Capítulo 8: Sistema de membranas citoplásmicas: estructura, función y tránsito de membranas

Bajo el microscopio óptico, el citoplasma de las células vivas se observa como una estructura relativamente vacía. Sin embargo, incluso antes del inicio del siglo xx, el examen de cortes teñidos de tejidos animales sugirió la existencia de una extensa red de membranas dentro del citoplasma. No obstante, fue hasta el desarrollo del microscopio electrónico en el decenio de 1940 cuando los biólogos empezaron a identificar la diversa disposición de las estructuras limitadas por membranas presentes en el citoplasma de la mayoría de las células eucariotas. Estos primeros microscopistas electrónicos observaron vesículas limitadas por membranas de diámetros variables que contenían material con diferente densidad electrónica, canales largos delimitados por membranas que se irradiaban por el citoplasma para formar una red interconectada de canales y pilas de sacos aplanados delimitados por membranas llamadas cisternas.

A partir de estos primeros estudios con el microscopio electrónico y las investigaciones bioquímicas que siguieron, se hizo evidente que las células eucariotas se subdividían en diferentes compartimientos delimitados por barreras de membrana. A medida que se examinaron más tipos de células, resultó aparente que tales compartimientos membranosos en el citoplasma formaban organelos que podían identificarse en diversas células, desde levaduras hasta plantas y animales. La extensión en la que el citoplasma de una célula eucariota está ocupado por estructuras membranosas se ilustra en la micrografía electrónica de una célula radicular del maíz en la figura 8.1. Como se advierte en las páginas siguientes, cada uno de estos organelos contiene un complemento particular de proteínas y está especializado en actividades específicas. Por lo tanto, tal y como una casa o un restaurante se dividen en estancias especializadas en las que pueden realizarse diferentes actividades independientes unas de otras, el citoplasma de una célula se divide en compartimientos membranosos especializados por razones análogas. Al examinar las micrografías de este capítulo hay que tener presente que estos organelos citoplásmicos pueden parecer estructuras estables, como las habitaciones de una casa o restaurante, pero de hecho son compartimientos dinámicos con un flujo continuo.

En este capítulo se examinan la estructura y funciones del retículo endoplásmico, el aparato de Golgi, endosomas, lisosomas y vacuolas. Considerados en conjunto, estos organelos forman un sistema endomembranoso en el que los componentes individuales funcionan como parte de una unidad coordinada. (Mitocondrias y cloroplastos no son parte de este sistema interconectado y fueron los temas de los capítulos 5 y 6. En la actualidad existen indicios de que los peroxisomas, que se expusieron en el capítulo 6, tienen un origen doble. Se cree que los elementos básicos de la membrana limitante provienen del retículo endoplásmico, pero muchas de las proteínas de membrana y las proteínas solubles internas son captadas del citosol, como se describe en la sección 8.9.)

Los organelos del sistema endomembranoso son parte de una red dinámica integrada en la que los materiales se envían y regresan de una parte de la célula a otra. Casi en su totalidad, los materiales se trasladan entre los organelos; por ejemplo, del aparato de Golgi a la membrana plasmática, en pequeñas vesículas de transporte limitadas por membrana que se desprenden de un compartimiento donador de membrana (fig. 8.2a).¹ Las vesículas de transporte se mueven por el citoplasma en forma dirigida, a menudo tiradas por proteínas motoras que operan sobre rieles formados por microtúbulos y microfilamentos del citoesqueleto (fig. 9.1a). Cuando llegan a su destino, las vesículas se fusionan con la membrana del compartimiento receptor, el cual recibe el cargamento soluble de la vesícula, así como su envoltura membranosa (fig. 8.2a). Los ciclos repetidos de desprendimiento y fusión trasladan diversos materiales por los numerosos trayectos que cruzan la célula.

Ya se han identificado distintas vías a través del citoplasma y se ilustran en la revisión que se muestra en la figura 8.2b. Se puede distinguir una vía biosintética en la que se sintetizan proteínas en el retículo endoplásmico, se modifican a su paso por el aparato de Golgi y se transportan del aparato de Golgi a varios destinos, como la membrana plasmática, un lisosoma o una gran vacuola en una célula vegetal. Esta ruta también se conoce como la vía secretora, ya que muchas de las proteínas sintetizadas en el retículo endoplásmico (así como los polisacáridos complejos producidos en el aparato de Golgi, fig. 7.37c) se descargan (secretan) de la célula. Las actividades secretoras de las células pueden dividirse en dos tipos: constitutivas y reguladas (fig. 8.2b). Durante la secreción constitutiva, los materiales se transportan en vesículas secretoras de los sitios donde se producen para descargarse en el espacio extracelular en forma continua. La mayor parte de las células lleva a cabo secreción constitutiva, un proceso que contribuye no sólo a la formación de la matriz extracelular (sección 7.1), sino también a la formación de la membrana plasmática misma. Durante la secreción regulada, los materiales se almacenan en paquetes delimitados por membrana y se descargan sólo como respuesta a un estímulo apropiado. La secreción regulada ocurre, por ejemplo, en las células endocrinas que liberan hormonas, en las células de los ácinos pancreáticos que liberan enzimas digestivas y en las células nerviosas que liberan neurotransmisores. En algunas de estas células, los materiales que se secretan se almacenan en grandes gránulos secretores densos y delimitados por membrana (fig. 8.3).

Las proteínas, lípidos y polisacáridos complejos se transportan por la célula mediante la vía biosintética o secretora. Esta primera parte del capítulo se enfoca en la síntesis y transporte de proteínas, como se resume en la figura 8.2b. Durante la explicación se consideran varias clases diferentes de proteínas. Éstas incluyen proteínas solubles que se expulsan de la célula, proteínas integrales de varias membranas mostradas en la figura 8.2b y proteínas solubles que residen dentro de varios compartimientos limitados por endomembranas (p. ej., enzimas lisosómicas). Mientras que los materiales salen de la célula por la vía secretora, la vía endocítica opera en sentido contrario. A través de la vía endocítica, los materiales se mueven de la superficie externa de la célula a los compartimientos, como los endosomas y lisosomas, que se localizan dentro del citoplasma (fig. 8.2b).

El movimiento de las vesículas y su contenido en las diversas vías de una célula es análogo al movimiento de camiones que llevan distintos tipos de cargamento por las autopistas de una ciudad. Ambos tipos de transporte requieren patrones de tránsito definidos para asegurar que los materiales se entreguen de manera precisa en los sitios adecuados. Por ejemplo, el tránsito de proteínas dentro de la célula de una glándula salival requiere que las proteínas del moco salival, que se sintetizan en el retículo endoplásmico, se dirijan de manera específica a los gránulos secretores, mientras que las enzimas lisosómicas, que también se producen en el retículo endoplásmico se dirigen específicamente a un lisosoma blanco o diana. Asimismo, los diferentes organelos contienen distintas proteínas integrales de membranas. Por consiguiente, las proteínas de membrana también deben dirigirse a organelos particulares, como un lisosoma o cisterna de Golgi. Estos tipos de cargamento (proteínas secretadas, enzimas lisosómicas y proteínas de membrana), se dirigen a sus destinos celulares apropiados en virtud de sus “domicilios” específicos o señales clasificadoras que están codificadas en la secuencia de aminoácidos de las proteínas o en los oligosacáridos unidos. Las señales de clasificación son reconocidas por receptores específicos que residen dentro de las membranas o las cubiertas superficiales de las vesículas en gemación, lo que asegura el transporte de la proteína al destino apropiado. En su mayor parte, la maquinaria encargada de conducir este complejo sistema de distribución consiste en proteínas solubles que se reclutan en superficies membranosas específicas. En el transcurso de este capítulo se intenta comprender por qué una proteína es reclutada; por ejemplo, por el retículo endoplásmico, mientras que otra podría ser reclutada por una región específica del aparato de Golgi.

En los últimos 30 años se han hecho grandes avances en el mapeo de los patrones de tránsito de las células eucariotas, la identificación de domicilios y receptores específicos que regulan el flujo del tránsito y la disección de los mecanismos que asegura que los materiales se entreguen en los sitios correctos de la célula. Estos temas se tratan con detalle en las páginas siguientes. Las proteínas motoras y los elementos del citoesqueleto, que tienen funciones clave en los movimientos de las vesículas de transporte y otras endomembranas, se describen en el capítulo siguiente. El estudio de las endomembranas se inicia con la revisión de algunas de las estrategias experimentales más importantes que condujeron a la comprensión actual de este tema.

Los estudios iniciales con el microscopio electrónico proporcionaron a los biólogos un retrato detallado de la estructura celular, pero suministraron poca información sobre las funciones de los componentes que observaban. Para identificar las funciones de los organelos citoplásmicos fue necesario el desarrollo de técnicas nuevas y la ejecución de experimentos innovadores. Las técnicas experimentales descritas en las secciones siguientes resultaron muy útiles para establecer la base de conocimiento sobre la cual se finca la investigación actual de los organelos citoplásmicos.

Información obtenida de la autorradiografía

Entre los cientos de células diferentes del cuerpo, las células acinares del páncreas tienen un sistema de endomembrana en particular extenso. La función principal de estas células es la síntesis y secreción de enzimas digestivas. Después de la secreción pancreática, estas enzimas se envían al intestino delgado mediante conductos, donde degradan el alimento ingerido. ¿En qué sitio de las células acinares pancreáticas se sintetizan las proteínas secretoras y cómo llegan a la superficie de las células de las que se expulsan? Estas preguntas son difíciles de responder porque todos los pasos del proceso de secreción ocurren al mismo tiempo dentro de la célula. Para seguir los pasos de un solo ciclo desde el inicio al final, o sea, desde la síntesis de una proteína secretora hasta su salida de la célula, James Jamieson y George Palade de Rockefeller University utilizaron la técnica de la autorradiografía (sección 18.4).

La autorradiografía es un medio para visualizar los procesos bioquímicos al permitir que el investigador determine la localización de materiales con marca radiactiva dentro de una célula. En esta técnica, los cortes hísticos con los isótopos radiactivos se cubren con una capa delgada de emulsión fotográfica, la cual se expone por la radiación que emana de los radioisótopos del tejido. Los sitios de las células que contienen radiactividad se revelan al microscopio por los granos de plata de la emulsión que se aplicó encima (fig. 8.3).

Para reconocer los puntos en los que se sintetizan las proteínas secretoras, Palade y Jamieson incubaron fragmentos de tejido pancreático en una solución que contenía aminoácidos radiactivos durante un periodo corto. En este lapso, las células vivas captaron estos aminoácidos marcados y los incorporaron en las enzimas digestivas que se sintetizaban en los ribosomas. Los tejidos se fijaron y con la autorradiografía se identificó la localización de las proteínas que se habían sintetizado durante el breve periodo de incubación con aminoácidos marcados. Con esta técnica se descubrió el retículo endoplásmico como el sitio donde se sintetizan las proteínas secretoras (fig. 8.3a).

Para determinar la vía intracelular que siguen las proteínas secretoras desde el punto donde se sintetizan hasta el sitio donde se secretan, Palade y Jamieson realizaron un experimento adicional. Después de incubar el tejido por un breve lapso con aminoácidos radiactivos, lavaron el tejido para retirar el exceso de isótopos y transfirieron el tejido a un medio que contenía sólo aminoácidos no marcados. Un experimento de este tipo se llama pulso-caza. El pulso se refiere a la incubación breve con radiactividad durante la cual los aminoácidos marcados se incorporan en la proteína. La caza se refiere al periodo en el que el tejido se expone al medio no marcado, un lapso durante el cual se sintetizan proteínas adicionales con aminoácidos no radiactivos. Cuanto mayor sea el tiempo de caza, más lejos se desplazan las proteínas radiactivas producidas durante el pulso de su sitio de síntesis en la célula. Con esta técnica es posible seguir los movimientos de las moléculas recién sintetizadas mediante la observación de la onda de material radiactivo que se mueve por los organelos citoplásmicos desde un punto al siguiente hasta que se completa el proceso. La figura 8.3b-d resume los resultados de estos experimentos, que definieron por primera vez la vía biosintética (o secretora) y vincularon varios compartimientos membranosos que parecían inconexos en una unidad funcional integrada.

Información obtenida a partir de la proteína verde fluorescente

Para los experimentos con autorradiografías descritos en la sección anterior fue necesario que los investigadores examinaran cortes delgados de células diferentes que se fijaron en distintos momentos después de introducir una marca radiactiva. Los biólogos celulares actuales en gran medida han dejado de utilizar técnicas a base de radionúclidos. En los últimos años se desarrolló una nueva tecnología que permite a los investigadores seguir con sus propios ojos los movimientos de proteínas específicas mientras éstos ocurren dentro de una sola célula viva. Dicha tecnología emplea un gen aislado de una medusa que codifica una pequeña proteína, la proteína verde fluorescente (GFP, green fluorescent protein), que emite una luz fluorescente de dicho color. Para usar esta técnica, el DNA (ácido desoxirribonucleico) que codifica a la GFP se fusiona con el DNA que codifica a la proteína que se va a estudiar y el DNA quimérico resultante (compuesto) se introduce en las células, las cuales pueden observarse al microscopio. Una vez dentro de una célula, el DNA quimérico expresa una proteína quimérica que consiste en GFP fusionada con el final de la proteína que se va a estudiar. En la mayor parte de los casos, la presencia de la GFP unida con el final de una proteína tiene poco o ningún efecto en el movimiento o función de esa proteína.

La figura 8.4 presenta un par de micrografías que muestran células que contienen proteína fusionada con GFP. En este caso, las células se infectaron con una cepa del virus de la estomatitis vesicular (VSV, vesicular stomatitis virus) en la que uno de los genes virales (VSVG) se fusiona con el gen GFP. Los virus son útiles en estos tipos de estudios porque convierten a las células infectadas en fábricas para producir una o varias proteínas virales, las cuales son transportadas igual que cualquier otro cargamento de proteína por la vía biosintética. Cuando una célula está infectada con el virus VSV, se producen cantidades masivas de la proteína VSVG en el retículo endoplásmico (ER, endoplasmic reticulum). Después, las moléculas de VSVG viajan por el aparato de Golgi y se transportan a la membrana plasmática de la célula infectada, donde se incorporan en envolturas virales. Como en el experimento con pulso radiactivo y caza, el uso de un virus permite a los investigadores seguir una onda relativamente sincrónica de movimiento de las proteínas, en este caso representada por una oleada de fluorescencia verde que se inicia poco después de la infección. La sincronía puede intensificarse, como se hizo en el experimento mostrado en la figura 8.4, mediante el uso de un virus con una proteína VSVG mutante que no puede salir del retículo endoplásmico de las células infectadas que se cultivan a una temperatura elevada (p. ej., 40°C). Cuando la temperatura se reduce hasta los 32°C, la proteína fluorescente GFP-VSVG que se había acumulado en el retículo endoplásmico (fig. 8.4a,c) se mueve en forma sincrónica al aparato de Golgi (fig. 8.4b,c), donde ocurren varios fenómenos del procesamiento, y luego a la membrana plasmática. Los mutantes de este tipo que funcionan de manera normal a una temperatura baja (permisiva), pero no a una temperatura elevada (restrictiva), se describen como mutantes sensibles a la temperatura. En la página 321 se muestra un experimento en el que se utilizan dos sondas fluorescentes distintas.

Información obtenida del análisis bioquímico de las fracciones subcelulares

La microscopia electrónica, la autorradiografía y el uso de GFP proporcionan información sobre la estructura y función de los organelos celulares, pero no acerca de la composición molecular de estas estructuras. Albert Claude y Christian De Duve fueron los pioneros en las técnicas para romper (homogeneizar) las células y aislar los tipos particulares de organelos en los decenios de 1950 y 1960. Cuando una célula se rompe por homogeneización, las membranas citoplásmicas se fragmentan y los bordes de los fragmentos de la membrana se fusionan para formar vesículas esféricas menores de 100 nm de diámetro. Las vesículas obtenidas de diferentes organelos (núcleo, mitocondria, membrana plasmática, retículo endoplásmico, etc.) tienen diferentes propiedades, que les permiten separarse entre sí. Esta técnica se conoce como fraccionamiento subcelular.

Las vesículas membranosas derivadas del sistema endomembranoso (sobre todo del retículo endoplásmico y el aparato de Golgi) forman colecciones heterogéneas de vesículas de tamaño similar que se conocen como microsomas. La figura 8.5a muestra una preparación rápida (y esquemática) de la fracción microsómica de una célula. La fracción microsómica puede segmentarse aún más en fracciones de membrana lisa y rugosa (fig. 8.5b,c) mediante técnicas de gradiente descritas en la sección 18.6. Una vez aisladas, puede identificarse la composición bioquímica de varias fracciones. En los últimos años, la identificación de las proteínas presentes en las fracciones celulares se llevó a un nuevo nivel con la aplicación de la compleja tecnología proteómica. Una vez que se aísla el organelo particular, es posible extraer las proteínas, separarlas e identificarlas mediante espectrometría de masas, como se describe en la página 72. Se pueden reconocer cientos de proteínas al mismo tiempo, lo que proporciona un retrato molecular completo de cualquier organelo que pueda prepararse con relativa pureza. En un ejemplo de esta nueva tecnología se encontró que un simple fagosoma (pág. 315) que contiene una cuenta de látex ingerida contenía más de 160 proteínas diferentes, muchas de las cuales nunca se habían identificado o no se sabía que participaran en la fagocitosis.

Información obtenida a partir de sistemas libres de células

Tras desarrollar las técnicas para fraccionar los organelos membranosos, los investigadores empezaron a explorar las capacidades de estas burdas preparaciones subcelulares. Encontraron que las partes aisladas de una célula eran capaces de realizar actividades extraordinarias. Dichos sistemas libres de células, llamados así porque no contienen células completas, suministraron mucha información sobre los procesos complejos imposibles de estudiar con células intactas. Por ejemplo, durante el decenio de 1960, George Palade, Philip Siekevitz y col., de la Rockefeller University se dedicaron a aprender más sobre las propiedades de la fracción microsómica rugosa (mostrada en la figura 8.5c), que deriva del retículo endoplásmico rugoso (pág. 280). Estos investigadores hallaron que podían liberar una preparación microsómica rugosa de sus partículas adheridas y las partículas aisladas (ribosomas) eran capaces de sintetizar proteínas cuando contaban con los ingredientes necesarios del citosol. En tales condiciones, los ribosomas tan sólo liberaban las proteínas recién sintetizadas al medio acuoso del tubo de ensayo. Cuando se realizó el mismo experimento con microsomas rugosos intactos, las proteínas recién sintetizadas ya no se liberaban al medio de incubación, sino que quedaban atrapadas dentro de la luz de las vesículas membranosas. Con base en estos estudios se concluyó que la membrana microsómica no era necesaria para la incorporación de aminoácidos en las proteínas, pero sí para secuestrar las nuevas proteínas secretoras sintetizadas dentro del espacio de las cisternas del retículo endoplásmico.

En los últimos decenios, los investigadores emplearon sistemas libres de células para identificar las funciones de muchas de las proteínas participantes en el tránsito de la membrana. La figura 8.6 muestra un liposoma con vesículas que se desprenden de su superficie (flechas). Como se explica en la página 128, los liposomas son vesículas cuya superficie consiste en una bicapa artificial que se crea en el laboratorio a partir de fosfolípidos purificados. Las yemas y vesículas que se ven en la figura 8.6 se produjeron después de incubar la preparación de liposomas con proteínas purificadas que en condiciones normales forman cubiertas en la superficie citosólica de las vesículas de transporte dentro de la célula. Sin las proteínas de cubierta adicionales, no ocurriría el desprendimiento de vesículas. Con esta estrategia, en la que los procesos celulares se reconstituyen in vitro a partir de los componentes purificados, los investigadores han podido estudiar las proteínas que se unen con la membrana para iniciar la formación de vesículas, las proteínas encargadas de la selección del cargamento y las que cortan la vesícula de la membrana donadora.

