberación de proteínas exportadoras impulsa el remodelado del complejo que a su vez dirige el transporte a su destino final en donde se realizará la traducción.

CONTROL DE LA TRADUCCIÓN Las células eucariotas pueden responder a diversos estímulos (p. ej., choque térmico, infecciones víricas y cambios de fase del ciclo celular) alterando de forma selectiva la síntesis de proteínas. Se ha observado que la modificación covalente de diversos factores de traducción (proteínas no ribosómicas que ayudan en el proceso de traducción) altera la tasa global de síntesis de proteínas y/o potencia la traducción de mRNA específicos. Por ejemplo, cuando las concentraciones celulares de hierro son bajas, una proteína represora se une a los mRNA que codifican la proteína de almacenamiento de hierro, ferritina. Cuando la concentración de hierro se eleva lo suficiente, la unión del hierro a la proteína represora impulsa un cambio de conformación que la hace disociarse del mRNA. Después de esto, el mRNA de la ferritina, puede ser traducido. Entonces, ya puede ser traducida la ferritina.

TRANSDUCCIÓN DE SEÑALES Y EXPRESIÓN GÉNICA Todas las células responden a señales de su entorno y lo hacen, en parte, modificando sus patrones de expresión génica. Los cambios de expresión génica inducidos por transducción de señales son iniciados por la unión de un ligando a un receptor celular de superficie o a un receptor intracelular. Los mecanismos por los cuales las moléculas señalizadoras activan o desactivan determinados genes consisten en una serie intrincada de reacciones y cambios de conformación de proteínas que transmiten información desde el entorno de la célula a secuencias específicas del DNA en el núcleo. Considerando los enormes esfuerzos dedicados a la investigación del cáncer, los ejemplos mejor comprendidos de estas vías de transducción de señales son los que afectan la división celular.

A diferencia de los organismos unicelulares en los que el crecimiento y la división celulares están gobernados en gran medida por la disponibilidad de nutrientes, la proliferación de las células en los organismos multicelulares está regulada por una elaborada red intercelular de moléculas de señalización que estimulan o inhiben el crecimiento. La investigación sobre la proliferación celular ha revelado varias características que complican los mecanismos intracelulares de transducción de señales. Los mecanismos por los cuales las moléculas de señalización modifican la expresión de genes requieren en muchos casos la activación simultánea de diversas vías. Dependiendo de las circunstancias, la activación de varios tipos de receptores puede conducir a las mismas respuestas o a respuestas superpuestas.

En el ciclo celular eucariota, las células avanzan repetidamente a través de cada una de las cuatro fases (M, G₁, S y G₂, véase la figura 18.14). Hay puntos de control dentro de las fases G₁ (en las levaduras se denomina START), G₂ y M. Se impide que la célula entre en la fase siguiente hasta que las condiciones sean óptimas (p. ej., suficiente crecimiento celular en G₂ o alineamiento de los cromosomas en M). Las actividades fijas y rítmicas que se observan en la división celular son reguladas de forma que cada fase se complete antes de comenzar la siguiente. La progresión se logra alternando la síntesis y la degradación de las ciclinas, un grupo de proteínas reguladoras que se unen a las proteínas cinasas dependientes de ciclinas (Cdk) y las activan. Las Cdk fosforilan diversas proteínas que controlan el paso de las células a través de puntos de control en el ciclo celular.

La regulación de la división celular utiliza controles positivos y negativos. El control positivo se ejerce en gran medida mediante factores de crecimiento que se unen a receptores celulares especializados. La iniciación de la división celular requiere típicamente la unión a varios de esos factores. La proliferación celular se inhibe por productos proteínicos de genes supresores de tumores. Entre los ejemplos mejor conocidos de estos genes se encuentran el Rb (llamado así por el papel que desempeña la pérdida de la función del gen Rb en el retinoblastoma, un cáncer ocular de la infancia) y el gen p53 (una chaperona de ciclinas que detiene la progresión del ciclo celular). La detención del ciclo celular se prolonga cuando se ha producido una determinada cantidad de daño del DNA, como en la sobreexposición a la radiación. Si los mecanismos de reparación del DNA son incompletos, un mecanismo complejo que implica al p53 conduce a la muerte celular programada, o apoptosis (fig. 2.21).

