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A finales del siglo xix se desencadenó un debate acerca de si el proceso de formación del etanol requería o no de la presencia de células de levadura intactas. En un lado del debate estaba el químico orgánico Justus von Liebig, quien argumentaba que las reacciones de fermentación que se producían en el alcohol no eran distintas a aquellos tipos de reacciones orgánicas que había estado estudiando en el tubo de ensayo. En el otro lado estaba el biólogo Louis Pasteur, quien argumentaba que el proceso de fermentación sólo podía ocurrir dentro de los confines de una célula viva, intacta y altamente organizada.
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En 1897, dos años después de la muerte de Pasteur, Hans Büchner, un bacteriólogo, y su hermano Eduard, un químico, preparaban “jugo de levadura”, un extracto obtenido al triturar células de levadura con granos de arena y pasando luego la mezcla por papel filtro. Deseaban conservar el jugo de levadura para usarlo más tarde. Después de intentar conservar el extracto con antisépticos y no lograrlo, trataron de impedir la descomposición de la preparación con la adición de azúcar, el mismo procedimiento usado para conservar mermeladas y jaleas. En lugar de conservar la solución, el jugo de levadura produjo gas a partir del azúcar y burbujeó en forma continua durante días. Después de un mayor análisis, Eduard descubrió que la fermentación producía etanol y burbujas de dióxido de carbono. Büchner había mostrado que la fermentación no requería la presencia de células intactas.
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Sin embargo, pronto se encontró que la fermentación era muy distinta de los tipos de reacciones que realizan los químicos orgánicos. La fermentación necesitaba la presencia de un conjunto único de catalizadores que no tenía contraparte en el mundo inanimado. Estos catalizadores se llamaron enzimas (por el término griego “en levaduras”). Las enzimas son las mediadoras del metabolismo, responsables de virtualmente cada reacción que ocurre en la célula. Sin las enzimas, las reacciones metabólicas procederían tan lentamente que serían imperceptibles.
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La primera evidencia de que las enzimas son proteínas la obtuvo James Sumner de Cornell University en 1926, cuando cristalizó la enzima ureasa de las habas espada (Canavalia ensiformis) y determinó su composición. Aunque este hallazgo no se recibió con mucho entusiasmo en ese momento, pronto se demostró que varias enzimas más eran proteínas y en las siguientes décadas se aceptó que todos los catalizadores biológicos eran proteínas. Casualmente, se hizo evidente que ciertas reacciones biológicas están catalizadas por moléculas de RNA. Para mayor claridad, el término enzima se reserva en general para los catalizadores proteínicos, mientras que el término ribozima se usa para los catalizadores de RNA. La descripción de este capítulo se limita a los catalizadores proteínicos y las propiedades de los catalizadores de RNA se describen en el capítulo 11.
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Aunque las enzimas son proteínas, muchas de ellas son proteínas conjugadas, o sea, que contienen componentes no proteínicos llamados cofactores que pueden ser inorgánicos (metales) u orgánicos (coenzimas). Las vitaminas y sus derivados suelen actuar como coenzimas. Cuando están presentes, los cofactores son participantes importantes en el funcionamiento de la enzima, a menudo realizan actividades para las que los aminoácidos no son adecuados. Por ejemplo, como se explicó en el capítulo 2, en la mioglobina el átomo de hierro del grupo hemo es el sitio donde se une y almacena el oxígeno hasta que se requiere en el metabolismo celular.
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Propiedades de las enzimas
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Al igual que todos los catalizadores, las enzimas tienen las siguientes propiedades: (1) sólo se requieren en pequeñas cantidades, (2) no se alteran en forma irreversible durante la reacción, por lo que cada molécula de enzima puede participar repetidamente en reacciones individuales y (3) no tienen efecto en la termodinámica de la reacción. Este último punto es muy importante. Las enzimas no aportan energía a una reacción química, por lo que no determinan que una reacción sea o no favorable termodinámicamente. De igual manera, las enzimas no determinan la proporción entre productos y reactivos en el equilibrio. Éstas son propiedades inherentes de las sustancias químicas que estén reaccionando. Como catalizadores, las enzimas sólo pueden aumentar la velocidad en la que procede una reacción química favorable.
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No necesariamente existe una relación entre la magnitud de ΔG de una reacción particular y la velocidad con la que ocurre dicha reacción. La magnitud de ΔG sólo informa sobre la diferencia en la energía libre entre el estado inicial y el equilibrio. Es totalmente independiente de la vía o del tiempo que le tome alcanzar el equilibrio. Por ejemplo, la oxidación de la glucosa es un proceso muy favorable, como puede determinarse por la cantidad de energía liberada durante su combustión. Sin embargo, los cristales de glucosa pueden dejarse a temperatura ambiente por tiempo indefinido sin que haya una conversión notable hacia materiales menos energéticos. En otras palabras, la glucosa es cinéticamente estable, aun cuando es inestable desde el punto de vista termodinámico. Aunque el azúcar se disolviera, mientras la solución se mantuviera estéril no se degradaría con rapidez. Sin embargo, si se agregaran unas cuantas bacterias, en muy poco tiempo la glucosa sería captada por las células y degradada por medios enzimáticos.
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Las enzimas son expertos catalizadores. Los catalizadores que usan los químicos en el laboratorio, como ácido, platino metálico y magnesio, generalmente aceleran las reacciones de cientos a miles de veces con respecto a la velocidad sin catalizador. En cambio, las enzimas típicamente aumentan la velocidad de una reacción de 108 a 1013 veces o incluso más (cuadro 3-3). Con base en estas cifras, las enzimas pueden lograr en 1 s lo que requeriría entre tres y 300 000 años si la enzima no existiera. Lo que es aún más notable, realizan esta hazaña a temperatura ambiente y al pH que existe en el interior de la célula. Además, a diferencia de los catalizadores inorgánicos usados por los químicos, las enzimas son muy específicas con respecto a los reactivos con los que se unen y a la reacción que catalizan. Los reactivos a los que se puede unir una enzima se llaman sustratos. Si por ejemplo, la enzima hexocinasa se encontrara en una solución con cien compuestos de bajo peso molecular además de su sustrato, la glucosa, sólo ésta sería reconocida por la enzima y experimentaría la reacción. Para fines prácticos, los otros compuestos bien podrían estar ausentes. Este tipo de especificidad, ya sea entre enzimas y sustratos o entre otros tipos de proteínas y las sustancias con las que se unen, es crucial para mantener el orden requerido a fin de sostener la vida.