Información obtenida del estudio de fenotipos mutantes

Un mutante es un organismo (o célula cultivada) cuyos cromosomas contienen uno o más genes que codifican proteínas anormales. Cuando una proteína codificada por un gen mutante es incapaz de realizar su función normal, la célula que tiene la mutación presenta una deficiencia característica. La identificación de la naturaleza precisa de la deficiencia proporciona información sobre la función de la proteína normal. El estudio de la base genética de la secreción se ha realizado sobre todo en células de levadura y la mayor parte del trabajo la han realizado Randy Schekman y col., de la University of California, en Berkeley. Las levaduras son muy susceptibles a los estudios genéticos porque tienen una pequeña cantidad de genes en comparación con otros tipos de eucariotas; son organismos unicelulares pequeños fáciles de cultivar y pueden crecer como haploides durante la mayor parte de su ciclo celular. Una mutación en un solo gen de una célula haploide tiene un efecto observable porque las células carecen de una segunda copia del gen que enmascararía la presencia de la anormal.

En las levaduras, como en todas las células eucariotas, las vesículas se desprenden del retículo endoplásmico y viajan al aparato de Golgi, donde se fusionan con las cisternas de Golgi (fig. 8.7a). Para identificar los genes cuya proteína codificada participa en esta parte de la vía secretora (esto es, genes SEC), los investigadores buscan células mutantes que tienen una distribución anormal de membranas citoplásmicas. La figura 8.7b muestra una micrografía electrónica de una célula de levadura nativa. La célula que se muestra en la figura 8.7c tiene una mutación en el gen que codifica una proteína que participa en la formación de vesículas en la membrana del retículo endoplásmico (paso 1, fig. 8.7a). Cuando no forman vesículas, las células mutantes acumulan un retículo endoplásmico extenso. En cambio, la célula mostrada en la figura 8.7d posee una mutación en un gen que codifica una proteína participante en la fusión de las vesículas (paso 2, fig. 8.7a). Cuando el producto de este gen es defectuoso, las células mutantes acumulan un número excesivo de vesículas no fusionadas. Los investigadores han aislado docenas de mutantes diferentes, que consideradas como grupo presentan interrupciones en todos los pasos de la vía secretora. Ya se clonaron los genes causantes de estos defectos y se identificó su secuencia, además de aislar las proteínas que codifican. El aislamiento de las proteínas de la levadura inició búsquedas exitosas de proteínas homólogas (es decir, proteínas con secuencia relacionada) en sistemas de mamíferos.

Una de las lecciones más importantes que se aprendieron con el uso de todas estas técnicas es que las actividades dinámicas del sistema de endomembrana están muy bien conservadas. No sólo las células de levaduras, plantas, insectos y seres humanos efectúan procesos similares, sino que los llevan a cabo con proteínas muy parecidas. Es evidente que la diversidad estructural de las células contradice sus similitudes moleculares subyacentes. En muchos casos, las proteínas de especies muy distintas son intercambiables. Por ejemplo, los sistemas libres de células obtenidos de células de mamíferos pueden usar proteínas de levaduras para facilitar el transporte de vesículas. Por el contrario, las células de levaduras con deficiencias genéticas que interrumpen alguna fase de la vía biosintética a menudo pueden “curarse” con ingeniería genética al incorporarles genes de mamíferos.

En los últimos 10 años, los investigadores interesados en la búsqueda de genes que afectan un proceso celular particular en células vegetales o animales aprovecharon un fenómeno celular llamado interferencia de RNA (RNAi). Éste es un proceso en el que las células producen RNA pequeños (llamados siRNA) que se unen con mRNA específicos e inhiben la traducción de éstos en proteínas. Tal fenómeno y su aplicación se explican con detalle en las secciones 11.5 y 18.17. Para los fines de este capítulo, sólo se indica que los investigadores pueden sintetizar una colección (biblioteca) de siRNA capaces de inhibir la traducción de cualquier mRNA que se produzca a partir de un genoma. Cada mRNA representa la expresión de un gen específico; por lo tanto, puede averiguarse qué genes participan en un proceso particular mediante la identificación de los siRNA que interfieren con ese proceso. En el experimento ilustrado en la figura 8.8, los investigadores pretendían identificar los genes que participan en varios pasos de la vía secretora, un objetivo similar al de los investigadores que estudian las levaduras mutantes mostradas en la figura 8.7. En este caso, los investigadores utilizaron una cepa de células de Drosophila e intentaron identificar genes que afectan la localización de la manosidasa II, una enzima que se sintetiza en el retículo endoplásmico y se mueve mediante vesículas de transporte al aparato de Golgi, donde se establece. La figura 8.8a muestra una célula de control que sintetiza una versión de manosidasa II marcada con GFP; la fluorescencia se localiza en los abundantes aparatos de Golgi de la célula, como era de esperar. La figura 8.8b muestra una célula que contiene moléculas de siRNA que produjeron el cambio de localización de la GFP-manosidasa hacia el retículo endoplásmico, que se ve fusionado con los aparatos de Golgi. Este tipo de fenotipo casi siempre se produce por la ausencia de una de las proteínas implicadas en el transporte de la enzima desde el retículo endoplásmico al aparato de Golgi. De los 130 siRNA distintos que interfirieron de alguna manera con la vía secretora en este estudio, 31 de ellos produjeron un fenotipo similar al que se muestra en la figura 8.8b. Entre estos 31 siRNA se incluían numerosas especies que inhibían la expresión de genes con participación ya conocida en la vía secretora. Además, el estudio identificó otros genes cuya función se desconocía y ahora se presume que participan también en estos procesos. Como es más fácil sintetizar un RNA pequeño que un organismo con un gen mutante, el RNAi se ha convertido en una estrategia frecuente para investigar el efecto de una proteína faltante.

El retículo endoplásmico (ER, endoplasmic reticulum) es una red de membranas que abarcan gran parte del citoplasma. Es probable que el ER haya evolucionado a partir de invaginaciones de la membrana plasmática como se muestra en la figura 1 pág. 27. Dentro de dicho retículo está un espacio extenso o “luz”, separado del citosol vecino por la membrana del retículo endoplásmico. Como resulta evidente en la descripción siguiente, la composición del espacio luminal o cisternas dentro de las membranas del ER es muy diferente de la del espacio citosólico circundante. A semejanza de otros organelos subcelulares el ER es una estructura altamente dinámica que muestra recambio y reorganización continuos.

El retículo endoplásmico está dividido en dos subcompartimientos que son el retículo rugoso (RER, rough endoplasmic reticulum) y el retículo liso (SER, smooth endoplasmic reticulum). El ER rugoso se define por la presencia de ribosomas unidos a su superficie citosólica, mientras que el ER liso carece de ribosomas. El RER casi siempre se compone de una red de sacos aplanados (cisternas), como se muestra en la figura 8.9a. El RER se continúa con la membrana externa de la envoltura nuclear, que también tiene ribosomas en su superficie citosólica (fig. 8.2b). En cambio, los elementos membranosos del SER son curvos y tubulares, forman un sistema de tuberías interconectadas que ondulan por todo el citoplasma. Cuando se realiza la homogeneización de las células, el SER se fragmenta en vesículas de superficie lisa, en tanto el RER se fragmenta en vesículas de superficie rugosa (fig. 8.5b,c).

Las proteínas y lípidos con marcas fluorescentes pueden difundirse de un tipo de retículo endoplásmico al otro, lo que indica que las membranas están interconectadas. De hecho, los dos tipos de compartimientos de dicho retículo comparten muchas de sus proteínas y realizan ciertas actividades comunes, como la síntesis de algunos lípidos y colesterol. Sin embargo, al mismo tiempo muchas proteínas se encuentran sólo en uno u otro tipo de retículo. Por ejemplo, la presencia de proteínas para “flexión” de la membrana, llamadas reticulones, induce y conserva un alto grado de curvatura de los túbulos de SER, curvatura que en gran medida falta en las hojas aplanadas de RER. A diferencia de ello, este último contiene proteínas que intervienen en el desplazamiento de proteínas “nacientes” hacia la luz del retículo endoplásmico.

Los diferentes tipos de células contienen proporciones muy distintas de los dos tipos de retículo endoplásmico, según sean las actividades de la célula. Por ejemplo, las células que secretan grandes cantidades de proteínas, como las pancreáticas o las células de las glándulas salivales, tienen regiones extensas de RER (fig. 8.9b,d). Más adelante se regresa a la función del RER, pero primero se describen las actividades del retículo endoplásmico liso.

El retículo endoplásmico liso

El SER está muy desarrollado en diversos tipos celulares, entre ellos los del músculo esquelético, túbulos renales y glándulas endocrinas productoras de esteroides (fig. 8.10). Las funciones del SER incluyen:

• Síntesis de hormonas esteroideas en las células endocrinas de las gónadas y la corteza suprarrenal.

• Desintoxicación en el hígado de diversos compuestos orgánicos, como barbitúricos y etanol, cuyo consumo crónico puede conducir a la proliferación del SER en las células hepáticas. La desintoxicación la realiza un sistema de enzimas que transfieren oxígeno (oxigenasas), incluida la familia del citocromo P-450. Estas enzimas son notables por su falta de especificidad de sustrato y pueden oxidar miles de compuestos hidrófobos distintos y convertirlos en sustancias más hidrófilas y más fáciles de excretar. Los efectos no siempre son positivos. Por ejemplo, el compuesto relativamente inocuo benzo[a]pireno que se forma cuando se requema la carne en una parrilla se convierte en un carcinógeno potente por efecto de las enzimas “desintoxicantes” del SER. Las enzimas del citocromo P-450 metabolizan muchos medicamentos prescritos y la variación genética en estas enzimas en los seres humanos explica las diferencias en la eficacia y efectos secundarios de muchos fármacos entre unas personas y otras.

• Secuestro de iones calcio en el citoplasma celular. La liberación regulada de Ca²⁺ del SER de células musculares esqueléticas y cardiacas (conocido como retículo sarcoplásmico en las células musculares) desencadena la contracción.

Funciones del retículo endoplásmico rugoso

Las investigaciones iniciales sobre las funciones del RER se realizaron en células que secretan grandes cantidades de proteína, como las células acinares del páncreas (fig. 8.3) o las células secretoras de moco del recubrimiento del tubo digestivo (fig. 8.11). A partir del dibujo y la micrografía de la figura 8.11 resulta evidente que los organelos de estas células epiteliales secretoras se disponen de tal forma en la célula que producen una polaridad distinta en uno y otro extremo de ella. El núcleo y un conjunto grande de cisternas de RER se localizan cerca de la superficie basal de la célula, la cual está próxima al aporte sanguíneo. El aparato de Golgi se localiza en la región central de la célula. La superficie apical de la célula está junto a un conducto que transporta las proteínas secretadas fuera del órgano. El citoplasma del extremo apical de la célula está lleno de gránulos secretores cuyo contenido está listo para liberarse hacia el conducto en cuanto llega la señal apropiada. La polaridad de estas células epiteliales glandulares refleja el movimiento de las proteínas secretoras por la célula, desde el sitio de síntesis hasta el punto por donde se descargan. El retículo endoplásmico rugoso es el punto inicial de la vía biosintética: es el punto donde se sintetizan las proteínas, cadenas de carbohidratos y fosfolípidos que viajan por los compartimientos membranosos de la célula.

Síntesis de proteínas en ribosomas unidos a la membrana o en ribosomas libres

Ya se describió (fig. 8.3) el descubrimiento del retículo endoplásmico rugoso como sitio de la síntesis de proteínas de secreción (secretoras) en las células acinares pancreáticas. Se obtuvieron resultados similares para otros tipos de células secretoras, incluidas las células caliciformes del intestino que secretan mucoproteínas, las células endocrinas que producen hormonas polipeptídicas, las células plasmáticas que secretan anticuerpos y las células hepáticas que secretan proteínas séricas a la sangre.

Experimentos posteriores han revelado que los polipéptidos se sintetizan en dos puntos distintos dentro de la célula.

1. En promedio, la tercera parte de las proteínas codificadas por el genoma de mamíferos son sintetizadas en los ribosomas unidos a la superficie citosólica de las membranas RER. Éstos incluyen: (a) las proteínas que secreta la célula, (b) proteínas integrales de la membrana y (c) proteínas solubles que se encuentran en compartimientos del sistema de endomembrana, como el retículo endoplásmico, aparato de Golgi, lisosomas, endosomas, vesículas y vacuolas vegetales.

2. Otros polipéptidos se sintetizan en ribosomas “libres”, es decir, los que no están unidos al RER, y luego se liberan al citosol. Esta clase incluye: (a) proteínas destinadas a permanecer en el citosol (como las enzimas de la glucólisis y las proteínas del citoesqueleto); (b) proteínas periféricas de la superficie citosólica de las membranas (como las espectrinas y las anquirinas que sólo tienen una relación débil con la superficie citosólica de la membrana plasmática); (c) proteínas que se transportan al núcleo (sección 12.2), y (d) proteínas que se incorporan a los peroxisomas, cloroplastos y mitocondrias. Las proteínas de los dos últimos grupos se sintetizan hasta terminarlas en el citosol y luego se importan después de la traducción al organelo apropiado a través de su membrana limitante (pág. 316).

¿Qué determina el sitio de la célula en el que se sintetiza una proteína? A principios del decenio de 1970, Günter Blobel, en colaboración con David Sabatini y Bernhard Dobberstein de la Rockefeller University, propusieron por primera vez, y luego demostraron, que el sitio de la síntesis de una proteína dependía de la secuencia de aminoácidos en la porción amino-terminal del polipéptido, que es la primera parte que surge del ribosoma durante la síntesis de las proteínas. Estos investigadores sugirieron lo siguiente:

1. Las proteínas secretoras contienen una secuencia de señal en su extremo amino que dirige al polipéptido emergente y al ribosoma hacia la membrana del retículo endoplásmico.

2. El polipéptido se mueve en dirección al espacio de cisterna del retículo endoplásmico, un canal acuoso recubierto con proteína en la membrana del retículo endoplásmico. Se ha propuesto que el polipéptido se mueve por la membrana conforme se sintetiza, esto es, al mismo tiempo de la traducción.²

Esta proposición, conocida como la hipótesis de la señal, tiene el respaldo de abundante evidencia experimental. Algo aún más importante: se demostró que el concepto original de Blobel, según el cual las proteínas tienen incluidos “códigos postales”, se aplica en principio a todos los tipos de proteína que transitan las vías de la célula.

Síntesis de proteínas secretoras, lisosómicas o vacuolares vegetales en los ribosomas unidos a membranas

Los pasos durante la síntesis de una proteína secretora, lisosómica o vacuolar vegetal, se muestran en la figura 8.12a. La síntesis del polipéptido inicia después que un RNA mensajero se une con un ribosoma libre, es decir, uno que no esté unido con una membrana citoplásmica. De hecho, se cree que todos los ribosomas son idénticos; los empleados en la síntesis de proteínas secretoras, lisosómicas o las de las vacuolas vegetales se toman de la misma población (reserva) que los utilizados en la producción de proteínas que permanecen en el citosol. Los polipéptidos sintetizados en ribosomas unidos con membranas contienen una secuencia señal, que incluye un segmento de seis a 15 residuos de aminoácidos hidrófobos, y que dirige al polipéptido naciente a la membrana del retículo endoplásmico, y además conduce a la división en compartimientos del polipéptido dentro de la luz de este retículo. (Un polipéptido naciente es uno que esté en proceso de síntesis.) Aunque la secuencia señal casi siempre se localiza en o cerca del extremo amino, en algunos polipéptidos ocupa una posición interna.

Conforme surge del ribosoma, una partícula de reconocimiento de señal (SRP) identifica la secuencia señal hidrófoba; dicha partícula posee en las células de mamíferos seis polipéptidos distintos y una pequeña molécula de RNA, llamada RNA 7SL. La SRP se une tanto a la secuencia señal en el polipéptido naciente como al ribosoma (paso 1, fig. 8.12a), con lo que detiene temporalmente la síntesis de más polipéptido. La SRP unida sirve como una marca que permite que el complejo entero (SRP-ribosoma-polipéptido naciente) se una de manera específica a la superficie citosólica de la membrana del retículo endoplásmico. La unión a este último ocurre a través de cuando menos dos interacciones bien definidas: una entre la SRP y el receptor de SRP (paso 2), y la otra entre el ribosoma y el translocón (paso 3). El translocón es un conducto recubierto con proteína incrustado en la membrana del ER a través del cual el polipéptido naciente puede moverse en su paso del ribosoma a la luz del retículo endoplásmico.

En los últimos años, uno de los mayores desafíos en el campo del tráfico de membrana ha sido la determinación de la estructura tridimensional de una versión procariótica del translocón mediante cristalografía de rayos X (fig. 8.12b). Este esfuerzo reveló la presencia dentro del translocón de un poro con forma de reloj de arena, con un anillo de seis aminoácidos hidrófobos en su diámetro más estrecho. En el estado inactivo (es decir, sin transposición), que fue el estado en el que se cristalizó la estructura, la abertura del anillo del poro está obstruida por una hélice α corta. En un inicio se propuso que este tapón sella el canal, impidiendo el paso indeseado de calcio y otros iones entre el citosol y la luz del retículo endoplásmico; sin embargo, este modelo en la actualidad se encuentra en debate.

Una vez que el complejo SRP-ribosoma-cadena naciente se une a la membrana del retículo endoplásmico (paso 2, fig. 8.12a), la SRP se libera de su receptor en el ER, el ribosoma se une al extremo citosólico del translocón, y la secuencia señal en el polipéptido naciente se inserta en el estrecho canal acuoso del translocón (paso 3). Se propone que el contacto de la secuencia señal con el interior del translocón causa el desplazamiento del tapón y la abertura del pasaje. El polipéptido en crecimiento se traspone entonces a través del anillo del poro hidrófobo hacia la luz del retículo endoplásmico (paso 4 y figura 8.12c). Dado que el anillo del poro observado en la estructura cristalina tiene un diámetro (5 a 8 Å) considerablemente menor que el de una cadena polipeptídica helicoidal, se supone que el poro se expande cuando la cadena naciente atraviesa el canal. (La expansión es posible porque los residuos que constituyen el anillo están situados en diferentes hélices de la proteína del translocón.) Cuando terminan la traducción y el paso del polipéptido completo por el translocón, el ribosoma unido a membrana se libera de la membrana del retículo endoplásmico y el tapón helicoidal se reinserta en el canal del translocón.

Varios de los pasos incluidos en la síntesis y tránsito de las proteínas secretoras se regulan mediante la unión o hidrólisis de GTP (trifosfato de guanosina). Como se trata con detalle en el capítulo 15 y en otra parte de este capítulo, las proteínas de unión con GTP (o proteínas G) tienen funciones reguladoras clave en muchos procesos celulares diferentes.³ Las proteínas G pueden estar presentes en por lo menos dos conformaciones alternativas, una que contiene una molécula de GTP unida y la otra con una molécula GDP. Las versiones unidas con GTP y GDP de una proteína G tienen conformaciones diferentes y, por consiguiente, capacidades distintas para unirse con otras proteínas. A causa de esta diferencia en las propiedades de unión, las proteínas G actúan como “interruptores moleculares”; la proteína unida con GTP casi siempre activa el proceso y la hidrólisis del GTP unido lo apaga. Entre los componentes mostrados en la figura 8.12, tanto SRP como el receptor para SRP son proteínas G que interactúan entre sí en sus estados unidos con GTP. La hidrólisis del GTP unido con estas dos proteínas ocurre entre los pasos 2 y 3 e inicia la liberación de la secuencia de señal por la SRP y su inserción en el translocón.

Procesamiento de proteínas recién sintetizadas en el retículo endoplásmico

Conforme entra a la cisterna del RER, un polipéptido naciente es sujeto de la actividad de diversas enzimas situadas dentro de la membrana o en la luz del RER. La porción amino-terminal que contiene el péptido señal se retira de la mayor parte de los polipéptidos nacientes por acción de una enzima proteolítica, la peptidasa de señal. Los carbohidratos se agregan a la proteína naciente mediante la enzima oligosacariltransferasa (descrita en la página 286). La peptidasa de señal y la oligosacariltransferasa son proteínas integrales de la membrana que están próximas al translocón y actúan sobre las proteínas nacientes conforme entran a la luz del retículo endoplásmico.