Se cree que los efectos positivos que ejercen los factores de crecimiento incluyen la expresión génica que específicamente supera las inhibiciones en los puntos de control del ciclo celular, en particular el punto de control G₁. La unión de los factores de crecimiento a sus receptores celulares de superficie, inicia una cascada de reacciones que induce dos clases de genes: los genes de respuesta temprana y los de respuesta tardía.

Genes de respuesta temprana Estos genes, que suelen codificar factores de transcripción, se activan con rapidez, por lo general en 15 min. Entre los genes de respuesta temprana mejor caracterizados están los protooncogenes jun, fos y myc. Los protooncogenes son genes normales que, mutados, pueden promover carcinogénesis. Cada una de las familias de protooncogenes jun y fos codifica un conjunto de factores de transcripción que contiene dominios de cremallera de leucina. Las proteínas Jun y Fos forman dímeros que pueden unirse al DNA. Entre los mejor caracterizados está un heterodímero Jun-Fos, conocido como AP-1, que se forma por medio de una interacción de cremallera de leucina. El Myc es miembro de una clase grande de factores de transcripción que poseen el motivo básico de unión DNA-proteína hélice-lazo-hélice-cremallera de leucina (bHLHZip). Los miembros de la familia proteínica Myc forman homodímeros y heterodímeros consigo mismos y con miembros de determinadas familias de factores de transcripción. Cuando Myc forma un heterodímero con una proteína llamada Max, se ve afectada la expresión de un gran número de genes. Los productos de algunos de los genes diana Myc/Max tienen un efecto estimulador sobre el ciclo celular.

Genes de respuesta tardía Estos genes son inducidos por las actividades de los factores de transcripción y de otras proteínas producidas o activadas durante la fase de respuesta temprana. Entre los productos de los genes de respuesta tardía están las Cdk, las ciclinas y otros componentes necesarios para la división celular.

Como ya se ha expuesto, muchos factores de crecimiento se unen a receptores de tirosincinasa y algunos de éstos se acoplan a la generación de DAG (diacilglicerol) y de IP₃ (trifosfato de inositol) a través de mecanismos semejantes a la vía de la proteína G (fig. 16.7). El factor de crecimiento epidérmico (EGF) es un factor de crecimiento de este tipo, y en la figura 18.56 se presenta su función en la activación del factor de transcripción AP-1. El oncogén ras, que se aisló primero de sarcomas de rata, sirve en su forma de protooncogén como el componente de proteína G de este sistema. El ras se activa cuando se une a SOS/GRB2, un complejo proteínico que se ha unido al dominio tirosincinasa del receptor del EGF. SOS es un tipo de factores de intercambio de nucleótidos de guanina (GEF) que causa que ras libere GDP y una GTP cuando éste, a su vez, está unido a la proteína llamada GRB2. El ras se inactiva cuando el GTP se hidroliza, una reacción catalizada por las proteínas activadoras de GTPasa, o GAP.

La fosfolipasa Cγ (PLCγ) se activa también cuando se une al receptor del EGF. Como su contraparte en los receptores ligados a la proteína G, la PLCγ activa hidroliza el PIP₂ para formar DAG e IP₃. El DAG activa la proteína cinasa C (PKC), la enzima que a su vez activa diversas proteínas que participan en el crecimiento y en la proliferación celulares.

Se inducen cascadas de fosforilación por la activación de ras y el aumento de las concentraciones de DAG y de IP₃ en la célula tras la unión del EGF. Una de las enzimas clave activadas en la cascada de fosforilación es la MAPKK (cinasa de proteína cinasa activada por mitógenos). La MAPKK activa fosforila después una tirosina y una treonina de la cinasa de MAP (MAPK). (Esta reacción poco habitual parece asegurar que la cinasa de MAP sólo sea activada por la MAPKK.) La cinasa de MAP activa (una cinasa serina/treonina) fosforila a continuación diversas proteínas celulares. Entre éstas están Jun, Fos y Myc. Las proteínas Jun y Fos fosforiladas se combinan a continuación para formar el AP-1, que promueve la transcripción de diversos genes de respuesta tardía que promueven a su vez la división celular.