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Además de su alto nivel de actividad y especificidad, las enzimas actúan como directores del tráfico metabólico en el sentido de que las reacciones catalizadas por enzimas son muy ordenadas —los únicos productos formados son los apropiados. Esto es muy importante porque la formación de subproductos químicos afectaría pronto la vida de una célula frágil. Por último, a diferencia de otros catalizadores, la actividad de las enzimas puede regularse para cubrir las necesidades particulares de una célula en un momento determinado. Como resulta evidente en este capítulo y el resto del libro, las enzimas de una célula en verdad son una colección asombrosa de máquinas moleculares en miniatura.
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Superación de la barrera de la energía de activación
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¿Cómo es que las enzimas son capaces de realizar una catálisis tan eficaz? La primera pregunta a considerar es por qué las reacciones con características termodinámicas favorables no proceden por sí mismas a velocidades relativamente altas en ausencia de enzimas. Incluso el ATP, cuya hidrólisis es tan favorable, permanece estable en una célula hasta que se degrada en una reacción enzimática controlada. Si esto no fuera así, el ATP tendría poco uso biológico.
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Las transformaciones químicas requieren que se rompan ciertos enlaces covalentes dentro de los reactivos. Para que esto ocurra, los reactivos deben contener suficiente energía cinética (energía de movimiento) para superar una barrera llamada energía de activación (EA). Esto se expresa en el diagrama de la figura 3.8, donde la energía de activación se representa con la altura de las curvas. Los reactivos de una reacción química a menudo se comparan con un objeto en reposo en la cima de un risco, listo para caer al fondo. Si se deja por sí solo, lo más probable es que el objeto permanezca ahí por tiempo indefinido. Sin embargo, si alguien pasara y le aplicara al objeto la energía suficiente para vencer la fricción u otra pequeña barrera en su camino e hiciera que llegara hasta el borde del risco, caería en forma espontánea hasta el fondo. El objeto tiene el potencial para caer a un estado de menor energía una vez que se eliminan las barreras cinéticas.
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En una solución a temperatura ambiente existen moléculas en un estado de movimiento aleatorio, cada una tiene cierta cantidad de energía cinética en un instante determinado. Dentro de una población de moléculas su energía se distribuye en una curva con forma de campana (fig. 3.9), algunas con muy poca energía y otras con mucho más. Las moléculas con alta energía (moléculas activadas) permanecen como tales sólo por un corto tiempo, pierden su exceso de energía hacia otras moléculas por colisión. Considérese una reacción en la que una molécula reactiva se divide en dos moléculas de producto. Si una molécula reactiva determinada adquiere energía suficiente para superar la barrera de activación, existe la posibilidad de que se divida en dos moléculas de producto. La velocidad de la reacción depende del número de moléculas reactivas que contienen la energía cinética necesaria en un momento dado. Una forma de aumentar la velocidad de reacción es incrementar la energía de los reactivos. La forma más fácil de hacer esto en el laboratorio es con la aplicación de calor a la mezcla de reacción (fig. 3.9). Por el contrario, la aplicación de calor a una reacción mediada por enzimas conduce a la rápida inactivación de la enzima porque se desnaturaliza.
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Cuando los reactivos están en la cresta de la curva de energía y se encuentran listos para convertirse en productos, se dice que están en el estado de transición (fig. 3.8). En este punto, los reactivos tienen un complejo activado transitorio en el que los enlaces se forman y se rompen. Puede ilustrarse la naturaleza de una estructura en estado de transición si se examina la interconversión de los estereoisómeros d y l de prolina, una reacción catalizada por la enzima bacteriana prolina racemasa.
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Esta reacción procede en ambos sentidos mediante la pérdida de un protón del carbono α de la molécula de prolina. Como resultado, la estructura del estado de transición contiene un carbanión con carga negativa en el que los tres enlaces formados por el átomo de carbono están en el mismo plano.
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Al contrario de la diferencia en la energía libre estándar para una reacción, la energía de activación necesaria para alcanzar el estado de transición no es un valor fijo, sino que varía dependiendo del mecanismo de reacción particular utilizado. Las enzimas catalizan las reacciones mediante la disminución de la magnitud de la barrera de energía de activación. Por consiguiente, a diferencia de la catálisis por calor, las enzimas hacen que los sustratos sean muy reactivos sin tener que elevarlos a niveles muy altos de energía. La figura 3.9 muestra una comparación entre el porcentaje de moléculas que reaccionan cuando el cambio químico es catalizado por una enzima y cuando no lo es. Las enzimas son capaces de disminuir las energías de activación al unirse con más fuerza al estado de transición que a los reactivos, lo que estabiliza este complejo activado, lo cual reduce su energía. Como consecuencia, en la actualidad constituyen temas de investigación sobre los mecanismos enzimáticos las diferencias en las características geométricas y las propiedades de unión entre los reactivos y el estado de transición. La importancia del estado de transición puede demostrarse de muchas formas. Por ejemplo:
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Los compuestos que se parecen al estado de transición de una reacción tienden a ser inhibidores muy efectivos de esa reacción porque pueden unirse con mucha fuerza a la región catalítica de la enzima.
En condiciones normales, los anticuerpos no se comportan como enzimas, sino que sólo se unen con gran afinidad a las moléculas. Sin embargo, los anticuerpos que se unen a compuestos que simulan un estado de transición para una reacción a menudo son capaces de actuar como enzimas y catalizar la degradación de ese compuesto.
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Conforme el estado de transición se convierte en productos, la afinidad de la enzima por las moléculas unidas disminuye y se liberan los productos.
