Capítulo 5: Respiración aeróbica y la mitocondria

Durante los primeros 2 000 millones de años de vida en la Tierra, la atmósfera estaba formada sobre todo por moléculas reducidas, como el hidrógeno molecular (H₂), el amoniaco (NH₃) y el agua (H₂O). En este periodo, el planeta estaba poblado por seres anaerobios; organismos que capturaban y utilizaban energía mediante un metabolismo independiente del oxígeno (anaeróbico), como la glucólisis y la fermentación (figs. 3.24 y 3.29). Luego, hace 2 400 a 2 700 millones de años, aparecieron las cianobacterias, una nueva clase de organismos que realizaba un tipo original de proceso fotosintético, en el que se dividían las moléculas de agua y se liberaba oxígeno molecular (O₂). En algún punto después de la aparición de las cianobacterias, la atmósfera de la Tierra empezó a acumular cantidades significativas de oxígeno, lo que estableció la base para un cambio espectacular en los tipos de organismos que habitarían el planeta.

Como se explica en la página 35, el oxígeno molecular puede ser una sustancia muy tóxica, puesto que capta electrones adicionales y reacciona con diversas moléculas biológicas. La presencia de dicho elemento en la atmósfera debió ser un factor muy importante para la selección natural. Con el tiempo evolucionaron especies que no sólo estaban protegidas de los efectos dañinos del oxígeno molecular, sino que tenían vías metabólicas que lo aprovechaban con gran ventaja. Sin la capacidad para usar el oxígeno, los organismos sólo podían extraer una cantidad limitada de energía de sus alimentos y excretaban productos ricos en energía, como ácido láctico y etanol, que no podían metabolizar más. En cambio, los organismos que incorporaron el O₂ en su metabolismo podían oxidar por completo estos compuestos hasta CO₂ y H₂O; en este proceso se extraía un porcentaje mucho mayor de su contenido energético. Estos organismos que se volvieron dependientes del oxígeno fueron los primeros aerobios de la Tierra y al final dieron origen a todas las especies procariotas y eucariotas dependientes de O₂ que existen hoy en día. En las eucariotas, la utilización de oxígeno como medio de extracción de energía ocurre en un organelo especializado, la mitocondria. Como se describe en el capítulo 1, muchísimos datos indican que este organelo evolucionó a partir de una bacteria aerobia ancestral que fijó su residencia dentro del citoplasma de una célula hospedadora anaerobia.

Las mitocondrias son lo bastante grandes para verse con el microscopio óptico (fig. 5.1a) y su presencia en las células se conoce desde hace más de 100 años. Según sea el tipo celular, dichos organelos pueden tener una estructura general muy diferente. En un extremo del espectro, pueden verse como organelos individuales con forma arriñonada (fig. 5.1b), con una longitud de 1 a 4 μm. Por otra parte, se observan como una red tubular interconectada muy ramificada. Este tipo de estructura mitocondrial puede verse en la micrografía inicial del capítulo. Las observaciones de mitocondrias teñidas con inmunofluorescencia dentro de células vivas las muestran como organelos dinámicos capaces de sufrir enormes cambios morfológicos. Uno de los más importantes es que las mitocondrias pueden fusionarse entre sí o dividirse (fisionarse) en dos (fig. 5.2a).

Desde hace muchos años se sabe que las mitocondrias y el retículo endoplásmico (ER, endoplasmic reticulum) participan en interacciones extensas; sin embargo, ha causado sorpresa descubrir que la fisión mitocondrial al parecer es inducida por contacto con finos túbulos del ER. Como se muestra en la figura 5.2b, los túbulos de este último organelo rodean a las mitocondrias como lazos corredizos y al parecer emprenden la constricción para ser terminada gracias a la acción de proteínas solubles reclutadas hasta la superficie externa de la mitocondria a partir del citosol (figura 5.2c). Es probable que el equilibrio entre la fusión y la fisión sea un factor determinante de la cantidad, la longitud y el grado de interconexión de las mitocondrias. Cuando la fusión se vuelve más frecuente que la fisión, éstas tienden a volverse más alargadas e interconectadas, mientras que el predominio de la fisión conduce a la formación de mitocondrias más numerosas, pequeñas y distintivas. Varias enfermedades neurológicas hereditarias se deben a mutaciones en los genes que codifican los componentes de la maquinaria de fusión mitocondrial.

Las mitocondrias ocupan 15 a 20% del volumen de una célula hepática promedio de mamífero y contienen más de mil proteínas diferentes. Estos organelos se conocen por su función en la generación de moléculas de trifosfato de adenosina (ATP, adenosine triphosphate) que se usan en la mayor parte de las actividades celulares que requieren energía. Para lograr esta función, las mitocondrias a menudo se relacionan con pequeñas acumulaciones oleosas que contienen ácidos grasos, a partir de las cuales obtienen materia prima para oxidar. En los espermatozoides se observa una disposición muy impresionante de las mitocondrias; muchas veces se localizan en la porción intermedia, justo detrás del núcleo (fig. 5.1c). El movimiento de los espermatozoides es impulsado por el ATP producido en estos organelos. Las mitocondrias también son notables en muchas células vegetales, donde son los principales productores de ATP en los tejidos no fotosintéticos y proporcionan energía a las células de las hojas fotosintéticas durante los periodos de oscuridad.

Aunque el metabolismo energético ha sido el centro de interés en el estudio de las mitocondrias, estos organelos también participan en otras actividades no relacionadas. Por ejemplo, son el sitio de síntesis de muchas sustancias, incluidos ciertos aminoácidos y los grupos hemo que se muestran en las figuras 2.34 y 5.12. También tienen una participación vital en la captación y liberación de iones calcio, que son iniciadores esenciales de actividades celulares (sección 15.5), y junto con el retículo endoplásmico regulan de manera importante la concentración citoplásmica de Ca²⁺. Por ejemplo, cuando las concentraciones de calcio aumentan y llegan a niveles anormalmente altos en el citosol, parte del exceso de iones es captado por un transportador localizado en la membrana mitocondrial interna. El proceso de muerte celular, que tiene una función fundamental en la vida de todos los organismos multicelulares, también se regula en gran medida por fenómenos que ocurren en las mitocondrias (sección 15.8).

Membranas mitocondriales

Si se mira de cerca la micrografía electrónica de la figura 5.1b, se puede observar que el límite externo de una mitocondria contiene dos membranas: la membrana mitocondrial externa y la membrana mitocondrial interna. La primera rodea por completo a la mitocondria y sirve como límite externo. La segunda se subdivide en dos dominios interconectados que tienen diferentes proteínas residentes que desempeñan funciones distintas. Uno de éstos, la membrana limitante interna, se encuentra justo por dentro de la membrana mitocondrial externa (formando una envoltura de doble membrana) y es muy rica en moléculas encargadas de importar a las proteínas mitocondriales (fig. 8.47). El otro dominio se encuentra en el interior del organelo como una serie de hojas membranosas invaginadas, llamadas crestas. La función de las mitocondrias como transductores de energía tiene gran relación con las membranas de las crestas, que son muy prominentes en las micrografías electrónicas de estos organelos. Las crestas contienen una gran cantidad de superficie de membrana que aloja la maquinaria necesaria para la respiración aeróbica y la formación de ATP (fig. 5.22). Su organización se muestra de forma clara en la micrografía electrónica de barrido de la figura 5.3a y en la reconstrucción tridimensional de la figura 5.3b. La membrana limitante interna y las membranas de las crestas internas se ensamblan entre sí mediante conexiones estrechas llamadas uniones de las crestas, como se muestra en las ilustraciones de la figura 5.3c.

Las membranas de la mitocondria dividen al organelo en dos compartimientos acuosos, uno en el interior, llamado matriz, y otro entre las membranas interna y externa, conocido como espacio intermembrana. La matriz tiene una consistencia gelatinosa por la elevada concentración (hasta 500 mg/ml) de proteínas hidrosolubles. Las proteínas del espacio intermembranal son mejor conocidas por su participación en el inicio del suicidio celular o apoptosis, un tema que se analiza en la sección 15.8.

Las membranas externa e interna tienen propiedades muy diferentes. La membrana externa está formada por lípidos (casi 50%) y contiene una mezcla curiosa de enzimas que participan en actividades tan diversas como la oxidación de la adrenalina, la degradación del triptófano y la elongación de los ácidos grasos. En cambio, la membrana interna contiene más de 100 polipéptidos diferentes y muestra una proporción proteína/lípido muy alta (más de 3:1 por peso, lo cual corresponde a una molécula de proteína por cada 15 fosfolípidos). La membrana interna es rica en cardiolipina (difosfatidilglicerol), un fosfolípido inusual (cuya estructura se muestra en la figura 4.6). Ésta es una característica de las membranas plasmáticas bacterianas, de las que se presupone que evolucionó la membrana mitocondrial interna. La cardiolipina tiene una función importante para facilitar la actividad de las proteínas participantes en la síntesis de ATP. Se cree que la membrana mitocondrial externa es homóloga a una membrana exterior que forma parte de la pared celular de ciertas bacterias. La membrana mitocondrial y la membrana bacteriana externas contienen porinas, que son proteínas integrales que poseen un conducto interno relativamente grande (de 2 a 3 nm) rodeado por un barril de cadenas β (fig. 5.4). Las porinas de la membrana mitocondrial externa no son estructuras estáticas, como alguna vez se pensó, sino que pueden realizar un cierre reversible como respuesta a las condiciones dentro de la célula. Cuando los conductos de porina están abiertos, la membrana externa es permeable a moléculas como el ATP, el NAD y la coenzima A, que tienen funciones clave en el metabolismo energético dentro de la mitocondria. En cambio, la membrana interna de este organelo es impermeable; todas las moléculas y los iones requieren transportadores de membrana especiales para ingresar a la matriz.

Como se describe en secciones siguientes, la composición y la organización de la membrana mitocondrial interna son fundamentales para las actividades bioenergéticas de este organelo. La configuración de la membrana interna y la aparente fluidez de su bicapa facilitan las interacciones necesarias para la síntesis de ATP.

Matriz mitocondrial

Además de tener varias enzimas, la matriz mitocondrial contiene ribosomas (de tamaño mucho menor al de los que se encuentran en el citosol) y varias moléculas de ácido desoxirribonucleico (DNA; deoxyribonucleic acid), el cual es circular en plantas y animales superiores (fig. 5.3c). Por lo tanto, las mitocondrias tienen su propio material genético y los mecanismos para producir su propio ácido ribonucleico (RNA; ribonucleic acid) y proteínas. Este DNA no cromosómico es importante porque codifica un pequeño número de polipéptidos mitocondriales (13 en los seres humanos) que se integran a la membrana mitocondrial interna con los polipéptidos codificados por genes que se encuentran en el núcleo. El DNA mitocondrial humano también codifica dos RNA ribosómicos y 22 RNA de transferencia (tRNA; transfer RNA) que se utilizan en la síntesis de proteínas dentro del organelo. El DNA mitocondrial (mtDNA, mitochondrial RNA) es una reliquia. Se cree que es el legado de una bacteria aeróbica individual que estableció su residencia en el citoplasma de una célula primitiva que al final se convirtió en el ancestro de todas las células eucariotas (pág. 26). La mayor parte de los genes de este simbionte ancestral se perdió o se transfirió al núcleo en el transcurso de la evolución de la célula hospedadora, dejando sólo un puñado de genes para codificar algunas de las proteínas más hidrófobas de la membrana mitocondrial interna. Es interesante señalar que la polimerasa de RNA que sintetiza los diversos RNA mitocondriales no se relaciona con la enzima compuesta por múltiples subunidades encontrada en las células procariotas y en las eucariotas, sino que es una enzima de una sola unidad, similar en muchos aspectos a la de ciertos virus bacterianos (bacteriófagos), de la cual parece haber evolucionado. Por varias razones, el mtDNA es apropiado para su uso en el estudio de las migraciones y la evolución del ser humano. Por ejemplo, varias compañías emplean secuencias de mtDNA para rastrear el linaje de clientes que buscan sus raíces étnicas o geográficas.