Resumen del capítulo

1. Los seres vivos deben poseer mecanismos eficientes para una síntesis rápida y exacta del DNA. La replicación del DNA ocurre mediante un mecanismo semiconservador; esto es, cada una de las dos cadenas originales se utiliza como plantilla (molde) para sintetizar una cadena nueva. Las actividades enzimáticas necesarias para la replicación del DNA se utilizan en el desenrollamiento de éste, en la síntesis de cebadores y de polinucleótidos, en el control del superenrollamiento y en el ligamiento. Aunque las características básicas de la replicación del DNA son similares en procariotas y en eucariotas, hay diferencias significativas (p. ej., el tiempo y la velocidad de replicación, la cantidad de orígenes de replicación, el tamaño de los fragmentos de Okazaki y la estructura de la maquinaria de replicación).

2. Existen varios tipos de mecanismos de reparación del DNA. Entre ellos están las reparaciones por fotorreactivación, por escisión de bases y por escisión de nucleótidos, por rompimiento de la doble cadena y por recombinación.

3. La recombinación genética, un proceso en el que se intercambian las secuencias de DNA entre diferentes moléculas de DNA, ocurre en dos formas. En la recombinación general, el intercambio se produce entre secuencias de cromosomas homólogos. En la recombinación específica de sitio, el intercambio de secuencias sólo requiere secuencias homólogas cortas. Las interacciones DNA-proteína son las principales causales del intercambio de secuencias que no tienen mucha homología.

4. La transposición, el movimiento de elementos genéticos (transposones) de un lugar a otro del genoma, pueden causar cambios genéticos como inserciones, deleciones y transposiciones. El movimiento de los retrotransposones, que se encuentra en grandes cantidades en los genomas eucariotas, puede causar enfermedades o crear oportunidades para la diversidad genética.

5. La síntesis del RNA, conocida como transcripción del DNA, requiere varias proteínas. El inicio de la transcripción involucra la unión de una RNA polimerasa a una secuencia específica de DNA que se denomina promotor. La regulación de la transcripción es muy diferente en procariotas y en eucariotas. Algunos ejemplos de procesos de transcripción eucariota que no se observan en los procariotas incluyen características del procesamiento del RNA como el encasquetamiento, la síntesis de colas de poli(A) y el empalme del RNA.

6. En la regulación de la expresión génica en procariotas participan unidades reguladoras basadas en proteínas llamadas operones y estructuras basadas en RNA llamadas ribointerruptores. Los eucariotas tienen una amplia variedad de mecanismos que controlan la expresión génica. Algunos ejemplos prominentes son la metilación del DNA, la modificación covalente de las histonas y la remodelación de la cromatina, así como las reacciones de procesamiento del RNA como el empalme alternativo, la edición del RNA, el transporte del RNA, el silenciamiento postranscripcional de genes y los controles de la traducción.