El RER es una planta procesadora de proteínas importante. Para realizar sus funciones, la luz del RER está empacada con chaperonas moleculares que reconocen proteínas desplegadas o mal plegadas, se unen a ellas y les dan la oportunidad de adquirir su estructura tridimensional correcta (nativa) (pág. 288). La luz del retículo endoplásmico también contiene varias enzimas procesadoras de proteínas, como la disulfuro isomerasa de proteína (PDI, protein disulfide isomerase). Las proteínas entran en la luz del retículo endoplásmico con sus residuos cisteína en el estado reducido (—SH), pero salen del compartimiento con muchos de estos residuos unidos entre sí como disulfuros oxidados (—SS—) (pág. 53). La formación (y el reordenamiento) de los enlaces de disulfuro es catalizada por PDI.

Los enlaces disulfuro tienen una función esencial en el mantenimiento de la estabilidad de las proteínas que se encuentran en la superficie extracelular de la membrana plasmática o que se secretan al espacio extracelular.

El retículo endoplásmico tiene la construcción ideal para cumplir su función como puerto de entrada a la vía biosintética de la célula. Su membrana suministra una gran superficie en la cual pueden unirse muchos ribosomas (se estima que son 13 millones en cada célula hepática). La luz de las cisternas del retículo endoplásmico proporciona un ambiente local especializado que favorece la modificación, el plegamiento y el ensamble de un subtipo seleccionado de proteínas de la célula. La separación de las proteínas nuevas en las cisternas del ER las retira del citosol y permite que sean modificadas y enviadas a su destino final, ya sea fuera de la célula o dentro de alguno de los organelos membranosos del citoplasma.

Síntesis de proteínas integrales de membrana en los ribosomas unidos a la membrana

Las proteínas integrales de la membrana, distintas de las de las mitocondrias y cloroplastos, también se sintetizan en los ribosomas unidos a la membrana del retículo endoplásmico. Estas proteínas de membrana se translocan a la membrana del ER conforme se sintetizan (esto es, al mismo tiempo que la traducción) con los mismos mecanismos descritos para la síntesis de las proteínas secretoras y lisosómicas (fig. 8.12). Sin embargo, a diferencia de las proteínas secretoras solubles y las lisosómicas, que pasan por completo a través de la membrana del retículo endoplásmico durante la translocación, las proteínas integrales de membrana contienen uno o más segmentos transmembranosos hidrófobos (pág. 134) que son desviados directamente del canal del translocón hacia el interior de la bicapa lipídica. ¿Cómo puede ocurrir tal transferencia?

Los estudios de cristalografía de rayos X del translocón antes descritos mostraron que este último tiene una conformación en forma de almeja con un surco o costura a lo largo del costado de la pared, donde el canal podría abrirse y cerrarse. Se propone que cuando un polipéptido pasa por el translocón, este “puente” lateral en el canal se abre y cierra continuamente, lo cual da a cada segmento del polipéptido naciente la oportunidad de distribuirse conforme a sus propiedades de solubilidad en el compartimiento acuoso del interior del canal del translocón o el centro hidrófobo circundante de la bicapa lipídica. Aquellos segmentos del polipéptido naciente que sean lo suficientemente hidrófobos se “disolverán” de manera espontánea en la bicapa lipídica y al final se convertirán en segmentos transmembranosos de una proteína integral de membrana. Este concepto ha recibido fuerte apoyo de un estudio in vitro en el cual se dio a los translocones la oportunidad de translocar proteínas nacientes “sobre pedido” que contenían segmentos de prueba de diversas hidrofobicidades. Cuanto más hidrófobo el segmento de prueba, tanto mayor la probabilidad de que pasara por la pared del translocón y se integrara como un segmento transmembranoso de la bicapa.

La figura 8.13 muestra la síntesis de un par de proteínas integrales de membrana que contienen un solo segmento transmembranoso. Las proteínas que cruzan una sola vez la membrana pueden estar orientadas con el extremo amino hacia el citosol o hacia la luz del retículo endoplásmico (y en última instancia hacia el espacio extracelular). Como se indica en la página 135, el factor determinante más frecuente de la alineación de la proteína de membrana es la presencia de residuos de aminoácidos con carga positiva que flanquean el extremo citosólico de un segmento transmembranoso (fig. 4.18). Durante la síntesis de las proteínas de membrana, se cree que el recubrimiento interno del translocón orienta al polipéptido naciente, como se indica en la figura 8.13, de manera que el extremo más positivo se dirija hacia el citosol. En las proteínas que cruzan varias veces la membrana (como se muestra en la figura 4.32d), los segmentos transmembranosos secuenciales tienen orientaciones opuestas. Para estas proteínas, su disposición dentro de la membrana se determina por la dirección en la que se inserta el primer segmento transmembrana. Una vez que se determina, cada tercer segmento transmembrana debe girar 180° para poder salir del translocón. Los estudios que se han realizado con componentes purificados en sistemas libres de células sugieren que un translocón es capaz, por sí mismo, de orientar en forma apropiada los segmentos transmembranosos. Pareciera que el translocón es más que un simple paso por la membrana del retículo endoplásmico; es una “máquina” compleja capaz de reconocer varias secuencias señal y realizar actividades mecánicas complejas.

Biosíntesis de membrana en el retículo endoplásmico

Las membranas no surgen de novo, es decir, por la combinación de elementos de las reservas de proteínas y lípidos. Por el contrario, se asume que las membranas surgen sólo de las membranas preexistentes. Las membranas crecen conforme las proteínas y lípidos recién sintetizados se insertan en las membranas existentes en el ER. Como resulta evidente en la siguiente revisión, los componentes de la membrana pasan del retículo endoplásmico a todos los demás compartimientos de la célula. Cuando la membrana se mueve de un compartimiento al siguiente, sus proteínas y lípidos se modifican por efecto de las enzimas que residen en los diversos organelos de la célula. Estas modificaciones contribuyen a dar a cada compartimiento de membrana una composición única y una identidad distintiva.

Hay que recordar que las membranas celulares son asimétricas: las dos capas de fosfolípidos (hojas) de una membrana tienen diferentes composiciones (pág. 128). Esta asimetría se establece al principio en el retículo endoplásmico, y se mantiene cuando la membrana se desprende de un compartimiento y se fusiona con el siguiente. Como resultado, los componentes situados en la superficie citosólica de la membrana del retículo endoplásmico pueden identificarse en la superficie citosólica de las vesículas de transporte, en la superficie citosólica de las cisternas de Golgi y en la superficie interna (citoplásmica) de la membrana plasmática (fig. 8.14). De igual forma, los dominios situados en la superficie luminal de la membrana del ER mantienen su orientación y se encuentran en la superficie externa (exoplásmica) de la membrana plasmática. En realidad, en muchos aspectos, como su alta concentración de calcio y abundancia de proteínas con enlaces disulfuro y cadenas de carbohidratos, la luz del ER (así como otros compartimientos de la vía secretora) se parece mucho al espacio extracelular.

Síntesis de los lípidos de la membrana La mayor parte de los lípidos de la membrana se sintetiza por completo dentro del retículo endoplásmico. Las principales excepciones son: (1) la esfingomielina y los glucolípidos, cuya síntesis comienza en el ER y se completa en el aparato de Golgi y (2) algunos de los lípidos únicos de las membranas de mitocondrias y cloroplastos, que se sintetizan por acción de enzimas que residen en esas membranas. Las enzimas participantes en la síntesis de fosfolípidos son proteínas integrales de la membrana del retículo endoplásmico y sus sitios activos están dirigidos hacia el citosol. Los fosfolípidos recién producidos se insertan en la mitad de la bicapa dirigidos hacia el citosol. Algunas de estas moléculas de lípidos se giran más tarde hacia la hoja contraria mediante la acción de enzimas llamadas flipasas. Los lípidos son transportados del retículo endoplásmico al aparato de Golgi y la membrana plasmática como parte de la bicapa que constituye las paredes de las vesículas de transporte.

Las membranas de los diferentes organelos tienen una composición de lípidos muy diferente (fig. 8.15a), lo cual indica que se producen cambios a medida que la membrana fluye por la célula. Varios factores pueden contribuir a tales cambios (fig. 8.15b):

1. La mayor parte de los organelos membranosos contiene enzimas que modifican los lípidos que ya están dentro de su membrana y convierten un tipo de fosfolípidos (p. ej., fosfatidilserina) en otro (p. ej., fosfatidilcolina) (paso 1, fig. 8.15b).

2. Cuando las vesículas se desprenden de un compartimiento (como en la figura 8.2a), algunos tipos de fosfolípidos pueden incluirse de manera preferencial dentro de la membrana de la vesícula en formación, mientras que otros tipos se dejan atrás (paso 2, fig. 8.15b).

3. Las células contienen proteínas de transferencia de lípidos que pueden unir y transportar a los lípidos a través del citosol acuoso de un compartimiento de membrana a otro (paso 3, fig. 8.15b). Las proteínas mencionadas facilitan el desplazamiento de lípidos específicos desde ER a otros organelos sin la participación de vesículas de transporte. Según se piensa, la transferencia de lípidos se hace en sitios en que el ER está muy cerca de la membrana externa de otros organelos.

Glucosilación en el retículo endoplásmico rugoso

Casi todas las proteínas producidas en los ribosomas unidos con membranas se convierten en glucoproteínas, ya sean componentes integrales de una membrana, enzimas lisosómicas solubles o vacuolares o partes de la matriz extracelular. Los grupos carbohidrato tienen una participación importante en la función de muchas glucoproteínas, sobre todo como sitios de unión en sus interacciones con otras macromoléculas, como ocurre durante muchos procesos celulares. También ayudan al plegamiento correcto de la proteína a la que están unidos. Las secuencias de azúcares que comprenden los oligosacáridos de las glucoproteínas son muy específicas; si los oligosacáridos se aíslan de una proteína purificada de un tipo celular en particular, su secuencia es consistente y predecible. ¿Cómo se logra el orden de los azúcares en los oligosacáridos?

La adición de azúcares a una cadena de oligosacárido se cataliza por una familia de enzimas unidas a la membrana llamadas glucosiltransferasas. Cada una de estas enzimas transfiere un monosacárido específico de un azúcar-nucleótido, como GDP-manosa o UDP-N-acetilglucosamina (fig. 8.16), al extremo en crecimiento de la cadena de carbohidrato. La secuencia en que se transfieren los azúcares durante el ensamblaje de un oligosacárido depende de la secuencia de acción de las glucosiltransferasas que participan en el proceso. A su vez, esto depende de la localización de enzimas específicas dentro de las diversas membranas de la vía secretora. Por lo tanto, la disposición de los azúcares en las cadenas de oligosacáridos de una glucoproteína depende de la localización espacial de las enzimas específicas en la línea de montaje.

La figura 8.16 muestra los pasos iniciales en el ensamble de los oligosacáridos unidos con N (a diferencia de los oligosacáridos unidos con O, véase fig. 4-11) de las proteínas solubles y las proteínas integrales de la membrana. El segmento basal o central de cada cadena de carbohidrato no se ensambla sobre la proteína misma, sino que se arma de manera independiente sobre un lípido portador y luego se transfiere, en bloque, a los residuos de asparagina específicos del polipéptido. Este lípido transportador, llamado fosfato de dolicol, está embebido en la membrana del retículo endoplásmico. Los azúcares se agregan a la molécula de fosfato de dolicol uno a la vez por acción de las glucosiltransferasas unidas a la membrana, a partir del paso 1 de la figura 8.16. Esta parte del proceso de glucosilación es invariable; en las células de mamíferos comienza con la transferencia de N-acetilglucosamina 1-fosfato, seguida de la transferencia de otra N-acetilglucosamina y luego nueve moléculas de manosa y tres unidades de glucosa en el patrón exacto indicado en la figura 8.16. Este bloque ya ensamblado de 14 azúcares se transfiere luego por acción de la enzima oligosacariltransferasa del ER del fosfato de dolicol a ciertas asparaginas en el polipéptido naciente (paso 10, fig. 8.16) mientras el polipéptido se transloca hacia la luz del retículo endoplásmico.

Las mutaciones que causan la ausencia total de N-glucosilación provocan la muerte de los embriones antes de la implantación. Sin embargo, las mutaciones que producen la interrupción parcial de la vía de glucosilación en el retículo endoplásmico causan trastornos hereditarios graves que afectan casi cualquier aparato o sistema. Estas anomalías se conocen como enfermedades congénitas de la glucosilación (CDG, congenital diseases of glycosylation), y suelen identificarse mediante pruebas sanguíneas que detectan la glucosilación anormal de proteínas séricas. Una de ellas, CDG1b, puede tratarse con medidas muy sencillas. La CDG1b se debe a la deficiencia de la enzima fosfomanosa isomerasa, que cataliza la conversión de fructosa 6-fosfato en manosa 6-fosfato, una reacción crucial en la vía que hace que la manosa esté disponible para incorporarla en los oligosacáridos. La afección puede tratarse con complementos orales de manosa. Al principio, el tratamiento se probó en un niño grave que sufría hemorragia gastrointestinal incontrolable, una de las complicaciones frecuentes de la enfermedad. Unos meses después de iniciar el complemento de manosa el niño pudo llevar una vida normal.

Poco después de transferirse al polipéptido naciente, la cadena de oligosacárido se somete a un proceso gradual de modificación. Esta modificación comienza en el ER con la eliminación enzimática de dos de los tres residuos terminales de glucosa (paso 1, fig. 8.17). Esto pone el escenario para un acontecimiento importante en la vida de una glucoproteína recién sintetizada en el cual ésta es evaluada por un sistema de control de calidad que determina si es apta o no para pasar al siguiente compartimiento de la vía biosintética. Para comenzar este proceso de detección, cada glucoproteína (que en esta etapa contiene una sola glucosa restante) se une a la chaperona del retículo endoplásmico (calnexina o calreticulina) (paso 2). La eliminación de la glucosa restante por la glucosidasa II hace que la chaperona libere la glucoproteína (paso 3). Si en esta etapa una glucoproteína no ha completado su plegamiento o está mal plegada, es reconocida por una enzima detectora de conformación (llamada UGGT) que agrega un solo residuo de glucosa de nuevo a uno de los residuos de manosa en el extremo expuesto del oligosacárido recién reducido (paso 4). La UGGT reconoce las proteínas mal plegadas, o plegadas sólo de forma parcial, porque exponen residuos hidrófobos que no se detectan en las proteínas bien plegadas. Una vez que se agrega el residuo de glucosa, las mismas moléculas chaperonas reconocen a la glucoproteína “marcada”, lo que da a la proteína otra oportunidad para plegarse de manera correcta (paso 5). Después de un periodo con la chaperona, el residuo de glucosa se retira y la enzima detectora de conformación la revisa de nuevo para confirmar que alcanzó su estructura tridimensional apropiada. Si todavía está parcialmente desplegada o mal plegada, se agrega otro residuo de glucosa y se repite el proceso hasta que al final, la glucoproteína se pliega en forma correcta y continúa su camino (paso 6) o permanece mal plegada y se destruye. Los estudios sugieren que la “decisión” de destruir la proteína defectuosa está regulada por una enzima de acción lenta en el ER que recorta un residuo de manosa de un extremo expuesto del oligosacárido de una proteína que ha estado en el retículo endoplásmico por un tiempo prolongado. Una vez que se retiran uno o más de estos residuos de manosa (paso 7), la proteína ya no puede reciclarse y se destina a la degradación (paso 8).

En la página 292 se retoma la historia de la glucosilación de las proteínas, cuando se describe la manera en que el oligosacárido que se ensambló en el retículo endoplásmico crece a su paso por el aparato de Golgi en su camino por la vía biosintética.

Mecanismos que aseguran la destrucción de las proteínas mal plegadas

Recién se describió el modo en que las enzimas del retículo endoplásmico identifican las proteínas que no se pliegan de manera apropiada. Fue una sorpresa descubrir que las proteínas mal plegadas no se destruyen en el retículo endoplásmico, sino que se transportan al citosol por un proceso de transposición inversa, y no hay consenso en cuanto al mecanismo exacto por el que ocurre tal proceso. Una vez en el citosol, las cadenas de oligosacáridos se retiran y las proteínas mal plegadas se degradan en los proteasomas, que son máquinas destructoras de proteínas cuya estructura y función se describen en la sección 12.7. Este proceso, conocido como degradación vinculada al retículo endoplásmico (ERAD, ER-associated degradation), asegura que las proteínas aberrantes no sean transportadas a otras partes de la célula, pero puede tener consecuencias negativas. En casos graves de fibrosis quística, la membrana plasmática de las células epiteliales carece de la proteína codificada por el gen de la fibrosis quística (pág. 162). En tales casos, la proteína mutante es destruida en el proceso de control de calidad del retículo endoplásmico, por lo que no llega a la superficie celular.

En ciertas circunstancias, las proteínas mal plegadas pueden generarse en el retículo endoplásmico a mayor velocidad de la que pueden transportarse al citoplasma. La acumulación de proteínas mal plegadas, que puede ser letal para la célula, inicia un “plan de acción” completo dentro de la célula que se conoce como respuesta de proteína no plegada (UPR). El retículo endoplásmico contiene sensores de proteína que vigilan la concentración de proteínas no plegadas o mal plegadas en la luz del ER. Según el modelo prevaleciente esbozado en la figura 8.18, los detectores se mantienen en un estado activo mediante chaperonas moleculares, en especial BiP. Si las circunstancias conducen a la acumulación de proteínas mal plegadas, las moléculas BiP de la luz del retículo endoplásmico se reclutan al servicio como chaperonas para las proteínas defectuosas, lo que las hace incapaces de inhibir a los sensores. La activación de los sensores da origen a una multitud de señales que se transmiten hacia el núcleo y el citosol y el resultado incluye lo siguiente:

• Expresión de cientos de genes diferentes cuyas proteínas codificadas tienen la capacidad de aliviar las condiciones de estrés dentro del retículo endoplásmico. Se incluyen genes que codifican: (1) chaperonas moleculares con base en el retículo endoplásmico que ayudan a las proteínas mal plegadas a alcanzar su estado nativo, (2) proteínas que intervienen en el transporte de proteínas fuera del ER y (3) proteínas que participan en la destrucción selectiva de proteínas anormales, como se mencionó antes.

• Fosforilación de una proteína clave (eIFα) necesaria para la síntesis de proteína. Esta modificación inhibe la síntesis proteínica y disminuye el flujo de proteínas nuevas al retículo endoplásmico. Esto suministra a la célula una oportunidad de retirar las proteínas que ya están en la luz del retículo endoplásmico.

Un dato interesante es que la respuesta a la proteína no plegada es más que un mecanismo de supervivencia celular; también incluye la activación de una vía que conduce a la muerte de la célula. Se presupone que la reacción a la proteína no plegada confiere un mecanismo para aliviar a la célula de condiciones de estrés. Si estas medidas correctivas no tienen éxito, se activa la vía de muerte celular y la célula se destruye.

Del retículo endoplásmico al aparato de Golgi: primer paso en el transporte vesicular

Los sitios de salida de las cisternas del RER están desprovistos de ribosomas, y en ellos se forman las primeras vesículas de transporte de la vía biosintética. El viaje desde el retículo endoplásmico al aparato de Golgi puede seguirse en forma visual en células vivas si las proteínas secretoras se marcan con la proteína verde fluorescente (GFP, green fluorescent protein), como se describe en la página 273. Con esta técnica se observa que poco después de desprenderse de la membrana del ER, las vesículas de transporte se fusionan entre sí para formar vesículas más grandes y túbulos interconectados en la región entre el ER y el aparato de Golgi. Esta región se llamó compartimiento intermedio entre el retículo endoplásmico y el aparato de Golgi (ERGIC, endoplasmic reticulum Golgi intermediate compartment), y los transportadores vesiculotubulares que se forman en él se denominaron VTC (vesicular-tubular carrier) (fig. 8.25a). Una vez formados, los VTC se alejan del retículo endoplásmico hacia el aparato de Golgi. La figura 8.19 muestra el movimiento de dos de estos transportadores membranosos vesiculotubulares del ERGIC al aparato de Golgi. El movimiento de los VTC ocurre sobre rieles compuestos por microtúbulos.