Más adelante en este capítulo se regresará a la descripción de la configuración molecular de las membranas mitocondriales, pero primero se debe considerar la función de estos organelos en las vías oxidativas básicas de las células eucariotas, que se resumen en la figura 5.5. Sería útil examinar esta figura general y leer el pie de la misma antes de continuar con las siguientes descripciones detalladas de estas vías.

En el capítulo 3 se describen las etapas iniciales de la oxidación de los carbohidratos. A partir de la glucosa, los primeros pasos en el proceso oxidativo los llevan a cabo las enzimas de la glucólisis que se encuentran en el citosol (fig. 5.5). Las 10 reacciones que constituyen la vía glucolítica se ilustran en la figura 3.23; los pasos principales de la vía se resumen en la figura 5.6. Durante la glucólisis, sólo una pequeña fracción de la energía libre de glucosa queda disponible para la célula, la suficiente para la síntesis neta de sólo dos moléculas de ATP por cada molécula de glucosa oxidada (fig. 5.6). La mayor parte de la energía permanece almacenada en el piruvato. Cada molécula de dinucleótido de nicotinamida y adenina reducido (NADH, reduced nicotinamide adenine dinucleotide) producida durante la oxidación de gliceraldehído 3-fosfato (reacción 6 de la fig. 5.6) también lleva un par de electrones de alta energía.¹ Los dos productos de la glucólisis (piruvato y NADH) pueden procesarse de dos formas distintas, según sea el tipo de célula en el que se formen y la presencia o la ausencia de oxígeno.

Cuando hay oxígeno disponible, los organismos aerobios son capaces de extraer grandes cantidades de energía adicional del piruvato y el NADH producidos durante la glucólisis, suficiente para sintetizar más de 30 moléculas adicionales de ATP. Esta energía se extrae en las mitocondrias (fig. 5.5). Se comenzará con el piruvato y después se considerará el destino del NADH. Cada molécula de piruvato producida en la glucólisis se transporta a través de la membrana mitocondrial interna y llega hasta la matriz, donde se descarboxila para formar un grupo acetilo de dos carbonos (—CH₃COO⁻). Éste se transfiere a la coenzima A (un compuesto orgánico vitamínico complejo que deriva del ácido pantoténico) para producir acetil-CoA.

La descarboxilación del piruvato y la transferencia del grupo acetilo a la coenzima A (CoA) (figs. 5.5 y 5.7) junto con la reducción del dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD⁺, nicotinamide adenine dinucleotide) es una reacción que cataliza un complejo multienzimático gigante llamado piruvato deshidrogenasa, cuya estructura se muestra en la figura 2.39.

Ciclo del ácido tricarboxílico (TCA)

Una vez formada, la acetil-CoA ingresa a una vía cíclica, llamada ciclo del ácido tricarboxílico (TCA, tricarboxylic acid), en la que se oxida el sustrato y se conserva su energía. Excepto por la deshidrogenasa de succinato, que se une a la membrana interna, todas las enzimas del ciclo del TCA residen en la fase soluble de la matriz (fig. 5.5). El ciclo del TCA también se conoce como ciclo de Krebs en honor al bioquímico británico Hans Krebs, quien dilucidó dicha vía en el decenio de 1930. Cuando este investigador obtuvo suficiente evidencia para apoyar la idea de un ciclo metabólico, presentó los resultados a la publicación británica Nature. El documento le fue devuelto varios días después acompañado de una carta de rechazo. El editor había concluido que no era lo bastante importante para publicarlo. Krebs rápidamente divulgó el artículo en otra revista.

El primer paso del ciclo del TCA es la condensación del grupo acetilo de dos carbonos con un oxaloacetato de cuatro carbonos para formar una molécula de citrato de seis carbonos (fig. 5.7, paso 12). Durante el ciclo se reduce la longitud de la molécula de citrato, un carbono a la vez, lo que regenera la molécula de oxaloacetato de cuatro carbonos que puede condensarse con otra de acetil-CoA. Los dos carbonos que se desprenden durante el ciclo del TCA (que no son los mismos que ingresaron con el grupo acetilo) son los que se oxidan por completo hasta dióxido de carbono. Durante el ciclo del TCA ocurren cuatro reacciones en las que un par de electrones se transfieren de un sustrato a una coenzima aceptora de electrones. Tres de las reacciones reducen el NAD⁺ a NADH y una reacción reduce el dinucleótido de flavina y adenina (FAD; flavin adenine dinucleotide) a dinucleótido de flavina y adenina reducido (FADH₂, reduced flavin adenine dinucleotide) (fig. 5.7). La ecuación neta de las reacciones del ciclo del TCA puede escribirse de la siguiente manera:

El ciclo del TCA es una vía metabólica crítica. Si se considera su posición en el metabolismo general de la célula (fig. 5.8; véase también la fig. 3.22), se advierte que los metabolitos de este ciclo son los mismos compuestos generados en la mayoría de las vías catabólicas de la célula. Por ejemplo, la acetil-CoA es un producto final importante de varias vías catabólicas, incluida la degradación de ácidos grasos, los cuales se degradan dentro de la matriz de la mitocondria hasta unidades de dos carbonos (fig. 5.8a). Éstas entran al ciclo del TCA como acetil-CoA. El catabolismo de los aminoácidos también genera metabolitos del ciclo del TCA (fig. 5.8b), que entran a la matriz mediante sistemas de transporte especiales, localizados en la membrana mitocondrial interna. Parece que todas las macromoléculas que proporcionan energía a las células (polisacáridos, grasas y proteínas) se degradan hasta metabolitos del ciclo del TCA. Por lo tanto, la mitocondria se convierte en el centro de los pasos finales para la conservación de energía, sin importar cuál sea la naturaleza del material inicial.

Importancia de las coenzimas reducidas en la formación de ATP

A partir de la ecuación neta del ciclo del TCA resulta evidente que los productos primarios de la vía son las coenzimas reducidas FADH₂ y NADH, que contienen los electrones de alta energía removidos de varios sustratos durante su oxidación. El NADH también es uno de los productos de la glucólisis (junto con el piruvato). Las mitocondrias no son capaces de importar el NADH formado en el citosol durante la degradación de azúcares. En cambio, los electrones de dicha molécula se usan para reducir un metabolito de bajo peso molecular que puede: (1) entrar a la mitocondria (mediante una vía llamada lanzadera de malato-aspartato) y reducir ahí el NAD⁺ a NADH o (2) transferir sus electrones al FAD (por una vía llamada lanzadera de fosfato de glicerol que se muestra en la fig. 5.9) para producir FADH₂. Ambos mecanismos permiten que los electrones del NADH citosólico ingresen a la cadena mitocondrial de transporte de electrones y se utilicen en la formación de trifosfato de adenosina.

Una vez que se explicó la formación de NADH y FADH₂ en la glucólisis y en el ciclo del TCA, puede regresarse a los pasos que utilizan estas coenzimas reducidas para producir ATP. El proceso general puede dividirse en dos pasos, que se resumen a continuación:

Paso 1 (fig. 5.10). Los electrones de alta energía pasan del FADH₂ o del NADH al primero de una serie de portadores o acarreadores de electrones que constituyen la cadena transportadora de electrones, localizada en la membrana mitocondrial interna. Dichas partículas atómicas pasan a lo largo de la cadena respiratoria en reacciones que liberan energía. Éstas se vinculan con cambios conformacionales dependientes de energía de los portadores de electrones que mueven a los protones a través de la membrana mitocondrial interna. Como resultado, la energía liberada durante el transporte de electrones se almacena en forma de un gradiente electroquímico de protones a través de la membrana. De manera eventual, los electrones de baja energía se transfieren al aceptor final de electrones, es decir, el oxígeno molecular (O₂), que se reduce hasta formar agua.

Paso 2 (fig. 5.10). El movimiento controlado de protones de regreso a través de la membrana, mediante una enzima, proporciona la energía necesaria para fosforilar moléculas de bisfosfato de adenosina (ADP, adenosine diphosphate) y formar ATP. Peter Mitchell, de la University of Edinburgh, postuló en el año 1961 la importancia del movimiento de los protones para la formación de ATP. Los experimentos que condujeron a la aceptación del mecanismo quimiosmótico, como lo denominó Mitchell, se revisan en la sección “Vías experimentales”, que se encuentran el sitio de internet www.wiley.com/college/karp. El análisis de los dos pasos recién resumidos ocupa gran parte del resto de este capítulo.

Cada par de electrones transferido del NADH al oxígeno mediante la cadena transportadora de electrones libera la energía suficiente para impulsar la formación de casi tres moléculas de ATP. Cada par donado por el FADH₂ proporciona la energía necesaria para producir cerca de dos moléculas de ATP. Si se suman todas las moléculas de trifosfato de adenosina formadas a partir de una molécula de glucosa que se cataboliza por completo mediante glucólisis y el ciclo del TCA, la ganancia neta es de unas 36 moléculas de ATP (incluido el GTP formado por cada ronda del ciclo del TCA; paso 16 de la fig. 5.7). El número real de moléculas de ATP formadas por cada molécula de glucosa oxidada depende de las actividades particulares que realice la célula. En la sección “Perspectiva humana” se compara la importancia relativa de la glucólisis con la del ciclo del TCA (p. ej., metabolismo anaeróbico frente a metabolismo aeróbico), en la función de los músculos esqueléticos humanos.

Con frecuencia las mitocondrias se describen como centrales eléctricas en miniatura, puesto que extraen la energía de materiales orgánicos y la almacenan durante un lapso en forma de energía eléctrica. En términos más específicos, la energía obtenida de los sustratos se utiliza para generar un gradiente iónico a través de la membrana mitocondrial interna. Éste representa una forma de energía que puede aprovecharse para realizar un trabajo. En el capítulo 4 se describe la forma en que las células intestinales emplean un gradiente iónico a través de su membrana plasmática para transportar azúcares y aminoácidos fuera de la luz intestinal, de la misma forma que las células nerviosas usan un gradiente similar para conducir impulsos neurales. El uso de gradientes iónicos como forma de energía requiere varios componentes, incluidos un sistema para generar el gradiente, una membrana capaz de mantenerlo y los mecanismos para utilizarlo de tal manera que pueda realizar un trabajo.

Las mitocondrias emplean un gradiente iónico a través de su membrana interna para impulsar muchas actividades que requieren energía, en particular la síntesis de ATP. Cuando la formación de dicha molécula se impulsa con la energía liberada de los electrones removidos durante la oxidación de sustratos, el proceso se conoce como fosforilación oxidativa y se resume en la figura 5.10. Ésta puede compararse con la fosforilación en el nivel del sustrato, como se explica en la página 113; en dicho proceso se forma ATP de manera directa por la transferencia de un grupo fosfato de una molécula de sustrato a otra de ADP. De acuerdo con una estimación, la fosforilación oxidativa produce más de 2 × 10²⁶ moléculas (>160 kg) de ATP en el cuerpo humano cada día. El descubrimiento del mecanismo básico de la fosforilación oxidativa ha sido uno de los principales logros en el campo de la biología celular y molecular; aún continúa la investigación de los eventos por descubrir. Para comprender el mecanismo de este proceso, primero es necesario considerar cómo es que la oxidación de un sustrato puede liberar energía libre.