Lecturas recomendadas

Palabras clave

• anotación

• apoptosis

• biblioteca de cDNA

• bioinformática

• cadena codificadora

• cargador de pinza

• cebador

• clonación aleatoria

• complejo de preiniciación

• complejo de replicación de la preiniciación

• complejo del origen de replicación

• complejo MCM

• complejos de remodelación de cromatina

• conjugación

• contig

• cósmido

• cromosoma artificial bacteriano

• cromosoma artificial de levadura

• DNA ligasa

• edición de RNA

• electroporación

• elemento de inserción

• elemento transponible

• empalme de RNA

• empalmosoma

• exonucleasa

• fábrica de replicación

• factor de autorización para la replicación

• factor de replicación C

• factor intercambiador de nucleótido de guanina

• factores de unión a repeticiones teloméricas

• fragmento de Okazaki

• gen constitutivo

• gen de supresión tumoral

• gen marcador

• genómica

• genómica funcional

• glucosilasa de DNA

• helicasa

• horquilla de replicación

• mediador

• micromatriz de DNA

• migración cromosómica

• modelo de hibridación de cadenas dependiente de síntesis

• modelo de Meselson-Radding

• modelo de reparación de roturas de doble cadena

• oncogén

• operador

• operón

• palíndromo

• primasa

• primosoma

• procesividad

• promotor

• promotor tumoral

• proteína activadora de GTPasa

• proteína de replicación A

• proteína de unión a extremo de telómero

• protooncogén

• reacción en cadena de la polimerasa

• recombinación

• recombinación específica de sitio

• recombinación general

• reparación acoplada a transcripción

• reparación de errores de apareamiento

• reparación fotoinducida

• reparación por escisión de bases

• reparación por escisión de nucleótidos

• reparación por fotorreactivación

• repetición invertida

• replicación

• replicación semiconservadora

• replicón

• replisoma

• retroelemento

• retroposón

• ribointerruptor

• RNA de interferencia

• secuencia de consenso

• silenciamiento de genes

• sitio apirimidínico

• sitio apurínico

• supraempalmosoma

• técnica de hibridación de colonias

• tecnología de DNA recombinante

• telomerasa

• terminación dependiente de ρ

• terminación independiente de ρ

• terminación intrínseca

• transducción

• transfección

• transformación

• transposición

• transposón

• transposón compuesto

• vector

Estas preguntas están diseñadas para poner a prueba los conocimientos del lector sobre los conceptos clave expuestos en este capítulo, antes de pasar al siguiente.

1. Defina los siguientes términos:

   1. replicón

   2. fragmento de Okazaki

   3. región ter

   4. proteína tus

   5. complejo de preiniciación

2. Defina los siguientes términos:

   1. ORC

   2. factores de autorización

   3. RPA

   4. TEBP

   5. TRF

3. Defina los siguientes términos:

   1. RFC

   2. glucosilasa de DNA

   3. sitio apurínico

   4. sitio apirimidínico

   5. reparación por mal apareamiento

4. Defina los siguientes términos:

   1. transposición

   2. elemento transponible

   3. transformación bacteriana

   4. transducción

   5. conjugación

5. Defina los siguientes términos:

   1. transposición no replicativa

   2. transposición replicativa

   3. transposón compuesto

   4. retrotransposón

   5. elemento de inserción

6. Defina los siguientes términos:

   1. transfección

   2. cósmido

   3. electroporación

   4. animal transgénico

   5. técnica de hibridización de colonias

7. Defina los siguientes términos:

   1. promotor

   2. secuencia de consenso

   3. operón

   4. complejo de remodelación de cromatina

   5. factores de transcripción general

8. Defina los siguientes términos:

   1. empalme de RNA

   2. empalmosoma

   3. operador

   4. ribointerruptor

   5. operón lac

9. ¿Cómo impulsa el superenrollamiento negativo la iniciación de la replicación?

10. ¿Cómo apoya el experimento de Meselson-Sthal el modelo semiconservador de la replicación del DNA?

11. Mencione y describa los pasos de la replicación procariota del DNA. ¿En qué se diferencia este proceso de la replicación eucariota del DNA?

12. Indique la etapa de replicación del DNA en la que es activa cada una de las enzimas siguientes:

    1. helicasa

    2. primasa

    3. polimerasas de DNA

    4. ligasa

    5. topoisomerasa

    6. DNA girasa

13. El DNA se polimeriza en dirección 5′ → 3′. Demuestre con la incorporación de tres nucleótidos en una cadena individual de DNA cómo se deduce la direccionalidad 5′ → 3′.

14. Las mutaciones son producidas por fenómenos físicos y químicos. Indique el tipo de mutación que puede producir cada una de las reacciones o moléculas siguientes:

    1. ROS

    2. agentes intercalantes

    3. un agente alquilante pequeño

    4. un agente alquilante grande

    5. ácido nitroso

15. ¿Cómo pueden producir mutaciones los virus?

16. Aunque se requiere la variación genética para que las especies se adapten a los cambios del entorno, la mayoría de las alteraciones genéticas son perjudiciales. ¿Por qué las mutaciones genéticas son con poca frecuencia beneficiosas?

17. La recombinación general sucede en las bacterias, donde participa en varios tipos de transferencia de DNA entre los microorganismos. ¿Cuáles son estos tipos de transferencia y por medio de qué mecanismos se producen?

18. Dentro de las células la citosina se convierte lentamente en uracilo. ¿Qué tipo de mutación produciría esto en las moléculas de DNA? ¿Qué impacto tendría la misma modificación si ocurriera en el RNA o en productos génicos?

19. Se ha encontrado una correlación entre las distintas especies entre su longevidad y la eficacia de los sistemas de reparación del DNA. Sugiera una razón para este hallazgo.