En los últimos años del siglo xix, un biólogo italiano, Camillo Golgi, inventó nuevos procedimientos de tinción para revelar la organización de las células nerviosas dentro del sistema nervioso central. En 1898, Golgi aplicó una tinción metálica a las células nerviosas del cerebelo y descubrió una red teñida de oscuro localizada cerca del núcleo celular. Esta red, que más tarde se identificó en otros tipos celulares y se llamó aparato de Golgi, llevó a su descubridor a obtener el Premio Nobel en 1906. El aparato de Golgi permaneció como centro de controversia durante decenios entre los que creían que el organelo existía en las células vivas y los que pensaban que era un artefacto, es decir, una estructura artificial formada durante la preparación para el estudio microscópico. No fue sino hasta que el aparato de Golgi se identificó con claridad en células sin fijación, preparadas por congelamiento y fractura (fig. 18.17) que se comprobó su existencia más allá de cualquier duda razonable.

El aparato de Golgi tiene una morfología característica, consistente sobre todo en cisternas membranosas aplanadas, parecidas a discos, con bordes dilatados, y vesículas y túbulos asociados (fig. 8.20a). Las cisternas, cuyos diámetros típicos oscilan entre 0.5 y 1.0 μm, están dispuestas en una pila ordenada, muy parecida a una superposición de hojuelas, y curvadas de tal forma que semejan un tazón poco profundo (fig. 8.20b).⁴ Por lo general, una pila de Golgi contiene menos de ocho cisternas. Una célula individual puede contener desde unas cuantas hasta varios miles de pilas distintas, según sea el tipo de célula. Las pilas de Golgi en las células de los mamíferos están conectadas entre sí por túbulos membranosos para formar un solo complejo grande parecido a un listón (fig. 8.20c) situado junto al núcleo de la célula (fig. 8.20d). Una mirada más cercana a una cisterna individual sugiere que las vesículas se desprenden de un dominio tubular periférico de cada cisterna (fig. 8.20e). Como se explicará más adelante, muchas de estas vesículas contienen una cubierta proteínica distintiva que puede verse en la figura 8.20e.

El aparato de Golgi se divide en varios compartimientos con funciones diferentes dispuestos a lo largo de un eje, desde la cara cis, o de entrada más cercana al ER, hasta la cara trans o de salida, en el lado opuesto de la pila (fig. 8.20a,b). La cara más cis del organelo la forma una red de túbulos conectados entre sí que se conoce como red cis de Golgi (CGN). Se cree que la CGN funciona sobre todo como una estación de clasificación que distingue entre las proteínas que deben enviarse de regreso al retículo endoplásmico (pág. 298) y aquellas a las que se les permite avanzar a la siguiente estación de Golgi. La mayor parte del aparato de Golgi consiste en una serie de cisternas grandes y aplanadas que se dividen en cisternas cis, mediales y trans (fig. 8.20a). La cara más trans del organelo contiene una red distintiva de túbulos y vesículas llamada red trans de Golgi (TGN). La TGN es una estación de clasificación en la que las proteínas se separan en distintos tipos de vesículas que se dirigen ya sea hacia la membrana plasmática o a varios destinos intracelulares. Se cree que los elementos membranosos del aparato de Golgi cuentan con el soporte mecánico de un esqueleto periférico de la membrana o andamiaje compuesto por varias proteínas, incluidas integrantes de las familias de la espectrina, anquirina y actina, proteínas que también están presentes como parte del esqueleto de la membrana plasmática (pág. 147). La estructura de Golgi puede mantener un enlace físico con proteínas motoras que dirigen el movimiento de las vesículas y túbulos que entran y salen del aparato de Golgi. Se piensa que un grupo separado de proteínas fibrosas forma una “matriz” de Golgi que tiene una función clave en el desarmado y rearmado del aparato de Golgi durante la mitosis.

La figura 8.21 muestra evidencia visual de que el aparato de Golgi no tiene una composición uniforme de un extremo al otro. Las diferencias en la composición de los compartimientos de membrana desde la cara cis a la trans reflejan el hecho de que el aparato de Golgi es sobre todo una “planta procesadora”. Las proteínas de membrana recién sintetizadas, así como las proteínas secretoras y lisosómicas, salen del ER y entran al aparato de Golgi por su cara cis y luego pasan a través de la pila hasta la cara trans. Conforme avanzan por la pila, las proteínas originales sintetizadas en el retículo endoplásmico rugoso sufren varias modificaciones específicas. En la actividad del aparato de Golgi mejor estudiada, los carbohidratos de la proteína se modifican por una serie de reacciones enzimáticas secuenciales, como se describe en la siguiente sección.

Glucosilación en el aparato de Golgi

El aparato de Golgi tiene una función esencial en el ensamble del componente carbohidrato de las glucoproteínas y glucolípidos. Cuando se interrumpió de forma momentánea el tema de la síntesis de cadenas de carbohidratos con enlaces N en la página 288, los residuos de glucosa acababan de retirarse de los extremos del oligosacárido central. Conforme las nuevas glucoproteínas solubles y de membrana pasan por las cisternas cis y media de la pila de Golgi, la mayor parte de los residuos de manosa también se retira de los oligosacáridos centrales y se agregan otros azúcares en forma secuencial por acción de varias glucosiltransferasas.

En el aparato de Golgi, como en el retículo endoplásmico rugoso, la secuencia en la que se incorporan los azúcares en los oligosacáridos depende de la disposición espacial de las glucosiltransferasas específicas que entran en contacto con la proteína recién sintetizada a medida que se mueve por la pila de Golgi. Por ejemplo, la enzima sialiltransferasa, que coloca un ácido siálico en la posición terminal de la cadena en células animales, se localiza en el extremo trans de la pila de Golgi, como era de esperarse si las glucoproteínas nuevas se movieran de manera continua hacia esta parte del organelo. Contrario a los fenómenos de glucosilación que ocurren en el retículo endoplásmico, que acoplan un solo oligosacárido central, los pasos de la glucosilación en el aparato de Golgi pueden ser muy variados y producen dominios de carbohidrato con una notable diversidad en la secuencia. Una de las muchas vías posibles de glucosilación se muestra en la figura 8.22. A diferencia de los oligosacáridos con enlaces N, cuya síntesis comienza en el retículo endoplásmico, los unidos con proteínas mediante enlaces O (fig. 4.11) se articulan por completo dentro del aparato de Golgi.

El aparato de Golgi también es el sitio donde se sintetiza la mayor parte de los polisacáridos complejos de la célula, incluidas las cadenas de glucosaminoglucanos del proteoglucano que se muestra en la figura 7.9a, así como las pectinas y hemicelulosa de las paredes celulares de las plantas (fig. 7.36c).

El movimiento de materiales a través del aparato de Golgi

Desde hace mucho ya se estableció que los materiales se mueven por los diversos compartimientos del aparato de Golgi; empero, dos nociones de la manera en que esto ocurre han dominado el campo durante años. Hasta mediados del decenio de 1980 se aceptaba que las cisternas de Golgi eran estructuras transitorias. Se presuponía que tales cisternas formaban la cara cis de la pila mediante la fusión de los portadores membranosos desde el retículo endoplásmico y el ERGIC y que cada cisterna se movía físicamente desde el extremo cis al trans de la pila y cambiaba de composición conforme avanzaba. Esto se conoce como el modelo de maduración de las cisternas porque, de acuerdo con el modelo, cada cisterna “madura” a lo largo de la pila.

De mediados del decenio de 1980 a mitad del de 1990, el modelo de maduración del movimiento de Golgi casi se abandonó y se sustituyó por un modelo alternativo que proponía que las cisternas de una pila de Golgi permanecían en su sitio como compartimientos estables. En este último modelo, que se conoce como modelo de transporte vesicular, el cargamento (proteínas secretoras, lisosómicas y de membrana) se lanza a través de la pila de Golgi, desde la CGN hasta la TGN, en vesículas que se desprenden de un compartimiento de membrana y se fusionan con un compartimiento contiguo más avanzado en la pila. El modelo de transporte vesicular se ilustra en la figura 8.23a y su aceptación depende sobre todo de dos tipos de observaciones:

1. Cada una de las diversas cisternas de Golgi de una pila tiene una población distinta de enzimas residentes (fig. 8.21). ¿Cómo podrían las diversas cisternas tener propiedades tan diferentes si cada cisterna diera origen a la que le sigue en la línea, como lo sugería el modelo de maduración de cisternas?

2. Utilizando el microscopio electrónico es posible reconocer grandes cantidades de vesículas que se desprenden de los bordes de las cisternas de Golgi. En 1983, James Rothman y col., de la Stanford University, usaron preparaciones de membranas de Golgi libres de células (pág. 276) para demostrar que las vesículas de transporte son capaces de desprenderse de las cisternas de Golgi y fusionarse con otra cisterna in vitro. Este experimento crucial estableció la base para una hipótesis que sugería que dentro de la célula, las vesículas que llevan cargamento se desprendían de cisternas cis y se fusionaban con cisternas situadas en una posición más trans en la pila.

Aunque ambos modelos de la función de Golgi aún tienen defensores, el consenso de opinión regresó al modelo de maduración de cisternas. Algunas de las principales razones para este cambio son las siguientes:

• El modelo de maduración de las cisternas contempla un aparato de Golgi muy dinámico en el cual los principales elementos del organelo, las cisternas, se forman continuamente en la cara cis y se dispersan a la cara trans. Según esta idea, la existencia misma del aparato de Golgi en sí depende del influjo continuo de transportadores desde el retículo endoplásmico y el ERGIC. Como lo predice este modelo, cuando la formación de transportadores en el retículo endoplásmico es bloqueada por tratamiento de las células con fármacos específicos o por el uso de mutantes sensibles a la temperatura (pág. 275), el aparato de Golgi simplemente desaparece. Cuando se retira el fármaco o las células mutantes vuelven a colocarse a temperaturas propicias, el aparato de Golgi se reensambla con rapidez a medida que se renueva el transporte desde el retículo endoplásmico.

• Se puede demostrar que ciertos materiales que se producen en el retículo endoplásmico y viajan por el aparato de Golgi permanecen en las cisternas del mismo y nunca aparecen dentro de las vesículas de transporte asociadas con dicho aparato. Por ejemplo, los estudios con fibroblastos indican que grandes complejos de moléculas de procolágena (precursores del colágeno) (esquematizados por los objetos en color rojo en la fig. 8.23b) se mueven de las cisternas cis a las cisternas trans sin salir nunca de la luz de la cisterna.

• Hasta mediados del decenio de 1990 se asumió que las vesículas de transporte siempre se movían hacia adelante (en sentido anterógrado), esto es, de un origen cis a un destino más trans. No obstante, una gran cantidad de evidencia indicó que las vesículas pueden moverse hacia atrás (en sentido retrógrado), es decir, de una membrana donadora trans a una membrana receptora cis.

• Estudios con células de levadura vivas en gemación que contenían proteínas de Golgi con tinción fluorescente han mostrado de manera directa que la composición de una cisterna de Golgi individual puede cambiar con el tiempo: desde una que contiene proteínas residentes tempranas de Golgi (cis) hasta una que contiene proteínas residentes tardías de Golgi (trans). Los resultados de este experimento se muestran en la micrografía que abre el capítulo 18 y no son compatibles con el modelo de transporte vesicular. Queda por determinar si estos resultados obtenidos en levaduras pueden extrapolarse al aparato de Golgi de los mamíferos, que tiene una estructura apilada más compleja.

En la figura 8.23b se presenta una versión actual del modelo de maduración de las cisternas. A diferencia de las versiones originales del modelo de maduración de cisternas, la versión que se muestra en la figura 8.23b reconoce el papel de las vesículas de transporte, de las cuales ya se demostró que se desprenden de las membranas de Golgi. Sin embargo, en este modelo estas vesículas de transporte no envían el cargamento en sentido anterógrado, sino que transportan las enzimas residentes de Golgi en sentido retrógrado. En vez de ello, son las propias cisternas de Golgi las que actúan como transportadores anterógrados primarios de Golgi. Este modelo de transporte en el aparato de Golgi cuenta con el apoyo de las micrografías electrónicas del tipo ilustrado en la figura 8.23c,d. Estas micrografías muestran cortes ultradelgados de células de mamífero cultivadas, que se cortaron de un bloque congelado. En ambos casos, los cortes congelados se trataron con anticuerpos que estaban unidos con partículas de oro antes del examen al microscopio electrónico. La figura 8.23c presenta un corte a través del aparato de Golgi después del tratamiento con anticuerpos marcados con oro que se unen con una proteína del cargamento, en este caso la proteína viral VSVG (pág. 274). Las moléculas de VSVG se hallan dentro de las cisternas, pero no en las vesículas cercanas (flechas), lo que indica que el cargamento se traslada en sentido anterógrado dentro de las cisternas en maduración, pero no dentro de pequeñas vesículas de transporte. La figura 8.23d muestra un corte a través de un aparato de Golgi después del tratamiento con anticuerpos marcados con oro que se unen con una proteína residente del aparato de Golgi, en este caso la enzima procesadora manosidasa II. A diferencia de la proteína de cargamento VSVG, las moléculas de manosidasa II se encuentran tanto en las cisternas como en las vesículas asociadas (flecha), lo cual apoya la propuesta de que estas vesículas se usan para transportar enzimas residentes de Golgi en sentido retrógrado. Las proteínas residentes de Golgi también pueden desplazarse en dirección retrógrada a través de los túbulos que conectan diferentes cisternas de Golgi.

El modelo de maduración de cisternas que se muestra en la figura 8.23b explica cómo las diferentes cisternas de Golgi en una pila pueden tener una identidad única. Por ejemplo, una enzima como la manosidasa II, que retira residuos de manosa de los oligosacáridos y se limita casi del todo a las cisternas mediales (fig. 8.21), puede reciclarse hacia atrás en vesículas de transporte a medida que cada cisterna avanza hacia el extremo trans de la pila. Hay que señalar que varios investigadores prominentes todavía argumentan, con base en otros resultados experimentales, que la carga puede trasladarse mediante vesículas de transporte desde las cisternas de Golgi para continuar su avance. Por lo tanto, este asunto todavía debe aclararse.

La vía biosintética de una célula eucariota consiste en una serie de distintos organelos limitados por membrana que participan en la síntesis, modificación y entrega de proteínas solubles y membranosas en su destino apropiado en la célula. Como se ilustra en la figura 8.2a, los materiales son transportados entre compartimientos por vesículas (u otros tipos de transportadores limitados por membrana) que se desprenden de membranas donadoras y se fusionan con las membranas receptoras. Si se revisan micrografías electrónicas en busca de vesículas atrapadas en el acto de desprenderse, se encuentra que la mayoría de estas yemas membranosas están cubiertas en su superficie citosólica por una capa electrodensa “difusa”. Un análisis más cuidadoso revela que la capa teñida de color oscuro consta de una cubierta proteínica formada por proteínas solubles que se ensamblan en la superficie citosólica de la membrana donadora en sitios en que ocurre el desprendimiento de las vesículas. Cada yema cubierta se desprende para formar una vesícula cubierta, como las que se muestran en la figura 8.24. Se pueden formar vesículas de tamaño y estructura similares en sistemas libres de células, como se ilustra en la figura 8.6. (El descubrimiento de las vesículas cubiertas se trata en la sección “Vías experimentales” al final del capítulo.)

Las cubiertas de proteína tienen por lo menos dos funciones distintas: (1) actúan como dispositivo mecánico que hace que la membrana se curve y forme una vesícula desprendible y (2) proporcionan un mecanismo para seleccionar los componentes que transporta la vesícula. Los componentes seleccionados incluyen: (a) cargamento consistente en proteínas secretoras, lisosómicas y de membrana que deben transportarse y (b) la estructura necesaria para dirigir y conectar la vesícula con la membrana receptora correcta (pág. 300). En los dos casos mejor comprendidos (figs. 8.26 y 8.40), la cubierta de la vesícula está formada por dos capas distintas de proteínas: una jaula externa o andamiaje que forma el marco de la cubierta y una capa interna de adaptadores que sirven para unir la cara externa de la bicapa lipídica y el cargamento de la vesícula. Como se explica más adelante, los adaptadores pueden seleccionar moléculas de cargamento específico en virtud de su afinidad específica por las “colas” citosólicas de proteínas integrales que residen dentro de la membrana donadora (fig. 8.25b).

Se han identificado diferentes clases de vesículas cubiertas; se distinguen por las proteínas que conforman la cubierta, su apariencia al microscopio electrónico y su función en el tránsito celular. Las tres vesículas cubiertas mejor estudiadas son las siguientes:

1. Las vesículas cubiertas con COP II (fig. 8.24a) desplazan materiales del retículo endoplásmico “hacia adelante” al ERGIC y al aparato de Golgi. (Recuérdese que en la página 289 se mencionó que el ERGIC es el compartimiento intermedio situado entre el retículo endoplásmico y el aparato de Golgi.) (COP es una sigla para las proteínas de cubierta, del inglés coat proteins.)

2. Las vesículas cubiertas con COP I (fig. 8.24b) mueven materiales en sentido retrógrado: (1) del ERGIC y pila de Golgi “hacia atrás” al ER y (2) de las cisternas Golgi trans “de regreso” a las cisternas Golgi cis (fig. 8.25a). Subsiste el debate en cuanto a las actividades adicionales de las vesículas COPI.

3. Las vesículas cubiertas con clatrina movilizan materiales de la TGN a los endosomas, lisosomas y vacuolas vegetales. También mueven materiales de la membrana plasmática a los compartimientos citoplásmicos a lo largo de la vía endocítica. Asimismo, se han implicado en el tránsito de los endosomas y los lisosomas.

En las secciones siguientes se considera cada tipo de vesícula cubierta. La figura 8.25a presenta un resumen de los diversos pasos del transporte en la vía biosintética o secretora mediados por cada una de estas vesículas cubiertas.

Vesículas cubiertas con COP II: transporte de cargamento del retículo endoplásmico al aparato de Golgi

Las vesículas cubiertas con COP II median la primera rama del traslado por la vía biosintética, del ER al ERGIC y la red cis de Golgi (fig. 8.25a,b). La cubierta COP II contiene varias proteínas que se identificaron por primera vez en células mutantes de levaduras que no podían realizar el transporte del ER al aparato de Golgi. Más tarde se encontraron homólogos de las proteínas de levaduras en las cubiertas de vesículas que se desprenden del ER en células de mamíferos. Los anticuerpos contra las proteínas de la cubierta COP II bloquean el desprendimiento de las vesículas de las membranas del ER, pero no tienen efecto en el movimiento de cargamento en otras etapas en la vía secretora.

Las cubiertas COP II seleccionan y concentran ciertos componentes para transportar en vesículas. Ciertas proteínas integrales de membrana del ER se capturan en forma selectiva porque contienen señales de “exportación del ER” como parte de su cola citosólica. Estas señales interactúan de manera específica con las proteínas COP II de la cubierta de vesícula (fig. 8.25b). Las proteínas seleccionadas por las vesículas cubiertas con COP II incluyen: (1) enzimas que actúan en las etapas avanzadas de la vía biosintética, como las glucosiltransferasas del aparato de Golgi (indicadas como proteínas de membrana color naranja en la figura 8.25b); (2) proteínas de membrana participantes en el acoplamiento y fusión de la vesícula con el compartimiento blanco, y (3) proteínas de membrana que pueden unirse con cargamento soluble (como las proteínas secretoras, indicadas con las esferas rojas en la figura 8.25b). Las células que no tienen un receptor específico “del cargamento” no transportan un subgrupo específico de proteínas desde ER hasta el complejo de Golgi. Las mutaciones en uno de estos receptores de cargamento (ERGIC-53) se han vinculado con un trastorno hemorrágico hereditario. Las personas con esta anomalía no secretan ciertos factores de coagulación que promueven la coagulación sanguínea.