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Como catalizadores, las enzimas aceleran los procesos de formación y rotura de enlaces. Para lograr esta tarea, las enzimas tienen una participación íntima en las actividades que ocurren entre los reactivos; lo hacen mediante la formación de un complejo con los reactivos, el complejo enzima-sustrato (ES). La figura 3.10 muestra una ilustración esquemática del complejo ES y la figura 3.14 una imagen. En la mayor parte de los casos, la relación entre la enzima y el sustrato es no covalente, aunque se conocen muchos ejemplos en los que se forma un enlace covalente transitorio.
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La parte de la molécula de enzima que se une en forma directa con el sustrato es el sitio activo. El sitio activo y el (los) sustrato(s) tienen formas complementarias, lo que les permite unirse con mucha precisión. La unión del sustrato con la enzima se realiza mediante los mismos tipos de interacciones no covalentes (enlaces iónicos, enlaces de hidrógeno, interacciones hidrófobas) que determinan la estructura de la proteína misma. Por ejemplo, la enzima mostrada en la figura 3.11a contiene varios residuos con carga positiva en posiciones estratégicas para unirse con átomos de carga negativa del sustrato. Además de unirse con el sustrato, el sitio activo contiene un conjunto particular de cadenas laterales de aminoácidos que influyen en el sustrato y disminuyen la energía de activación de la reacción. La importancia de las cadenas laterales individuales del sitio activo puede valorarse mediante mutagénesis dirigida a un sitio (pág. 74), una técnica en la que un aminoácido particular se sustituye por otro con propiedades diferentes.
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Por lo general, el sitio activo se encuentra en el fondo de una hendidura o grieta que conduce desde los alrededores acuosos hacia el interior de la proteína. Cuando un sustrato entra a la hendidura del sitio activo, casi siempre libera sus moléculas de agua unidas (desolvatación) y entra a un ambiente hidrófobo dentro de la enzima. La reactividad de las cadenas laterales del sitio activo puede ser mucho mayor en este ambiente protegido, en comparación con el solvente acuoso de la célula. Los aminoácidos que conforman el sitio activo casi siempre se sitúan en puntos distantes a lo largo de la cadena polipeptídica extendida, pero quedan próximos entre sí cuando el polipéptido se pliega en su estructura terciaria final (fig. 3.11b,c). La estructura del sitio activo explica no sólo la actividad catalítica de la enzima, sino también su especificidad. Como se indicó antes, la mayor parte de las enzimas es capaz de unirse sólo con una o unas pocas moléculas biológicas estrechamente relacionadas.
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Mecanismos de catálisis enzimática
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¿Cómo es que una enzima puede hacer que una reacción ocurra cientos de veces por segundo cuando esa misma reacción sucede a una velocidad indetectable en ausencia de la enzima? La respuesta radica en la formación del complejo enzima-sustrato, que permite que el (los) sustrato(s) sea(n) extraído(s) de la solución y sujetado(s) en la superficie de la gran molécula catalizadora. Una vez ahí, las propiedades físicas y químicas del sustrato pueden modificarse de varias formas, algunas de las cuales se describen en las secciones siguientes.
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Orientación del sustrato
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Supóngase que se coloca un puñado de tornillos y tuercas en una bolsa y ésta se sacude durante 5 minutos. Es muy improbable que alguno de los tornillos tenga una tuerca firmemente unida en su extremo cuando se termine la agitación. En cambio, si se sujeta un tornillo en una mano y una tuerca en la otra, es posible colocar pronto el tornillo dentro de la tuerca. Al sujetar el tornillo y la tuerca en la orientación adecuada, se disminuyó mucho la entropía del sistema. Las enzimas disminuyen la entropía de sus sustratos en una forma similar.
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Los sustratos unidos con la superficie de una enzima quedan muy próximos entre ellos y en la orientación correcta precisa para que puedan reaccionar (fig. 3.12a). Por el contrario, cuando los reactivos están en una solución, son libres para tener movimientos de traslación y rotación, e incluso los que tienen energía suficiente no siempre llegan a una colisión que conduzca a la formación de un complejo en estado de transición.
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Cambio en la reactividad del sustrato
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Las enzimas se componen de aminoácidos que tienen diversos tipos de cadenas laterales, desde las que tienen cargas completas hasta las que son no polares. Cuando el sustrato se une con la superficie de una enzima, la distribución de los electrones dentro de la molécula de sustrato es influida por las cadenas laterales vecinas de la enzima (fig. 3.12b). Esta influencia aumenta la reactividad del sustrato y estabiliza el complejo en estado de transición que se forma durante la reacción. Tales efectos se logran sin el aporte de energía externa, como calor.
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Hay varios mecanismos generales por los que aumenta la reactividad de los sustratos cuando se unen a las enzimas. En términos básicos, dichos mecanismos son similares a los descritos por los químicos que estudian los mecanismos de las reacciones orgánicas en un tubo de ensayo. Por ejemplo, la velocidad de las reacciones puede modificarse mucho por los cambios en el pH. Aunque las enzimas no pueden cambiar el pH del medio, contienen muchos aminoácidos con cadenas laterales ácidas o básicas. Estos grupos son capaces de donarle o quitarle protones al sustrato, lo que altera el carácter electrostático del sustrato y lo hace más reactivo.
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Los sitios activos de muchas enzimas contienen cadenas laterales con una carga parcial positiva o negativa. Estos grupos son capaces de interactuar con un sustrato para alterar sus propiedades electrostáticas (fig. 3.12b) y por lo tanto, su reactividad. Dichos grupos también son capaces de reaccionar con un sustrato para producir una unión enzima-sustrato covalente temporal. La quimotripsina, una enzima que digiere las proteínas de la dieta en el intestino delgado, actúa de esta manera. La figura 3.13 presenta la serie de reacciones que ocurre cuando la quimotripsina hidroliza un enlace peptídico en una proteína sustrato. La reacción de la figura 3-13 se divide en dos pasos. En el primero, el átomo de oxígeno electronegativo de la cadena lateral de una serina de la enzima “ataca” a un átomo de carbono del sustrato. Como resultado, el enlace peptídico del sustrato se hidroliza y se forma un enlace covalente entre la serina y el sustrato, lo que desplaza al resto del sustrato como uno de los productos. Como se explica en el pie de la figura, la capacidad de la serina para llevar a cabo esta reacción depende de un residuo cercano de histidina, que atrae al protón del grupo hidroxilo de la serina y esto aumenta el poder nucleofílico del átomo de oxígeno del grupo. Las enzimas también son expertas en usar las moléculas de agua en las reacciones que catalizan. En el segundo paso mostrado en la figura 3.13b, el enlace covalente entre la enzima y el sustrato se rompe con una molécula de agua, lo que regresa a la enzima a su estado libre original y libera el resto del sustrato como el segundo producto.