Potenciales de oxidación-reducción

Si se comparan varios agentes oxidantes, éstos pueden ordenarse en una serie de acuerdo con su afinidad por los electrones: mientras mayor sea la atracción, más potente será el agente oxidante. Los agentes reductores también pueden clasificarse según el mismo criterio: cuanto menor sea la afinidad (mayor facilidad para liberar los electrones), más fuerte será el agente reductor. En términos cuantificables, los agentes reductores se ordenan de acuerdo con su potencial para transferir electrones; los agentes que poseen un potencial mayor, como el NADH, son reductores fuertes, mientras que aquellos con capacidad baja, como el H₂O, son reductores débiles. Las sustancias oxidantes y las reductoras se encuentran en parejas, como NAD⁺ y NADH, que difieren en cuanto a su número de electrones. Las moléculas reductoras potentes se unen con agentes oxidantes débiles, y viceversa. Por ejemplo, el NAD⁺ (de la pareja NAD⁺-NADH) es un agente oxidante débil, mientras que el O₂ (de la pareja O₂-H₂O) es una molécula oxidante fuerte.

Puesto que el movimiento de electrones genera separación de la carga, la afinidad de las sustancias por dichas partículas puede medirse con instrumentos que detectan el voltaje (fig. 5.11). Lo que se mide en una pareja determinada es un potencial de oxidación-reducción (o potencial redox) relativo al potencial de alguna pareja estándar (en este caso el hidrógeno [H⁺-H₂], el cual se eligió de forma arbitraria). Como sucede con los cambios de energía libre, donde se utilizaba el cambio de energía libre estándar (ΔG°), se emplea una asignación similar para las parejas redox. El potencial redox estándar (E₀) de una pareja determinada se designa como el voltaje producido por media celda (sólo con miembros de una pareja) en la que cada integrante está presente en condiciones normales (como en la figura 5.11). Las condiciones estándar son una concentración de 1.0 M para los solutos y los iones y una presión de una atmósfera para los gases (p. ej., H₂) a 25°C. El potencial redox estándar para la reacción de oxidación-reducción que incluye al hidrógeno (2 H⁺ + 2 electrones → H₂) es 0.00 V. El cuadro 5.1 presenta los potenciales redox de algunas parejas de importancia biológica. El valor del par de hidrógeno en el cuadro no es 0.00, sino −0.42 V. Este número representa el potencial cuando la concentración de H⁺ es 10⁻⁷ M (pH de 7.0) en lugar de 1.0 M (pH de 0.0), que tendría poca aplicación fisiológica. Cuando se calcula con un pH de 7, el potencial redox estándar se indica con el símbolo $E0′$ en lugar de E₀. La asignación del signo (positivo o negativo) a las parejas es arbitraria, varía entre las distintas disciplinas y se considera de la siguiente manera. A las parejas cuyos agentes reductores son mejores donadores de electrones se les asignan potenciales redox más negativos. Por ejemplo, el potencial redox estándar para la pareja NAD⁺-NADH es −0.32 V (cuadro 5.1). El acetaldehído es un agente reductor más fuerte que el NADH y la pareja acetato-acetaldehído tiene un potencial redox estándar de −0.58 V. Las parejas cuyos agentes oxidantes poseen mayor afinidad por los electrones que el NAD⁺, tienen potenciales redox más positivos.

Como cualquier reacción espontánea, las reacciones de oxidación-reducción también se acompañan de pérdida de energía. El cambio estándar de energía libre durante una transformación del siguiente tipo:

A_(ox) + B_(red) ⇌ A_(red) + B_(ox)

puede calcularse a partir de los potenciales redox estándar de las dos parejas involucradas utilizando la siguiente ecuación:

donde n es el número de electrones transferidos en la reacción, F es la constante de Faraday (23.063 kcal/V · mol) y $ΔE0′$ es la diferencia en voltios entre los potenciales redox estándar de las dos parejas. Mientras más amplia sea la diferencia del potencial redox estándar entre ambos pares, mayor será la formación de los productos en condiciones estándar hasta alcanzar un estado de equilibrio. Considérese una reacción en la que el NADH, un agente reductor potente, se oxida con oxígeno molecular, un agente oxidante fuerte.

Los potenciales redox estándar de las dos parejas pueden escribirse de la siguiente manera:

El cambio de voltaje en la reacción total es igual a la diferencia entre los dos valores de $E0′(ΔE0′)$:

que es una medida de la energía libre que se desprende cuando el NADH es oxidado por el oxígeno molecular en condiciones estándar. Si se sustituye este valor en la ecuación previa,

la diferencia en la energía libre estándar (ΔG°′) es −52.6 kcal/mol. Tal y como ocurre con otras reacciones, los valores reales de ΔG dependen de las concentraciones relativas de los reactivos y los productos (versiones oxidadas y reducidas de los compuestos) presentes en una célula en un instante determinado. Al margen de lo anterior, parece que el descenso de energía libre de un par de electrones al pasar del NADH al oxígeno molecular (ΔG°′ = −52.6 kcal/mol) debe ser suficiente para impulsar la formación de varias moléculas de ATP (ΔG°′ = +7.3 kcal/mol) aun en condiciones celulares, en las que las proporciones ATP/ADP son mucho más altas que en situaciones estándar. La transferencia de esta energía del NADH al ATP dentro de la mitocondria ocurre en una serie de pequeños pasos que la liberan. Estos eventos son el tema principal del resto del capítulo.

Los electrones se transfieren al NAD⁺ (o al FAD) dentro de la mitocondria a partir de numerosos sustratos del ciclo del TCA, el isocitrato, el α-cetoglutarato, malato y succinato (reacciones 14, 15-16, 19 y 17 de la figura 5.7, en dicho orden). Los primeros tres de estos intermediarios tienen potenciales redox con valores negativos lo suficientemente altos (cuadro 5.1) para transferir electrones al NAD⁺ en las condiciones que prevalecen en la célula.² En cambio, la oxidación de succinato a fumarato, que tiene un potencial redox más positivo, procede por la reducción del FAD, una coenzima con una mayor afinidad por los electrones que el NAD⁺.

Transporte de electrones

Cinco de las nueve reacciones ilustradas en la figura 5.7 son catalizadas por deshidrogenasas, enzimas que transfieren pares de electrones de sustratos a coenzimas. Cuatro de estas reacciones generan NADH y una produce FADH₂. Las moléculas de NADH, que se forman en la matriz mitocondrial, se disocian de sus deshidrogenasas respectivas y se unen a la deshidrogenasa de NADH, una proteína integral de la membrana mitocondrial interna (fig. 5.17). A diferencia de las otras enzimas del ciclo del TCA, la deshidrogenasa de succinato (la enzima que cataliza la formación de FADH₂ [fig. 5.7, reacción 17]), es un componente de la membrana mitocondrial interna. En cualquier caso, los electrones de alta energía unidos a NADH o a FADH₂ se transfieren a través de una serie de acarreadores específicos de electrones que constituyen la cadena de transporte de electrones (o cadena respiratoria) de la membrana mitocondrial interna.

Tipos de portadores de electrones

La cadena transportadora de electrones se compone de cinco tipos de portadores de electrones unidos a la membrana: flavoproteínas, citocromos, átomos de cobre, ubiquinona y proteínas con hierro y azufre. Excepto por la ubiquinona, todos los centros de redox dentro de la cadena respiratoria que aceptan y donan electrones son grupos prostéticos, es decir, componentes que no son aminoácidos, pero que mantienen una relación estrecha con las proteínas.

• Las flavoproteínas consisten en un polipéptido unido con fuerza a uno de dos grupos prostéticos relacionados; FAD o mononucleótido de flavina (FMN; flavin mononucleotide) (fig. 5.12a). Los grupos prostéticos de las flavoproteínas derivan de la riboflavina (vitamina B₂) y cada uno es capaz de aceptar y donar dos protones y dos electrones. Las principales flavoproteínas de las mitocondrias son la deshidrogenasa de NADH de la cadena de transporte de electrones y la deshidrogenasa de succinato del ciclo del TCA.

• Los citocromos son proteínas que contienen grupos prostéticos hemo (como el de la mioglobina, descrito en la página 58). El átomo de hierro de un grupo hemo presenta una transición reversible entre los estados oxidados Fe³⁺ y Fe²⁺ como resultado de la aceptación y la pérdida de un solo electrón (fig. 5.12b). Hay tres tipos distintos de citocromos (a, b y c) en la cadena transportadora de electrones, que difieren entre sí por sustituciones en el grupo hemo (que se indican como porciones sombreadas azules en la figura 5.12b).

• Tres átomos de cobre, que se localizan dentro de un solo complejo proteínico de la membrana mitocondrial interna (fig. 5.20), aceptan y donan un solo electrón cuando alternan entre los estados Cu²⁺ y Cu¹⁺.

• La ubiquinona (UQ o coenzima Q) es una molécula liposoluble que contiene una cadena hidrófoba larga compuesta de unidades isoprenoides de cinco carbonos (fig. 5.12c). Al igual que las flavoproteínas, cada ubiquinona puede aceptar y donar dos electrones y dos protones. La molécula en estado de reducción parcial es el radical libre ubisemiquinona y la molécula reducida por completo es el ubiquinol (UQH₂). La molécula UQ/UQH₂ permanece dentro de la bicapa lipídica de la membrana, donde se puede difundir de manera lateral con rapidez.

• Las proteínas con hierro y azufre son proteínas que contienen hierro, en las cuales los átomos de este metal no se localizan dentro de un grupo hemo, sino que están unidos a átomos de azufre inorgánico como parte de un centro de hierro-azufre. Los núcleos más frecuentes contienen dos o cuatro átomos de hierro y azufre (designados [2Fe-2S] y [4Fe-4S]), enlazados a la proteína a través de residuos de cisteína (fig. 5.13). Aunque un solo centro puede tener varios átomos de hierro, el complejo entero es capaz de aceptar y donar un solo electrón. El potencial redox de un centro hierro-azufre depende de la hidrofobicidad y la carga de los aminoácidos que constituyen su ambiente local. Como grupo, las proteínas con hierro-azufre tienen potenciales que van de −700 mV a cerca de +300 mV, lo cual corresponde a una porción considerable del espectro en el que ocurre el transporte de electrones. Se han identificado más de 12 centros de hierro-azufre diferentes dentro de las mitocondrias.

Los acarreadores de la cadena transportadora de electrones están dispuestos en orden de potencial redox positivo creciente (fig. 5.14). Cada transportador se reduce con la ganancia de electrones a partir del portador precedente en la cadena y luego se oxida por el paso de electrones al portador que le sigue. Por lo tanto, los electrones se pasan de un portador al siguiente y pierden energía conforme se desplazan “colina abajo” a lo largo de la sucesión. El aceptor final de esta “cadena de cubos” de electrones es el O₂, el cual acepta los electrones con energía agotada y se reduce para formar agua. Britton Chance y colaboradores; de la University of Pennsylvania; descubrieron la secuencia específica de los portadores que constituyen la cadena transportadora de electrones con diversos inhibidores que bloquean el transporte de dichas partículas en sitios específicos a lo largo de la ruta. En la figura 5.15 se muestra una analogía del concepto de estos experimentos. En cada caso se agregó un inhibidor a las células y se identificó el estado de oxidación de varios portadores de electrones en las células inhibidas. Esta identificación puede efectuarse con un espectrofotómetro que mide la absorción de la luz de una muestra en varias longitudes de onda. La medición revela si un portador particular se encuentra en estado reducido u oxidado. En el caso que se presenta en la figura 5.15, la adición de rotenona bloquea el transporte de electrones en un sitio que deja al NADH y al FMNH₂ en estado reducido y a los citocromos b, c y a en estado oxidado. Este resultado indica que el NAD y el FMN se localizan “antes” del bloqueo. En cambio, un inhibidor (p. ej., la antimicina A) que actúa entre los citocromos b y c dejaría al NADH, al FMNH₂, a la QH₂ y al citocromo b en el estado reducido. Por consiguiente, al identificar los componentes reducidos y oxidados en presencia de distintos inhibidores, puede establecerse la secuencia de los portadores.