Entre las proteínas de cubierta COP II se encuentra una pequeña proteína G llamada Sar1, que es reclutada específicamente en la membrana del retículo endoplásmico. Como otras proteínas G, Sar1 tiene una función reguladora, en este caso en el inicio de la formación de la vesícula y la regulación del ensamblaje de la cubierta de la vesícula. Estas actividades se ilustran en la figura 8.26. En el paso 1 de la figura, Sar1 es reclutada en la membrana del retículo endoplásmico en la forma unida a GDP y es inducida a intercambiar su GDP por una molécula de GTP. Al unirse a GTP, Sar1 sufre un cambio de conformación que hace que la hélice α en su extremo N terminal se inserte en la hoja citosólica de la bicapa del retículo endoplásmico (paso 2). Se ha demostrado que este suceso dobla la bicapa lipídica, lo cual constituye un paso importante en la conversión de una membrana aplanada en una vesícula esférica. Es probable que a la flexión de la membrana contribuya un cambio en el empaquetamiento de los lípidos que constituyen las dos hojas de la bicapa. En el paso 3, Sar1-GTP atrajo dos polipéptidos adicionales de la cubierta COP II, Sec23 y Sec24, que se unen como un dímero “con forma de banana”. Por su forma curva (fig. 8.27), el dímero Sec23-Sec24 ejerce presión adicional sobre la superficie de la membrana que le ayuda a doblarse más en una yema curva. Sec24 también funciona como la principal proteína adaptadora de la cubierta COP II que interactúa de manera específica con las señales de exportación del ER en las colas citosólicas de las proteínas de membrana destinadas para trasladarse al aparato de Golgi. En el paso 4 de la figura 8.26, las subunidades restantes de la cubierta COP II, Sec13 y Sec31, se unen con la membrana para formar la jaula estructural externa de la cubierta proteínica. La figura 8.27 muestra una representación de una vesícula de 40 nm con la cubierta COP II unida a su superficie. La jaula Sec13-Sec31 se ensambla en una celosía relativamente sencilla en la que cada arista está formada por la convergencia de cuatro ramas Sec13-Sec31 (fig. 8.27). La interfase entre las subunidades Sec13-Sec31 tiene cierto grado de flexibilidad que les permite formar jaulas de diámetro variable, lo que se adapta a vesículas de distintos tamaños.

Una vez que se ensambla toda la cubierta COP II, la yema se separa de la membrana del ER en la forma de una vesícula cubierta por COP II. Antes que la vesícula cubierta pueda fusionarse con una membrana blanco, la cubierta proteínica debe desensamblarse y sus componentes se liberan al citosol. El desacoplamiento se inicia por la hidrólisis del GTP unido para producir una subunidad Sar1-GDP, que tiene menor afinidad por la membrana de la vesícula. La separación de Sar1-GDP de la membrana va seguida de la liberación de otras subunidades COP II.

Vesículas cubiertas con COP I: transporte de proteínas escapadas de regreso al retículo endoplásmico

Las vesículas cubiertas con COP I se identificaron por primera vez en experimentos en los que las células se trataron con moléculas de estructura similar al GTP (análogos de GTP), pero a diferencia de éste, no pueden hidrolizarse. En tales condiciones, las vesículas cubiertas con COP I se acumularon dentro de la célula y se pudieron aislar de las células homogeneizadas mediante centrifugación por gradiente de densidad (sección 18.6). Las vesículas cubiertas con COP I se acumulan en presencia de un análogo de GTP no hidrolizable porque, como sus contrapartes COP II, la cubierta posee una proteína de unión con GTP llamada ARF1, cuyo GTP unido debe hidrolizarse antes de desarticularse la cubierta. Las vesículas cubiertas con COP I median el transporte retrógrado de proteínas, incluido el movimiento de: (1) las enzimas residentes en el aparato de Golgi en dirección trans a cis (como se indica en la figura 8.23d, que muestra una molécula de manosidasa II marcada con oro en una vesícula COP I) y (2) enzimas residentes del ER del ERGIC y el aparato de Golgi de regreso al retículo endoplásmico (fig. 8.25a). Para comprender la función de las vesículas cubiertas con COP I en el transporte retrógrado hay que considerar un tema más general.

Conservación y recuperación de las proteínas residentes del retículo endoplásmico

Si se desprenden vesículas en forma continua de los compartimientos de membrana, ¿cómo es que cada compartimiento conserva su composición única? ¿Qué determina, por ejemplo, si una proteína particular en la membrana del ER permanece en éste o se traslada al aparato de Golgi? Los estudios sugieren que las proteínas se mantienen en un organelo por una combinación de dos mecanismos:

1. Retención de las moléculas residentes que se excluyen de las vesículas de transporte. La retención puede basarse sobre todo en las propiedades físicas de la proteína. Por ejemplo, no es probable que las proteínas solubles que son parte de grandes complejos y las proteínas de membrana con dominios transmembrana cortos entren a la vesícula de transporte.

2. Recuperación de las moléculas “prófugas” para devolverlas al compartimiento en que se encuentran normalmente.

Las proteínas que habitualmente residen en el ER, sea en la luz o la membrana, contienen secuencias cortas de aminoácidos en su extremo C que sirven como señales de recuperación, lo que asegura su regreso al ER en caso que se trasladen por accidente hacia el ERGIC o aparato de Golgi. La recuperación de las proteínas del ER “prófugas” de estos compartimientos se realiza mediante receptores específicos que capturan las moléculas y las regresan al ER en vesículas cubiertas con COP I (figs. 8.25a, 8.28). Las proteínas solubles residentes de la luz del ER (como la disulfuro isomerasa de proteínas y las chaperonas moleculares que facilitan el plegamiento) casi siempre tienen la señal de recuperación “lys-asp-glu-leu” (o KDEL en la nomenclatura de una sola letra). Como se muestra en la figura 8.28, estas proteínas se reconocen y regresan al ER por el receptor KDEL, una proteína integral de la membrana que se traslada entre los compartimientos cis Golgi y los de ER. Si la secuencia KDEL se elimina de una proteína del ER, las proteínas prófugas no regresan al ER, sino que se trasladan al aparato de Golgi. Por el contrario, cuando se manipula una célula con ingeniería genética para que exprese una proteína lisosómica o secretora a la que se añade un KDEL en el extremo C, esa proteína se regresa al ER en lugar de enviarse a su destino apropiado. Las proteínas de membrana que residen en el ER también tienen una señal de recuperación que se une con la cubierta COP I, lo que facilita su regreso al ER. Las secuencias más frecuentes de recuperación para las proteínas de la membrana de ER incluyen dos residuos básicos estrechamente vinculados, casi siempre KKXX (donde K es lisina y X es cualquier aminoácido). Cada compartimiento de membrana en la vía biosintética puede tener sus propias señales de recuperación, lo que ayuda a explicar cómo cada compartimiento mantiene su complemento único de proteínas a pesar del movimiento constante de vesículas que entran y salen del mismo.

Más allá del aparato de Golgi: ordenamiento de proteínas en la red trans de Golgi (TGN)

A pesar de la descripción de las vesículas de transporte, aún hay que examinar cómo una proteína particular sintetizada en el ER se dirige a un destino celular particular. Es importante que una célula sea capaz de distinguir entre las diversas proteínas que elabora. Por ejemplo, una célula pancreática tiene que separar las enzimas digestivas nuevas que se secretan a un conducto, de las moléculas de adhesión celular recién sintetizadas que al final se instalan en la membrana plasmática y de las enzimas lisosómicas que se dirigen a los lisosomas. Esto se logra cuando la célula separa las proteínas destinadas a sitios diferentes en distintos portadores limitados por membranas. La red trans de Golgi, que es la última estación en el aparato de Golgi, funciona como una instancia clasificadora y dirige las proteínas hacia diversos destinos. La más conocida de las vías posteriores del aparato de Golgi es la que lleva enzimas lisosómicas.

Ordenamiento y transporte de enzimas lisosómicas

Las proteínas lisosómicas se sintetizan en ribosomas unidos con la membrana en el ER y se transportan al aparato de Golgi junto con otros tipos de proteínas. Una vez en las cisternas de Golgi, ciertas enzimas reconocen a las enzimas lisosómicas solubles y catalizan la adición de un grupo fosfato en dos pasos a ciertos azúcares manosa de las cadenas de carbohidrato con enlaces N (fig. 8.29a). Por lo tanto, a diferencia de otras glucoproteínas clasificadas en TGN, las enzimas lisosómicas tienen residuos de manosa fosforilada que actúan como señales de clasificación. Este mecanismo de separación de proteínas se descubrió mediante estudios en células de seres humanos que carecían de las enzimas participantes en la adición de fosfato (descrito en Perspectiva humana, pág. 306). Los receptores para manosa 6-fosfato (MPR) reconocen y capturan a las enzimas lisosómicas que llevan la señal manosa 6-fosfato; los receptores son proteínas integrales de la membrana que cruzan las membranas de la TGN (fig. 8.29b).

Las enzimas lisosómicas se transportan desde la TGN en vesículas cubiertas con clatrina (el tercer y último tipo de vesículas cubiertas que deben describirse). La estructura de estas vesículas cubiertas con clatrina se aborda en la página 308 junto con la endocitosis, un proceso que se conoce mejor que el desprendimiento de vesículas en la TGN. Por ahora es suficiente con señalar que las cubiertas de estas vesículas contienen: (1) una celosía externa parecida a un panal formada por la proteína clatrina, la cual constituye un soporte estructural y (2) una capa interna formada por adaptadores de proteína que cubre la superficie de la membrana de la vesícula y que está dirigida hacia el citosol (fig. 8.30). El término adaptador describe una molécula que vincula físicamente dos componentes distintos. Las enzimas lisosómicas están flanqueadas desde la TGN por una familia recién descubierta de proteínas adaptadoras llamadas GGA.

Como se indica en el recuadro de la figura 8.30, una molécula de GGA tiene varios dominios, cada uno capaz de sujetar una proteína diferente que participa en la formación de vesículas. Los extremos exteriores de los adaptadores GGA se unen con las moléculas de clatrina, con lo que fijan la configuración de éstas a la superficie de la vesícula. En la superficie interna, los adaptadores GGA se unen con una señal clasificadora en las colas citosólicas de los receptores para manosa 6-fosfato. A su vez, estos MPR se unen con las enzimas lisosómicas solubles dentro de la luz de la vesícula (fig. 8.30, recuadro). Como resultado de estas interacciones con los adaptadores GGA, los MPR de la membrana de la red trans de Golgi y las enzimas lisosómicas dentro de la luz de la TGN se concentran en las vesículas cubiertas con clatrina. Como sucede con la formación de vesículas con COP I y COP II, la producción de vesículas cubiertas con clatrina en el TGN comienza con el reclutamiento en la membrana de una pequeña proteína para unión con GTP, en este caso Arf1, que establece las condiciones para la unión de las otras proteínas de la cubierta. A semejanza de Sar1 (fig. 8.26), Arf1 extiende una hélice α de flexión de membrana que actúa junto con la capa de clatrina, para iniciar la formación de la vesícula en gemación. Una vez que la vesícula se desprende de la TGN, la cubierta de clatrina se pierde y la vesícula descubierta avanza a su destino, el cual puede ser un endosoma temprano, endosoma tardío o vacuola en una célula vegetal. Antes de llegar a alguno de estos organelos, los MPR se separan de las enzimas lisosómicas y regresan a la TGN (fig. 8.29b) para iniciar otra ronda de transporte de enzima lisosómica.

Separación y transporte de proteínas no lisosómicas

Las proteínas lisosómicas no son los únicos materiales que abandonan la TGN. Como se indica en la figura 8.2, las proteínas de membrana destinadas a la membrana plasmática y los materiales secretores destinados a la exportación fuera de la célula también se transportan desde la TGN, pero se sabe poco de los mecanismos implicados. De acuerdo con un modelo, los portadores membranosos se producen cuando la TGN se fragmenta en vesículas y túbulos de diversos tamaños. Este concepto se adapta al modelo de maduración de cisternas, que propone que las cisternas del aparato de Golgi se mueven en forma continua en dirección a la TGN, donde tendrían que dispersarse para permitir la maduración continua de la pila del Golgi. Se cree que las proteínas que se descargan a la célula mediante un proceso de secreción regulada, como el caso de las enzimas digestivas y las hormonas, forman agregados selectivos que al final se retienen en gránulos secretores grandes y muy concentrados. Al parecer, estos agregados atrapados como gránulos secretores inmaduros se desprenden de los márgenes de las cisternas trans de Golgi y la TGN. En algunas células se observan túbulos largos que son jalados de la TGN por proteínas motoras que operan a lo largo de trayectos microtubulares. Luego, estos túbulos se dividen en varias vesículas o gránulos por fisión de membrana. Una vez que salen de la TGN, el contenido de los gránulos secretores se concentra. Al final, los gránulos maduros se almacenan en el citoplasma hasta que su contenido se libera después de la estimulación de la célula por una hormona o impulso nervioso.

La entrega dirigida de las proteínas integrales a la membrana plasmática parece basarse sobre todo en las señales de separación en los dominios citoplásmicos de las proteínas de membrana. Hay muchas investigaciones que se han enfocado en células polarizadas, como las que se muestran en la figura 8.11. En estas células, las proteínas de membrana destinadas a residir en la porción apical de la membrana plasmática contienen diferentes señales de separación respecto de las de proteínas destinadas a la porción lateral o basal. Los dos grupos de proteínas de la membrana plasmática están reunidas en dominios diferentes de la membrana TGN y son llevados hasta la superficie celular por transportadores separados. Es posible que las proteínas plasmáticas de células no polarizadas, como los fibroblastos y los leucocitos, no requieran señales de separación especiales. Tal vez estas proteínas tan sólo se trasladen de la TGN a la superficie celular en vesículas de la vía secretora constitutiva (fig. 8.2b).

Direccionamiento de las vesículas a un compartimiento particular

La fusión de las vesículas requiere interacciones específicas entre membranas diferentes. Por ejemplo, las vesículas del ER se fusionan con el ERGIC o red cis de Golgi y no con una cisterna trans. La fusión selectiva es uno de los factores que asegura un flujo dirigido por los compartimientos membranosos de la célula. A pesar de un gran esfuerzo de investigación, aún no se comprenden del todo los mecanismos por medio de los cuales las células dirigen a las vesículas a compartimientos especiales. Se asume que una vesícula contiene proteínas específicas en asociación con su membrana que regulan los movimientos y el potencial de fusión de esa vesícula. Para comprender la naturaleza de estas proteínas, se consideran los pasos que ocurren entre el desprendimiento de la vesícula y la fusión de la misma.

1. Movimiento de la vesícula hacia el compartimiento blanco específico. En muchos casos, las vesículas membranosas deben viajar distancias considerables en el citoplasma antes de llegar a su objetivo final. Estos tipos de movimiento están mediados sobre todo por microtúbulos, que actúan como las vías de un tren que lleva contenedores con cargamento a lo largo de un trayecto definido hacia un destino predeterminado. Por ejemplo, los portadores membranosos que se observan en la figura 8.19 se mueven desde el ERGIC al aparato de Golgi mediante microtúbulos.

2. Fijación de las vesículas al compartimiento blanco. Se cree que los contactos iniciales entre una vesícula de transporte y sus membranas blanco, como una cisterna de Golgi, están mediados por proteínas fijadoras. Se han descrito dos grupos de proteínas fijadoras (fig. 8.31a): proteínas fibrosas cilíndricas, capaces de formar un puente molecular entre las dos membranas a una distancia considerable (50 a 200 nm) y grandes complejos de múltiples proteínas que parecen mantener próximas las dos membranas. Diferentes proteínas “fijadoras” inician la fusión entre diversos tipos de membranas. Por ejemplo, una clase de proteínas fijadoras fibrosas llamadas golginas actúan en el interior y la periferia del complejo de Golgi. Entre las funciones atribuidas a las golginas pueden estar las que actúan como “tentáculos” para alcanzar y “capturar” vesículas de transporte que portan un “cargamento” unido al aparato de Golgi. Con el microscopio electrónico se han visualizado diferentes complejos de “fijación”. La figura 8.31b muestra imágenes tomográficas de la zona presináptica de la terminación de un nervio de mamífero. Las imágenes tridimensionales indican la presencia de estructuras filamentosas posiblemente compuestas de proteínas “fijadoras” que conectan vesículas sinápticas entre sí, y con la membrana plasmática vecina con la cual tendrían que fusionarse tales vesículas. Gran parte de esta especificidad podría derivar de una familia de pequeñas proteínas G llamadas Rab, que fluctúan entre el estado activo unido con GTP y el estado inactivo unido con GDP. Las Rab unidas con GTP se relacionan con membranas mediante un ancla de lípido. Con más de 60 genes Rab diferentes, identificados en los seres humanos, estas proteínas constituyen el grupo más diverso de proteínas participantes en el tránsito de membrana. Más importante es que distintas proteínas Rab se vinculan con distintos compartimientos de membrana. Esta localización preferencial da a cada compartimiento una identidad de superficie única, necesaria para reclutar las proteínas implicadas en la especificidad de direccionamiento. En su estado unido con GTP, las Rab tienen una función clave en la dirección hacia un blanco mediante la atracción de proteínas fijadoras citosólicas específicas hacia superficies de membrana específicas (fig. 8.31a). Las Rab también tienen una función clave en la regulación de las actividades de muchas proteínas implicadas en otros aspectos del tráfico de membrana, incluidas las proteínas motoras que mueven vesículas membranosas por el citoplasma (fig. 9.52c).

3. Acoplamiento de las vesículas al compartimiento blanco. En algún momento durante el proceso que conduce a la fusión vesicular, las membranas de la vesícula y el compartimiento blanco entran en contacto estrecho debido a la interacción entre las regiones citosólicas de las proteínas integrales de las dos membranas. Las proteínas clave que participan en estas interacciones se conocen como SNARE y constituyen una familia de más de 35 proteínas de membrana cuyos miembros se localizan en compartimientos subcelulares específicos. Aunque las proteínas SNARE tienen estructuras y tamaños muy diversos, todas poseen un segmento en su dominio citosólico llamado motivo SNARE que consiste en 60 a 70 aminoácidos capaces de formar un complejo con otro motivo SNARE. Las SNARE pueden dividirse en dos categorías, SNARE-v, que se incorporan en las membranas de vesículas de transporte durante el desprendimiento, y SNARE-t, que se localizan en las membranas de los compartimientos blanco (fig. 8.31c). Las SNARE mejor estudiadas son las que median el acoplamiento de vesículas sinápticas con la membrana presináptica durante la liberación regulada de neurotransmisores (pág. 169). En este caso, la membrana plasmática de la célula nerviosa contiene dos SNARE-t, sintaxina y SNAP-25, en tanto que la membrana de la vesícula sináptica contiene una sola SNARE-v, la sinaptobrevina. La figura 8.31d muestra la distribución de las moléculas de sinaptobrevina en una vesícula sináptica representativa. Cuando la vesícula sináptica y la membrana presináptica se aproximan una a la otra, los motivos SNARE de las moléculas SNARE-t y v de las membranas próximas interactúan para formar haces de cuatro hélices como se muestra en la figura 8.32a. Cada haz consiste en cuatro hélices α, dos donadas por SNAP-25 y una por la sintaxina y la sinaptobrevina, respectivamente. Juntas, estas hélices α paralelas forman un rizo entretejido ajustado que tira de las dos bicapas de lípidos y las aproxima bastante (figs. 8.31c y 8.32a). La formación de haces similares helicoidales de cuatro cadenas tiene lugar entre otras proteínas SNARE en otros sitios de la célula, en dondequiera que las membranas estén destinadas a fusionarse. Es interesante señalar que las proteínas SNARE de la vesícula sináptica y la membrana presináptica son los blancos de dos de las toxinas bacterianas más potentes: las causantes del botulismo y el tétanos. Estas toxinas letales actúan como proteasas cuyo único sustrato conocido son las SNARE. La escisión de los SNARE neuronales por las toxinas bloquea la liberación de neurotransmisores, lo que causa parálisis.