20. ¿Cuáles son las semejanzas y cuáles las diferencias entre la replicación celular del DNA y la PCR?

21. Descríbase la finalidad de los genes marcadores en la tecnología del DNA recombinante.

22. Defina y describa las funciones de los siguientes elementos en la transcripción:

    1. factores de transcripción

    2. RNA polimerasa

    3. promotor

    4. factor σ

    5. potenciador

    6. caja TATA

23. Enlístense los pasos del procesamiento de un típico precursor de mRNA eucariota que lo preparan para su función.

24. Describa las ventajas y las desventajas para los organismos que tienen dispuestos sus genes en operones.

25. Determine la magnitud de amplificación que puede lograrse con la PCR durante cinco ciclos a partir de una sola molécula de DNA.

26. Muchos genes elaboran productos diferentes según el tipo de célula que expresa el gen. ¿Cómo ocurre este fenómeno?

27. Las moléculas de RNA son más reactivas que el DNA. ¿Por qué?

28. ¿Cómo ocurre la recombinación específica de sitio?

El objetivo de estas preguntas es reforzar la comprensión de todos los conceptos clave expuestos en el libro hasta el momento. Es factible que no tengan una única respuesta correcta.

1. En el experimento de Meselson-Stahl, ¿por qué se eligió un isótopo de nitrógeno en lugar de un isótopo de carbono?

2. En los eucariotas la velocidad de replicación del DNA es de 50 nucleótidos por segundo. ¿Cuánto tarda la replicación de un cromosoma de 150 millones de pares de bases? Si los cromosomas de los eucariotas se replicaran como los de los procariotas, la replicación del genoma tardaría varios meses. De hecho, la replicación eucariota sólo tarda algunas horas. ¿Cómo consiguen los eucariotas esta elevada velocidad?

3. Parece existir material genético insuficiente para dirigir todas las actividades de ciertos tipos de células eucariotas, como por ejemplo los linfocitos T. ¿Cómo es que ayudan a resolver este problema la recombinación genética, el empalme de genes y el empalme alternativo de RNA?

4. El gas mostaza es una sustancia extremadamente tóxica que daña gravemente el tejido pulmonar cuando se inhala en grandes cantidades. En dosis pequeñas, el gas mostaza es un mutágeno y un carcinógeno. Considerando que el gas mostaza es un agente alquilante bifuncional, ¿cómo muta los genes e influye en la replicación del DNA?

5. Las bases pirimídicas adyacentes en el DNA forman dímeros con gran eficiencia tras su exposición a la luz UV. Si estos dímeros no se reparan, puede producirse cáncer de piel. La melanina es un filtro solar natural que producen los melanocitos, una clase de célula de la piel, cuando la piel se expone a la luz solar. Las personas que pasan largos periodos durante muchos años bronceando su piel finalmente adquieren una piel gruesa y arrugada. Estas personas tienen también un gran riesgo de padecer cáncer cutáneo. Explíquese, en términos generales, por qué están relacionados estos fenómenos.

6. Debido a uso indiscriminado de antibióticos, al debilitamiento de la vigilancia gubernamental de las enfermedades infecciosas, o a ambas situaciones, varias patologías que se pensaba no eran ya una amenaza para el ser humano (p. ej., la neumonía y la tuberculosis) rápidamente se están volviendo inmanejables. En varios casos, se han detectado los denominados súper-microbios (microorganismos que son resistentes a casi todos los antibióticos conocidos) ¿Cómo surgió esta circunstancia? ¿Qué sucederá en el futuro si continúa este proceso?

7. El retinoblastoma es un cáncer poco frecuente en el que aparecen tumores en la retina del ojo. Los tumores surgen debido a la pérdida del gen Rb, que codifica a un supresor tumoral. El retinoblastoma hereditario normalmente se produce en niños que heredan una sola copia funcional de dicho gen. ¿Por qué el retinoblastoma no hereditario se produce usualmente en épocas posteriores de la vida?

8. Explique qué diferencia hay entre los efectos potenciales que tienen los errores producidos durante la replicación de los que tienen lugar durante la transcripción sobre un organismo.