La tendencia de los electrones a transferirse de un transportador al siguiente depende de la diferencia de potencial entre los dos centros redox, pero la velocidad de transferencia guarda relación con las actividades catalíticas de las proteínas implicadas. Esta diferenciación entre la termodinámica y la cinética es similar a la explicada en la página 95 respecto de la actividad de las enzimas. Ciertos estudios indican que los electrones pueden transcurrir distancias considerables (de 10 a 20 Å) entre centros redox adyacentes y que es probable que los electrones fluyan por “túneles” especiales formados por una serie de enlaces covalentes y de hidrógeno que se extienden entre partes de numerosos residuos de aminoácidos. La figura 5.16 muestra un ejemplo de una de las vías que involucran al citocromo c.

Complejos transportadores de electrones

Cuando se rompe la membrana mitocondrial interna con un detergente, pueden aislarse los diversos portadores de electrones como parte de cuatro complejos transmembrana asimétricos distintos que se identifican como complejos I, II, III y IV (fig. 5.17). A cada uno de éstos se les puede asignar una función distinta en la vía general de oxidación. Dos componentes de la cadena transportadora de electrones, el citocromo c y la ubiquinona, no son parte de ninguno de los cuatro complejos. La segunda existe como parte de una reserva de moléculas disueltas en la bicapa lipídica y el citocromo c es una proteína soluble localizada en el espacio intermembrana. Se cree que la ubiquinona y el citocromo c se mueven dentro o a lo largo de la membrana y transfieren electrones entre los complejos proteínicos grandes y relativamente inmóviles. Una vez dentro de alguno de estos, los electrones viajan a lo largo de trayectos definidos (como los que se ilustran en la figura 5.16) entre centros redox adyacentes cuyas posiciones relativas están fijas.

Cuando el NADH es el donador de electrones, estos entran a la cadena respiratoria a través del complejo I, el cual los transfiere a la ubiquinona, generando ubiquinol (figs. 5.12 y 5.17). A diferencia del NADH, que puede difundirse lejos de estas deshidrogenasas solubles, el FADH₂ permanece unido mediante un enlace covalente a la deshidrogenasa de succinato, un componente del complejo II. Cuando el donador es el FADH₂, los electrones pasan de manera directa a la ubiquinona y evitan el paso a través del extremo final de la cadena, que tiene un potencial redox demasiado negativo para aceptar los electrones con menor energía del nucléotido de flavina (fig. 5.14).

Si se examinan los potenciales redox de los portadores sucesivos en la figura 5.14, resulta evidente que hay tres sitios en los que la transferencia de electrones se acompaña de una liberación notable de energía libre. Cada una de estas regiones, llamadas sitios de unión (acoplamiento), ocurre entre portadores que son parte de uno de los tres complejos, I, III y IV. La energía disponible, que se libera cuando los electrones pasan por estos tres sitios, se conserva mediante la translocación de protones de la matriz a través de la membrana interna hacia el espacio intermembrana. Estos tres complejos proteínicos se describen a menudo como bombas de protones. A diferencia de otros iones (p. ej., Na⁺ o Cl⁻) que tienen que difundirse por sí mismos toda la distancia por recorrer, los iones de hidrógeno pueden “brincar” a través de un conducto al intercambiarse con otros protones presentes en el trayecto (como se muestra en la figura 5.19b). Dichas vías de conducción de protones (o “cables protónicos”) pueden identificarse porque consisten en cordones de residuos ácidos, residuos unidos a hidrógeno, moléculas de agua atrapadas o los tres componentes de consuno. Las translocaciones de protones por estos tres complejos transportadores de electrones establecen el gradiente de protones que impulsa la síntesis de ATP. La capacidad de estas notables máquinas moleculares, para actuar como unidades independientes de translocación de protones, puede demostrarse si se purifica cada una de ellas y se les incorpora de manera individual en vesículas artificiales de lípidos. Cuando se aporta un donador de electrones adecuado, estas vesículas portadoras de proteínas son capaces de aceptar electrones y usar la energía liberada para bombear protones a través de la membrana de la vesícula (fig. 5.18).

En los últimos años ha habido grandes avances en la descripción de la configuración molecular de todos los complejos proteínicos de la membrana interna (fig. 5.17b). Los investigadores ya no se preguntan cómo se ven estas proteínas; en cambio, utilizan la abundante información estructural para comprender cómo funcionan. A continuación se analizan de forma breve las versiones que tienen los mamíferos de cada uno de estos complejos transportadores de electrones, que en conjunto contienen cerca de 70 polipéptidos diferentes. Las versiones bacterianas son mucho mas sencillas que sus contrapartes en los mamíferos y contienen muchas menos subunidades. Las subunidades adicionales de los complejos de los mamíferos no poseen centros redox y se cree que funcionan en la regulación o el ensamble del complejo y no en el transporte de electrones. En otras palabras, el proceso básico del transporte de electrones durante la respiración ha permanecido sin cambios desde su evolución hace miles de millones de años en los ancestros procariotas.

Complejo I (o deshidrogenasa de NADH) El complejo I es la puerta de entrada a la cadena transportadora de electrones y cataliza la transferencia de un par de electrones del NADH a la ubiquinona (UQ) para formar ubiquinol (UQH₂). La versión de los mamíferos del complejo I es un conglomerado enorme con forma de L que contiene por lo menos 45 subunidades diferentes y representa una masa molecular cercana a 1 millón de daltones. Como se muestra en las figuras 5.17b y 5.19a, en promedio, la mitad del complejo consiste en un dominio hidrófilo que sobresale al interior de la matriz, en tanto que el segmento hidrófobo restante del complejo está incluido en la membrana. Los genes mitocondriales codifican siete de las subunidades (todas polipéptidos hidrófobos que abarcan toda la membrana) y muestran homología con los polipéptidos bacterianos. En conjunto, el dominio hidrófilo y los segmentos embebidos en la membrana del complejo desempeñan dos actividades diferentes que son necesarias en la cadena de transporte electrónico: la transferencia de electrones y la translocación de protones.

Todos los componentes necesarios para la transferencia electrónica están dentro del segmento hidrófilo del complejo (fig. 5.19b). La cadena de portadores de electrones comienza con una flavoproteína que contiene FMN y que oxida al NADH en la parte más alta del complejo gigante. Más adelante, los electrones son transferidos a través de siete centros de hierro-azufre distintos dentro del dominio hidrófilo y tal paso termina con la transferencia de electrones a una molécula de ubiquinona unida a proteína, situada cerca de los límites de la membrana (también existen un octavo grupo de Fe-S y tal vez una segunda molécula de quinona, pero no se manifiestan en la vía directa de la transferencia electrónica). Según se piensa, el paso de un par de electrones del NADH a la ubiquinona se acompaña del desplazamiento de cuatro protones desde la matriz hasta el interior del espacio intermembrana. El conocimiento de la estructura del complejo I (fig. 5.19a) ha permitido plantear una propuesta que explica la forma en que el transporte electrónico a través del componente periférico del complejo puede impulsar la translocación de protones a través de la porción distante embebida en la membrana. En la figura 5.19b se advierte que el dominio transmembrana del complejo contiene una hélice α muy larga, que se ha denominado HL (señalada en color púrpura), que sigue una orientación casi paralela a la superficie de la membrana. Dicha hélice, que transcurre a casi todo lo largo del dominio de membrana, está en contacto directo con tres hélices discontinuas transmembrana (señaladas con los colores violeta, azul y verde olivo). Cada una de las hélices discontinuas es parte de la mitad de un conducto. Cada par de medios conductos está unido por una red de cadenas laterales de aminoácidos polares para formar un canal completo potencial para la translocación de protones a través de la membrana. Es probable que un cuarto conducto transportador de protones esté cerca de los límites con el dominio soluble, como se demuestra en la figura 5.19b. Se ha planteado que el desplazamiento de electrones hasta la ubiquinona induce un cambio de conformación en el complejo, que origina el desplazamiento lateral de la hélice HL (hacia la región derecha en la figura 5.19b); ello a su vez origina una inclinación de las hélices transmembrana que cambia el entorno iónico de algunos residuos que transfieren protones, provocando el desplazamiento de éstos a través de la membrana (flechas negras descendentes). Los autores de tal planteamiento comparan el mecanismo de acción del complejo I con el de una máquina de vapor, en el que la hélice HL actúa como un pistón que impulsa el desplazamiento de los elementos de la máquina hacia abajo.

Hay que destacar que la disfunción del complejo I se ha vinculado con algunas enfermedades neurodegenerativas, como se discute en la sección “Perspectiva humana” de la página 208).

Complejo II (o deshidrogenasa de succinato) El complejo II está formado por cuatro polipéptidos: dos subunidades hidrófobas que fijan la proteína a la membrana y dos subunidades hidrófilas que comprenden la enzima del ciclo del TCA, llamada deshidrogenasa de succinato. El complejo II suministra una vía para alimentar al FAD y a la ubiquinona con electrones de baja energía (aquellos con un potencial cercano a 0 mV) del succinato (figs. 5.14 y 5.17). El trayecto del FADH₂, localizado en el sitio catalítico, a la ubiquinona mueve a los electrones una distancia de 40 Å a través de tres cúmulos diferentes de hierro-azufre. El complejo II también contiene un grupo hemo, el cual se piensa que atrae a los electrones que se han escapado, lo que previene que se formen radicales superóxido destructivos (pág. 35). La transferencia de electrones a través del complejo II no se acompaña de translocación de protones.

Complejo III (o citocromo bc₁) El complejo III cataliza la transferencia de electrones del ubiquinol al citocromo c. Las evaluaciones experimentales sugieren que se bombean cuatro protones a través de la membrana por cada par de electrones que se transfiere por el complejo III. Los protones se liberan hacia el espacio intermembrana en dos pasos separados, impulsados por la energía que se libera cuando dos electrones se separan entre sí y pasan por diferentes vías a través del complejo. Dos protones provienen de la molécula de ubiquinol que ingresó al complejo. Dos más se retiran de la matriz y se trasladan a través de la membrana como parte de una segunda molécula de ubiquinol. Tres de las subunidades del complejo III contienen grupos redox: el citocromo b posee dos moléculas “hemo b” con diferentes potenciales redox, citocromo c₁ y una proteína que contiene hierro y azufre. El citocromo b es el único polipéptido del complejo que es codificado por un gen mitocondrial.

Complejo IV (u oxidasa de citocromo c) El paso final en el transporte de electrones en una mitocondria es la transferencia sucesiva de dichas partículas del citocromo c reducido al oxígeno, de acuerdo con la siguiente reacción:

Para reducir una molécula completa de O₂,

La reducción de O₂ la cataliza el complejo IV, el cual es una enorme estructura de polipéptidos conocida como citocromo oxidasa. Esta molécula fue el primer componente de la cadena de transporte de electrones que se demostró que actúa como bomba de protones, lo cual se llevó a cabo con el experimento que se muestra en la figura 5.18, en el cual se incorporó la enzima purificada en vesículas formadas por una bicapa lipídica artificial (liposomas). La adición del citocromo c reducido al medio se acompañó de la expulsión de iones H⁺ de las vesículas, lo cual se cuantificó como una disminución del pH circundante. Sea dentro de un liposoma o en la membrana mitocondrial interna, la translocación de protones se suma a cambios de la conformación generados por la liberación de energía que acompaña a la transferencia de electrones. Se cree que por cada molécula de O₂ reducida por la oxidasa de citocromo (cyt, cytochrome) se captan ocho protones de la matriz. Cuatro de éstos se consumen en la formación de dos moléculas de agua, como se indicó antes; los cuatro restantes se trasladan a través de la membrana y se liberan en el espacio intermembrana (fig. 5.17). Por consiguiente, la reacción total puede escribirse de la siguiente manera:

Los seres humanos producen cerca de 300 ml de “agua metabólica” al día mediante esta reacción. Se puede señalar que varios venenos respiratorios potentes, incluidos el monóxido de carbono (CO), la azida (N₃⁻) y el cianuro (CN⁻), ejercen su efecto tóxico al unirse al sitio hemo a₃ de la citocromo oxidasa. (El monóxido de carbono también se une al grupo hemo de la hemoglobina.)