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Aunque las cadenas laterales de los aminoácidos puedan participar en diversas reacciones, no son muy adecuadas para donar o aceptar electrones. Como se explica en la sección siguiente (y con más detalle en los caps. 5 y 6), la transferencia de electrones es el fenómeno central en las reacciones de oxidación-reducción que tienen una función vital en el metabolismo celular. Para catalizar estas reacciones, las enzimas contienen cofactores (iones metálicos o coenzimas) que aumentan la reactividad de los sustratos mediante la eliminación o donación de electrones. En diversos casos las enzimas generan su propio cofactor aceptor de electrones mediante la modificación química de uno de los residuos aminoácidos situados en su sitio activo.
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Inducción de tensión en el sustrato
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Aunque el sitio activo de una enzima puede ser complementario a su(s) sustrato(s), diversos estudios revelan un cambio en las posiciones relativas de ciertos átomos de la enzima una vez que se haya unido el sustrato. En muchos casos, la conformación cambia tanto que mejora el ajuste complementario entre la enzima y los reactivos (un ajuste inducido) y los grupos reactivos apropiados de la enzima se mueven a su sitio. Un ejemplo de ajuste inducido se muestra en la figura 3.14. Estos tipos de movimientos dentro de una molécula de enzima son un buen ejemplo de una proteína que actúa como una máquina molecular. Conforme ocurren estos cambios en la conformación, se realiza un trabajo mecánico, lo que permite a la enzima ejercer una fuerza física en ciertos enlaces dentro de una molécula de sustrato. Esto tiene el efecto de desestabilizar el sustrato, lo que hace que adopte el estado de transición en el que se alivia la tensión (fig. 3.12c).
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Estudio de los cambios en la conformación y los intermediarios catalíticos Para comprender del todo el mecanismo por el cual una enzima cataliza una reacción particular, es necesario describir los diversos cambios en la estructura atómica y electrónica, tanto en la enzima como en el (los) sustrato(s), que ocurren conforme procede la reacción. En el capítulo previo se explicó cómo las técnicas de cristalografía por rayos X revelan detalles de la estructura de una molécula enzimática grande. Como el 40 a 60% del volumen de un cristal de proteína típico consiste en solvente atrapado, la mayor parte de las enzimas cristalizadas conservan un alto nivel de actividad enzimática. Por lo tanto, debería ser posible usar las técnicas de difracción de rayos X para estudiar los mecanismos de reacción. Existe una limitación importante, que es el tiempo. En un estudio cristalográfico estándar, los cristales de enzima deben someterse a un haz de rayos X por un periodo de horas o días mientras se recopilan los datos necesarios. El retrato que se obtiene con tales estudios captura la estructura de la molécula promediada en el tiempo. Sin embargo, las innovaciones recientes han hecho posible usar las técnicas cristalográficas de rayos X para observar los cambios estructurales fugaces que ocurren en el sitio activo mientras una enzima está catalizando un único ciclo de reacción. Esta técnica, llamada cristalografía resuelta en tiempo, puede incluir lo siguiente:
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Uso de haces de rayos X de ultra alta intensidad generados por un sincrotón, un instrumento usado por los físicos nucleares para estudiar las partículas subatómicas. Esto puede acortar el periodo de exposición a los rayos X a unos cuantos picosegundos, que es la misma escala de tiempo requerida para que una enzima catalice una sola transformación química.
Enfriamiento de los cristales de enzima a temperaturas entre 20 y 40 grados por abajo del cero absoluto, lo que disminuye la velocidad de la reacción en un factor de hasta 10 000 millones, y aumenta mucho la vida de los intermediarios transitorios.
Uso de técnicas para inducir una reacción en un cristal completo de forma que todas las moléculas de enzima en él estén en la misma etapa de reacción al mismo tiempo. Por ejemplo, en el caso de una reacción en la que el ATP es un sustrato, los cristales de la enzima pueden infiltrarse con moléculas de ATP no reactivas a las que se les haya unido un grupo inerte (p. ej., un grupo nitrofenilo) mediante un enlace sensible a la luz. Cuando los cristales se exponen a un pulso breve de luz, todas las moléculas de ATP “encapsuladas” se liberan, lo que inicia la reacción al mismo tiempo en los sitios activos de todo el cristal.
Uso de enzimas con mutaciones en sitios específicos (pág. 74) que imponen barreras cinéticas en etapas específicas de la reacción, lo que aumenta la vida de intermediarios particulares.
Determinación de la estructura a una resolución ultra-alta (atómica) (p. ej., 0.8 Å), lo que permite visualizar hidrógenos individuales que podrían estar presentes en enlaces de hidrógeno o relacionados con grupos ácidos en la proteína; la presencia o ausencia de moléculas de agua unidas; la conformación precisa de las cadenas laterales catalíticas, y la sutil tensión que aparece en partes del sustrato durante la catálisis. El detalle notable que puede obtenerse con estas imágenes de alta resolución se ilustra mediante el enlace de hidrógeno de la figura 3.15.
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Al combinar estas técnicas, los investigadores han podido determinar la estructura tridimensional de una enzima en las etapas sucesivas durante una sola reacción catalizada. Cuando estas “tomas” individuales se ponen juntas en una secuencia, producen una “película” que muestra los diversos intermediarios catalíticos que aparecen y desaparecen conforme avanza la reacción. La figura 3.16 presenta un ejemplo de los datos que pueden obtenerse utilizando varias de estas estrategias.