4. Fusión entre las membranas de la vesícula y el blanco. Cuando las vesículas artificiales de lípidos (liposomas) que contienen SNARE-t purificada se mezclan con liposomas que contienen una SNARE-v purificada, los dos tipos de vesículas se fusionan entre sí, pero no las vesículas del mismo tipo. Este hallazgo indica que las interacciones entre las proteínas SNARE-t y v son capaces de unir dos bicapas de lípidos con la fuerza suficiente para hacer que se fusionen (fig. 8.32b,c). Sin embargo, hay mucha evidencia que sugiere que aunque la interacción entre las proteínas SNARE-v y t es necesaria para la fusión de las membranas, no es suficiente por sí misma para inducir la fusión dentro de una célula. De acuerdo con la idea prevaleciente sobre la secreción regulada de las moléculas de neurotransmisor, el haz SNARE de cuatro cadenas permanece cerrado en una conformación inactiva por su interacción con proteínas accesorias. Las vesículas que se encuentran en esta etapa permanecen acopladas con la membrana y listas para descargar su contenido en forma casi instantánea una vez que reciban una señal de activación en la forma de un incremento de la concentración de Ca²⁺ (como se explica más adelante). Sin importar cuál sea la forma en que se regule, una vez que se fusionan las bicapas de lípidos de las dos membranas, las SNARE que sobresalían antes de membranas separadas residen en la misma membrana (fig. 8.32c). La disociación del complejo SNARE de cuatro cadenas se logra con una proteína citosólica con forma de rosquilla llamada NSF que se une con el haz SNARE y, usando energía procedente de la hidrólisis de ATP (trifosfato de adenosina), lo tuerce para separarlo.

Ahora que se describieron los fenómenos que ocurren durante la fusión de una vesícula con una membrana blanco es posible regresar a la pregunta, ¿cómo se determina la especificidad de esta interacción? De acuerdo con el consenso actual, la capacidad de una vesícula y membrana blanco particulares para fusionarse depende de la combinación específica de proteínas que interactúan, incluidas proteínas de fijación, proteínas Rab y SNARE que pueden ensamblarse en ese sitio de la célula. Consideradas en conjunto, estas múltiples interacciones entre varios tipos de proteínas proporcionan una gran especificidad, lo que asegura que cada compartimiento de membrana pueda reconocerse en forma selectiva.

Exocitosis

La fusión de una vesícula secretora o gránulo secretor con la membrana plasmática y la descarga subsiguiente de su contenido se llama exocitosis. Es probable que la exocitosis ocurra en forma continua en la mayor parte de las células, conforme se envían proteínas y otros materiales a la membrana plasmática y el espacio extracelular. Sin embargo, los ejemplos mejor estudiados de la exocitosis son los que ocurren durante la secreción regulada, sobre todo la liberación de neurotransmisores a la hendidura sináptica. En estos casos, la fusión de la membrana produce una abertura a través de la cual se libera el contenido de la vesícula o gránulo hacia el espacio extracelular. En la página 169 se indicó que la llegada de un impulso nervioso al botón terminal de una neurona induce un aumento de la entrada de Ca²⁺ con la descarga subsecuente de moléculas de neurotransmisor por exocitosis. En este caso, la fusión está regulada por una proteína de unión con calcio (sinaptotagmina) presente en la membrana de la vesícula sináptica. En otros tipos de células, la exocitosis casi siempre se inicia por la liberación de Ca²⁺ de las reservas citoplásmicas. Se cree que el contacto entre la vesícula y las membranas plasmáticas conduce a la formación de un pequeño “poro de fusión” recubierto con proteína (fig. 8.32c). Algunos poros de fusión se cierran de nuevo, pero en la mayoría de los casos el poro se dilata con rapidez para formar una abertura para que se descargue el contenido de la vesícula (fig. 8.32d). Al margen del mecanismo, cuando una vesícula citoplásmica se fusiona con la membrana plasmática, la superficie luminal de la membrana de la vesícula se vuelve parte de la superficie externa de la membrana plasmática, mientras que la superficie citosólica de la membrana de la vesícula se torna parte de la cara interna (citosólica) de la membrana plasmática (fig. 8.14).

Los lisosomas son los organelos digestivos de una célula animal. Un lisosoma típico contiene cerca de 50 enzimas hidrolíticas diferentes (cuadro 8.1) que se producen en el retículo endoplásmico rugoso y se dirigen a estos organelos. Consideradas en conjunto, las enzimas lisosómicas pueden hidrolizar todo tipo de macromoléculas biológicas. Las enzimas de un lisosoma comparten una propiedad importante: todas alcanzan su actividad óptima en un pH ácido, por lo que son hidrolasas ácidas. El pH óptimo de estas enzimas se sitúa por debajo del pH del compartimiento lisosómico, que se aproxima a 4.6. La elevada concentración interna de protones se mantiene mediante una bomba de protones (una ATP-asa de H⁺ tipo V) (pág. 160) presente en la membrana que limita al organelo. Las membranas lisosómicas contienen diversas proteínas integrales muy glucosiladas cuyas cadenas de carbohidratos se cree que forman un recubrimiento protector para la membrana contra el ataque de las enzimas que encierra.

Aunque los lisosomas tienen una colección predecible de enzimas, su apariencia en las micrografías electrónicas no es distintiva ni uniforme. La figura 8.33 muestra una pequeña porción de una célula de Kupffer, una célula fagocítica del hígado que atrapa eritrocitos viejos. Los lisosomas de una célula de Kupffer tienen una forma irregular y densidad electrónica variable, lo que ilustra qué tan difícil es identificar estos organelos sólo con base en su morfología.

La presencia dentro de una célula del lisosoma, que es en esencia una bolsa de enzimas destructivas, sugiere varias funciones posibles. La función mejor estudiada es la degradación de materiales que llegan a la célula desde el ambiente extracelular. Muchos organismos unicelulares ingieren partículas de alimento que luego se degradan por medios enzimáticos en un lisosoma. Los nutrientes obtenidos pasan por la membrana lisosómica hacia el citosol. En los mamíferos, las células fagocíticas como los macrófagos y los neutrófilos funcionan como eliminadores que ingieren los detritos y microorganismos que pudieran ser peligrosos (pág. 315). Las bacterias ingeridas casi siempre se desactivan por el pH bajo del lisosoma y luego se someten a la digestión enzimática. Como se muestra en la figura 17.24, los péptidos producidos por este proceso digestivo se “sitúan” en la superficie celular, donde pueden alertar al sistema inmunitario sobre la presencia de un agente extraño.

Autofagia

Los lisosomas también tienen una función clave en el recambio de organelos, o sea en la destrucción regulada de los propios organelos celulares y su remplazo. Durante el proceso mencionado, llamado autofagia, un organelo, como la mitocondria que se señala en la figura 8.34, está rodeado por una doble membrana (o fagóforo) para producir una vesícula secuestrante de doble membrana llamada autofagosoma (fig. 8.35). No hay certeza del origen de la doble membrana en las células de mamíferos, y las posibilidades varían desde el ER hasta la membrana mitocondrial externa. La membrana externa del autofagosoma, una vez formada, se fusiona con un lisosoma y genera una estructura llamada autolisosoma, en la cual hay degradación de la membrana interna del autofagosoma y el contenido en su interior. La célula puede disponer de los productos de estas reacciones de degradación. Se ha calculado que 1 a 1.5% de las proteínas dentro de un hepatocito sano son degradados por medio de autofagia, cada hora, como parte del fenómeno normal de renovación celular. Según se piensa, el confinamiento dentro de las vesículas autofagosómicas es un fenómeno relativamente selectivo y no aleatorio simplemente. Es probable que la autofagia haya evolucionado en los microorganismos protoeucarióticos en reacción a la privación de nutrientes. Si se somete a inanición a una población de células (obtenidas de levaduras, plantas o animales) se advierte un incremento extraordinario en la autofagia. En tal situación, las células adquieren energía para conservar su vida al consumir en forma caníbal sus propios organelos. El mismo proceso autofágico se induce en las células de un embrión de mamífero antes de que sea implantado en el útero, y de ese modo, antes de que aproveche los nutrientes que le llegan por medio de la sangre de su madre.

Los conocimientos de la importancia de la autofagia en animales han coincidido con el descubrimiento y el análisis de diversos genes (conocidos como Atg) necesarios para diversas fases de la vía de la autofagia. La deleción de algunos de los genes autofágicos ocasiona consecuencias graves en el desarrollo embrionario o la fisiología del adulto, de organismos modelo, sean un gusano o un ratón. Por ejemplo, se ha demostrado que la autofagia protege a un organismo contra amenazas intracelulares que varían desde agregados proteínicos anormales, hasta bacterias y parásitos invasores. Se ha mencionado que la autofagia interviene en la prevención de la neurodegeneración.

Si se bloquea la autofagia en un área particular del cerebro de un animal de laboratorio, esa región del sistema nervioso central experimenta una pérdida masiva de células nerviosas. Estos hallazgos revelan la importancia de la autofagia para proteger a las células cerebrales del daño continuo a las proteínas y organelos que experimentan estas células de larga vida. Es posible que la autofagia intervenga en la prevención de algunos tipos de cánceres y lentifique el proceso de envejecimiento del cuerpo.

La función de los lisosomas en la autofagia se resume en la figura 8.35. Una vez que se completa el proceso digestivo en el autofagolisosoma, el organelo se conoce como cuerpo residual. Según sea el tipo celular, el contenido del cuerpo residual puede eliminarse de la célula mediante exocitosis o conservarse dentro del citoplasma por tiempo indefinido como un gránulo de lipofuscina. La cantidad de gránulos de lipofuscina se incrementa a medida que el individuo envejece; la acumulación es muy evidente en las células de vida prolongada, como las neuronas, en las que estos gránulos se consideran una característica principal del proceso de envejecimiento. La función de los lisosomas en diversas enfermedades se describe en la sección Perspectiva humana.

Hasta el 90% del volumen de muchas células vegetales está ocupado por una sola vacuola central llena con líquido y limitada por una membrana (fig. 8.36). Aunque su estructura es sencilla, las vacuolas vegetales realizan una gran variedad de funciones esenciales. Muchos de los solutos y macromoléculas de una célula, incluidos iones, azúcares, aminoácidos, proteínas y polisacáridos, se almacenan en forma temporal en la vacuola. Las vacuolas también pueden almacenar muchos compuestos tóxicos. Algunos de estos compuestos (como los glucósidos que contienen cianuro y los glucosinolatos) son parte de un arsenal de armas químicas que se liberan cuando la célula sufre el ataque de un herbívoro o un hongo. Otros compuestos tóxicos tan sólo son productos intermediarios de reacciones metabólicas; como las plantas carecen de algún tipo de sistemas excretores que se encuentran en los animales, utilizan sus vacuolas para aislar estos productos intermediarios del resto de la célula. Algunos de estos compuestos, como la digital, tienen un valor clínico importante demostrado.

La membrana que limita la vacuola, el tonoplasto, contiene diversos sistemas de transporte activo que bombean iones hacia el compartimiento vacuolar a una concentración mucho mayor de la que se encuentra en el citoplasma o el líquido extracelular. A causa de esta gran concentración, el agua entra a la vacuola por ósmosis. La presión hidrostática (turgencia) que ejerce la vacuola no sólo suministra soporte mecánico a los tejidos blandos de una planta (pág. 150), sino que también estira la pared celular durante el crecimiento de la célula.

Las vacuolas vegetales también son sitios de digestión intracelular, no muy distintos a los lisosomas, que no existen en las plantas. De hecho, las vacuolas vegetales tienen algunas de las mismas hidrolasas ácidas que se encuentran en los lisosomas. El pH de la vacuola se mantiene en un valor bajo por acción de una ATP-asa de H⁺ de tipo V dentro del tonoplasto que bombea protones hacia el líquido vacuolar. Al igual que las proteínas del lisosoma, muchas de las proteínas de una vacuola vegetal se sintetizan en los ribosomas unidos a la membrana del RER, se transportan por el aparato de Golgi y se separan en la cara trans del aparato de Golgi antes de dirigirse a la vacuola.

Ya se describió con detalle cómo una célula transporta materiales del RER y el aparato de Golgi a la membrana plasmática y el espacio extracelular. Ahora se describirá el movimiento de materiales en el sentido contrario. En el capítulo 4 se consideró la forma en que los solutos de bajo peso molecular pasan por la membrana plasmática, pero ¿cómo son las células capaces de incluir materiales que son demasiado grandes para penetrar su membrana sin importar sus propiedades de permeabilidad?, ¿y cómo se reciclan las proteínas que residen en la membrana plasmática a los compartimientos interiores? Estos dos requerimientos se cumplen con la vía endocítica, en la que segmentos de la membrana plasmática se invaginan para formar vesículas citoplásmicas que se transportan al interior de la célula. En esta sección del capítulo se consideran dos procesos básicos, la endocitosis y la fagocitosis, que ocurren por mecanismos distintos. La endocitosis es un proceso por el cual la célula interioriza los receptores de la superficie celular y los ligandos extracelulares unidos a ellos. La fagocitosis describe la captación de partículas.

Endocitosis

En términos amplios, la endocitosis puede dividirse en dos categorías: la endocitosis por volumen y la endocitosis mediada por receptor. La endocitosis por volumen (también conocida como pinocitosis) es la captación inespecífica de líquidos extracelulares. Cualquier molécula, grande o pequeña, que esté presente en el líquido abarcado también entra a la célula. La endocitosis por volumen puede visualizarse con la adición de una sustancia al medio de cultivo, como el colorante amarillo lucifer o la enzima peroxidasa del rábano picante que captan las células en forma inespecífica. La endocitosis por volumen también retira porciones de la membrana plasmática y puede funcionar sobre todo en el reciclaje de membrana entre la superficie celular y los compartimientos interiores. En cambio, la endocitosis mediada por receptor (RME, receptor mediated endocytosis) se refiere a la captación de macromoléculas extracelulares específicas (ligandos) después de su unión con receptores en la superficie externa de la membrana plasmática.⁵

Endocitosis mediada por receptor y la función de las concavidades cubiertas

La endocitosis mediada por un receptor proporciona un medio para la captación selectiva y eficiente de macromoléculas que pueden estar presentes en concentraciones relativamente bajas en el líquido extracelular. Las células tienen receptores para la captación de muchos tipos diferentes de ligandos, incluidas hormonas, factores de crecimiento, enzimas y proteínas sanguíneas que transportan ciertos nutrientes. Las sustancias que ingresan a la célula mediante la RME, a su vez mediada por clatrina, se unen con los receptores que se reúnen en dominios especializados de la membrana plasmática, conocidos como concavidades cubiertas. Los receptores se concentran en dichas concavidades con un nivel 10 a 20 veces mayor que en el resto de la membrana plasmática. Las concavidades cubiertas (fig. 8.37a) se reconocen en las micrografías electrónicas como sitios en los que la superficie está hundida y la membrana plasmática está cubierta en su cara citoplásmica con una capa electrodensa erizada que contiene clatrina. Las concavidades cubiertas se invaginan en el citoplasma (fig. 8.37b) y luego se liberan de la membrana plasmática para formar vesículas cubiertas (fig. 8.37c,d). Para comprender el mecanismo de la formación de vesículas cubiertas es necesario examinar la estructura molecular de la cubierta de clatrina.

La figura 8.38 muestra una concavidad cubierta como se observa desde las superficies extracelular y citoplásmica de las membranas plasmáticas de las células que realizan la endocitosis mediada por receptor. Cuando se observa desde la superficie citoplásmica (fig. 8.38b,c), la cubierta erizada parece consistir en una red de hexágonos parecidos a un panal de abejas. La construcción geométrica de la cubierta deriva de la estructura de sus bloques constituyentes de clatrina. Cada molécula de clatrina consiste en tres cadenas pesadas y tres ligeras unidas para formar un ensamble de tres ramas llamado módulo trípode de clatrina (trisquelion) (fig. 8.39).

La disposición superpuesta de los trisqueliones dentro del andamiaje de clatrina de una vesícula cubierta se muestra en la figura 8.40. Cada miembro de un trisquelion de clatrina se extiende hacia afuera en dos aristas de un polígono. Las moléculas de clatrina se superponen de modo que cada vértice de un polígono contiene un centro de uno de los trisqueliones componentes.

Al igual que las vesículas cubiertas con clatrina que se desprenden de la TGN (pág. 299), las vesículas cubiertas que se forman durante la endocitosis también contienen una capa de adaptadores complejos situados entre la celosía de clatrina y la superficie de la vesícula que queda frente al citosol. El adaptador mejor estudiado que opera en conexión con la endocitosis mediada por clatrina es AP2. A diferencia de los adaptadores de GGA empleados en la TGN que consisten en una sola subunidad con varios dominios (fig. 8.30), los adaptadores AP2 que se incorporan en las vesículas que se desprenden de la membrana plasmática contienen múltiples subunidades con distintas funciones (fig. 8.40). La subunidad μ de los adaptadores AP2 se acopla a las colas citoplásmicas de los receptores específicos en la membrana plasmática, lo que conduce a la concentración de estos receptores seleccionados, y sus moléculas de cargamento unidas, en la vesícula cubierta emergente (se explica mejor en “Vías experimentales”, pág. 321). En cambio, la subunidad adaptina β de los adaptadores AP2 se une y congrega las moléculas de clatrina de la celosía suprayacente. Una comparación de las figuras 8.26 y 8.40 muestra las diferencias y similitudes importantes entre las vesículas cubiertas con COP II y las cubiertas con clatrina. Ambas cubiertas contienen dos capas distintas: un andamiaje externo geométrico y una capa interna de proteínas adaptadoras. Sin embargo, la estructura de los andamiajes externos es muy distinta; las subunidades de la celosía de clatrina (complejos trípodes de clatrina) están muy superpuestas, mientras que las de la celosía COP II (complejos Sec13-Sec31 cilíndricos) no se superponen. Además, cada vértice de una capa de COPII está formado por cuatro bordes y no por tres, como se observa en la cubierta de clatrina. No se sabe si existe una fase funcional para estos dos tipos distintos de estrategias para construcción.

La estructura mostrada en la figura 8.40 es una versión muy simplificada de una vesícula cubierta “real”, que puede contener hasta 24 proteínas accesorias diferentes que forman una red dinámica de moléculas en interacción. No se conocen las funciones de estas proteínas en el reclutamiento de cargamento, ensamble de cubierta, curvatura e invaginación de membrana, interacción con los componentes del citoesqueleto, liberación de vesículas y descubrimiento de la membrana. La mejor estudiada de estas proteínas accesorias es la dinamina.

La dinamina es una proteína de unión con GTP necesaria para la liberación de la vesícula cubierta con clatrina de la membrana en la que se forma. La dinamina se ensambla por sí misma en un collar helicoidal alrededor del cuello de una concavidad cubierta invaginada (fig. 8.41), justo antes que se desprenda de la membrana. En el modelo mostrado en la figura 8.41a, pasos 3 a 4, la hidrólisis de la GTP unida por las moléculas polimerizadas de dinamina induce un movimiento de torsión en la hélice de dinamina que separa la vesícula cubierta de la membrana plasmática. Según este mecanismo, la dinamina actúa como una enzima capaz de utilizar la energía química de GTP para generar fuerzas mecánicas. La disociación de la capa de clatrina y su separación de la vesícula exige la participación de una proteína adicional que es la ATPasa Hsc70, obtenida de la capa de clatrina por medio de un cofactor, la auxilina.