Una mirada más cercana a la citocromo oxidasa

La citocromo oxidasa consta de 13 subunidades, tres de las cuales son codificadas por el genoma mitocondrial y contienen los cuatro centros redox de la proteína. Un desafío importante para los investigadores consiste en explicar cómo portadores, que sólo son capaces de transferir electrones individuales, pueden reducir una molécula de O₂ a dos moléculas de H₂O, un proceso que requiere cuatro electrones (junto con cuatro protones). De manera importante, el proceso debe ser muy eficiente debido a que la célula trata con sustancias muy peligrosas; la liberación “accidental” de las especies de oxígeno parcialmente reducidas puede dañar todas las macromoléculas de la célula (pág. 35).

El movimiento de electrones entre los centros redox de la citocromo oxidasa se muestra en la figura 5.20. Los electrones se transfieren uno a la vez del citocromo c, a través de un centro de cobre bimetálico (Cu_A) de la subunidad II, a un grupo hemo a de la subunidad I. De ahí, los electrones se pasan a un centro redox localizado en la subunidad I que contiene un segundo grupo hemo (a₃) y otro átomo de cobre (Cu_B) situado a menos de 5 Å de distancia. La aceptación de los primeros dos electrones reduce el centro binuclear a₃-Cu_B de acuerdo con la siguiente reacción:

Una vez que el centro binuclear acepta su segundo electrón, una molécula de O₂ se une a él. El doble enlace O=O se rompe cuando los átomos de oxígeno aceptan un par de electrones del centro binuclear a₃-Cu_B reducido, lo que quizá forma un anión peróxido reactivo O₂²⁻.

En etapas subsiguientes, el centro binuclear acepta dos electrones más provenientes del citocromo c y cuatro protones de la matriz, con lo cual se forman dos moléculas de agua. Por cada protón que se retira de la matriz, queda un exceso de carga negativa (en forma de un grupo OH⁻), lo que contribuye en forma directa al gradiente electroquímico a través de la membrana mitocondrial interna.

Como se mencionó antes, los protones captados de la matriz se utilizan de dos formas muy distintas. Por cada molécula de O₂ que se reduce a dos de H₂O por acción de la citocromo oxidasa en esta reacción química: (1) se consumen cuatro iones H⁺ y (2) se trasladan cuatro más a través de la membrana mitocondrial interna. Los primeros cuatro protones pueden denominarse de “sustrato” (o químicos) y los últimos cuatro pueden referirse como protones “bombeados”. El movimiento de ambos grupos de protones contribuye al gradiente electroquímico a través de la membrana.

Con la publicación de la estructura cristalina tridimensional de la citocromo oxidasa fue posible la búsqueda de vías por las cuales podrían moverse los protones de sustrato y los bombeados a través de la enorme proteína. Algunos investigadores han identificado posibles conductos de protones dentro de la molécula, pero su función aún no se confirma de manera experimental. Por desgracia, los modelos estructurales estáticos no pueden revelar por sí mismos los movimientos dinámicos que ocurren dentro de la proteína durante su función. Es probable que la energía liberada por la reducción de O₂ se utilice para impulsar los cambios conformacionales que alteran los estados de ionización y las localizaciones precisas de las cadenas laterales de los aminoácidos ubicados dentro de estos conductos. A su vez, estos cambios podrían promover el movimiento de iones H⁺ a través de la proteína, como ocurre durante el transporte de electrones en el complejo I (fig. 5.19b).

Ya se mencionó que la energía libre producida durante el transporte de electrones se utiliza para mover protones de la matriz hacia el espacio intermembrana y el citosol. La translocación de protones a través de la membrana interna es electrogénica (produce voltaje) porque aumenta la cantidad de cargas positivas en el espacio intermembrana y el citosol e incrementa la cantidad de cargas negativas dentro de la matriz. Por lo tanto, hay dos componentes del gradiente de protones que deben considerarse. Uno de ellos es la diferencia en la concentración de iones hidrógeno entre un lado de la membrana y el otro, es decir, un gradiente de pH (ΔpH). El otro componente es el voltaje (ψ) que se produce por la separación de carga a través de la membrana. Un gradiente que tiene un componente de concentración (químico) y otro eléctrico (voltaje) es un gradiente electroquímico (pág. 148). La energía presente en ambos componentes del gradiente electroquímico puede combinarse y expresarse como fuerza protón-motriz (Δp), que se mide en milivoltios. En consecuencia:

Δp = ψ −2.3 (RT/F) ΔpH

Como 2.3 RT/F es igual a 59 mV a 25°C, la ecuación³ puede escribirse como sigue:

Δp = ψ −59 ΔpH

La contribución del potencial eléctrico a la fuerza protón-motriz comparada con la participación del gradiente de pH depende de las propiedades de permeabilidad de la membrana interna. Por ejemplo, si el movimiento de protones hacia el exterior durante el transporte de electrones se acompaña de iones cloro con carga negativa, el potencial eléctrico (ψ) se reduce sin afectar el gradiente de protones (ΔpH). Las mediciones que se han realizado en varios laboratorios sugieren que las mitocondrias con actividad respiratoria generan una fuerza protón-motriz cercana a 220 mV a través de su membrana interna. En las mitocondrias de los mamíferos, cerca de 80% de la energía libre de Δp está representada por el componente de voltaje y el otro 20% por la diferencia en la concentración de protones (alrededor de 0.5 a 1 unidad de pH de diferencia). Si la diferencia en la concentración de protones fuera mucho mayor que ésta, es probable que afectará la actividad de las enzimas citoplásmicas. El voltaje transmembrana a través de la membrana mitocondrial interna puede visualizarse con tintes liposolubles con carga positiva que se distribuyen a través de las membranas en proporción al potencial eléctrico (fig. 5.21).

Cuando las células se tratan con cierto tipo de agentes liposolubles, en particular con 2,4-dinitrofenol (DNP, dinitrophenol), continúa la oxidación de sustratos sin poder generar ATP. En otras palabras, el DNP desacopla la oxidación de la glucosa y la fosforilación del ADP. Gracias a esta propiedad, dicha molécula se utiliza bastante en el laboratorio para inhibir la formación de ATP. Durante el decenio de 1920, unos cuantos médicos prescribían DNP como agente para reducir el peso corporal. Cuando se exponen a este fármaco, las células en los pacientes obesos continúan la oxidación de sus reservas de grasa en un intento vano para mantener los niveles normales de ATP. La práctica cesó por la muerte de varios individuos expuestos al fármaco. Con la formulación de la teoría quimioosmótica y la confirmación de que las mitocondrias generan un gradiente de protones, se comprendió el mecanismo de acción del DNP. Este agente desacopla la oxidación y la fosforilación porque se combina con protones y, debido a su solubilidad en lípidos, los transporta a través de la membrana mitocondrial interna en favor del gradiente electroquímico.

Para que se mantenga una fuerza protón-motriz es necesario que la membrana mitocondrial interna permanezca muy impermeable a los protones. De lo contrario, el gradiente establecido por el transporte de electrones se disipa en poco tiempo por el escape de protones de regreso a la matriz, lo que conduce a la liberación de energía en forma de calor. Resultó sorprendente descubrir que la membrana mitocondrial interna de ciertas células contiene proteínas que actúan como desacopladores naturales (endógenos). Estas moléculas, llamadas proteínas de desacoplamiento (UCP, uncoupling proteins), son muy abundantes en el tejido adiposo pardo de los mamíferos, que funciona como fuente de producción de calor durante la exposición a bajas temperaturas. Los seres humanos lactantes también dependen de depósitos de grasa parda para mantener la temperatura corporal. Hasta hace poco se pensaba que los humanos adultos casi no tenían tejido adiposo pardo, pero algunos estudios recientes han indicado la presencia de adipocitos multiloculados en el cuello y la mitad superior del tórax. Al igual que en los lactantes, las células en cuestión se activan cuando las personas están expuestas a temperaturas frías. La UCP1 es el centro de atención de varias compañías farmacéuticas, quienes esperan desarrollar productos que estimulen a esta proteína como parte de un régimen de pérdida de peso. Otras isoformas de UCP (UCP2 a UCP5) se encuentran en varios tejidos, en especial en células del sistema nervioso, pero sus funciones son tema de controversia. Por ejemplo, se cree que las UCP presentes en la membrana mitocondrial interna impiden la acumulación de una fuerza protón-motriz desmedida. Si tal estado de alta energía se creara, éste podría bloquear el paso de electrones a través de los complejos respiratorios, causando el escape de electrones y la producción de radicales de oxígeno reactivos.

Los experimentos que permitieron la aceptación de la fuerza protón-motriz como un intermediario en la formación de ATP se revisan en la sección “Vías experimentales”, la cual se puede encontrar en la página de internet www.wiley.com/college/karp.

Una vez descrita la forma en que el transporte de electrones genera un gradiente electroquímico de protones a través de la membrana mitocondrial interna, se puede describir la maquinaria que utiliza la energía almacenada en este gradiente para impulsar la fosforilación del ADP.

A principios del decenio de 1960, Humberto Fernandez-Moran, del Massachussetts General Hospital, examinó mitocondrias aisladas con la técnica de tinción negativa, un método novedoso en dicha época. Fernandez-Moran descubrió una capa de esferas unidas mediante tallos a la cara interior (matriz) de la membrana interna (fig. 5.22). Unos cuantos años después, Efraim Racker, de la Cornell University aisló dichas esferas de la membrana interna, a las que llamó factor de acoplamiento 1, o tan sólo F₁. Este investigador descubrió que las partículas F₁ se comportaban como una enzima que hidroliza el ATP, es decir, una ATPasa. A primera vista, parece ser un hallazgo peculiar. ¿Por qué tendrían las mitocondrias una enzima predominante que hidroliza la sustancia que se supone producen?

Si se considera que la hidrólisis del ATP es la reacción inversa a su formación, la función de las esferas F₁ se torna más evidente; contiene el sitio catalítico en el que ocurre por lo general la formación de ATP. Hay que recordar lo siguiente:

1. Las enzimas no afectan la constante de equilibrio de la reacción que catalizan.

2. Las enzimas son capaces de catalizar las reacciones en ambos sentidos.

Por consiguiente, la dirección de una reacción catalizada por una enzima en un momento determinado depende de las condiciones prevalecientes. Esto se demuestra de manera adecuada en experimentos realizados con otras ATPasas, como la bomba de Na⁺/K⁺-ATPasa de la membrana plasmática (pág. 158). Cuando se explicó el funcionamiento de esta proteína en el capítulo 4, se describió como una enzima que utiliza la energía obtenida de la hidrólisis del ATP para exportar Na⁺ e importar K⁺ contra sus gradientes respectivos. En la célula, ésta es la única función de la enzima. Sin embargo, en condiciones experimentales, puede catalizar la formación de ATP en lugar de su hidrólisis (fig. 5.23). Para lograr tales condiciones, se prepararon fantasmas de eritrocitos (pág. 145) con concentraciones internas de K⁺ y externas de Na⁺ muy altas, mayores a las existentes en el cuerpo. En estas condiciones, el K⁺ sale de la “célula” y el Na⁺ ingresa a ella. Ambos iones se mueven en favor de sus gradientes respectivos, en lugar de en el sentido opuesto, como sucedería en condiciones normales en una célula viva. Si existen ADP y P_i en el fantasma celular, el movimiento de iones induce la síntesis de ATP en lugar de su hidrólisis. Experimentos como éste ilustran la realidad de lo que podría esperarse con base en la reversibilidad teórica de las reacciones catalizadas por enzimas. También ejemplifican la manera en que puede usarse un gradiente iónico para impulsar una reacción en la que el ADP se fosforila hasta ATP, que es lo que ocurre en la mitocondria. La energía de impulso es la fuerza protón-motriz establecida por el transporte de electrones.