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Si bien la atención se ha enfocado en los cambios de conformación que ocurren cuando una enzima transforma sus sustratos en productos, en años recientes también se ha prestado considerable atención a los cambios de conformación que ocurren dentro de la proteína misma. Como se muestra en la figura 2.37, las proteínas son moléculas dinámicas capaces de un movimiento propio (intrínseco) que puede tener mucha relevancia funcional. En el caso presentado en la figura 2.37, este movimiento permite la entrada del sustrato al sitio activo de la enzima. El análisis de este tipo de movimiento intrínseco con varias técnicas experimentales sugirió que las proteínas, incluso en ausencia de sustrato, son capaces de muchos de los mismos movimientos que pueden detectarse durante el ciclo catalítico de una proteína. Si esto es cierto, sugiere que la evolución ha seleccionado estructuras proteínicas capaces de movimientos intrínsecos que pueden ser útiles para las funciones potenciales de una proteína. En lugar de inducir un cambio de conformación específico, los sustratos estarían simplemente “esperando” a que una proteína asumiera una conformación en la cual se pudieran unir de forma eficaz.
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Las enzimas varían mucho en su capacidad para catalizar reacciones. La actividad catalítica de una enzima se revela mediante el estudio de su cinética, es decir, de la velocidad con la que cataliza una reacción bajo ciertas condiciones experimentales. En 1913, Leonor Michaelis y Maud Menten publicaron la relación matemática entre la concentración del sustrato y la velocidad de las reacciones enzimáticas medidas por la cantidad de producto formado (o de sustrato consumido) en un tiempo determinado. Esta relación puede expresarse con una ecuación (presentada en la pág. 103) que genera una hipérbola, como se muestra en la figura 3.17. En lugar de considerar los aspectos teóricos de la cinética enzimática, puede obtenerse la misma curva de una manera práctica, como se hace para cada enzima estudiada. A fin de conocer la velocidad de una reacción, se incuba a una temperatura deseada una mezcla que contenga todos los ingredientes necesarios, excepto uno, que cuando se agregue iniciará la reacción. Si al momento en que inicia la reacción no hay producto en la mezcla, la cantidad de producto que aparezca a lo largo del tiempo proporcionará una medida de la velocidad de la reacción. En este procedimiento existen factores que lo complican. Si el tiempo de incubación es demasiado prolongado, la concentración de sustrato disminuye en forma mensurable. Además, conforme aparece el producto puede convertirse de nuevo en sustrato mediante la reacción inversa, que también está catalizada por la enzima. Lo ideal es determinar la velocidad inicial, es decir, la velocidad en el instante en el que aún no se ha formado producto. Para medir con exactitud la velocidad de reacción inicial, se usan tiempos de incubación cortos y técnicas de medición sensibles.
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Para generar una curva como la que se muestra en la figura 3.17, se determina la velocidad inicial para una serie de mezclas de incubación que contienen la misma cantidad de enzima, pero una concentración creciente de sustrato. A partir de esta curva resulta evidente que la velocidad de reacción inicial varía mucho con la concentración de sustrato. Con concentraciones bajas de sustrato, las moléculas de enzima sufren relativamente pocas colisiones con el sustrato en un tiempo determinado. Por consiguiente, la enzima tiene “tiempo ocioso”, es decir, las moléculas de sustrato son las que limitan la velocidad. Con altas concentraciones de sustrato, las enzimas chocan con las moléculas de sustrato más rápido de lo que pueden ser convertidas en producto. Por lo tanto, en presencia de concentraciones altas de sustrato, las moléculas individuales de enzima trabajan a su máxima capacidad, o sea, que las moléculas de enzima son las que limitan la velocidad. Por lo tanto, mientras mayor sea la concentración de sustrato en una mezcla de reacción, la enzima se aproxima al estado de saturación. La velocidad inicial en este punto de saturación teórico se denomina velocidad máxima (Vmáx).
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La medida más sencilla de la actividad catalítica de una enzima la provee su número de recambio, que puede calcularse a partir de la Vmáx. Dicho número (o constante catalítica, kcat, como también se llama) es el número máximo de moléculas de sustrato que puede convertirse en producto por una molécula de enzima por unidad de tiempo. Un número de recambio (por segundo) de 1 a 103 es típico de las enzimas, aunque se conocen valores tan altos como 106 (cuadro 3.3). A partir de estos valores resulta evidente que unas pocas moléculas de enzima pueden convertir rápidamente una gran cantidad de moléculas de sustrato en producto.
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El valor de Vmáx es sólo un término útil obtenido a partir de una gráfica como la de la figura 3.17; otro es la constante de Michaelis (KM), que es igual a la concentración de sustrato cuando la velocidad de la reacción es la mitad de Vmáx. Como su nombre implica, la KM es constante para una enzima determinada y por lo tanto, independiente de la concentración de sustrato o enzima. La relación entre Vmáx y KM se aprecia mejor si se considera la ecuación de Michaelis-Menten, que puede usarse para generar la gráfica de la figura 3.17.
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De acuerdo con la ecuación, cuando la concentración de sustrato [S] se establece en un valor equivalente a KM, la velocidad de la reacción (V) se vuelve igual a Vmáx/2, o la mitad de la velocidad máxima. Por lo tanto, KM = [S] cuando V = Vmáx/2.
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Para generar una curva hiperbólica como la de la figura 3.17 y hacer una determinación precisa de los valores de Vmáx y KM, debe graficarse una cantidad considerable de puntos. Una descripción más sencilla y exacta se obtiene al graficar el recíproco de la concentración de sustrato respecto al recíproco de la velocidad, como lo formularon Hans Lineweaver y Dean Burk. Cuando se hace así, la hipérbola se vuelve una línea recta (fig. 3.18) cuya intersección en el eje de las x es igual a −1/KM, la intersección en el eje de las y es igual a 1/Vmáx y la pendiente es igual a KM/Vmáx. Por lo tanto, los valores de KM y Vmáx son fáciles de obtener mediante la extrapolación de la línea trazada a partir de pocos puntos.