9. Explique cómo una actividad transcriptasa inversa dentro de una célula puede amplificar los genes.

10. Alguna vez se pensó que la maquinaria de la DNA polimerasa se movía a lo largo del DNA de manera análoga a un tren sobre sus vías. La evidencia actual indica, en cambio, que la maquinaria de polimerización es estacionaria, y las cadenas de DNA son empujadas a través del complejo. ¿Qué ventajas tiene este mecanismo estacionario?

11. Describa las características de un ribointerruptor que es activado por concentraciones excesivas de metabolitos.

12. El DNA es el depósito celular de la información genética y las proteínas se sintetizan a partir de transcritos de RNA. ¿Por qué las células no omiten simplemente el paso de la transcripción y utilizan el DNA directamente en la síntesis de proteínas?

18.1

En resumen, la duplicación del DNA procariota consiste en el desenrollamiento del DNA, la formación del iniciador de RNA, la síntesis de DNA catalizada por polimerasa de DNA y la unión de los fragmentos de Okazaki por medio de la ligasa de DNA. La duplicación del DNA procariota se diferencia del proceso eucariota en que la primera es más rápida, los fragmentos de Okazaki son más largos y en general hay un solo origen de replicación por cromosoma (los eucariotas tienen muchos por cromosoma).

18.2

En la reparación por escisión, las secuencias cortas dañadas se escinden (p. ej., los dímeros de timina) y se sustituyen con las secuencias correctas. Luego de que una endonucleasa elimina la secuencia dañada de cadena individual, una actividad de DNA polimerasa sintetiza una secuencia de sustitución utilizando como molde la cadena que no está dañada. En la reparación por fotorreactivación, una enzima fotorreactivadora utiliza energía lumínica para reparar los dímeros de pirimidina. En la reparación por recombinación se eliminan las secuencias dañadas. La reparación implica el intercambio de un segmento adecuado de la molécula homóloga de DNA.

18.3

Cuando se utilizan grandes cantidades de antibióticos, las células bacterianas que poseen genes de resistencia (adquiridos mediante mutaciones espontáneas o a través de mecanismos de transferencia de DNA entre microorganismos como la conjugación, la transducción o la transformación) sobreviven o prosperan. Debido a que el uso de antibióticos actúa como una presión selectiva, los organismos resistentes (alguna vez constituyentes menores de la población microbiana) se hacen las células dominantes en su nicho ecológico.

18.4

Al parecer, la mayoría de las duplicaciones génicas son consecuencia de accidentes durante la recombinación genética. Entre los ejemplos de causas posibles se encuentran el entrecruzamiento desigual durante las sinapsis y la transposición. Tras duplicarse un gen, mutaciones aleatorias y procesos de recombinación genética pueden introducir variaciones.

18.5

Se ha demostrado que el fitocromo media numerosos procesos vegetales inducidos por luz, por lo que parece razonable suponer que lo hace en parte interactuando con elementos de respuesta a la luz (LRE) de los genomas de las células vegetales. Se cree que el fitocromo influye en la expresión génica, uniéndose, solo o como parte de un complejo, a diversos LRE cuando la luz activa su cromóforo.

PREGUNTAS DE REVISIÓN

1

1. replicón: una unidad del genoma que contiene un origen para iniciar la replicación

2. fragmento de Okazaki: cualquiera de una serie de segmentos de desoxirribonucleótido que se forman durante las replicaciones discontinuas de una cadena de DNA mientras la otra se replica de manera continua

3. región ter: un segmento del cromosoma de E. coli que contiene secuencias para terminación de la replicación del DNA

4. proteína tus: una proteína que al unirse con una secuencia ter facilita la terminación de la replicación del DNA

5. complejo de preinicio: el complejo de replicación eucariota (preRC) cuya formación es el primer paso importante en la replicación del DNA

4

1. transposición: el movimiento de una secuencia de DNA de un sitio del genoma a otro

2. elemento transponible: una secuencia de DNA que se corta por sí misma y se inserta en otro sitio

3. transformación bacteriana: un proceso en el que fragmentos de DNA entran a una célula bacteriana y se introducen en el genoma bacteriano

4. transducción: la transferencia de segmentos de DNA entre bacterias y bacteriófagos

5. conjugación: apareamiento sexual no convencional entre células bacterianas; una célula donadora transfiere un segmento de DNA a una célula receptora mediante un pelo especializado

10

El resultado de los experimentos de Meselson-Stahl, la presencia de una base única de DNA a la mitad entre las bandas de referencia ¹⁴N y ¹⁵N en los tubos CsCl, indicó que el producto de una sola ronda de replicación era una molécula híbrida con una cadena ¹⁵N original y una cadena ¹⁴N nueva. Cualquier forma de replicación de DNA distinta al mecanismo semiconservador habría generado múltiples bandas.