Estructura de la sintasa de ATP

Aunque se mencionó que la esfera F₁ es la porción catalítica de la enzima que produce el ATP en la mitocondria, su descripción aún no está completa. La enzima productora de trifosfato de adenosina, la sintasa de ATP, es un complejo proteínico en forma de hongo (fig. 5.24a) conformado por dos componentes principales: una cabeza F₁ esférica (de casi 90 Å de diámetro) y una sección basal, llamada F₀, incrustada en la membrana interna. Las micrografías electrónicas de alta resolución revelan que las dos porciones se conectan mediante un tallo central y uno periférico, como se muestra en la figura 5.24b. Una mitocondria típica de un hepatocito tiene apenas 15 000 sintasas de ATP. Existen versiones homólogas de dicha enzima en la membrana plasmática de las bacterias, en la membrana tilacoide de los cloroplastos vegetales y en la membrana interna de las mitocondrias.

Las porciones F₁ de las sintasas de ATP bacteriana y mitocondrial están muy conservadas; ambas contienen cinco polipéptidos diferentes con una composición α₃β₃δγϵ. Las subunidades α y las β se disponen en forma alternada dentro de la partícula F₁, semejando a los gajos de una naranja (figs. 5.24a y 5.26b). Se pueden señalar dos aspectos para una discusión posterior: (1) cada F₁ posee tres sitios catalíticos para la síntesis de ATP, uno en cada subunidad β, y (2) el componente γ se extiende desde la punta exterior de F₁, pasa por el tallo central y hace contacto con la porción basal de F₀. En la enzima mitocondrial, los cinco polipéptidos de F₁ son codificados por el DNA nuclear, se sintetizan en el citosol y después se importan (fig. 8.47).

La porción F₀ de la sintasa de ATP reside dentro de la membrana y está formada por tres polipéptidos diferentes con una configuración ab₂c₁₀ en E. coli (fig. 5.24b). El número de subunidades en el anillo c varía según sea la fuente de la enzima. Por ejemplo, la ATP sintasa de las mitocondrias de levaduras y de E. coli tiene 10 subunidades c, en tanto que ya se demostró que una enzima de cloroplasto posee 14 de ellas (fig. 5.25) y, como dato sorprendente, la enzima de mamíferos tiene sólo ocho. La base F₀ tiene un conducto a través del cual se conducen los protones desde el espacio intermembrana hasta la matriz.

Fundamento de la formación de ATP según el mecanismo de cambio de unión

¿Cómo es que el gradiente electroquímico de un protón proporciona la energía necesaria para impulsar la síntesis de ATP? Para responder esta pregunta, Paul Boyer de la UCLA, publicó una hipótesis innovadora en 1979 denominada mecanismo de cambio de unión, que ha ganado gran aceptación desde entonces. En general, dicho postulado tiene numerosos componentes, que a continuación se describen en secuencia.

1. La energía liberada por el movimiento de los protones no se usa para impulsar la fosforilación del ADP en forma directa, sino que se emplea para cambiar la afinidad de unión del sitio activo por el producto (p. ej., ATP). Se suele pensar que las reacciones químicas ocurren en un ambiente acuoso en el que la concentración de agua es 55 M y los reactivos y los productos sólo están disueltos en el medio. En estas condiciones se requiere energía para impulsar la formación de enlaces covalentes entre el ADP y el fosfato inorgánico para formar ATP. Sin embargo, ya se demostró que una vez que el ADP y el P_i se unen dentro del sitio catalítico de la ATP sintasa, los dos reactivos se condensan con facilidad para formar una molécula de ATP unida con firmeza sin el ingreso de energía adicional. En otras palabras, aunque la reacción

   ADP soluble + P_i soluble → ATP soluble + H₂O

   puede requerir el ingreso de una cantidad considerable de energía (7.3 kcal/mol en condiciones estándar), la reacción

   $ADP unido a enzima+Pi unido a enzima→ ATP unido a enzima+H2O$

   puede ocurrir en forma espontánea sin el ingreso de energía (pág. 90). Esto no significa que el ATP pueda formarse a partir de ADP sin gasto energético, sino que se requiere energía para la liberación del producto que está unido con fuerza al sitio catalítico y no para el fenómeno mismo de fosforilación.

2. Cada sitio activo adquiere de manera sucesiva tres diferentes conformaciones con afinidades distintas por los sustratos y los productos. Recuérdese que el complejo F₁ tiene tres sitios catalíticos, uno en cada una de las tres subunidades β. Cuando los investigadores examinaron las propiedades de los tres sitios catalíticos en una enzima estática (una que no participaba en el recambio enzimático), los tres sitios mostraron diferentes propiedades químicas. Boyer propuso que, en cualquier momento, los tres sitios catalíticos están presentes en conformaciones diferentes, lo cual hace que tengan distintas afinidades por los nucleótidos. En un instante, un sitio está en la conformación “laxa” o L, en la que el ADP y el P_i están unidos con soltura; el segundo está en la conformación “ajustada” o T, en la que los nucleótidos (los sustratos ADP + P_i o el producto ATP) están unidos con fuerza; y el tercero está en la conformación “abierta” u O, que permite la liberación del ATP porque posee una afinidad muy baja por los nucleótidos.

   Aunque había diferencias entre los tres sitios catalíticos de una enzima estática, Boyer obtuvo evidencia de que todas las moléculas de ATP producidas por una enzima activa se sintetizaban por el mismo mecanismo catalítico. En otras palabras, parecía que los tres sitios de la enzima operaban de manera idéntica. Para explicar la contradicción aparente entre la asimetría de la estructura enzimática y la uniformidad de su mecanismo de acción, Boyer propuso que cada uno de los tres sitios catalíticos pasaba de manera secuencial por las mismas conformaciones L, T y O (fig. 5.27).

3. El ATP se sintetiza por catálisis rotatoria, en la que una parte de la ATP sintasa gira con respecto a otra parte. Para explicar los cambios secuenciales en la conformación de cada uno de los sitios catalíticos, Boyer propuso que las subunidades α y β, que forman un anillo hexagonal de subunidades dentro de la cabeza F₁ (fig. 5.24), giran en relación con el tallo central. En este modelo, que se conoce como catálisis rotatoria, el giro es impulsado por el movimiento transmembrana de los protones a través del conducto localizado en la base F₀. Por consiguiente, de acuerdo con este modelo, la energía eléctrica almacenada en el gradiente de protones se traduce en la energía mecánica de un tallo rotatorio, la cual se transforma luego en energía química almacenada en ATP.

Evidencias que respaldan el mecanismo de cambio de unión y la catálisis rotatoria

La publicación de John Walker y colaboradores del Medical Research Council de Inglaterra (1994) sobre un modelo atómico detallado de la partícula F₁ proporcionó mucha evidencia estructural que apoya el mecanismo de cambio de unión de Boyer. Primero, reveló la estructura de cada uno de los sitios catalíticos en una enzima estática, con lo que confirmó que difieren en cuanto a su conformación y su afinidad por los nucleótidos. Se identificaron las estructuras correspondientes a las conformaciones L, T y O en los sitios catalíticos de las tres subunidades β. Segundo, reveló que la subunidad γ de la enzima mantiene una posición perfecta dentro de la sintasa de ATP para transmitir los cambios de conformación del sector de membrana F₀ a los sitios catalíticos F₁. Podía verse que la subunidad γ se extendía como un tallo desde el sector F₀, pasaba por el tallo, y llegaba hasta una cavidad central dentro de la esfera F₁ (fig. 5.26a), donde establece contacto (de manera distinta) con cada una de las tres subunidades β (fig. 5.26b).

El extremo apical de la subunidad γ es asimétrico y en un instante determinado diferentes caras de ésta interactúan con las distintas subunidades β, lo que hace que adopten conformaciones diferentes (L, T y O). Al rotar, cada sitio de unión de la subunidad γ interactúa de manera sucesiva con las tres subunidades β de F₁. Durante un solo ciclo catalítico, la subunidad γ gira 360° completos, lo que hace que cada sitio catalítico pase en forma secuencial por las conformaciones L, T y O. Este mecanismo se ilustra en la figura 5.27 y se describe con detalle en su pie. Como se indica en la figura 5.27a, la condensación de ADP y Pi para formar ATP ocurre cuando cada subunidad está en la conformación T. Como se señala en la figura 5.24b, la subunidad ϵ se relaciona con la porción “inferior” de la subunidad γ y ambas rotan juntas como una unidad fija.

Se ha obtenido evidencia directa de la rotación de la subunidad γ respecto de las subunidades α y β en diversos experimentos. Si “ver es creer”, entonces la demostración más convincente proviene del trabajo de Masasuke Yoshida y colaboradores, realizado en el Tokyo Institute of Technology y la Keio University de Japón en 1997. Estos investigadores desarrollaron un sistema ingenioso para observar la reacción inversa a la que ocurre normalmente en la célula con moléculas enzimáticas individuales. Primero prepararon una versión con modificaciones genéticas de la porción operativa de la ATP sintasa, formada por tres subunidades α, tres β y una subunidad γ (α₃β₃γ) (fig. 5.28a). Este complejo polipéptido se fijó por su cabeza a un cubreobjetos de vidrio y se le conectó un pequeño filamento de actina con un marcador fluorescente al extremo de la subunidad γ, que se proyectaba hacia el medio (fig. 5.28a). Cuando la preparación se incubó con ATP, se observó que el filamento de actina fluorescente rotaba como una hélice microscópica (fig. 5.28b) impulsada por la energía que se liberaba cuando las moléculas de ATP se unían a los sitios catalíticos de las subunidades β y se hidrolizaban en ellos.

En fechas más recientes, un tipo similar de complejo F₁ fue “forzado” a realizar la actividad más desafiante que ocurre de manera normal dentro de la célula: la síntesis de ATP. En este estudio, una cuenta magnética microscópica se fijó a la subunidad γ de una molécula F₁ individual y luego se le hizo girar en el sentido de las manecillas del reloj, al someter a la preparación a un campo magnético giratorio. Cuando una de estas moléculas F₁ se colocó dentro de una microcámara transparente en presencia de ADP y P_i, la rotación forzada de la subunidad γ condujo a la síntesis de ATP, que se acumuló hasta concentraciones de μM. Como se esperaría con base en el modelo, se sintetizaron tres moléculas de ATP por cada giro de 360°. Cuando se retiró el campo magnético, la subunidad γ giró de manera espontánea en el sentido inverso, impulsando la hidrólisis del ATP recién sintetizado. En conjunto, estos innovadores experimentos de bioingeniería demuestran de manera inequívoca que la ATP sintasa opera como un motor rotatorio.

Las máquinas rotatorias son frecuentes en las sociedades industrializadas; se utilizan turbinas, taladros, ruedas y hélices giratorios, por mencionar sólo algunos ejemplos. Sin embargo, estos instrumentos son muy raros en los organismos vivos. Por ejemplo, no hay organelos en células eucariotas, articulaciones en animales ni estructuras de alimentación en el mundo biológico que sean rotatorios. De hecho, sólo se conocen dos tipos de estructuras biológicas que contienen partes que giran: las ATP sintasas (y proteínas afines que actúan como bombas iónicas) y los flagelos bacterianos (que se ilustran en la figura 1.14a, recuadro) y ambos pueden describirse como “nanomáquinas” rotatorias porque su tamaño se mide en nanómetros. Los ingenieros ya comenzaron a inventar instrumentos en escala nanométrica, elaborados con materiales inorgánicos que algún día podrían realizar varios tipos de actividades mecánicas submicroscópicas. La construcción de motores de estas dimensiones implica un reto particular y ya comenzaron los intentos para usar la ATP sintasa para impulsar dispositivos inorgánicos simples. Algún día, los seres humanos podrían emplear ATP en lugar de electricidad para impulsar algunos de sus instrumentos más delicados.