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En la mayor parte de los casos, el valor de KM proporciona una medida de la afinidad de la enzima por el sustrato. Mientras más alta sea la KM, más alta será la concentración de sustrato requerida para alcanzar la mitad de la Vmáx y por lo tanto, menor será la afinidad de la enzima por ese sustrato. La KM de la mayoría de las enzimas varía entre 10−1 y 10−7, con un valor típico alrededor de 10−4 M. Otros factores que influyen mucho en la cinética de la enzima son el pH y la temperatura del medio de incubación. Cada enzima tiene un pH y una temperatura óptimos en los que opera con su máxima actividad (fig. 3.19). La influencia de la temperatura en la actividad enzimática se ilustra mediante el efecto notorio de la refrigeración en la disminución del crecimiento de los microorganismos.
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Inhibidores enzimáticos Los inhibidores enzimáticos son moléculas capaces de unirse a una enzima y disminuir su actividad. La célula depende de inhibidores para regular la actividad de muchas de sus enzimas; los bioquímicos usan inhibidores para estudiar las propiedades de las enzimas, y muchas compañías farmacéuticas producen inhibidores enzimáticos que actúan como fármacos. Los inhibidores enzimáticos pueden dividirse en dos tipos: reversibles e irreversibles.
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Los inhibidores irreversibles son los que se unen con fuerza a una enzima, a menudo forman un enlace covalente con uno de sus residuos de aminoácidos. Varios gases nerviosos, como el diisopropilfosfofluoridato y los pesticidas organofosforados, actúan como inhibidores irreversibles de la acetilcolinesterasa, una enzima que tiene una función crucial en la destrucción de acetilcolina, el neurotransmisor encargado de causar la contracción muscular. Con la enzima inhibida, el músculo es estimulado de forma continua y queda en un estado de contracción permanente. Como se explica en la sección Perspectiva humana, el antibiótico penicilina actúa como inhibidor irreversible de una enzima clave en la formación de la pared celular bacteriana.
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Por otra parte, los inhibidores reversibles se unen sólo débilmente a una enzima, por lo que son fáciles de desplazar. Para simplificarlo, se describen los casos más sencillos de inhibidores reversibles, que son los tipos competitivo y no competitivo.
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Los inhibidores competitivos son inhibidores reversibles que compiten con un sustrato por el acceso al sitio activo de una enzima. Como los sustratos tienen una estructura complementaria al sitio activo con el que se unen, los inhibidores competitivos deben parecerse al sustrato para competir por el mismo sitio de unión, pero difieren en alguna manera que les impide transformarse en el producto (fig. 3.20). El análisis de los tipos de moléculas que pueden competir con el sustrato por un sitio de unión en la enzima aporta información sobre la estructura del sitio activo y la naturaleza de la interacción entre el sustrato y su enzima.
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La inhibición enzimática competitiva constituye la base de la acción de muchos fármacos de uso frecuente, como se ilustra en el ejemplo siguiente. La enzima convertidora de angiotensina (ACE, angiotensin-converting enzyme) es una enzima proteolítica que actúa sobre un péptido de 10 residuos (angiotensina I) para producir un péptido de ocho residuos (angiotensina II). Las concentraciones altas de angiotensina II son un factor de riesgo importante para el desarrollo de presión arterial alta (hipertensión). En el decenio de 1960, John Vane y col., en la compañía Eli Lilly iniciaron una búsqueda de compuestos que pudieran inhibir la ACE. Los estudios previos habían encontrado que el veneno de una serpiente brasileña contenía inhibidores de enzimas proteolíticas y se observó que uno de los componentes de este veneno, un péptido llamado teprótido
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era un inhibidor competitivo potente de la ACE. Aunque se demostró que el teprótido disminuía la presión sanguínea en pacientes hipertensos, no era un fármaco muy útil porque tenía una estructura peptídica y por lo tanto, era rápidamente degradado si se tomaba por vía oral. Los esfuerzos siguientes para desarrollar inhibidores no peptídicos de la enzima llevaron a los investigadores a sintetizar un compuesto llamado captoprilo,
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que se convirtió en el primer fármaco antihipertensivo útil que actúa mediante su unión con la ACE.
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La eficacia de un inhibidor competitivo depende de su afinidad relativa por la enzima. Aparte de esto, la inhibición competitiva puede ser superada si la proporción sustrato/inhibidor es lo bastante grande. En otras palabras, si el número de colisiones entre la enzima y un inhibidor se vuelve insignificante en relación con las colisiones que se producen entre la enzima y su sustrato, entonces el efecto del inhibidor se vuelve mínimo. Si la concentración de sustrato es suficiente, es teóricamente posible alcanzar la velocidad máxima de la enzima, incluso en presencia del inhibidor competitivo.
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En la inhibición no competitiva, el sustrato y el inhibidor no compiten por el mismo sitio de unión; por lo general, el inhibidor actúa en un sitio distinto al sitio activo de la enzima. El nivel de inhibición depende sólo de la concentración del inhibidor y el aumento de la concentración del sustrato no puede contrarrestarlo. Dado que en presencia de un inhibidor no competitivo, una parte de las moléculas de la enzima se encuentran necesariamente inactivas en un instante determinado, no puede alcanzarse la velocidad máxima de la población de moléculas de enzima. El tipranavir es un potente inhibidor no competitivo de la proteasa producida por el VIH cuando infecta un leucocito. A diferencia de otros inhibidores de esta enzima, como el ritonavir, el tipranavir no se asemeja al sustrato peptídico de la enzima ni compite con él. Los efectos en la cinética de las enzimas en presencia de inhibidores no competitivos y competitivos se muestran en la figura 3.21. En un caso, la Vmáx está disminuida, y en el otro, la KM está aumentada. En ambos tipos, la pendiente (KM/Vmáx) está aumentada en relación con la reacción sin inhibidores. Como se explica en la página 115, las células utilizan una versión de la inhibición no competitiva para regular la actividad de enzimas clave en las vías metabólicas.
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REVISIÓN
¿Cómo es posible tener una reacción caracterizada por una ΔG grande y una EA pequeña?, ¿y con una EA grande y una ΔG pequeña?
Explique cómo las enzimas pueden ser tan específicas para los sustratos con los que se unen.
Examine la figura 3.13 que ilustra los pasos en una reacción catalizada por enzimas y describa qué ocurre sin leer el pie de la figura.