13

La incorporación de un nucleótido en una cadena de DNA:

17

En las bacterias, la recombinación general participa en la transformación (el DNA de una célula entra a otra célula y se integra luego en el genoma de la célula receptora), transducción (un bacteriófago sintetizado en una célula bacteriana transporta un fragmento de DNA de manera inadvertida a una célula bacteriana que infecta el virus) y conjugación (apareamiento sexual no convencional en el que el DNA de una célula entra a una segunda célula a través de un pelo sexual).

19

Como el DNA está expuesto todo el tiempo a procesos que lo alteran, su integridad estructural depende mucho de mecanismos de reparación eficientes. La duración de la vida de un organismo depende de la salud de sus células constituyentes, que a su vez depende de la expresión oportuna y exacta de la información genética. Por consiguiente, la capacidad de los organismos de una especie para mantener la integridad de las moléculas de DNA es un factor importante para determinar la duración de la vida.

22

1. Los factores de transcripción son proteínas que regulan o inician la síntesis de RNA mediante la unión con secuencias de DNA específicas llamadas elementos de respuesta.

2. La RNA polimerasa es una enzima que transcribe una secuencia de DNA en un producto de RNA.

3. Un promotor es una secuencia de DNA inmediata anterior a un gen que es reconocida por la RNA polimerasa y señala el punto de inicio y la dirección de la transcripción.

4. Un factor sigma es una proteína bacteriana que facilita la unión de la enzima central de la RNA polimerasa con el sitio de inicio durante la transcripción.

5. Un intensificador es una secuencia de DNA reguladora que cuando se une con un factor de transcripción apropiado aumenta la probabilidad de que los genes cercanos se transcriban.

6. La caja TATA es el ejemplo mejor investigado de un elemento promotor central eucariótico.

25

La amplificación de una sola molécula de DNA durante 5 ciclos produce 25 o 32 moléculas.

PREGUNTAS DE ANÁLISIS

31

Los procesos que cambian la secuencia de DNA, como la recombinación genética, el corte y empalme génico y el corte y empalme alternativo de RNA, a veces permiten a las células modificar la expresión génica y expandir su repertorio de proteínas. El ejemplo mejor conocido es la producción de anticuerpos en los linfocitos. El reordenamiento de varias elecciones posibles para cada uno de varios segmentos de genes de anticuerpos mediante la recombinación específica de sitio da por resultado la generación de una cantidad muy grande de anticuerpos distintos.

33

El proceso de bronceado que ocurre como respuesta a la exposición excesiva al sol, se inicia por el daño al DNA. El daño al DNA en las células cutáneas produce un proceso acelerado de envejecimiento que se manifiesta por piel engrosada y arrugada. El daño al DNA también desactiva genes supresores tumorales y causa mutaciones en protooncogenes, lo que incrementa el riesgo de cáncer cutáneo.

35

Debido a que el gen Rb codifica un supresor tumoral, el retinoblastoma sólo se produce cuando se han dañado o perdido ambas copias. En general se requiere mucho tiempo para que las mutaciones aleatorias produzcan este suceso. En el retinoblastoma hereditario, en el que una persona afectada sólo posee un gen Rb funcional, el tiempo necesario para que una mutación aleatoria desactive el segundo gen Rb es mucho menor que el que se requiere para la desactivación de ambos genes que produce la versión no hereditaria de la enfermedad.

40

Las “copias” de RNA del DNA pueden modificarse para generar diversidad proteínica sin cambiar la secuencia del molde de DNA. Además, las moléculas de RNA pueden usarse varias veces y después ser eliminadas sin dañar el DNA original. Si este último se usara de manera directa, la molécula patrón podría dañarse o ser destruida. Por otro lado, las moléculas de RNA pueden salir con facilidad del nucleoide o del núcleo para viajar a otras partes de la célula.