Uso del gradiente de protones para impulsar la maquinaria catalítica: función de la porción F₀ de la ATP sintasa

En 1997 ya se tenía conocimiento detallado de los mecanismos operativos del complejo F₁, pero aún debían responderse preguntas importantes sobre la estructura y la función de la porción F₀ de la enzima unida a la membrana. Las más importantes eran: ¿cuál es el camino que toman los protones cuando se mueven por el complejo F₀? y ¿de qué manera este movimiento conduce a la síntesis de ATP? Al respecto se postuló lo siguiente:

1. Las subunidades c de la base F₀ se ensamblaban en un anillo que se encuentra dentro de la bicapa de lípidos (como en la figura 5.24b).

2. El anillo c está unido de manera física a la subunidad γ del tallo.

3. El movimiento “colina abajo” de los protones a través de la membrana impulsa la rotación del anillo de subunidades c.

4. La rotación del anillo c de la partícula F₀ proporciona la fuerza de torsión (torque) que impulsa la rotación de la subunidad γ unida, lo que conduce a la síntesis y la liberación de ATP por parte de subunidades catalíticas del anillo F₁.

Todas estas suposiciones se han confirmado. A continuación se describen cada uno de estos aspectos con más detalle.

Un conjunto de evidencias, incluidas la cristalografía por rayos X y la microscopia con fuerza atómica, demostró que las subunidades c en realidad están organizadas en un círculo para formar un complejo anular (fig. 5.25). Las micrografías electrónicas de alta resolución indican que las dos subunidades b y la subunidad a del complejo F₀ están fuera del anillo de las subunidades c, como se muestra en la figura 5.24. Se cree que las subunidades b son sobre todo componentes estructurales de la ATP sintasa. Las dos subunidades b alargadas forman un tallo periférico que conecta las porciones F₀ y F₁ de la enzima (fig. 5.24b) y se piensa que junto con la subunidad δ de F₁ sostienen las subunidades α₃β₃ en una posición fija mientras la subunidad γ gira dentro del centro del complejo.

La rotación del anillo c de F₀ durante la síntesis de ATP ya se demostró de manera experimental en preparaciones de membrana, lo que confirma que tanto el anillo c como la subunidad γ actúan como rotores durante la actividad enzimática. ¿Cómo se conectan estas dos “partes móviles”? Cada subunidad c está formada como una horquilla: contiene dos hélices transmembranosas conectadas por un asa hidrofílica que se proyecta hacia la cabeza F₁. Se piensa que las asas hidrofílicas situadas en la parte superior de las subunidades c forman un sitio de unión para las bases de las subunidades γ y ϵ, que juntas actúan como un “pie” que se une al anillo c (figs. 5.24 y 5.29). Como resultado de esta unión, la rotación del anillo c hace girar también a la subunidad γ unida, lo cual puede ocurrir a una velocidad de 100 revoluciones por segundo o más.

El mecanismo por el cual los movimientos de H⁺ impulsan la rotación del anillo c es más complejo y no se ha comprendido por completo. La figura 5.29 presenta un modelo de la forma en que los iones H⁺ podrían fluir por el complejo F₀. Durante la explicación siguiente hay que tener en mente: (1) que las partes del anillo c pasan en forma sucesiva por una subunidad estacionaria a y (2) que los protones se recogen del espacio intermembrana uno a la vez por cada subunidad c y se transportan por completo alrededor de un círculo antes de liberarse en la matriz. En este modelo, cada subunidad a tiene dos medios conductos que están separados entre sí. Uno conduce del espacio intermembrana (citosólico) al centro de la subunidad a y el otro va desde el centro de la subunidad a hasta la matriz. Se propuso que cada protón se mueve del espacio intermembrana a través del medio conducto y se une a un residuo de ácido aspártico de carga negativa situado en la superficie de la subunidad c adyacente. Al parecer, el residuo en cuestión es ácido aspártico en E. coli (fig. 5.29), pero es ácido glutámico en mitocondrias de animales. La unión del protón al grupo carboxilo genera un cambio mayor en la conformación de la subunidad c que hace que ésta rote unos 30° en sentido levógiro. El movimiento de la subunidad c recién unida al protón hace que la subunidad adyacente en el anillo (que se unió con un protón en un paso previo) se alinee con el segundo medio conducto de la subunidad a. Una vez ahí, el ácido aspártico libera su protón, el cual se difunde a la matriz. Después de la separación de dicha partícula, la subunidad c regresa a su conformación original y queda lista para aceptar otro protón del espacio intermembrana y repetir el ciclo.

De acuerdo con este modelo, el ácido aspártico de cada subunidad c actúa como un transportador giratorio de protones. Un protón salta al portador en un sitio seleccionado para que lo recoja y luego lo transporta en un círculo antes de liberarlo en un punto seleccionado para ello. El movimiento del anillo se impulsa por los cambios en la conformación relacionados con la unión y la disociación secuencial de los protones del residuo de ácido aspártico de cada subunidad c. En consecuencia, puede considerarse que el número de protones transportados con cada rotación del anillo c es igual al de las subunidades que componen el anillo, aunque esto no siempre se ha validado en forma experimental. Se ha demostrado que el anillo c contiene entre ocho y 15 subunidades, según sea la fuente. Para simplificar la explicación, se describe un anillo c formado por 12 subunidades, como se ilustra en la figura 5.29. En este caso, la asociación/disociación de cuatro protones en la forma descrita movería el anillo 120°, lo cual impulsaría la rotación correspondiente de la subunidad γ unida el mismo número de grados, posibilitando así la liberación de una molécula recién formada de ATP por el complejo F₁. De acuerdo con esta estequiometría, la translocación de 12 protones produciría la rotación completa de 360° del anillo c y la subunidad γ, así como la síntesis y liberación de tres moléculas de ATP. Si el anillo c contuviera más o menos 12 subunidades, la proporción H⁺/ATP cambiaría, pero esto es fácil de adaptar al modelo básico de rotación impulsada por protones que se muestra en la figura 5.29.

Otras funciones de la fuerza protón-motriz además de la síntesis de ATP

Aunque la producción de ATP puede ser la actividad más importante de las mitocondrias, estos organelos participan en muchos otros procesos que requieren el ingreso de energía. A diferencia de la mayor parte de los organelos que dependen sobre todo de la hidrólisis del ATP para impulsar sus actividades, las mitocondrias dependen de una fuente alternativa de energía: la fuerza protón-motriz. Este impulso, por ejemplo, promueve la captación de ADP y P_i en las mitocondrias a cambio de ATP e H⁺, en dicho orden. El cambio de ADP por ATP a través de la membrana es tarea de la translocasa de nucleótido de adenina (ANT, adenine nucleotide translocase) que hace que el ATP generado dentro de la mitocondria esté disponible para cubrir las necesidades energéticas del resto de la célula. Ésta y otras actividades que ocurren durante la respiración aeróbica se resumen en la figura 5.30. En otros ejemplos, la fuerza protón-motriz puede usarse como fuente energética para “jalar” iones calcio hacia el interior de la mitocondria, para impulsar los eventos que inducen la fusión mitocondrial y para hacer que polipéptidos específicos seleccionados entren a la mitocondria desde la matriz (fig. 8.47).

Los peroxisomas son vesículas simples limitadas por membranas (fig. 5.31a) con un diámetro de 0.1 a 1.0 μm, que pueden contener un centro denso y cristalino de enzimas oxidativas. Los peroxisomas (o microcuerpos) son organelos multifuncionales y contienen más de 50 enzimas que participan en actividades tan diversas como la oxidación de ácidos grasos de cadena muy larga (VLCFA; very-long-chain fatty acids), con sucesiones de 24 a 26 carbonos, y la síntesis de plasmalógenos, una clase inusual de fosfolípidos en los que uno de los ácidos grasos está unido al glicerol mediante un enlace éter en lugar de uno éster. Los plasmalógenos son muy abundantes en las vainas de mielina que aíslan los axones del cerebro (fig. 4.5). Anomalías en la síntesis de plasmalógenos pueden originar disfunción neurológica grave. La enzima luciferasa, que genera la luz que emiten las luciérnagas, también es una enzima peroxisómica. Los peroxisomas se consideran en este capítulo porque comparten varias propiedades con las mitocondrias, ambos se forman por la división de organelos preexistentes (utilizando algunas de las mismas proteínas para completar la tarea), los dos importan proteínas preformadas del citosol (sección 8.9) y ambos participan en tipos similares de metabolismo oxidativo. De hecho, por lo menos una enzima, la aminotransferasa de alanina/glioxilato, se encuentra en las mitocondrias de algunos mamíferos (p. ej., gatos y perros) y en los peroxisomas de otros mamíferos (p. ej., conejos y seres humanos). Los dos organelos se han vinculado más íntimamente con informes recientes de que las mitocondrias forman vesículas destinadas al transporte de elementos para los peroxisomas.

Estos organelos se llamaron “peroxisomas” porque son el sitio donde se sintetiza y degrada el peróxido de hidrógeno (H₂O₂), un agente oxidante muy reactivo y tóxico. Dicho compuesto se produce por acción de varias enzimas peroxisómicas, incluidas la urato oxidasa, glucolato oxidasa y oxidasas de aminoácidos, que utilizan oxígeno molecular para oxidar sus sustratos respectivos (fig. 5.31b). El H₂O₂ generado en estas reacciones se degrada pronto mediante la enzima catalasa, que está presente en grandes concentraciones en estos organelos. La importancia de los peroxisomas en el metabolismo humano resulta evidente en la sección “Perspectiva humana” de este capítulo.

Los peroxisomas también existen en las plantas. Las plantas de semillero contienen un tipo especializado de peroxisoma, llamado glioxisoma (fig. 5.32). Dichos organismos dependen de ácidos grasos y materiales almacenados para obtener energía a fin de formar una nueva planta. Una de las principales actividades metabólicas de estas plantas jóvenes es la conversión de los ácidos grasos almacenados en carbohidratos. La degradación de los primeros genera acetil-CoA, la cual se condensa con oxaloacetato (OAA) para formar citrato, que luego se convierte en glucosa por efecto de una serie de enzimas del ciclo del glioxilato localizadas en el glioxisoma. La función de los peroxisomas en el metabolismo de las células de las hojas se describe en la sección 6.6.

Las mitocondrias son organelos grandes formados por una membrana externa porosa y una membrana interna muy impermeable, formada sobre todo por pliegues (crestas) que contienen gran parte de los mecanismos necesarios para la respiración aeróbica. La porosidad de la membrana externa se debe a proteínas integrales llamadas porinas. La configuración de la membrana interna y la fluidez aparente de su bicapa facilitan las interacciones de los componentes necesarios durante el transporte de electrones y la formación de ATP. La membrana interna rodea una matriz gelatinosa que además de proteínas contiene un sistema genético que incluye DNA, RNA, ribosomas y todos los mecanismos necesarios para transcribir y traducir la información genética. Muchas de las propiedades de las mitocondrias pueden explicarse a través de su supuesta evolución a partir de bacterias simbióticas antiguas (pág. 179).