Diferencie entre número de recambio y Vmáx.
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PERSPECTIVA HUMANA El problema creciente de la resistencia a antibióticos
Hace no mucho tiempo se creía que la salud de los seres humanos ya no se vería amenazada por infecciones bacterianas graves. Las enfermedades bacterianas, como lepra, neumonía, gonorrea y docenas más se curaban con la administración de alguno de varios antibióticos, compuestos que matan bacterias en forma selectiva sin dañar al hospedador humano en el que crecen. La situación de esto ha cambiado mucho en los últimos 20 años conforme las bacterias patógenas se han vuelto cada vez más resistentes a estos “fármacos maravilla”, lo que causa la muerte a muchas personas que en otro tiempo se hubieran tratado con éxito. Incluso la tuberculosis, que prácticamente había desaparecido de los países desarrollados, ha resurgido alrededor del mundo en una forma denominada XDR (extremadamente resistente a fármacos) que es virtualmente intratable. Se teme que la tuberculosis XDR esté a punto de convertirse en una crisis mayor de salud mundial. Para agravar la situación, la industria farmacéutica ha reducido drásticamente los recursos dedicados al desarrollo de nuevos antibióticos. Este cambio de actitud por parte de la industria farmacéutica suele atribuirse a que no cuenta con incentivos económicos, porque: (1) Los antibióticos se administran por lapsos breves (a diferencia de fármacos que se utilizan contra cuadros crónicos como la diabetes o la depresión). (2) A diferencia de otros tipos de medicamentos que conservan su eficacia, los antibióticos nuevos corren el riesgo de que su vida útil en el mercado sea relativamente breve, a medida que las bacterias se vuelven resistentes a cada producto sucesivo. (3) Se ha frenado el uso general de los antibióticos más eficaces y en cambio se conservan como armas de último recurso para cuando fallan otros fármacos. Han sido ampliamente revisadas las ideas para la formación de instituciones no lucrativas dedicadas al desarrollo de nuevos antibióticos.
En esta sección se presenta una breve revisión del mecanismo de acción de los antibióticos, sobre todo los dirigidos a enzimas, que son tema de este capítulo, y al desarrollo de la resistencia bacteriana. Muchos antibióticos se derivan de productos naturales sintetizados por microorganismos que viven en la tierra y que son cultivados fácilmente en el laboratorio. El cuadro 1 incluye las clases principales de antibióticos, ejemplos de cada clase, los sitios o dianas en las bacterias sobre las que actúan dichos compuestos y el mecanismo por el cual las bacterias han desarrollado resistencia a esa clase de compuestos. En primer lugar analizaremos algunos de los tipos principales de “sitios efectores o de acción”.
1. Enzimas implicadas en la síntesis de la pared celular bacteriana. La penicilina y sus derivados (p. ej., meticilina) son análogos estructurales de los sustratos de una familia de transpeptidasas que catalizan las reacciones finales de formación de enlaces cruzados que le dan rigidez a la pared celular. Si estas reacciones no ocurren, no se desarrolla una pared celular rígida. La penicilina es un inhibidor irreversible de las transpeptidasas; el antibiótico se adapta al sitio activo de estas enzimas, forma un complejo unido por un enlace covalente que no puede ser desalojado. El antibiótico vancomicina inhibe la transpeptidación al unirse con el sustrato peptídico de la transpeptidasa, en lugar de unirse con la enzima misma. Lo normal es que el sustrato de la transpeptidasa se convierta en un dipéptido d-alanina-d-alanina. Para volverse resistente a la vancomicina, una célula bacteriana debe sintetizar un producto alternativo que no se una con el fármaco, lo cual es un proceso indirecto que requiere de la adquisición de varias actividades enzimáticas nuevas. Como resultado, la vancomicina es el antibiótico para el cual las bacterias tienen menor capacidad de desarrollar resistencia y por ello usualmente se administra como último recurso cuando otros antibióticos han fallado. Por desgracia, en años recientes han surgido cepas resistentes a vancomicina de varias bacterias patógenas, incluyendo a Staphylococcus aureus, el cual es un habitante común de la piel y la cavidad nasal. Aunque por lo general es relativamente innocuo, este organismo es la causa más frecuente de infecciones que ponen en peligro la vida de pacientes hospitalizados que tienen heridas abiertas o sondas invasivas. Durante años, la presencia de cepas de S. aureus resistentes a la meticilina (MRSA, methicillin-resistant S. aureus), que también son resistentes a otros antibióticos, han causado estragos en las salas de los hospitales. Las infecciones por este único patógeno cada año provocan la muerte de unos 20 000 pacientes sólo en Estados Unidos, cifra mayor que la de fallecimientos en ese país por sida. Las infecciones por MRSA también han comenzado a manifestarse en entornos comunitarios como gimnasios, en escuelas de enseñanza superior o en las guarderías de niños, sitios en los que se produce contacto muy frecuente entre las personas. En muchos casos, la vancomicina es el único fármaco que puede detener estas infecciones. Por consiguiente, resultó alarmante el descubrimiento de que MRSA puede volverse resistente a la vancomicina al adquirir un grupo de genes de resistencia a la vancomicina de otra bacteria (E. faecium), que también es una causa común de infecciones intrahospitalarias. Hasta ahora no se conoce de ningún MRSA resistente a la vancomicina que haya logrado establecerse dentro de un hospital o instalación comunitaria, pero podría ser sólo cuestión de tiempo. Por tal razón, los especialistas en enfermedades infecciosas han solicitado a los hospitales que establezcan mejores programas de higiene y que aíslen a los pacientes ante el primer signo de infección. Está demostrado que dichas prácticas disminuyen la incidencia de infecciones letales en los sitios donde se han implementado.
2. Componentes del sistema por el cual las bacterias duplican, transcriben y traducen su información genética. Aunque las bacterias y las células eucariotas tienen un sistema similar para almacenar y utilizar la información genética, hay muchas diferencias entre los dos tipos de células que pueden aprovechar los farmacólogos. Por ejemplo, la estreptomicina y las tetraciclinas se unen a los ribosomas bacterianos, pero no a los ribosomas de eucariotas. Las quinolonas, como la ciprofloxacina, son un ejemplo poco común de antibióticos completamente sintéticos (es decir que, no se basan en productos naturales). Las quinolonas inhiben la enzima DNA girasa, necesaria para la replicación del DNA bacteriano.