La función de los fosfoinosítidos en la formación de vesículas cubiertas

Aunque la explicación hace énfasis en las moléculas proteínicas de la cubierta y la vesícula, los fosfolípidos de la membrana vesicular también tienen una función importante. Como se explica en el capítulo 15, pueden agregarse grupos fosfato en distintas posiciones del anillo de azúcar del fosfolípido fosfatidilinositol (PI), lo que lo convierte en fosfoinosítidos (fig. 15.10). Se conocen siete fosfoinosítidos: PI(3)P, PI(4)P, PI(5)P, PI(3,4)P₂, PI(4,5)P₂, PI(3,5)P₂ y PI(3,4,5)P₃. Los anillos fosforilados de estos fosfoinosítidos se encuentran en la superficie de la membrana, donde pueden ser reconocidos por proteínas particulares que se les unen. Distintos fosfoinosítidos se concentran en distintos compartimientos de la membrana, lo que ayuda a dar a cada compartimiento una “identidad superficial” única. Por ejemplo, la hoja interna de la membrana plasmática tiende a contener niveles altos de PI(4,5)P₂, que tiene una función importante en la atracción de proteínas implicadas en la endocitosis mediada por clatrina, como la dinamina y AP2 (fig. 8.40b). Además de que un fosfoinosítido facilita el reclutamiento de proteínas específicas, también induce cambios de conformación en una proteína unida, que facilitan el proceso molecular. Por ejemplo, el adaptador de clatrina AP2 existe normalmente en el citosol con una conformación “fija” o no modificable. La unión del complejo AP2 con PI(4,5)P₂ en la membrana plasmática induce un gran cambio de conformación de AP2 que abre un sitio de unión al “cargamento” dentro del adaptador, y permite la interacción con las zonas caudales citoplásmicas de los receptores de membrana específicos. En la figura 8.42 se incluye un modelo estructural que señala esta serie de fenómenos.

Una especie de lípido, como PI(4,5)P₂, puede tener función reguladora porque puede formarse y destruirse con rapidez por acción de enzimas que se localizan en sitios y momentos particulares dentro de la célula. En el ejemplo de la endocitosis, PI(4,5)P₂ desaparece del sitio de endocitosis más o menos al momento que la vesícula cubierta se desprende de la membrana plasmática. Otros PI vinculados con vías secretoras/endocíticas incluyen PI(3)P situado en los endosomas tempranos y vesículas intraluminales de los endosomas tardíos; PI(4)P localizado en la TGN, gránulos secretores y vesículas sinápticas, y PI(3,5)P2 localizado en la membrana limitante del endosoma tardío.

La vía endocítica

Las moléculas que capta una célula por endocitosis se mueven en una vía endocítica bien definida (fig. 8.43a). Antes de describir los fenómenos que ocurren en la vía endocítica, vale la pena considerar dos tipos diferentes de receptores que están sujetos a la endocitosis. Un grupo de receptores, al cual se le denomina “receptores constitutivos”, es el encargado de la captación de materiales que se utilizan en la célula. Los ejemplos mejor estudiados son los receptores para transferrina y lipoproteínas de baja densidad (LDL, low density lipoprotein), que median la entrega a las células del hierro y el colesterol, respectivamente. El receptor para LDL se describe con detalle al final de esta sección. El receptor de color rojo de la figura 8.43a representa un receptor constitutivo. El segundo grupo de receptores, al que se conoce como “receptores de señalización”, es el encargado de unir los ligandos extracelulares que llevan mensajes que cambian las actividades celulares. Estos ligandos, que incluyen hormonas como la insulina y factores de crecimiento como el EGF, se unen con el receptor de la superficie (en verde en la fig. 8.43a) y emiten una señal para dar origen a una respuesta fisiológica dentro de la célula (proceso descrito con detalle en el cap. 15). La endocitosis del primer grupo de receptores por lo general conduce a la entrega de los materiales unidos, como el hierro y el colesterol, a la célula, y el receptor regresa luego a la superficie celular para realizar más rondas de captación. La endocitosis del segundo grupo de receptores conduce a menudo a la destrucción del receptor, un proceso llamado regulación en descenso del receptor, y que tiene el efecto de reducir la sensibilidad de la célula a la estimulación posterior por la hormona o factor de crecimiento. La regulación en descenso del receptor es un mecanismo por el cual las células regulan su capacidad para responder a los mensajeros extracelulares. Los “receptores de señalización” casi siempre están marcados para la endocitosis y destrucción ulterior por el enlace covalente con una “etiqueta” en la cola citoplásmica del receptor cuando aún está en la superficie celular. La etiqueta es una pequeña proteína llamada ubicuitina (ubiquitina) que se agrega por medios enzimáticos. Las proteínas de membrana que no se someten en forma usual a la endocitosis se interiorizan si llevan una ubicuitina adicional.⁶

Después de la interiorización, los materiales unidos con la vesícula se transportan a una red dinámica de túbulos y vesículas conocidas en conjunto como endosomas, que representan los centros de distribución a lo largo de la vía endocítica. El líquido de la luz de los endosomas se acidifica por efecto de una ATP-asa de H⁺ en la membrana limitante. Los endosomas se dividen en dos clases diferentes, los endosomas tempranos, que casi siempre se localizan cerca de la región periférica de la célula, y los endosomas tardíos, que por lo general se hallan más cerca del núcleo. Según el modelo prevaleciente, los endosomas tempranos maduran poco a poco hasta endosomas tardíos. Esta transformación de endosoma temprano a tardío se caracteriza por descenso en el pH, intercambio de proteínas Rab (p. ej., de Rab5 a Rab7) y un cambio notable en la morfología interna de las estructuras.

Los receptores que se captan por endocitosis se transportan en vesículas a un endosoma temprano, el cual sirve como estación clasificadora que dirige los distintos tipos de receptores y ligandos por vías diferentes (fig. 8.43a). Por lo general, los “receptores constitutivos” se disocian de sus ligandos unidos como resultado de la concentración alta de H⁺ de los endosomas tempranos. Luego, los receptores se concentran en compartimientos tubulares especializados del endosoma temprano que representan centros de reciclaje. Las vesículas que se forman de estos túbulos llevan a los receptores de regreso a la membrana plasmática para efectuar más rondas de endocitosis (fig. 8.43a). En cambio, los ligandos liberados (p. ej., LDL) se concentran en un compartimiento de clasificación antes de enviarse hacia un endosoma tardío y al final a un lisosoma, donde ocurre el procesamiento final. Como se indicó antes, los “receptores de señalización” con sus marcas de ubicuitina no se reciclan de nuevo a la membrana. En vez de ello, tales receptores ubicuitinados son secuestrados dentro de una población de pequeñas vesículas esféricas que se apiñan en el interior del endosoma tardío (fig. 8.43b); este fenómeno de vesiculación (que se incluye en el cuadro en la mitad izquierda de la fig. 8.43a) es concertado por una serie de complejos proteínicos llamados ESCRT. Cuatro complejos ESCRT diferentes actúan de manera seriada para: (1) seleccionar los receptores ubicuitinados en un cúmulo dentro de la membrana endosómica tardía; (2) hacer que un parche de la membrana se invagine como si fuera una yema al interior del endosoma tardío y (3) seccionar el cuello de la invaginación para que se liberen la vesícula intraluminal de formación reciente. En la figura 8.43c se incluye la segregación de receptores de señales dentro del endosoma tardío. A causa de tales vesículas internas también se conocen a los endosomas tardíos como cuerpos multivesiculares (MVBs, multivesicular bodies).

Metabolismo de LDL y colesterol Entre muchos ejemplos de endocitosis mediada por receptor, el primero estudiado y el mejor comprendido es el que aporta a las células animales el colesterol exógeno. Las células animales utilizan el colesterol como parte esencial de sus membranas plasmáticas y como precursor de las hormonas esteroideas. El colesterol es una molécula hidrófoba que se transporta en la sangre como parte de enormes complejos de lipoproteínas; por ejemplo, las lipoproteínas de baja densidad (LDL) que se muestran en la figura 8.44. Cada partícula de LDL contiene un centro de unas 1 500 moléculas de colesterol esterificadas en ácidos grasos de cadenas largas. El centro está rodeado por una sola capa de fosfolípidos que contiene una sola copia de una proteína grande, llamada apolipoproteína B-100, que se une en forma específica con los receptores para LDL en la superficie de las células.

Los receptores LDL se transportan a las membranas plasmáticas de las células, donde se concentran en concavidades cubiertas, incluso en ausencia del ligando LDL. Como resultado, los receptores están en la superficie celular listos para captar las lipoproteínas en la sangre si están disponibles. Una vez que las LDL se unen con una concavidad cubierta, ésta se invagina para formar una vesícula cubierta, la cubierta de clatrina se desarma y los receptores para LDL pasan por los endosomas tempranos y de regreso a la membrana plasmática, como se muestra en la figura 8.43a. Mientras tanto, las partículas de LDL se trasladan a los endosomas tardíos y lisosomas, donde el componente de proteína se degrada y el colesterol sufre desesterificación para usarlo en el ensamble de la membrana u otros procesos metabólicos (p. ej., formación de hormonas esteroideas). Las personas con un raro trastorno hereditario llamado enfermedad de Niemann-Pick tipo C carecen de una de las proteínas necesarias para transferir el colesterol fuera de los lisosomas. La acumulación resultante de colesterol en estos organelos causa degeneración nerviosa y muerte durante la lactancia temprana. En la sección “Vías experimentales” se describen con detalle los estudios de una enfermedad diferente que condujo al descubrimiento de la endocitosis mediada por receptor y la interiorización de la LDL.

El nivel de LDL en sangre se relaciona con el desarrollo de ateroesclerosis, un trastorno caracterizado por la formación de placas en las paredes de las arterias que disminuyen el flujo sanguíneo por los vasos y actúan como nichos para la formación de coágulos sanguíneos. Los coágulos que bloquean las arterias coronarias son la principal causa de infartos miocárdicos (ataque al corazón). Los estudios sugieren que la ateroesclerosis se debe a la reacción inflamatoria crónica que se inicia por el depósito de LDL en las paredes internas de los vasos sanguíneos, como se indica en la figura 8.45. La reducción de los niveles de LDL es más fácil de lograr si se administran medicamentos llamados estatinas (p. ej., lovastatina y pravastatina) que bloquean la acción de la reductasa de HMG CoA, una enzima clave para la síntesis de colesterol (pág. 319). Cuando las concentraciones sanguíneas de colesterol disminuyen, el riesgo de un infarto cardiaco también lo hace.

Las LDL no son los únicos agentes transportadores de colesterol en la sangre. Las lipoproteínas de alta densidad (HDL, high density lipoprotein) tienen una construcción similar, pero poseen una proteína distinta (apolipoproteína A-I) y una función diferente en el cuerpo. Las LDL sirven sobre todo para transportar en la sangre moléculas de colesterol, del hígado, donde se sintetizan y empacan, a todas las células del cuerpo. Las HDL transportan colesterol en el sentido contrario. El exceso de colesterol se traslada fuera de la membrana plasmática de las células del cuerpo a las partículas de HDL circulantes, las cuales llevan el colesterol al hígado para su excreción. Tal y como las concentraciones sanguíneas elevadas de LDL se relacionan con un mayor riesgo de enfermedad cardiaca, las concentraciones sanguíneas altas de HDL se vinculan con un menor riesgo, lo cual hizo que la HDL se llamara “colesterol bueno”. No hay duda que el descenso en la concentración de LDL es beneficioso, pero las consecuencias del aumento en la concentración de HDL no son tan claras. Por ejemplo, las moléculas de colesterol pueden transferirse de HDL a otras partículas de lipoproteína mediante una enzima llamada proteína para transferencia de éster de colesterilo (CETP, cholesteryl ester transfer protein), una actividad que tiende a disminuir la concentración de colesterol HDL. La CETP se convirtió en el centro de investigaciones después del descubrimiento de familias japonesas cuyos integrantes vivían más de 100 años y tenían mutaciones en el gen CETP. Se han sometido a prueba en investigaciones en humanos, a algunos inhibidores CETP de peso molecular pequeño y se ha observado que incrementan los niveles de HDL en la sangre. Uno de estos fármacos elegibles (torcetrapib) se retiró de estudios adicionales a pesar del hecho de que aumentó la concentración sanguínea de HDL. Por razones desconocidas, los sujetos que tomaron el fármaco y una estatina tuvieron una probabilidad mucho mayor de morir que los del grupo testigo que sólo tomaron la estatina.

El estudio preliminar de otro inhibidor CETP (anacetrapib) no aportó prueba alguna de efectos nocivos propios del fármaco. El medicamento en cuestión incrementó impresionantemente los niveles de HDL (un promedio mayor de 100%), pero no se ha corroborado si dicha respuesta se podría traducir en prolongación de la supervivencia a largo plazo en sujetos expuestos al riesgo de cardiopatías. Otra molécula sobre la cual actuaría un producto hipocolesterolemiante sería PCSK9, enzima proteolítica que destruye los receptores de LDL en el hígado. Los individuos que portan mutaciones inactivadoras en el gen que codifica PCSK9 muestran menores niveles de colesterol de LDL y una menor frecuencia de cardiopatías. Están en fase de estudio en humanos cuando menos dos inhibidores de PCSK9 (REGN727 y AMG145).

Fagocitosis

La fagocitosis (cuando la “célula come”) es la tarea extensa de unos cuantos tipos de células especializadas en la captación de partículas relativamente grandes (>0.5 μm de diámetro) del ambiente. Muchos protistas unicelulares, como las amebas y los ciliados, viven porque atrapan partículas de alimento y microorganismos más pequeños y los encierran dentro de pliegues de su membrana plasmática. Los pliegues se fusionan para formar una vacuola (o fagosoma) que se separa de la membrana plasmática hacia el interior. El fagosoma se fusiona con un lisosoma y el material se digiere dentro del fagolisosoma resultante.

En la mayoría de los animales, la fagocitosis es un mecanismo protector en lugar de una forma de alimentación. Los mamíferos tienen diversos fagocitos “profesionales”, incluidos macrófagos y neutrófilos, que se desplazan por la sangre y los tejidos, donde fagocitan microorganismos invasores, células dañadas o muertas y detritos. Las células fagocíticas reconocen a los materiales y los unen mediante receptores en su superficie antes de captarlos. Una vez dentro del fagocito, los microorganismos pueden destruirse con las enzimas lisosómicas o con radicales libres de oxígeno generados dentro de la luz del fagosoma. El proceso de inclusión de la partícula se muestra en la micrografía que abre el capítulo y en la figura 8.46a. Los pasos de la digestión de los materiales atrapados se ilustran en la figura 8.46b. La fagocitosis de material particulado se favorece por las actividades contráctiles de los microfilamentos formados por actina subyacentes a la membrana plasmática.

No todas las bacterias ingeridas por células fagocíticas se destruyen. De hecho, algunas especies secuestran los mecanismos fagocíticos para promover su propia supervivencia en el cuerpo. Por ejemplo, los macrófagos engullen a Mycobacterium tuberculosis, agente causante de la tuberculosis, por fagocitosis, pero la bacteria es capaz de inhibir la fusión del fagosoma en el que se encuentra con un lisosoma. Estudios recientes sugieren incluso que si el fagosoma se vuelve muy ácido, la bacteria es capaz de mantener su propio pH fisiológico a pesar del pH bajo en su medio circundante. La bacteria causante de la fiebre Q, Coxiella burnetii, queda encerrada en un fagosoma que se fusiona con un lisosoma, pero ni el ambiente ácido ni las enzimas lisosómicas pueden destruir al patógeno. Listeria monocytogenes, una bacteria que causa meningitis, produce proteínas que destruyen la integridad de la membrana lisosómica, lo que permite que la bacteria escape hacia el citosol de la célula (fig. 9.67).

La división del contenido de una célula en varios compartimientos presenta muchos desafíos de organización para la maquinaria celular de tráfico proteínico. En este capítulo ya se explicó que el tráfico de proteínas en una célula eucariota está regulado por: (1) señales de clasificación, como el péptido de señal de proteínas secretadas o grupos manosa-fosfato de enzimas lisosómicas y (2) receptores que reconocen estas señales y trasladan a las proteínas que las contienen a los compartimientos apropiados. Cuatro de los principales organelos de la célula (núcleo, mitocondrias, cloroplastos y peroxisomas), importan proteínas a través de una o más membranas limitantes externas. Como en el caso del retículo endoplásmico rugoso, las proteínas que importan estos organelos contienen secuencias de aminoácidos que sirven como domicilios que reconocen los receptores en la membrana externa del organelo. A diferencia del ER rugoso que casi siempre importa sus proteínas al mismo tiempo de la traducción, las proteínas de estos otros organelos se importan después de la traducción, es decir, después de completar la síntesis en los ribosomas libres en el citosol.

La importación de proteínas al núcleo es un tema especializado que se trata por separado en la sección 12.2. La importación de proteínas a los peroxisomas, mitocondrias y cloroplastos se explica en las siguientes secciones.

Captación de proteínas en los peroxisomas

Los peroxisomas son organelos muy sencillos que sólo tienen dos compartimientos en los que una proteína importada puede situarse: la membrana limitante y la matriz interna (pág. 206). Las proteínas destinadas a un peroxisoma tienen una señal de dirección peroxisómica (PTS, peroxisomal targeting signal), ya sea una PTS para una proteína de la matriz peroxisómica o una mPTS para una proteína peroxisómica de la membrana. Se han identificado diferentes PTS: mPTS y receptores PTS. Los receptores PTS se unen con proteínas destinadas al peroxisoma en el citosol y las trasladan a la superficie del peroxisoma, sitio en el cual penetran en el organelo. Algunos datos sugieren que, como mínimo, uno de los receptores PTS (PEX5) se desplaza desde el citosol para penetrar en la membrana peroxisómica, en donde forma un poro transitorio que facilita el desplazamiento de proteínas y su paso al peroxisoma. A diferencia de las mitocondrias y los cloroplastos, cuyas proteínas importadas deben asumir un estado desplegado, de alguna manera los peroxisomas son capaces de importar proteínas de la matriz peroxisómica en su conformación plegada nativa, incluso las que tienen varias subunidades. El mecanismo por el cual los peroxisomas son capaces de realizar esta tarea impactante aún es tema de controversia.

Captación de proteínas en las mitocondrias

Las mitocondrias tienen cuatro compartimientos a los cuales pueden llegar las proteínas: una membrana mitocondrial externa (OMM), membrana mitocondrial interna (IMM), espacio intermembranoso y matriz (fig. 5.3c). Aunque las mitocondrias sintetizan unos cuantos de sus polipéptidos integrales de membrana (13 en los mamíferos), alrededor de 99% de las proteínas del organelo se codifica en el genoma nuclear, se sintetiza en el citosol y se importa después de la traducción. Esta descripción se limita a las proteínas de la matriz mitocondrial y a la membrana mitocondrial interna, que juntas constituyen la gran mayoría de las proteínas dirigidas a este organelo. Como sucede con las proteínas peroxisómicas y las proteínas de otros compartimientos, las proteínas mitocondriales contienen secuencias de señalización que las dirigen al sitio a donde pertenecen. La mayoría de las proteínas de la matriz mitocondrial contiene una secuencia directriz removible (llamada presecuencia) situada en el extremo N de la molécula (paso 1, fig. 8.47a). La “presecuencia” comprende típicamente varios residuos con carga positiva en una cara de la hélice y residuos hidrófobos en la cara contraria. En cambio, la mayor parte de las proteínas destinadas a la membrana mitocondrial interna cuenta con secuencias directrices internas que permanecen como parte de la molécula.