La mitocondria es el centro del metabolismo oxidativo en la célula y convierte los productos del catabolismo de carbohidratos, grasas y proteínas en energía química almacenada en ATP. El piruvato y el NADH son los dos productos de la glucólisis. El primero se transporta a través de la membrana mitocondrial interna, donde se descarboxila y combina con la coenzima A para formar acetil-CoA, la cual se condensa con oxaloacetato para formar citrato, que alimenta al ciclo del ácido tricarboxílico. Al pasar por las reacciones del ciclo del TCA se retiran dos de los carbonos del citrato y se liberan como CO₂, que representa el estado más oxidado del átomo de carbono. Los electrones retirados de los sustratos se transfieren al FAD y al NAD⁺ para formar FADH₂ y NADH. Los ácidos grasos se degradan para formar acetil-CoA, la cual alimenta al ciclo del TCA, y los 20 aminoácidos se degradan hasta formar piruvato, acetil-CoA o productos intermedios del ciclo del TCA. Por lo tanto, dicho ciclo es la vía en la que convergen las principales vías catabólicas de la célula (pág. 183).

Los electrones transferidos de los sustratos al FADH₂ y al NADH pasan por una cadena de portadores de electrones hasta el O₂, lo que libera energía que se emplea para generar un gradiente electroquímico a través de la membrana mitocondrial interna. El movimiento controlado de los protones de regreso a través de la membrana mediante una enzima productora de energía se emplea para impulsar la formación de ATP en el sitio catalítico de la enzima. Cada par de electrones de NADH libera energía suficiente para impulsar la formación de unos tres ATP, mientras que la energía liberada de un par de electrones de FADH₂ permite la formación de dos de estas moléculas (pág. 186).

La cantidad de energía liberada conforme un electrón se transfiere de un donador (agente reductor) a un aceptor (agente oxidante) puede calcularse a partir de la diferencia en el potencial redox entre las dos parejas. El potencial redox estándar de una pareja se mide en condiciones estándar y se compara con el de la pareja H₂-H⁺. El potencial redox estándar de la pareja NADH-NAD⁺ es −0.32 V, lo cual refleja el hecho de que el NADH es un agente reductor fuerte, es decir, que transfiere con facilidad sus electrones. El potencial redox estándar de la pareja H₂O-O₂ es +0.82 V, lo que indica que el O₂ es un agente oxidante potente, con gran afinidad por los electrones. La diferencia entre estas dos parejas, que equivale a 1.14 V, proporciona una medida de la energía libre (52.6 kcal/mol) que se emite al pasar un par de electrones de NADH a lo largo de la cadena transportadora de electrones hasta el O₂ (pág. 189).

La cadena transportadora de electrones contiene cinco tipos diferentes de portadores: citocromos que contienen grupos hemo, flavoproteínas que poseen el nucleótido flavina, proteínas con hierro-azufre, átomos de cobre y quinonas. Las flavoproteínas y las quinonas son capaces de aceptar y donar átomos de hidrógeno, en tanto que los citocromos, los átomos de cobre y las proteínas con hierro-azufre pueden aceptar y donar sólo electrones. Los portadores de la cadena de transporte de electrones están dispuestos en orden creciente según la positividad de su potencial redox. Los diversos portadores se organizan en cuatro complejos multiproteínicos grandes. El citocromo c y la ubiquinona son portadores móviles y emiten electrones entre los grandes complejos. Conforme los pares de electrones pasan por los complejos I, III y IV, se traslada una cantidad específica de protones de la matriz a través de la membrana, hacia el espacio intermembrana. La translocación de protones mediante estos complejos transportadores de electrones establece el gradiente de protones en el que se almacena la energía. El último de los complejos es la oxidasa de citocromo, que transfiere electrones del citocromo c al O₂, y lo reduce para formar agua, paso que también retira protones de la matriz y contribuye a la formación del gradiente (pág. 191).

La translocación de protones crea una separación de carga a través de la membrana, además de una diferencia en la concentración de dichas partículas. Por consiguiente, el gradiente de protones tiene dos componentes, un gradiente de voltaje y otro de pH, cuyas magnitudes dependen del movimiento de otros iones a través de la membrana. Juntos, los dos elementos constituyen una fuerza protón-motriz (Δp). En las mitocondrias de los mamíferos, casi 80% de la energía libre de la Δp la representa el voltaje y 20% radica en el gradiente de pH (pág. 198).

La enzima que cataliza la formación de ATP es un complejo multiproteínico grande llamado sintasa de ATP. La sintasa de ATP contiene dos partes distintas: una cabeza F₁ que sobresale hacia la matriz e incluye sitios catalíticos, y una base F₀ que está incrustada en la bicapa de lípidos y forma un conducto por el cual se conducen protones del espacio intermembrana hacia la matriz. En la hipótesis del cambio de unión para la formación de ATP, que ya tiene una aceptación general, el movimiento controlado de los protones a través de la porción F₀ induce la rotación de la subunidad γ de la enzima, lo que forma un tallo que conecta las porciones F₀ y F₁. La rotación de la subunidad γ se logra con la rotación del anillo c de la base F₀, inducida por el movimiento de protones a través de medios conductos en la subunidad a. La rotación de la subunidad γ induce los cambios en la conformación de sitios catalíticos de la partícula F₁, lo que impulsa la formación de ATP. Evidencias indican que el paso que requiere energía no es la fosforilación real del ADP, sino la liberación del ATP producido del sitio activo, que ocurre como respuesta a los cambios inducidos en la conformación. Además de impulsar la generación de ATP, la fuerza protón-motriz también suministra la energía necesaria para varias actividades de transporte, incluidas la captación de ADP en la mitocondria a cambio de la liberación de ATP al citosol, la captación de iones calcio y fosfato y la importación de proteínas mitocondriales (pág. 199).

Los peroxisomas son vesículas citoplásmicas unidas a la membrana que realizan diversas reacciones metabólicas, entre las que se encuentra la oxidación de urato, glucolato y aminoácidos, con lo que se genera H₂O₂ (pág. 206).

1. Considérese la reacción A:H + B ⇌ B:H + A. Si, en equilibrio, la proporción de [B:H]/[B] es igual a 2.0, se puede concluir que: (1) B:H es el agente reductor más potente de los cuatro compuestos; (2) la pareja (A:H-A) tiene un potencial redox más negativo que la pareja (B:H-B); (3) ninguno de los cuatro compuestos es un citocromo; (4) los electrones relacionados con B tienen mayor energía que los asociados con A. ¿Cuáles de las aseveraciones previas son verdaderas? Trácese una de las semireacciones para esta oxidación-reducción.

2. El DNA mitocondrial muestra réplica por acción de la enzima DNA polimerasa γ. El ratón “mutador” señalado en la página 208 tenía dicho genotipo porque poseía una polimerasa γ que tendía a cometer errores al copiar el templete de mtDNA. Se señalaron dos limitaciones para interpretar los estudios en cuestión en términos del proceso de envejecimiento normal. En opinión del lector: ¿qué es lo que se puede aprender de la producción de ratones con una polimerasa γ muy precisa, es decir, que cometiera menos errores que la versión normal o natural?

3. La proteína A es una flavoproteína con un potencial redox de −0.2 V. La proteína B es un citocromo con un potencial redox de +0.1 V.

   1. Trácense las semirreacciones para cada uno de estos dos portadores de electrones.

   2. Preséntese la reacción que ocurriría si se mezclaran moléculas A reducidas y moléculas B oxidadas.

4. ¿Cuáles serían los dos compuestos de la reacción del apartado b que estarían presentes en mayor concentración cuando se alcanzara el equilibrio?

5. ¿Cuál de las siguientes sustancias es el agente reductor más fuerte: ubiquinona, citocromo c, NAD⁺, NADH, O₂ o H₂O?, ¿cuál es el agente oxidante más fuerte?, ¿cuál tiene la mayor afinidad por los electrones?

6. Si se determinara que la membrana mitocondrial interna es permeable a los iones cloro, ¿qué ocurriría con la fuerza protón-motriz a través de la membrana mitocondrial interna?

7. Observe la caída de energía durante el transporte de electrones que se muestra en la figura 5.14. ¿En qué cambiaría este perfil si el donador de electrones original fuera FADH₂ en lugar de NADH?

8. ¿Se esperaría que la importación de P_i diera lugar a un descenso de la fuerza protón-motriz?, ¿por qué?

9. En la lista de potenciales redox estándar del cuadro 5.1, la pareja oxaloacetato-malato es menos negativa que la pareja NAD⁺-NADH. ¿En qué forma son consistentes estos valores con la transferencia de electrones de malato a NAD⁺ en el ciclo del ácido tricarboxílico?

10. ¿Cuántos trifosfatos de alta energía se forman con la fosforilación en el nivel del sustrato durante cada giro del ciclo del TCA (considérense sólo las reacciones del ciclo del TCA)?, ¿cuántos se forman como resultado de la fosforilación oxidativa?, ¿cuántas moléculas de CO₂ se liberan?, ¿cuántas moléculas de FAD se reducen?, ¿cuántos pares de electrones se separan del sustrato?

11. El ensamblaje de grupos Fe-S, que ocurre en la matriz mitocondrial, es muy vulnerable a la presencia de O₂. Dada la importancia de las mitocondrias en el metabolismo aerobio, ¿parece ser éste un lugar improbable para que ocurra dicho proceso?

12. El descenso de ΔG°′ de un par de electrones al pasar del NADH al O₂ es −52.6 kcal/mol y el ΔG°′ de la formación de ATP es +7.3 kcal/mol. Si se forman tres moléculas de ATP por cada par de electrones separados del sustrato, ¿puede concluirse que la fosforilación oxidativa tiene sólo una eficiencia de 21.9/52.6 o 42%?, ¿por qué?

13. ¿Se esperaría que mitocondrias con actividad metabólica acidificaran o alcalinizaran el medio en el que están suspendidas?, ¿por qué?

14. Asúmase que el movimiento de tres protones es necesario para la síntesis de una molécula de ATP. Calcúlese la energía liberada por el paso de tres moles de protones a la matriz cuando la fuerza protón-motriz mide 220 mV (véase la página 191 para obtener información).

15. ¿Se esperaría que mitocondrias aisladas pudieran realizar la oxidación de la glucosa con la producción acompañante de ATP?, ¿por qué?, ¿cuál sería un compuesto adecuado para agregar a la preparación de mitocondrias aisladas a fin de lograr la síntesis de ATP?

16. Calcule la energía libre que se emite cuando el FADH₂ es oxidado por O₂ molecular en condiciones estándar.

17. Con base en el conocimiento sobre la organización de la mitocondria y la manera en que genera ATP, respóndanse las preguntas siguientes. Explique con brevedad cada respuesta.

    1. ¿Cuál sería el efecto de la producción de ATP si se agregara una sustancia (protonóforo) que provocara que la membrana mitocondrial posibilitara el escape de protones?

    2. ¿Cuál sería el efecto de la reducción del suministro de oxígeno sobre el pH de la matriz mitocondrial?

    3. Presupóngase que el suministro celular de glucosa se reduce de manera considerable. ¿Cuál sería el efecto sobre la producción de CO₂ en la mitocondria?

18. Asúmase que es posible manipular el potencial de la membrana interna de una mitocondria aislada. Se mide el pH de la matriz mitocondrial y se observa que es de 8.0. El pH de la solución que la rodea es de 7.0. Se registra con una pinza en la membrana interna un potencial de +59 mV, esto es, que obliga a la matriz a tener un valor positivo de 59 mV con respecto al medio. En estas circunstancias, ¿puede la mitocondria usar el gradiente de protones para impulsar la síntesis de ATP? ¿Por qué?

19. Supóngase que es posible sintetizar una ATP sintasa que carezca de la subunidad γ. ¿Cómo se compararían los sitios catalíticos de las subunidades β de esta enzima entre sí?, ¿por qué?

20. Desde el punto de vista funcional, la ATP sintasa puede dividirse en dos partes: un “estabilizador” formado por subunidades que no se mueven durante la catálisis y un “rotor” formado por las partes móviles. ¿Qué subunidades de la enzima constituyen cada una de estas dos partes?, ¿cómo se relacionan las estructuras de las partes inmóviles del estabilizador de F₀ con las partes inmóviles del estabilizador de F₁?