3. Enzimas que catalizan reacciones metabólicas específicas de las bacterias. Las sulfas, por ejemplo, son antibióticos eficaces porque se parecen mucho al compuesto ácido p-aminobenzoico (PABA),

que las bacterias convierten por medios enzimáticos en la coenzima esencial ácido fólico. Como los seres humanos carecen de una enzima que sintetice ácido fólico, deben obtener esta coenzima esencial en la dieta y por consiguiente, las sulfas no tienen efecto en el metabolismo de los seres humanos.
Prácticamente todos los antibióticos “nuevos” que en los últimos años han sido aprobados para usarse son derivados de compuestos que ya existían y que han sido modificados por mecanismos químicos en el laboratorio. En otras palabras, tales compuestos poseen el mismo núcleo o “esqueleto” que el compuesto del cual provienen, y por ello habrá que considerarlos como miembros de la misma clase química. Los fármacos existentes han sido modificados químicamente en un intento de volverlos menos vulnerables a los mecanismos de resistencia utilizados por las bacterias que son su blanco. Se esperaba que la secuenciación del genoma de bacterias patógenas que comenzó en 1995 condujera a la identificación de muchos nuevos blancos farmacológicos, pero no ha sido así. Un hecho notable es que sólo se han desarrollado y aprobado dos clases nuevas de antibióticos desde 1963. Una de estas clases incluye al antibiótico linezolida, introducido en el año 2000, que actúa de manera específica en los ribosomas bacterianos e interfiere con la síntesis proteínica. La otra nueva clase de antibióticos, introducida en 2003 y representada por la daptomicina, son lipopéptidos cíclicos que interrumpen la función de la membrana bacteriana. Muchos investigadores esperan que la linezolida y la daptomicina se usen poco para poder mantener la resistencia al mínimo.
Las bacterias se vuelven resistentes a los antibióticos mediante varios mecanismos distintos, muchos de los cuales pueden ilustrarse tomando como ejemplo la penicilina. La penicilina es un β-lactámico, o sea, que contiene un anillo lactámico β de cuatro elementos (mostrado en color).

Para el decenio de 1940, los investigadores habían descubierto que ciertas bacterias tienen una enzima llamada lactamasa β (o penicilinasa) que puede abrir el anillo lactámico, lo que vuelve al compuesto innocuo para la bacteria. Cuando se introdujo la penicilina como antibiótico durante la Segunda Guerra Mundial, ninguna de las bacterias principales causantes de enfermedad tenía un gen para lactamasa β. Esto puede comprobarse si se examina el DNA de las bacterias descendientes de los cultivos de laboratorio que se iniciaron en la era previa a los antibióticos. Ahora, el gen de la lactamasa β está presente en una gran variedad de bacterias infecciosas y la producción de esta enzima en dichas bacterias es la principal causa de resistencia a la penicilina. ¿Cómo adquirieron el gen estas especies?
La presencia difundida del gen para lactamasa β ilustra la facilidad con la que los genes pueden diseminarse de una bacteria a otra, no sólo entre las células de una especie determinada, sino también entre especies. Esto puede ocurrir de varias formas, incluyendo la conjugación (mostrada en la fig. 1.13), en la que el DNA pasa de una célula bacteriana a otra; la transducción, en la que el gen bacteriano es acarreado de una célula a otra en un virus; y la transformación, en la que la célula bacteriana es capaz de captar DNA desnudo de su medio circundante. Los farmacólogos han intentado contrarrestar la diseminación de la lactamasa β mediante la síntesis de derivados de penicilina (p. ej., meticilina) que son más resistentes a la enzima hidrolítica.
La meticilina, que ya no está en uso, fue producida por primera vez en 1959 como un antibiótico resistente a la lactamasa β. Como podría esperarse, la selección natural conduce pronto a la evolución de bacterias cuya lactamasa β puede hidrolizar las nuevas formas del antibiótico.
No todas las bacterias resistentes a la penicilina han adquirido un gen de lactamasa β. Algunas son resistentes porque tienen modificaciones en su pared celular que bloquean la entrada del antibiótico; otras lo son porque poseen una bomba de expulsión que les permite expulsar el antibiótico después de que haya entrado a la bacteria; e incluso otras son resistentes porque poseen una molécula “efectora” alterada como una transpeptidasa modificada a la que no se puede unir antibiótico. Por ejemplo, la meningitis bacteriana se debe a la bacteria Neisseria meningitidis, que aún no presenta evidencia de haber adquirido lactamasa β. No obstante, estas bacterias son cada vez más resistentes a la penicilina porque sus transpeptidasas perdieron la afinidad por los antibióticos como resultado de mutaciones en el gen que codifica para la enzima.
El problema de la resistencia a fármacos no se limita a enfermedades bacterianas, se ha convertido también en un problema mayor en el tratamiento del sida. A diferencia de las bacterias, cuyas enzimas para replicar el DNA trabajan con un nivel de exactitud muy alto, la enzima de replicación del virus del sida (VIH), llamada transcriptasa inversa, comete muchos errores, lo que genera un alto índice de mutación. Este elevado índice de error (alrededor de un error por cada 10 000 bases duplicadas), junto con la alta velocidad de replicación viral (una persona produce >108 partículas virales al día), hace muy probable que en un individuo surjan variantes resistentes a los fármacos durante el progreso de la infección. Este problema se combate con las medidas siguientes:
Con la administración de varios fármacos diferentes dirigidos a distintas enzimas virales, lo cual reduce mucho la probabilidad de que surja una variante resistente a todos los fármacos.
Con el diseño de fármacos que interactúan con las porciones más conservadas de cada enzima blanco o diana, es decir, aquellas porciones donde las mutaciones tienen mayor probabilidad de producir una enzima defectuosa. Este punto subraya la importancia de conocer tanto la estructura y función de la enzima blanco, como la forma en que los fármacos potenciales interactúan con ese blanco.
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