Antes que una proteína pueda entrar a una mitocondria, se cree que suceden varios fenómenos. Primero, la proteína debe presentarse a la mitocondria en un estado relativamente desplegado o extendido (pasos 1 y A, fig. 8.47a). Varias moléculas chaperonas diferentes (p. ej., Hsp70 y Hsp90) participan en la preparación de polipéptidos para su captación en las mitocondrias, incluidas unas que dirigen en forma específica las proteínas mitocondriales a la superficie citosólica de la membrana mitocondrial externa (fig. 8.47a). La membrana mitocondrial externa contiene un complejo importador de proteína, el complejo TOM, que incluye: (1) receptores que reconocen y se unen con proteínas mitocondriales y (2) canales recubiertos con proteína por los cuales pasan los polipéptidos desplegados a través de la membrana externa (pasos 2 y B).⁷ Las proteínas destinadas a la membrana mitocondrial interna o la matriz deben pasar por el espacio intermembranoso y acoplarse con un segundo complejo importador de proteínas localizado en la membrana mitocondrial interna, el complejo TIM. La membrana mitocondrial interna contiene dos complejos TIM mayores: TIM22 y TIM23. TIM22 se une con proteínas integrales de la IMM que contienen una secuencia directriz interna y las inserta en la bicapa lipídica (pasos C-D, fig. 8.47a). Por el contrario, TIM23 se une con proteínas con una presecuencia en el extremo N, que incluyen a todas las proteínas de la matriz (así como varias de la IMM que no se describen aquí). TIM23 reconoce y traslada a las proteínas de la matriz a través de la IMM hasta el compartimiento acuoso interno (paso 3, fig. 8.47a). La translocación ocurre en sitios en los que las membranas mitocondriales externa e interna están muy próximas, de manera que la proteína importada puede cruzar ambas membranas al mismo tiempo. El movimiento hacia la matriz está impulsado por el potencial eléctrico a través de la membrana mitocondrial interna que actúa sobre la señal directriz con carga positiva; si se disipa el potencial por la adición de un fármaco como el dinitrofenol (pág. 198), cesa la translocación.

Cuando entra a la matriz, un polipéptido interactúa con las chaperonas mitocondriales, como mtHsp70 (paso 4, fig. 8.47a), que median la entrada al compartimiento acuoso. Se han propuesto dos mecanismos para explicar la acción general de las chaperonas participantes en el movimiento de proteínas a través de las membranas, que es un fenómeno muy difundido. De acuerdo con un nuevo punto de vista, las chaperonas actúan como motores generadores de fuerza que usan la energía derivada de la hidrólisis del ATP para “tirar” del polipéptido desplegado a través del poro de translocación. Según un enfoque alternativo, las chaperonas ayudan a la difusión del polipéptido a través de la membrana. La difusión es un proceso aleatorio en el que una molécula puede moverse en cualquier dirección disponible. Considérese lo que sucedería si un polipéptido desplegado entrara a un poro de translocación en la membrana mitocondrial y “metiera la cabeza” en la matriz. De igual modo, qué sucedería si una chaperona que reside en la superficie interna de la membrana pudiera unirse con el polipéptido sobresaliente de tal forma que bloqueara la difusión del polipéptido de regreso por el poro y hacia el citosol, pero no bloqueara su difusión hacia la matriz. A medida que el polipéptido se difunde cada vez más hacia la matriz, se producirían uniones repetidas con la molécula chaperona y en cada etapa impediría que se difundiera de regreso. Este mecanismo de acción de las chaperonas se conoce como difusión tendenciosa y se dice que la chaperona actúa como “trinquete browniano”; el término “browniano” se refiere a la difusión aleatoria y un “trinquete” es un instrumento que permite el movimiento sólo en una dirección. Los estudios recientes sugieren la probabilidad de que se utilicen ambos mecanismos de acción de las moléculas chaperonas y actúen en cooperación. Sin importar cuál sea el mecanismo de entrada, una vez que está en la matriz, el polipéptido obtiene su conformación nativa (paso 5a, fig. 8.47a) después de la eliminación enzimática de la secuencia previa (paso 5b).

Captación de proteínas en los cloroplastos

Los cloroplastos poseen seis subcompartimientos a los que pueden llegar las proteínas: membranas de envoltura interna y externa, espacio intermembranoso, estroma, membrana tilacoide y luz del tilacoide (fig. 8.48). Los mecanismos de importación del cloroplasto y la mitocondria tienen muchas similitudes, aunque sus mecanismos de translocación evolucionaron de manera independiente. Como sucede en la mitocondria:

1. La gran mayoría de las proteínas de los cloroplastos se importa del citosol.

2. Las membranas de envoltura externa e interna contienen distintos complejos de translocación (complejos Toc y Tic, respectivamente) que funcionan juntos durante la importación.

3. Las moléculas chaperonas ayudan a desplegar los polipéptidos en el citosol y a plegar las proteínas en el cloroplasto.

4. Las proteínas destinadas al cloroplasto se sintetizan con una secuencia terminal N removible (llamada péptido de tránsito) la cual varía notablemente tanto en longitud como en secuencia.

El péptido de tránsito hace algo más que sólo dirigir un polipéptido al cloroplasto: le proporciona un “domicilio” que localiza al polipéptido en uno de varios posibles compartimientos dentro del organelo (fig. 8.48). Todas las proteínas que pasan por la envoltura del cloroplasto contienen un dominio de dirección estromal como parte de su péptido de tránsito que garantiza que el polipéptido entre al estroma. Una vez en el estroma, se retira el dominio directriz del estroma mediante una peptidasa procesadora que se localiza en ese compartimiento. Los polipéptidos que pertenecen a la membrana tilacoide o a la luz tilacoidal poseen un segmento adicional en el péptido de tránsito, el dominio de transferencia tilacoidal, que determina la entrada al tilacoide. Se han identificado distintas vías y a través de ellas, las proteínas se insertan en la membrana tilacoide o se trasladan a la luz tilacoidal. Estas vías muestran similitudes llamativas con los sistemas de transporte de las células bacterianas, los supuestos ancestros de los cloroplastos. Muchas de las proteínas que residen dentro de la membrana tilacoidal se codifican en genes del cloroplasto y se sintetizan en ribosomas unidos a la membrana del cloroplasto, como se ilustra en el paso 4 de la figura 8.48.

El citoplasma de las células eucariotas contiene un sistema de organelos membranosos, incluidos el retículo endoplásmico, aparato de Golgi y lisosomas, que establecen una relación funcional y estructural entre ellos y con la membrana plasmática. Estos diversos organelos membranosos son parte de una red dinámica e integrada de endomembrana en la que los materiales van y vienen como parte de vesículas de transporte que se forman al desprenderse de un compartimiento y fusionarse con otro. Una vía biosintética (secretora) mueve proteínas de su sitio de síntesis en el ER a través del aparato de Golgi hasta su destino final (un organelo, la membrana plasmática o el espacio extracelular), mientras que una vía endocítica desplaza material en sentido contrario, de la membrana plasmática o espacio extracelular al interior de la célula. El cargamento se dirige a su destino apropiado mediante señales específicas que son parte de las proteínas mismas (pág. 271).

El retículo endoplásmico (ER) es un sistema de túbulos, cisternas y vesículas que divide el citoplasma en un espacio luminal dentro de las membranas del ER y un espacio citosólico fuera de las membranas. El ER se divide en dos grandes tipos: el ER rugoso (RER), que está formado por cisternas aplanadas y cuyas membranas tienen ribosomas unidos, y el ER liso (SER), que se compone sobre todo de compartimientos tubulares y cuyas membranas carecen de ribosomas. Las funciones del SER varían de una célula a otra e incluyen la síntesis de hormonas esteroideas, desintoxicación de una amplia variedad de compuestos orgánicos y secuestro de iones calcio. Las funciones del RER incluyen síntesis de las proteínas que se secretan, proteínas lisosómicas y proteínas integrales de membrana (pág. 279).

Las proteínas que se sintetizan en los ribosomas unidos con la membrana del RER se reconocen por una secuencia señal hidrófoba, que casi siempre se sitúa cerca del extremo N del polipéptido naciente. Conforme la secuencia señal surge del ribosoma, se le une una partícula de reconocimiento de señal (SRP) que detiene la síntesis y media la unión del complejo a la membrana del RER. Después de la unión, la SRP se libera de la membrana y el polipéptido naciente pasa por un poro recubierto con proteína en la membrana del ER hacia la luz de éste. Las proteínas lisosómicas y secretoras se trasladan completas hacia la luz, mientras que las proteínas de membrana se incluyen en la bicapa lipídica gracias a una o más secuencias transmembranosas hidrófobas. Las proteínas que no se pliegan en forma correcta se trasladan de regreso al citosol y se destruyen. Una vez que una proteína nueva se sitúa en la luz o la membrana del RER, puede moverse de ese sitio a destinos específicos de la vía biosintética. Si la luz del ER se “atraganta” por la abundancia excesiva de las proteínas recién sintetizadas, una respuesta integral llamada respuesta a proteínas desplegadas detiene la síntesis de las proteínas en el ER y fomenta la eliminación de las que ya están presentes (pág. 282).

La mayor parte de los lípidos de las membranas celulares también se sintetiza en el ER y se traslada de ese sitio a varios destinos. Los fosfolípidos se sintetizan en la cara citosólica del ER y se insertan en la hoja externa de la membrana del mismo. Algunas de estas moléculas después giran hacia la hoja contraria. La composición de lípidos de las membranas se modifica de varias maneras. Por ejemplo, los fosfolípidos pueden transportarse en forma selectiva de la membrana de un organelo a otro, o los grupos cabeza de lípidos específicos pueden modificarse por medios enzimáticos (pág. 285).

La adición de azúcares (glucosilación) a los residuos de asparagina de las proteínas inicia en el ER rugoso y continúa en el aparato de Golgi. Las secuencias de los azúcares que constituyen las cadenas de oligosacáridos de las glucoproteínas se determinan por los tipos y localizaciones de los miembros de una gran familia de glucosiltransferasas, enzimas que transfieren un azúcar específico de un azúcar de nucleótido donador a un receptor específico. Las cadenas de carbohidrato se ensamblan en el ER, un azúcar a la vez, y luego se transfieren como unidad del portador dolicol a un residuo de asparagina del polipéptido. Casi tan pronto como se transfiere el bloque de carbohidrato, empieza a modificarse, primero por la eliminación de los residuos terminales de glucosa. Las vesículas de membrana, con su cargamento dentro, se desprenden de los bordes del ER y se dirigen al aparato de Golgi (pág. 286).

El aparato de Golgi funciona como una planta procesadora, modifica los componentes de la membrana y el cargamento sintetizado en el ER antes de desplazarse a su destino final. El aparato de Golgi también es el sitio de síntesis de los polisacáridos complejos que forman la matriz de la pared celular de los vegetales. Cada aparato de Golgi consiste en una pila de cisternas aplanadas parecidas a platos, con bordes dilatados, vesículas y túbulos asociados. Los materiales entran a la pila por la cara cis y se modifican a medida que se mueven por transporte vesicular hacia la cara contraria, o trans. Mientras atraviesan la pila, se agregan azúcares a las cadenas de oligosacáridos por acción de las glucosiltransferasas localizadas en las cisternas de Golgi particulares. Una vez que las proteínas llegan a la red trans de Golgi (TGN) al final de la pila, están listas para clasificarse y dirigirse a su destino celular o extracelular final (pág. 290).

La mayoría, si no es que todas las vesículas que transportan materiales por el sistema de endomembrana, se encierran al principio en una cubierta proteínica. Se han identificado varios tipos de vesículas cubiertas. Las vesículas cubiertas con COP II transportan materiales del ER al aparato de Golgi. Las vesículas cubiertas con COP I trasladan materiales en el sentido contrario (retrógrado), del aparato de Golgi al ER. Las vesículas cubiertas con clatrina llevan materiales de la TGN a los endosomas, lisosomas y vacuola central (en las plantas). Las vesículas cubiertas con clatrina también forman parte de la vía endocítica, trasladan materiales de la membrana plasmática a los endosomas y lisosomas (pág. 295).

Cada compartimiento de la vía biosintética o endocítica tiene una composición proteínica característica. Las proteínas residentes tienden a ser retenidas en ese compartimiento particular y se recuperan si escapan a otros compartimientos. La mayor parte de la clasificación de proteínas en la vía biosintética ocurre en los últimos compartimientos de Golgi, la TGN. La TGN es la fuente de las vesículas que contiene proteínas de membrana particulares que dirigen la vesícula hacia un destino particular. Las enzimas lisosómicas producidas en el ER rugoso se separan en la TGN y se dirigen a los lisosomas en vesículas cubiertas con clatrina. Las enzimas lisosómicas están encerradas en estas vesículas desprendidas porque tienen residuos de manosa fosforilada en sus oligosacáridos centrales. Los receptores de membrana (MPR) reconocen estos oligosacáridos modificados, y además están unidos con una clase de adaptadores (proteínas GGA) que forman una capa entre la cubierta externa de clatrina y la membrana de la vesícula (pág. 298).

Las vesículas que se desprenden de un compartimiento donador poseen proteínas específicas en su membrana que reconocen a las proteínas localizadas en el compartimiento blanco (aceptor). El acoplamiento de dos membranas está mediado por proteínas de fijación y regulado por una gran familia de proteínas G llamadas Rab. SNARE-v y SNARE-t median la fusión de las membranas donadora y receptora e interactúan para formar haces de cuatro cadenas (pág. 300).

Los lisosomas son organelos limitados por membrana de apariencia diversa que contienen conjuntos de hidrolasas ácidas capaces de digerir cualquier tipo de macromolécula biológica. Entre sus numerosas funciones, los lisosomas degradan materiales, como bacterias y detritos, que llegan a la célula por fagocitosis, degradan los organelos citoplásmicos viejos mediante un proceso llamado autofagia y digieren diversas macromoléculas que se liberan mediante endosomas por endocitosis mediada por receptor. En los vertebrados, los lisosomas tienen una función clave en la defensa inmunitaria (pág. 303).

Las vacuolas de las plantas realizan diversas actividades. Las vacuolas sirven como almacén temporal para los solutos y macromoléculas; contienen compuestos tóxicos que se emplean en la defensa; suministran un contenedor para los desechos celulares; mantienen un compartimiento hipertónico que ejerce la presión de turgencia contra la pared celular; y son el sitio para la digestión intracelular mediada por hidrolasas ácidas (pág. 307).

La endocitosis facilita la captación de líquido y macromoléculas suspendidas, la interiorización de los receptores de membrana y sus ligandos unidos y además participa en el reciclaje de la membrana entre la superficie celular y el citoplasma. La fagocitosis es la captación de materia en partículas. En la endocitosis mediada por receptor, ligandos específicos se unen con los receptores de la membrana plasmática. Los receptores se reúnen en concavidades de la membrana que están cubiertas por su cara citoplásmica con un soporte poligonal de moléculas de clatrina. Las concavidades cubiertas dan origen a vesículas cubiertas, que pierden su cubierta y entregan su contenido a un endosoma y, al final, a un lisosoma. La fagocitosis puede funcionar como mecanismo de alimentación o como sistema de defensa celular (pág. 308).

Las proteínas dentro de los peroxisomas, mitocondrias o cloroplastos que están codificadas en genes nucleares deben importarse al organelo después de la traducción. En todos estos casos, las proteínas que deben importarse contienen secuencias señal que interactúan con los receptores encargados de la importación de proteínas. Estos tres organelos tienen canales recubiertos con proteína en sus membranas que promueven la translocación de polipéptidos plegados (en los peroxisomas) o polipéptidos desdoblados (en las mitocondrias y cloroplastos) al interior del organelo. Las mitocondrias y los cloroplastos contienen varios compartimientos diferentes a los que se dirigen las proteínas nuevas recién translocadas (pág. 316).

1. ¿Cuál (si lo hay) de los polipéptidos siguientes se esperaría que careciera de péptido de señal: colágeno, fosfatasa ácida, hemoglobina, proteínas ribosómicas, glucoforina, proteínas del tonoplasto?

2. Supóngase que sospecha que un paciente podría sufrir enfermedad de células I (pág. 306). ¿Cómo confirmaría que el diagnóstico es preciso con células cultivadas de ese paciente?

3. ¿En qué compartimiento celular se esperaría que una glucoproteína tuviera el mayor contenido de manosa, N-acetilglucosamina y ácido siálico?

4. En la página 316 se indicó que los peroxisomas son capaces de importar proteínas plegadas. Sin embargo, estos organelos son impermeables a moléculas relativamente pequeñas, como NADH y acetil-CoA. ¿Cómo es posible que sea permeable a unas y no a otros?

5. ¿Cuáles son las dos proteínas que esperaría encontrar como componentes integrales de la membrana del RER y que estarían ausentes de la membrana del SER?, ¿cuáles son dos de las proteínas del SER que no existen en el RER?

6. Si se desea estudiar el proceso de secreción regulada en una célula que carece de gránulos secretores maduros, esto es, vesículas que contienen material secretor que ya está listo para exportarse, ¿cómo podría obtenerse una célula que no tuviera tales gránulos?

7. En la página 307 se describió cómo podría prepararse glucocerebrosidasa que tuviera residuos de manosa en el extremo de sus oligosacáridos superficiales y no en el azúcar usual, el ácido siálico. Una versión similar de la glucocerebrosidasa con residuos de manosa expuestos está en proceso de producción mediante tecnología de DNA recombinante con una línea especial de células. ¿Qué características cree que pudieran tener estas células? Un indicio: la información para responder esta pregunta está en la figura 8.22.

8. La autorradiografía depende de partículas emitidas por átomos radiactivos que golpean una emulsión fotográfica que se encuentra sobre el corte tisular. Cuando se revela la emulsión, el sitio en el que la partícula golpeó la emulsión aparece como un grano plateado, como en la figura 8.3a. ¿Cómo cree que afectaría el grosor del corte a la resolución de la técnica, esto es, la capacidad para localizar el sitio preciso en la célula en el que se incorporó la radiactividad?

9. ¿En qué parte de la célula esperaría que se incorporaran primero los compuestos siguientes: [³H]leucina, [³H]ácido siálico, [³H]manosa, [³H]colina, [³H]ácido glucurónico (precursor de los GAG), [³H]pregnenolona (precursor de hormonas esteroideas), [³H]ramnosa en una célula vegetal (la ramnosa es precursora de las pectinas)?

10. ¿Cuál de las células siguientes esperaría que participara en forma más activa en la endocitosis por volumen: (a) un eritrocito, (b) una célula acinar pancreática, (c) una célula de músculo esquelético?, ¿por qué?

11. ¿Esperaría que las propiedades del lado de la cisterna de las membranas de Golgi fueran más parecidas al lado extracelular o al citosólico de la membrana plasmática?, ¿por qué?

12. ¿Qué compartimiento(s) de una célula se relaciona(n) con cada uno de los siguientes: clatrina, iones calcio en una célula de músculo esquelético, fosfato de dolicol, ribonucleasa y lipasa, digital, receptores para LDL, proteínas COP I, proteínas COP II, SRP no unidas?

13. Si un corte de tejido pancreático se incubara en [³H]leucina en forma continua durante dos horas, ¿en qué parte de las células acinares esperaría encontrar la radiactividad incorporada?

14. Si agregara un fármaco que interfiere con la capacidad de los ribosomas para unirse con mRNA, ¿qué efecto esperaría que tuviera en la estructura del ER rugoso?

15. No todos los receptores que participan en la endocitosis mediada por receptores se localizan en las concavidades cubiertas antes de unirse al ligando, pero se concentran en éstas antes de la interiorización ¿Cómo presupone que la unión de un ligando haría que un receptor se concentrara en una concavidad cubierta?

16. En el texto se indicó que los lisosomas carecen de una apariencia distintiva con un microscopio electrónico. ¿Cómo podría establecer si una vacuola particular es en realidad un lisosoma?

17. Los estudios de un raro trastorno hereditario, la enfermedad de Dent, revelaron que las personas con este padecimiento carecen de un canal para el ion cloro en los endosomas de las células de los túbulos renales. Dichos pacientes sufren diversos síntomas que sugieren que sus compartimientos endosómicos no eran tan ácidos como los de individuos normales. ¿Cómo presupone que un defecto en el canal para el cloro explique esta alteración?

18. Examine la micrografía con fluorescencia de la figura 8.20d. Aunque el aparato de Golgi tiene una tinción brillante, existe fluorescencia roja dispersa en otras partes de la célula. ¿Cómo explica la presencia de esta tinción dispersa?

19. La figura 8.8b muestra la localización de la manosidasa II marcada con GFP en una célula tratada con siRNA contra un mRNA que codifica una proteína participante en un paso temprano de la vía secretora. ¿Cuál esperaría que fuera el patrón de fluorescencia en una célula que se trató con un siRNA contra un mRNA que codificara la proteína GGA? ¿Y la proteína clatrina? ¿O una proteína de la partícula de reconocimiento de señal?